Дзякуй за наведванне сайта Nature.com. Версія браўзера, якой вы карыстаецеся, мае абмежаваную падтрымку CSS. Для найлепшага карыстання рэкамендуем выкарыстоўваць абноўлены браўзер (або адключыць рэжым сумяшчальнасці ў Internet Explorer). Тым часам, каб забяспечыць бесперапынную падтрымку, мы будзем адлюстроўваць сайт без стыляў і JavaScript.
Пладавітасць птушак залежыць ад іх здольнасці захоўваць дастатковую колькасць жыццяздольных сперматазоідаў на працягу доўгага перыяду часу ў канальцах для захоўвання сперматазоідаў (SST). Дакладны механізм, з дапамогай якога сперматазоіды трапляюць, знаходзяцца і пакідаюць SST, застаецца спрэчным. Сперма курэй шаркасі праяўляла высокую схільнасць да аглютынацыі, утвараючы рухомыя ніткападобныя пучкі, якія змяшчаюць шмат клетак. З-за цяжкасці назірання за рухомасцю і паводзінамі сперматазоідаў у непразрыстай маткавай трубе мы выкарысталі мікрафлюідную прыладу з папярочным сячэннем мікраканала, падобным да папярочнага сячэння сперматазоідаў, для вывучэння аглютынацыі і рухомасці сперматазоідаў. У гэтым даследаванні абмяркоўваецца, як фарміруюцца пучкі сперматазоідаў, як яны рухаюцца і іх магчымая роля ў падаўжэнні знаходжання сперматазоідаў у SST. Мы даследавалі хуткасць сперматазоідаў і рэалагічныя паводзіны, калі паток вадкасці ствараўся ў мікрафлюідным канале пад уздзеяннем гідрастатычнага ціску (хуткасць патоку = 33 мкм/с). Сперматазоіды, як правіла, плаваюць супраць плыні (станоўчая рэалогія), і хуткасць пучка сперматазоідаў значна зніжаецца ў параўнанні з адзінкавымі сперматазоідамі. Было заўважана, што пучкі спермы рухаюцца па спіралі і павялічваюцца ў даўжыні і таўшчыні па меры таго, як у іх уцягваецца больш адзіночных сперматазоідаў. Назіраліся пучкі спермы, якія набліжаліся і прыліпалі да бакавых сценак мікрафлюідных каналаў, каб пазбегнуць іх змятання хуткасцю патоку вадкасці > 33 мкм/с. Назіраліся пучкі спермы, якія набліжаліся і прыліпалі да бакавых сценак мікрафлюідных каналаў, каб пазбегнуць іх змятання хуткасцю патоку вадкасці > 33 мкм/с. Было адзначана, што пучкі сперматозоидов набліжаюцца і прыліпаюць да бакавой сценцы мікрафлюідных каналаў, каб пазбегнуць смецця з хуткасцю патоку вадкасці> 33 мкм / с. Было заўважана, што пучкі спермы набліжаюцца і прыліпаюць да бакавых сценак мікрафлюідных каналаў, каб пазбегнуць змывання пры хуткасці патоку вадкасці >33 мкм/с.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速> 33 мкм/с 扫过。33 мкм/с 扫过. Было адзначана, што пучкі сперматозоидов набліжаюцца і прыліпаюць да бакавой сценцы микрожидкостного канала, каб пазбегнуць смецця патоку вадкасці са хуткасцю > 33 мкм/с. Было заўважана, што пучкі спермы набліжаюцца і прыліпаюць да бакавых сценак мікрафлюіднага канала, каб пазбегнуць змывання патокам вадкасці са хуткасцю >33 мкм/с.Сканіруючая і прасвечвальная электронная мікраскапія паказала, што пучкі спермы падтрымліваюцца вялікай колькасцю шчыльнага матэрыялу. Атрыманыя дадзеныя дэманструюць унікальную рухомасць сперматазоідаў курэй Шарказі, а таксама здольнасць сперматазоідаў да аглютынацыі і ўтварэння рухомых пучкоў, што спрыяе лепшаму разуменню доўгатэрміновага захоўвання сперматазоідаў у СМТ.
Каб дасягнуць апладнення ў людзей і большасці жывёл, сперматазоіды і яйкаклеткі павінны прыбыць у месца апладнення ў патрэбны час. Такім чынам, спарванне павінна адбывацца да або падчас авуляцыі. З іншага боку, некаторыя млекакормячыя, такія як сабакі, а таксама немлекакормячыя віды, такія як насякомыя, рыбы, рэптыліі і птушкі, захоўваюць сперму ў сваіх рэпрадуктыўных органах на працягу доўгага перыяду часу, пакуль іх яйкаклеткі не будуць гатовыя да апладнення (асінхроннае апладненне 1). Птушкі здольныя падтрымліваць жыццяздольнасць сперматазоідаў, здольных апладняць яйкаклеткі, на працягу 2-10 тыдняў2.
Гэта ўнікальная асаблівасць, якая адрознівае птушак ад іншых жывёл, бо яна забяспечвае высокую верагоднасць апладнення пасля аднаразовага апладнення на працягу некалькіх тыдняў без адначасовага спарвання і авуляцыі. Асноўны орган захоўвання спермы, які называецца сперматазоідным канальцам (СКЗ), размешчаны ва ўнутраных складках слізістай абалонкі ў месцы маткава-похвавага злучэння. Да сённяшняга дня механізмы, з дапамогай якіх сперматазоіды трапляюць у банк спермы, знаходзяцца ў ім і выходзяць з яго, да канца не зразумелыя. На падставе папярэдніх даследаванняў было высунута шмат гіпотэз, але ні адна з іх не пацверджана.
Форман4 высунуў гіпотэзу, што сперматазоіды падтрымліваюць сваё месцазнаходжанне ў поласці SST дзякуючы бесперапыннаму вагальнаму руху супраць кірунку патоку вадкасці праз бялковыя каналы, размешчаныя на эпітэліяльных клетках SST (рэалогія). АТФ высільваецца з-за пастаяннай актыўнасці жгуцікаў, неабходнай для ўтрымання сперматазоідаў у прасвете SST, і рухомасць у рэшце рэшт зніжаецца, пакуль сперматазоіды не выносяцца з банка спермы патокам вадкасці і не пачынаюць новае падарожжа па ўзыходнай маткавай трубе для апладнення сперматазоіда. Яйкаклетка (Форман4). Гэтая мадэль захоўвання спермы пацвярджаецца выяўленнем з дапамогай імунацытахіміі аквапарынаў 2, 3 і 9, якія прысутнічаюць у эпітэліяльных клетках SST. На сённяшні дзень даследаванняў рэалогіі курынай спермы і яе ролі ў захоўванні SST, адборы спермы ў похве і канкурэнцыі сперматазоідаў недастаткова. У курэй сперма трапляе ў похву пасля натуральнага спарвання, але больш за 80% сперматазоідаў выкідваюцца з похвы неўзабаве пасля спарвання. Гэта сведчыць аб тым, што похва з'яўляецца асноўным месцам адбору спермы ў птушак. Акрамя таго, паведамлялася, што менш за 1% сперматазоідаў, аплодненых у похве, трапляюць у SST2. Пры штучным апладненні куранят у похве колькасць сперматазоідаў, якія дасягаюць SST, мае тэндэнцыю да павелічэння праз 24 гадзіны пасля апладнення. Пакуль што механізм адбору сперматазоідаў падчас гэтага працэсу незразумелы, і рухомасць сперматазоідаў можа гуляць важную ролю ў паглынанні сперматазоідаў у SST. З-за тоўстых і непразрыстых сценак маткавых труб цяжка непасрэдна кантраляваць рухомасць сперматазоідаў у маткавых трубах птушак. Такім чынам, нам не хапае базавых ведаў пра тое, як сперматазоіды пераходзяць у SST пасля апладнення.
Рэалогія нядаўна была прызнана важным фактарам, які кантралюе транспарт спермы ў палавых органах млекакормячых. Зыходзячы з здольнасці рухомых сперматазоідаў міграваць у супрацьпатоку, Заферані і інш.8 выкарысталі мікрафлюідную сістэму Corra для пасіўнага вылучэння рухомых сперматазоідаў з узораў спермы, якія былі сабраны. Гэты тып сартавання спермы мае важнае значэнне для лячэння бясплоддзя і клінічных даследаванняў і пераважнейшы за традыцыйныя метады, якія патрабуюць шмат часу і працы і могуць паставіць пад пагрозу марфалогію і структурную цэласнасць спермы. Аднак да гэтага часу не праводзілася даследаванняў уплыву вылучэнняў з палавых органаў курэй на рухомасць сперматазоідаў.
Незалежна ад механізму, які падтрымлівае сперму ў SST, многія даследчыкі назіралі, што рэзідэнтныя сперматазоіды аглютынуюць галава да галавы ў SST курэй 9, 10, перапёлак 2 і індыкоў 11, утвараючы аглютынаваныя пучкі спермы. Аўтары мяркуюць, што існуе сувязь паміж гэтай аглютынацыяй і працяглым захоўваннем сперматазоідаў у SST.
Тынгары і Лэйк12 паведамілі пра моцную сувязь паміж сперматазоідамі ў сперматазоіднай залозе курыцы і паставілі пад сумнеў, ці аглютынуюцца птушыныя сперматазоіды гэтак жа, як і сперматазоіды млекакормячых. Яны лічаць, што глыбокія сувязі паміж сперматазоідамі ў семявыносячай пратоцы могуць быць выкліканы стрэсам, выкліканым прысутнасцю вялікай колькасці сперматазоідаў у невялікай прасторы.
Пры ацэнцы паводзін сперматазоідаў на свежых падвешаных шкляных слайдах можна ўбачыць кароткачасовыя прыкметы аглютынацыі, асабліва па краях кропель спермы. Аднак аглютынацыя часта парушалася вярчальным дзеяннем, звязаным з бесперапынным рухам, што тлумачыць кароткачасовы характар ​​гэтай з'явы. Даследчыкі таксама заўважылі, што пры даданні разбаўляльніка ў сперму з'яўляліся падоўжаныя «ніткападобныя» агрэгаты клетак.
Раннія спробы імітаваць сперматазоід рабіліся шляхам выдалення тонкага дроту з вісячай кроплі, у выніку чаго з кроплі спермы выступаў падоўжаны сперматазоідны пузырчык. Сперматазоіды адразу ж выстраіліся паралельна ўнутры пузырка, але ўся адзінка хутка знікла з-за абмежавання 3D. Такім чынам, для вывучэння аглютынацыі сперматазоідаў неабходна назіраць за рухомасцю і паводзінамі сперматазоідаў непасрэдна ў ізаляваных канальчыках для захоўвання спермы, што цяжка дасягнуць. Такім чынам, неабходна распрацаваць прыбор, які імітуе сперматазоіды, для падтрымкі даследаванняў рухомасці і паводзін аглютынацыі сперматазоідаў. Брыляр і інш.13 паведамлялі, што сярэдняя даўжыня канальчыкаў для захоўвання спермы ў дарослых куранят складае 400–600 мкм, але некаторыя SST могуць дасягаць 2000 мкм. Меро і Агасавара14 падзялілі семявыносячыя залозы на павялічаныя і непавялічаныя канальцы для захоўвання спермы, якія мелі аднолькавую даўжыню (~500 мкм) і шырыню шыйкі (~38 мкм), але сярэдні дыяметр прасвету канальцаў складаў 56,6 і 56,6 мкм адпаведна 11,2 мкм. У дадзеным даследаванні мы выкарыстоўвалі мікрафлюідную прыладу з памерам канала 200 мкм × 20 мкм (Ш × В), папярочны перасек якой некалькі блізкі да папярочнага перасеку ўзмоцненага SST. Акрамя таго, мы вывучылі рухомасць спермы і яе аглютынацыйныя паводзіны ў праточнай вадкасці, што адпавядае гіпотэзе Формана аб тым, што вадкасць, якая выпрацоўваецца эпітэліяльнымі клеткамі SST, утрымлівае сперму ў прасвете ў супрацьтоку (рэалагічным) кірунку.
Мэтай гэтага даследавання было пераадолець праблемы назірання за рухомасцю сперматазоідаў у маткавай трубе і пазбегнуць цяжкасцей, звязаных з вывучэннем рэалогіі і паводзін сперматазоідаў у дынамічным асяроддзі. Была выкарыстана мікрафлюідная прылада, якая стварае гідрастатычны ціск для імітацыі рухомасці сперматазоідаў у палавых органах курыцы.
Калі ў мікраканальную прыладу загружалі кроплю разведзенага ўзору спермы (1:40), можна было вызначыць два тыпы рухомасці сперматазоідаў (ізаляваныя сперматазоіды і звязаныя сперматазоіды). Акрамя таго, сперматазоіды мелі тэндэнцыю плаваць супраць плыні (станоўчая рэалогія; відэа 1, 2). Нягледзячы на ​​тое, што хуткасць руху пучкоў сперматазоідаў была ніжэйшай, чым у адзінокіх сперматазоідаў (p < 0,001), яны павялічвалі працэнт сперматазоідаў з станоўчым рэатаксісам (p < 0,001; Табліца 2). Нягледзячы на ​​тое, што хуткасць руху пучкоў сперматазоідаў была ніжэйшай, чым у адзінокіх сперматазоідаў (p < 0,001), яны павялічвалі працэнт сперматазоідаў з станоўчым рэатаксісам (p < 0,001; Табліца 2). Хоць пучкі сперматозоидов мелі больш нізкую хуткасць, чым у адзіночных сперматозоидов (р <0,001), яны павялічвалі працэнт сперматозоидов, якія дэманструюць станоўчы рэатаксіс (р <0,001; табліца 2). Нягледзячы на ​​тое, што хуткасць руху пучкоў сперматазоідаў была ніжэйшай, чым хуткасць руху асобных сперматазоідаў (p < 0,001), яны павялічылі працэнт сперматазоідаў з станоўчым рэатаксісам (p < 0,001; Табліца 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001，但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0,001；表2）。尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001） ， 但 增加 了 显示 阳性 流变性 精子百分比 （p <0,001 ； 2。。。。。。）））)）) Хоць хуткасць сперматозоидов была ніжэй, чым у адзіночных сперматозоидов (р <0,001), яны павялічвалі працэнт сперматозоидов з станоўчай рэалогіяй (р <0,001; табліца 2). Нягледзячы на ​​тое, што хуткасць руху пучкоў сперматазоідаў была ніжэйшай, чым у асобных сперматазоідаў (p < 0,001), яны павялічылі працэнт сперматазоідаў з станоўчай рэалогіяй (p < 0,001; Табліца 2).Станоўчая рэалогія для адзінкавых сперматазоідаў і пучкоў ацэньваецца прыкладна ў 53% і 85% адпаведна.
Было заўважана, што сперматазоіды курэй шаркасі адразу пасля эякуляцыі ўтвараюць лінейныя пучкі, якія складаюцца з дзясяткаў асобін. Гэтыя пучкі з часам павялічваюцца ў даўжыні і таўшчыні і могуць заставацца in vitro на працягу некалькіх гадзін, перш чым рассейвацца (відэа 3). Гэтыя ніткападобныя пучкі маюць форму сперматазоідаў ехідны, якія ўтвараюцца ў канцы прыдатка яечка. Было выяўлена, што сперма курэй шаркасі мае высокую тэндэнцыю да аглютынацыі і ўтварэння сеткаватага пучка менш чым за адну хвіліну пасля збору. Гэтыя пучкі дынамічныя і здольныя прыліпаць да любых блізкіх сценак або статычных прадметаў. Нягледзячы на ​​тое, што пучкі спермы зніжаюць хуткасць сперматазоідаў, відавочна, што макраскапічна яны павялічваюць іх лінейнасць. Даўжыня пучкоў змяняецца ў залежнасці ад колькасці спермы, сабранай у пучках. Былі выдзелены дзве часткі пучка: пачатковая частка, якая ўключае свабодную галоўку аглютынаванага сперматазоіда, і тэрмінальная частка, якая ўключае хвост і ўвесь дыстальны канец сперматазоіда. З дапамогай хуткаснай камеры (950 кадраў у секунду) у пачатковай частцы пучка назіраліся свабодныя галоўкі аглютынаваных сперматазоідаў, якія дзякуючы свайму вагальнаму руху і прыцягвалі астатнія ў пучок па спіралі (відэа 4). Аднак у доўгіх пучках было заўважана, што некаторыя свабодныя галоўкі сперматазоідаў прыліплі да цела, а канцавая частка пучка дзейнічала як лопасці, дапамагаючы прасоўваць пучок.
Падчас павольнага патоку вадкасці пучкі сперматазоідаў рухаюцца паралельна адзін аднаму, аднак яны пачынаюць перакрывацца і прыліпаць да ўсяго, што нерухома, каб не быць змытымі бягучым патокам па меры павелічэння хуткасці патоку. Пучкі ўтвараюцца, калі некалькі сперматазоідаў набліжаюцца адзін да аднаго, яны пачынаюць рухацца сінхронна і абкручвацца адзін вакол аднаго, а затым прыліпаюць да ліпкага рэчыва. На малюнках 1 і 2 паказана, як сперматазоіды набліжаюцца адзін да аднаго, утвараючы стык, калі хвасты абкручваюцца адзін вакол аднаго.
Даследчыкі ўжылі гідрастатычны ціск для стварэння патоку вадкасці ў мікраканале з мэтай вывучэння рэалогіі спермы. Быў выкарыстаны мікраканал памерам 200 мкм × 20 мкм (Ш × В) і даўжынёй 3,6 мкм. Паміж кантэйнерамі выкарыстоўваліся мікраканалы са шпрыцамі, усталяванымі на канцах. Каб зрабіць каналы больш бачнымі, выкарыстоўваўся харчовы фарбавальнік.
Прымацуйце злучальныя кабелі і аксэсуары да сцяны. Відэа было знята з дапамогай фазава-кантрастнага мікраскопа. З кожным выявай прадстаўлены выявы фазава-кантрастнай мікраскапіі і картаграфаванне. (A) Злучэнне паміж двума патокамі супраціўляецца патоку з-за спіральнага руху (чырвоная стрэлка). (B) Злучэнне паміж пучком трубак і сценкай канала (чырвоныя стрэлкі), у той жа час яны злучаюцца з двума іншымі пучкамі (жоўтыя стрэлкі). (C) Пучкі спермы ў мікрафлюідным канале пачынаюць злучацца адзін з адным (чырвоныя стрэлкі), утвараючы сетку пучкоў спермы. (D) Утварэнне сеткі пучкоў спермы.
Калі кропля разведзенай спермы была загружана ў мікрафлюідную прыладу і быў створаны паток, назіралася, што пучок спермы рухаецца супраць кірунку патоку. Пучкі шчыльна прылягаюць да сценак мікраканалаў, а свабодныя галоўкі ў пачатковай частцы пучкоў шчыльна прылягаюць да іх (відэа 5). Яны таксама прыліпаюць да любых нерухомых часціц на сваім шляху, такіх як смецце, каб не быць знесенымі патокам. З часам гэтыя пучкі ператвараюцца ў доўгія ніткі, якія захопліваюць іншыя адзінкавыя сперматазоіды, і больш кароткія пучкі (відэа 6). Па меры таго, як паток пачынае запавольвацца, доўгія лініі спермы пачынаюць утвараць сетку ліній спермы (відэа 7; малюнак 2).
Пры высокай хуткасці патоку (V > 33 мкм/с) спіральныя рухі нітак павялічваюцца ў спробе злавіць мноства асобных сперматазоідаў, якія ўтвараюць пучкі, каб лепш супрацьстаяць дрэйфуючай сіле патоку. Пры высокай хуткасці патоку (V > 33 мкм/с) спіральныя рухі нітак павялічваюцца ў спробе злавіць мноства асобных сперматазоідаў, якія ўтвараюць пучкі, каб лепш супрацьстаяць дрэйфуючай сіле патоку. Пры высокай хуткасці патоку (V > 33 мкм/с) спіралевідныя руху нитей ўзмацняюцца, паколькі яны спрабуюць знайсці мноства асобных народкаў, якія ўтвараюць пучкі, якія лепш супрацьстаяць дрэйфуючай сіле патоку. Пры высокіх хуткасцях патоку (V > 33 мкм/с) спіральныя рухі нітак павялічваюцца, бо яны спрабуюць злавіць мноства асобных сперматазоідаў, утвараючы пучкі, якія лепш здольныя супраціўляцца дрэйфуючай сіле патоку.在高流速 (V > 33 мкм/с)时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成束的单个精子，从而更好地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 мкм/с) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形成 束 单 个 精子 ，从而 更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。 Пры вялікіх хуткасцях патоку (V > 33 мкм/с) спіральнае перамяшчэнне павялічваецца ў спробе захопу мноства асобных народкаў, якія ўтвараюць пучкі, каб лепш супрацьстаяць сіле патоку дрэйфа. Пры высокіх хуткасцях патоку (V > 33 мкм/с) спіральны рух нітак павялічваецца ў спробе захапіць мноства асобных сперматазоідаў, якія ўтвараюць пучкі, каб лепш супрацьстаяць сілам дрэйфу патоку.Яны таксама спрабавалі прымацаваць мікраканалы да бакавых сценак.
З дапамогай светлавой мікраскапіі (СМ) пучкі спермы былі ідэнтыфікаваны як кластары галовак спермы і завітых хвастоў. Пучкі спермы з рознымі агрэгатамі таксама былі ідэнтыфікаваны як скручаныя галоўкі і агрэгаты жгуцікаў, некалькі злітых хвастоў спермы, галоўкі спермы, прымацаваныя да хваста, і галоўкі спермы з выгнутымі ядрамі як некалькі злітых ядраў. Прасвечвальная электронная мікраскапія (ПЭМ). Сканіруючая электронная мікраскапія (СЭМ) паказала, што пучкі спермы былі пакрытымі абалонкай агрэгатамі галовак спермы, а агрэгаты спермы мелі прымацаваную сетку загорнутых хвастоў.
Марфалогія і ультраструктура сперматазоідаў, фарміраванне пучкоў сперматазоідаў вывучаліся з дапамогай светлавой мікраскапіі (палова зрэзу), сканіруючай электроннай мікраскапіі (СЭМ) і прасвечвальнай электроннай мікраскапіі (ПЭМ), мазкі спермы афарбоўваліся акрыдынавым аранжавым і даследаваліся з дапамогай эпіфлуарэсцэнтнай мікраскапіі.
Афарбоўка мазка спермы акрыдынавым аранжавым (мал. 3B) паказала, што галоўкі сперматазоідаў былі зліпаныя разам і пакрытыя сакрэторным матэрыялам, што прывяло да ўтварэння вялікіх пучкоў (мал. 3D). Пучкі сперматазоідаў складаліся з агрэгатаў сперматазоідаў з сеткай прымацаваных хвастоў (мал. 4A-C). Пучкі сперматазоідаў складаюцца з хвастоў многіх сперматазоідаў, зліпаных разам (мал. 4D). Сакрэты (мал. 4E,F) пакрывалі галоўкі пучкоў сперматазоідаў.
Фарміраванне пучка сперматазоідаў. Выкарыстанне фазава-кантрастнай мікраскапіі і мазкоў спермы, афарбаваных акрыдынавым аранжавым, паказала, што галоўкі сперматазоідаў зліпаюцца. (A) Ранняе фарміраванне пучкоў спермы пачынаецца з аднаго сперматазоіда (белы круг) і трох сперматазоідаў (жоўты круг), прычым спіраль пачынаецца ад хваста і заканчваецца на галоўцы. (B) Мікрафатаграфія мазка спермы, афарбаванага акрыдынавым аранжавым, на якой паказаны прымацаваныя галоўкі сперматазоідаў (стрэлкі). Вылучэнне пакрывае галоўку(-і). Павелічэнне × 1000. (C) Развіццё вялікага прамяня, які пераносіцца патокам у мікрафлюідным канале (з выкарыстаннем хуткаснай камеры з частатой 950 кадраў/с). (D) Мікрафатаграфія мазка спермы, афарбаванага акрыдынавым аранжавым, на якой паказаны вялікія пучкі (стрэлкі). Павелічэнне: ×200.
Мікрафатаграфія пучка спермы і мазка спермы, афарбаванага акрыдынавым аранжавым. (A, B, D, E) — лічбавыя каляровыя электронныя мікрафатаграфіі сперматазоідаў, а C і F — мікрафатаграфіі мазкоў спермы, афарбаваных акрыдынавым аранжавым, якія дэманструюць прымацаванне некалькіх сперматазоідаў, якія абгортваюць хваставую перапонку. (AC) Агрэгаты сперматазоідаў паказаны ў выглядзе сеткі прымацаваных хвастоў (стрэлкі). (D) Адгезія некалькіх сперматазоідаў (з клейкім рэчывам, ружовы контур, стрэлка), якія абгортваюцца вакол хваста. (E і F) Агрэгаты галовак сперматазоідаў (паказальнікі), пакрытыя клейкім матэрыялам (паказальнікамі). Сперматазоіды ўтварылі пучкі з некалькімі віхрападобнымі структурамі (F). Павелічэнне (C) ×400 і (F) ×200.
З дапамогай прасвечвальнай электроннай мікраскапіі мы выявілі, што пучкі сперматазоідаў мелі прымацаваныя хвасты (мал. 6A, C), галоўкі, прымацаваныя да хвастоў (мал. 6B), або галоўкі, прымацаваныя да хвастоў (мал. 6D). Галоўкі сперматазоідаў у пучку выгнутыя, на зрэзе прадстаўлены двума ядзернымі абласцямі (мал. 6D). У разрэзаным пучку сперматазоіды мелі скручаную галоўку з двума ядзернымі абласцямі і некалькімі жгуцікавымі абласцямі (мал. 5A).
Лічбавая каляровая электронная мікрафатаграфія, якая паказвае злучальныя хвасты ў пучку сперматазоідаў і аглютынуючы матэрыял, які злучае галоўкі сперматазоідаў. (A) Прымацаваны хвост вялікай колькасці сперматазоідаў. Звярніце ўвагу, як выглядае хвост у партрэтнай (стрэлка) і гарызантальнай (стрэлка) праекцыях. (B) Галоўка (стрэлка) сперматазоіда злучана з хвастом (стрэлка). (C) Прымацавана некалькі хвастоў сперматазоідаў (стрэлкі). (D) Аглютынацыйны матэрыял (AS, сіні) злучае чатыры галоўкі сперматазоідаў (фіялетавы).
Для выяўлення галовак сперматазоідаў у пучках сперматазоідаў, пакрытых вылучэннямі або мембранамі (малюнак 6B), выкарыстоўвалася сканіруючая электронная мікраскапія, што сведчыць аб тым, што пучкі сперматазоідаў былі замацаваны пазаклеткавым матэрыялам. Аглютынаваны матэрыял быў сканцэнтраваны ў галоўцы сперматазоіда (падобны на галаву медузы сход; мал. 5B) і пашыраны дыстальна, надаючы ярка-жоўты выгляд пад флуарэсцэнтнай мікраскапіяй пры афарбоўванні акрыдынавым аранжавым (мал. 6C). Гэта рэчыва добра бачна пад сканіруючым мікраскопам і лічыцца злучальнай рэчывай. Паўтонкія зрэзы (мал. 5C) і мазкі спермы, афарбаваныя акрыдынавым аранжавым, паказалі пучкі сперматазоідаў, якія змяшчалі шчыльна ўпакаваныя галоўкі і закручаныя хвасты (мал. 5D).
Розныя мікрафатаграфіі, якія паказваюць агрэгацыю галовак і хвастоў сперматазоідаў, атрыманыя рознымі метадамі. (A) Папярочны зрэз лічбавай каляровай электроннай мікрафатаграфіі пучка сперматазоідаў, на якой бачная скручаная галоўка сперматазоіда з двухчасткавым ядром (сіні колер) і некалькімі жгуцікавымі часткамі (зялёны колер). (B) Лічбавая каляровая сканіруючая электронная мікрафатаграфія, на якой бачная група галовак сперматазоідаў, падобных на медузы (стрэлкі), якія, здаецца, пакрытыя. (C) Паўтонкі зрэз, на якім бачныя агрэгаваныя галоўкі сперматазоідаў (стрэлкі) і закручаныя хвасты (стрэлкі). (D) Мікрафатаграфія мазка спермы, афарбаванага акрыдынавым аранжавым, на якой бачныя агрэгаты галовак сперматазоідаў (стрэлкі) і закручаныя прыліплыя хвасты (стрэлкі). Звярніце ўвагу, што галоўку сперматазоіда пакрывае клейкае рэчыва (S). (D) Павелічэнне × 1000.
З дапамогай прасвечвальнай электроннай мікраскапіі (мал. 7А) таксама было адзначана, што галоўкі сперматазоідаў былі скручаныя, а ядры мелі спіральную форму, што пацверджана мазкамі спермы, афарбаванымі акрыдынавым аранжавым і даследаванымі з дапамогай флуарэсцэнтнай мікраскапіі (мал. 7B).
(A) Лічбавая каляровая электронная мікрафатаграфія і (B) мазок спермы, афарбаваны акрыдынавым аранжавым, на якім бачныя спіральныя галоўкі і прымацаваныя галоўкі і хвасты сперматазоідаў (стрэлкі). (B) Павелічэнне × 1000.
Цікавым адкрыццём з'яўляецца тое, што сперматазоіды Шарказі агрэгуюцца, утвараючы рухомыя ніткападобныя пучкі. Уласцівасці гэтых пучкоў дазваляюць нам зразумець іх магчымую ролю ў паглынанні і захоўванні сперматазоідаў у SST.
Пасля спарвання сперматазоіды трапляюць у похву і праходзяць інтэнсіўны працэс адбору, у выніку чаго ў СМТ трапляе толькі абмежаваная колькасць сперматазоідаў15,16. На сённяшні дзень механізмы, з дапамогай якіх сперматазоіды трапляюць у СМТ і выходзяць з яго, незразумелыя. У птушак сперматазоіды захоўваюцца ў СМТ на працягу працяглага перыяду ад 2 да 10 тыдняў, у залежнасці ад віду6. Застаюцца спрэчкі адносна стану спермы падчас захоўвання ў СМТ. Ці знаходзяцца яны ў руху ці ў стане спакою? Іншымі словамі, як сперматазоіды так доўга захоўваюць сваё становішча ў СМТ?
Форман4 выказаў здагадку, што знаходжанне і выкідванне SST можна растлумачыць рухомасцю сперматазоідаў. Аўтары вылучаюць гіпотэзу, што сперматазоіды ўтрымліваюць сваё становішча, плаваючы супраць патоку вадкасці, створанага эпітэліем SST, і што сперматазоіды выкідваюцца з SST, калі іх хуткасць падае ніжэй за кропку, у якой яны пачынаюць рухацца назад з-за недахопу энергіі. Занібоні5 пацвердзіў наяўнасць аквапарынаў 2, 3 і 9 у апікальнай частцы эпітэліяльных клетак SST, што можа ўскосна падтрымліваць мадэль захоўвання спермы Формана. У бягучым даследаванні мы выявілі, што амаль палова сперматазоідаў Шаркашы дэманструе станоўчую рэалогію ў праточнай вадкасці, і што аглютынаваныя пучкі сперматазоідаў павялічваюць колькасць сперматазоідаў з станоўчай рэалогіяй, хоць аглютынацыя іх запавольвае. Як сперматазоіды рухаюцца па маткавай трубе птушкі да месца апладнення, да канца не вывучана. У млекакормячых фалікулярная вадкасць хемаатрактуе сперматазоіды. Аднак лічыцца, што хемаатрактанты накіроўваюць сперматазоіды на вялікія адлегласці7. Такім чынам, за транспарт спермы адказваюць іншыя механізмы. Паведамляецца, што здольнасць спермы арыентавацца і цячы супраць вадкасці, якая вылучаецца з маткавых труб пасля спарвання, з'яўляецца асноўным фактарам нацэльвання спермы ў мышэй. Паркер17 выказаў здагадку, што сперматазоіды перасякаюць яйцеводы, плаваючы супраць цыліярнага току ў птушак і рэптылій. Нягледзячы на ​​тое, што гэта не было эксперыментальна даказана ў птушак, Адольфі18 быў першым, хто выявіў, што птушыная сперма дае станоўчыя вынікі, калі тонкі пласт вадкасці паміж покрыўным шклом і прадметным шклом ствараецца з дапамогай палоскі фільтравальнай паперы. Рэалогія. Хіно і Янагімачы [19] змясцілі комплекс яечнікаў-труб-маткі мышы ў перфузійнае кольца і ўвялі 1 мкл чарнілаў у пярэсмык, каб візуалізаваць паток вадкасці ў маткавых трубах. Яны заўважылі вельмі актыўны рух скарачэння і расслаблення ў маткавай трубе, пры якім усе шарыкі чарнілаў пастаянна рухаліся да ампулы маткавай трубы. Аўтары падкрэсліваюць важнасць патоку трубнай вадкасці з ніжняй у верхнюю часткі маткавых труб для ўздыму і апладнення спермы. Брыляр20 паведаміў, што ў курэй і індыкоў сперматазоіды мігруюць шляхам актыўнага руху ад уваходу ў похву, дзе яны захоўваюцца, да маткава-похвавага злучэння, дзе яны захоўваюцца. Аднак гэта перамяшчэнне неабавязковае паміж маткава-похвавым злучэннем і варонкай, паколькі сперматазоіды транспартуюцца шляхам пасіўнага перамяшчэння. Ведаючы гэтыя папярэднія рэкамендацыі і вынікі, атрыманыя ў бягучым даследаванні, можна выказаць здагадку, што здольнасць сперматазоідаў рухацца ўверх па плыні (рэалогія) з'яўляецца адной з уласцівасцей, на якіх заснаваны працэс адбору. Гэта вызначае праходжанне сперматазоідаў праз похву і іх трапленне ў ЦКТ для захоўвання. Як выказаў здагадку Форман4, гэта таксама можа палегчыць працэс траплення сперматазоідаў у ПМТ і яго асяроддзе пражывання на пэўны перыяд часу, а затым выхаду, калі іх хуткасць пачынае запавольвацца.
З іншага боку, Мацудзакі і Сасанамі21 выказалі здагадку, што птушыныя сперматазоіды перажываюць змены рухомасці ад стану спакою да рухомасці ў мужчынскіх і жаночых палавых шляхах. Было прапанавана, што інгібіраванне рухомасці рэзідэнтных сперматазоідаў у SST тлумачыць працяглы час захоўвання спермы, а затым іх амаладжэнне пасля выхаду з SST. Ва ўмовах гіпаксіі Мацудзакі і інш.1 паведамлялі пра высокую выпрацоўку і вызваленне лактата ў SST, што можа прывесці да інгібіравання рухомасці рэзідэнтных сперматазоідаў. У гэтым выпадку важнасць рэалогіі спермы адлюстроўваецца ў адборы і паглынанні сперматазоідаў, а не ў іх захоўванні.
Характар ​​аглютынацыі сперматазоідаў лічыцца праўдападобным тлумачэннем працяглага перыяду захоўвання спермы ў прасвету маткавай трубы, паколькі гэта распаўсюджаная заканамернасць затрымкі спермы ў птушак2,22,23. Бакст і інш.2 заўважылі, што большасць сперматазоідаў прыліпалі адзін да аднаго, утвараючы пучковыя агрэгаты, і адзінкавыя сперматазоіды рэдка сустракаліся ў перапёлчыных ККМ. З іншага боку, Вэн і інш.24 назіралі больш раскіданых сперматазоідаў і менш пучкоў сперматазоідаў у прасвете маткавай трубы ў курэй. Зыходзячы з гэтых назіранняў, можна выказаць здагадку, што схільнасць да аглютынацыі сперматазоідаў адрозніваецца ў розных птушак і паміж сперматазоідамі ў адным і тым жа эякуляце. Акрамя таго, Ван Крэй і інш.9 выказалі здагадку, што выпадковая дысацыяцыя аглютынаваных сперматазоідаў адказная за паступовае пранікненне сперматазоідаў у прасвет маткавай трубы. Згодна з гэтай гіпотэзай, сперматазоіды з меншай здольнасцю да аглютынацыі павінны быць выгнаны з маткавай трубы першымі. У гэтым кантэксце здольнасць сперматазоідаў да аглютынацыі можа быць фактарам, які ўплывае на вынік канкурэнцыі сперматазоідаў у брудных птушак. Акрамя таго, чым даўжэй дысацыюецца аглютынаваны сперматазоід, тым даўжэй захоўваецца фертыльнасць.
Нягледзячы на ​​тое, што агрэгацыя сперматазоідаў і іх зліццё ў пучкі назіраліся ў некалькіх даследаваннях2,22,24, яны не былі падрабязна апісаны з-за складанасці іх кінематычнага назірання ў SST. Было зроблена некалькі спроб вывучыць аглютынацыю сперматазоідаў in vitro. Назіралася значная, але часовая агрэгацыя, калі тонкі дрот быў выдалены з кроплі насення, якая звісала. Гэта прыводзіць да таго, што з кроплі выступае падоўжаны бурбалка, які імітуе насенную залозу. З-за 3D-абмежаванняў і кароткага часу высыхання кропляй увесь блок хутка прыйшоў у заняпад9. У бягучым даследаванні, выкарыстоўваючы курэй Шаркашы і мікрафлюідныя чыпы, мы змаглі апісаць, як утвараюцца гэтыя пучкі і як яны рухаюцца. Пучкі сперматазоідаў утварыліся адразу пасля збору спермы і, як было выяўлена, рухаліся па спіралі, дэманструючы станоўчую рэалогію пры прысутнасці ў патоку. Акрамя таго, пры макраскапічным аглядзе назіралася павелічэнне лінейнасці рухомасці пучкоў сперматазоідаў у параўнанні з ізаляванымі сперматазоідамі. Гэта сведчыць аб тым, што аглютынацыя сперматазоідаў можа адбывацца да пранікнення SST, і што выпрацоўка сперматазоідаў не абмяжоўваецца невялікай плошчай з-за стрэсу, як меркавалася раней (Tingari і Lake12). Падчас утварэння пучка сперматазоіды плаваюць сінхронна, пакуль не ўтвараюць злучэнне, затым іх хвасты абкручваюцца адзін вакол аднаго, і галоўка сперматазоіда застаюцца свабоднымі, але хвост і дыстальная частка сперматазоіда склейваюцца ліпкім рэчывам. Такім чынам, свабодная галоўка звязкі адказвае за рух, цягнучы астатнюю частку звязкі. Сканіруючая электронная мікраскапія пучкоў сперматазоідаў паказала прымацаваныя галоўкі сперматазоідаў, пакрытыя вялікай колькасцю ліпкага матэрыялу, што сведчыць аб тым, што галоўкі сперматазоідаў былі прымацаваны ў пучках спакою, што магло адбыцца пасля дасягнення месца захоўвання (SST).
Калі мазок спермы афарбоўваюць акрыдынавым аранжавым, пад флуарэсцэнтным мікраскопам можна ўбачыць пазаклеткавы клейкі матэрыял вакол сперматазоідаў. Гэта рэчыва дазваляе пучкам сперматазоідаў прыліпаць і чапляцца за любыя навакольныя паверхні або часціцы, каб яны не дрэйфавалі разам з навакольным патокам. Такім чынам, нашы назіранні паказваюць ролю адгезіі сперматазоідаў у выглядзе рухомых пучкоў. Іх здольнасць плаваць супраць плыні і прыліпаць да бліжэйшых паверхняў дазваляе сперматазоідам даўжэй заставацца ў паверхні спермы.
Ротшыльд25 выкарыстаў гемацытаметрычную камеру для вывучэння размеркавання плаваючай спермы буйной рагатай жывёлы ў кроплі суспензіі, робячы мікрафотаздымкі праз камеру з вертыкальнай і гарызантальнай аптычнымі восямі мікраскопа. Вынікі паказалі, што сперматазоіды прыцягваюцца да паверхні камеры. Аўтары мяркуюць, што паміж спермай і паверхняй могуць існаваць гідрадынамічныя ўзаемадзеянні. Улічваючы гэта, а таксама здольнасць спермы курэй Шаркашы ўтвараць ліпкія пучкі, верагоднасць таго, што сперма будзе прыліпаць да сценкі SST і захоўвацца на працягу доўгага часу, можа павялічыць.
Бчэці і Афцэліу26 паведамілі, што глікакалікс сперматазоідаў неабходны для распазнавання і аглютынацыі гамет. Форман10 назіраў, што гідроліз α-гліказідных сувязяў у глікапратэін-глікаліпідных пакрыццях шляхам апрацоўкі птушынай спермы нейрамінідазай прыводзіць да зніжэння фертыльнасці без уплыву на рухомасць сперматазоідаў. Аўтары мяркуюць, што ўздзеянне нейрамінідазы на глікакалікс пагаршае секвестрацыю сперматазоідаў на маткава-вагінальным злучэнні, тым самым зніжаючы фертыльнасць. Іх назіранні не могуць ігнараваць магчымасць таго, што апрацоўка нейрамінідазай можа знізіць распазнаванне сперматазоідаў і яйкаклетак. Форман і Энгель10 выявілі, што фертыльнасць зніжалася, калі курэй апладнялі інтравагінальна спермай, апрацаванай нейрамінідазай. Аднак ЭКА са спермай, апрацаванай нейрамінідазай, не паўплывала на фертыльнасць у параўнанні з кантрольнай групай курэй. Аўтары прыйшлі да высновы, што змены ў глікапратэін-глікаліпідным пакрыцці вакол мембраны сперматазоіда зніжаюць здольнасць сперматазоідаў да апладнення, парушаючы секвестрацыю сперматазоідаў у маткава-вагінальным злучэнні, што, у сваю чаргу, павялічвае страту сперматазоідаў з-за хуткасці маткава-вагінальнага злучэння, але не ўплывае на распазнаванне сперматазоідаў і яйкаклетак.
У індыкоў Бакст і Баўчан 11 выявілі невялікія везікулы і фрагменты мембран у прасвете SST і назіралі, што некаторыя з гэтых гранул зліліся з мембранай сперматазоіда. Аўтары мяркуюць, што гэтыя ўзаемасувязі могуць спрыяць доўгатэрміноваму захоўванню сперматазоідаў у SST. Аднак даследчыкі не ўдакладнілі крыніцу гэтых часціц, ці вылучаюцца яны эпітэліяльнымі клеткамі CCT, выпрацоўваюцца і вылучаюцца мужчынскай рэпрадуктыўнай сістэмай, ці выпрацоўваюцца самімі сперматазоідамі. Акрамя таго, гэтыя часціцы адказваюць за аглютынацыю. Грютцнер і інш.27 паведамілі, што эпітэліяльныя клеткі прыдатка ... Рассейванне гэтых прамянёў звязана са стратай гэтага бялку.
У дадзеным даследаванні ультраструктурны аналіз з выкарыстаннем электроннай мікраскапіі паказаў, што сперматазоіды прыліплі да вялікай колькасці шчыльнага матэрыялу. Лічыцца, што гэтыя рэчывы адказваюць за аглютынацыю, якая кандэнсуецца паміж і вакол прыліплых галовак, але ў меншых канцэнтрацыях у хваставой вобласці. Мы мяркуем, што гэта аглютынуючае рэчыва вылучаецца з мужчынскай рэпрадуктыўнай сістэмы (прыдатка яйкаклеткі або семявыносячай пратокі) разам са спермай, паколькі мы часта назіраем аддзяленне спермы ад лімфы і спермальнай плазмы падчас эякуляцыі. Паведамлялася, што па меры праходжання птушыных сперматазоідаў праз прыдатак яйкаклеткі і семявыносячую пратоку яны перажываюць змены, звязаныя з паспяваннем, якія падтрымліваюць іх здольнасць звязваць бялкі і набываць глікапратэіны, звязаныя з плазматычнай лемай. Персістанцыя гэтых бялкоў на рэзідэнтных мембранах сперматазоідаў у SST сведчыць аб тым, што гэтыя бялкі могуць уплываць на набыццё стабільнасці мембран сперматазоідаў 30 і вызначаць іх фертыльнасць 31. Ахамад і інш.32 паведамлялі, што жыццяздольнасць сперматазоідаў, атрыманых з розных частак мужчынскай рэпрадуктыўнай сістэмы (ад яечкаў да дыстальных аддзелаў семявыносячай пратокі), паступова павялічвалася ў вадкіх умовах захоўвання, незалежна ад тэмпературы захоўвання, а жыццяздольнасць курэй таксама павялічваецца ў маткавых трубах пасля штучнага апладнення.
Пучкі спермы курэй шаркашы маюць іншыя характарыстыкі і функцыі, чым у іншых відаў, такіх як ехідны, качканосы, лясныя мышы, аленевыя пацукі і марскія свінкі. У курэй шаркасі ўтварэнне пучкоў спермы зніжала хуткасць іх плавання ў параўнанні з адзінкавымі сперматазоідамі. Аднак гэтыя пучкі павялічвалі працэнт рэалагічна станоўчых сперматазоідаў і павялічвалі здольнасць сперматазоідаў стабілізавацца ў дынамічным асяроддзі. Такім чынам, нашы вынікі пацвярджаюць папярэднюю здагадку аб тым, што аглютынацыя спермы ў SST звязана з працяглым захоўваннем спермы. Мы таксама выказваем гіпотэзу, што схільнасць спермы да ўтварэння пучкоў можа кантраляваць хуткасць страты спермы ў SST, што можа змяніць вынік канкурэнцыі спермы. Згодна з гэтым меркаваннем, сперматазоіды з нізкай здольнасцю да аглютынацыі першымі вызваляюць SST, у той час як сперматазоіды з высокай здольнасцю да аглютынацыі даюць большую частку нашчадкаў. Утварэнне аднапорных пучкоў спермы карысна і ўплывае на суадносіны бацькоў і дзяцей, але выкарыстоўвае іншы механізм. У ехідн і качканосаў сперматазоіды размешчаны паралельна адзін аднаму, каб павялічыць хуткасць руху прамяня. Пучкі ехідн рухаюцца прыкладна ў тры разы хутчэй, чым адзінкавыя сперматазоіды. Лічыцца, што ўтварэнне такіх пучкоў спермы ў ехідн з'яўляецца эвалюцыйнай адаптацыяй для падтрымання дамінавання, паколькі самкі неразборлівыя і звычайна спарваюцца з некалькімі самцамі. Такім чынам, сперматазоіды з розных эякулятаў люта канкуруюць за апладненне яйкаклеткі.
Аглютынаваныя сперматазоіды курэй шаркасі лёгка візуалізаваць з дапамогай фазава-кантрастнай мікраскапіі, што лічыцца перавагай, паколькі дазваляе лёгка вывучаць паводзіны сперматазоідаў in vitro. Механізм, з дапамогай якога ўтварэнне пучкоў спермы спрыяе размнажэнню ў курэй шаркасі, таксама адрозніваецца ад таго, які назіраецца ў некаторых плацэнтных млекакормячых, якія прадстаўляюць кааператыўную паводзіны сперматазоідаў, такіх як лясныя мышы, дзе некаторыя сперматазоіды дасягаюць яйкаклетак, дапамагаючы іншым роднасным асобінам дасягнуць і пашкодзіць іх яйкі. праявіць сябе. альтруістычныя паводзіны. Самаапладненне 34. Яшчэ адзін прыклад кааператыўнай паводзін сперматазоідаў быў знойдзены ў аленевых мышэй, дзе сперматазоіды змаглі ідэнтыфікаваць і аб'яднацца з найбольш генетычна роднаснымі сперматазоідамі і ўтвараць кааператыўныя групы, каб павялічыць сваю хуткасць у параўнанні з нероднаснымі сперматазоідамі35.
Вынікі, атрыманыя ў гэтым даследаванні, не супярэчаць тэорыі Фомана аб працяглым захоўванні сперматазоідаў у SWS. Даследчыкі паведамляюць, што сперматазоіды працягваюць рухацца ў патоку эпітэліяльных клетак, якія высцілаюць SST, на працягу доўгага перыяду часу, і праз пэўны прамежак часу запасы энергіі сперматазоідаў высільваюцца, што прыводзіць да зніжэння хуткасці, што дазваляе выкідваць рэчывы з малой малекулярнай масай разам з патокам вадкасці з прасвету SST у поласць маткавай трубы. У дадзеным даследаванні мы назіралі, што палова асобных сперматазоідаў прадэманстравала здольнасць плаваць супраць патоку вадкасці, а іх адгезія ў пучку павялічыла іх здольнасць дэманстраваць станоўчую рэалогію. Акрамя таго, нашы дадзеныя адпавядаюць дадзеным Мацудзакі і інш. 1, якія паведамлялі, што павышаная сакрэцыя лактата ў SST можа інгібіраваць рухомасць рэзідэнтных сперматазоідаў. Аднак нашы вынікі апісваюць утварэнне рухомых звязкаў сперматазоідаў і іх рэалагічныя паводзіны ў прысутнасці дынамічнага асяроддзя ўнутры мікраканала ў спробе высветліць іх паводзіны ў SST. Будучыя даследаванні могуць быць сканцэнтраваны на вызначэнні хімічнага складу і паходжання аглютынуючага агента, што, несумненна, дапаможа даследчыкам распрацаваць новыя спосабы захоўвання вадкай спермы і павялічыць працягласць фертыльнасці.
У якасці донараў спермы для даследавання былі адабраны пятнаццаць 30-тыднёвых самцоў шаркасі без шыі (гамазіготная дамінантная; NaNa). Птушкі вырошчваліся на даследчай птушкаферме факультэта сельскай гаспадаркі Універсітэта Ашыт, правінцыя Ашыт, Егіпет. Птушкі размяшчаліся ў асобных клетках (30 х 40 х 40 см), падвяргаліся светлавой праграме (16 гадзін святла і 8 гадзін цемры) і карміліся рацыёнам, які змяшчаў 160 г сырога бялку, 2800 ккал метабалізаванай энергіі, 35 г кальцыя на чалавека, 5 грамаў даступнага фосфару на кілаграм рацыёну.
Згодна з дадзенымі 36, 37, сперма ў самцоў была сабрана шляхам масажу жывата. Усяго на працягу 3 дзён было сабрана 45 узораў спермы ў 15 мужчын. Сперма (n = 15/дзень) была неадкладна разведзена ў суадносінах 1:1 (аб'ём:аб'ём) разбаўляльнікам для спермы птушкі Belsville, які змяшчае дыфасфат калію (1,27 г), глутамат натрыю моногідрат (0,867 г), фруктозу (0,5 г), бязводны ацэтат натрыю (0,43 г), трыс(гідраксіметыл)амінаметан (0,195 г), цытрат калію моногідрат (0,064 г), монафасфат калію (0,065 г), хларыд магнію (0,034 г) і H2O (100 мл), pH = 7,5, асмалярнасць 333 мОсм/кг38. Разведзеныя ўзоры спермы спачатку даследавалі пад светлавым мікраскопам, каб пераканацца ў добрай якасці спермы (вільготнасці), а затым захоўвалі ў вадзяной лазні пры тэмпературы 37°C да выкарыстання на працягу паўгадзіны пасля збору.
Кінематыка і рэалогія сперматазоідаў апісаны з выкарыстаннем сістэмы мікрафлюідных прылад. Узоры спермы былі дадаткова разведзены да 1:40 у разбаўляльніку для спермы птушак Beltsville, загружаны ў мікрафлюідную прыладу (гл. ніжэй), а кінетычныя параметры вызначаліся з выкарыстаннем сістэмы камп'ютарызаванага аналізу спермы (CASA), раней распрацаванай для мікрафлюіднай характарыстыкі. Плагін улічваў рухомасць сперматазоідаў у вадкіх асяроддзях (Кафедра машынабудавання, Інжынерны факультэт, Універсітэт Асюта, Егіпет). Плагін можна спампаваць па адрасе: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Былі вымераны хуткасць крывой (VCL, мкм/с), лінейная хуткасць (VSL, мкм/с) і сярэдняя хуткасць траекторыі (VAP, мкм/с). Відэа сперматазоідаў былі зняты з дапамогай інвертаванага фазава-кантрастнага мікраскопа Optika XDS-3 (з аб'ектывам 40x), падлучанага да камеры Tucson ISH1000, з частатой 30 кадраў у секунду на працягу 3 секунд. Выкарыстоўвайце праграмнае забеспячэнне CASA для вывучэння як мінімум трох абласцей і 500 траекторый сперматазоідаў на ўзор. Запісанае відэа было апрацавана з дапамогай самаробнага CASA. Вызначэнне рухомасці ў плагіне CASA заснавана на хуткасці плавання сперматазоідаў у параўнанні з хуткасцю патоку і не ўключае іншыя параметры, такія як рух з боку ў бок, бо гэта аказалася больш надзейным пры патоку вадкасці. Рэалагічны рух апісваецца як рух сперматазоідаў супраць кірунку патоку вадкасці. Колькасць рухомых сперматазоідаў дзялілася на колькасць рухомых сперматазоідаў; сперматазоіды, якія знаходзіліся ў стане спакою, і сперматазоіды, якія рухаліся канвектыўна, былі выключаны з падліку.
Усе выкарыстаныя хімічныя рэчывы былі атрыманы ад Elgomhoria Pharmaceuticals (Каір, Егіпет), калі не пазначана іншае. Прылада была выраблена, як апісана Эль-Шэры і інш. 40 з некаторымі мадыфікацыямі. Матэрыялы, якія выкарыстоўваліся для вырабу мікраканалаў, уключалі шкляныя пласціны (Howard Glass, Вустэр, Масачусэтс), негатыўны рэзіст SU-8-25 (MicroChem, Ньютан, Каліфорнія), дыацэтонавы спірт (Sigma Aldrich, Штайнхайм, Германія) і поліацэтон 1-184, Dow Corning, Мідленд, Мічыган). Мікраканалы вырабляюцца з выкарыстаннем мяккай літаграфіі. Спачатку празрыстая ахоўная маска для твару з патрэбным дызайнам мікраканала была надрукавана на прынтары высокага разрознення (Prismatic, Каір, Егіпет і Pacific Arts and Design, Маркхэм, Антарыё). Майстры былі зроблены з выкарыстаннем шкляных пласцін у якасці падкладак. Пласціны былі ачышчаны ў ацэтоне, ізапрапаноле і дэіянізаванай вадзе, а затым пакрыты пластом SU8-25 таўшчынёй 20 мкм шляхам кручэння (3000 абаротаў у хвіліну, 1 хвіліна). Затым пласты SU-8 акуратна высушылі (65°C, 2 хвіліны і 95°C, 10 хвілін) і падвергнулі ўздзеянню УФ-выпраменьвання на працягу 50 секунд. Пасля экспазіцыі прапалілі пры тэмпературы 65°C і 95°C на працягу 1 хвіліны і 4 хвілін для зшывання адкрытых пластоў SU-8, а затым праявілі ў дыацэтонавым спірце на працягу 6,5 хвілін. Вафлі прапалілі ў цвёрдай фазе (200°C на працягу 15 хвілін) для далейшага зацвярдзення пласта SU-8.
ПДМС быў падрыхтаваны шляхам змешвання монамера і ацвярджальніка ў суадносінах па вазе 10:1, затым дэгазаваны ў вакуумным эксікатары і выліты на асноўную раму SU-8. ПДМС быў зацвярдзелы ў печы (120°C, 30 хвілін), пасля чаго каналы былі выразаны, аддзелены ад галоўнага матэрыялу і перфараваны, каб дазволіць прымацаванне трубак да ўваходу і выхаду мікраканала. Нарэшце, мікраканалы ПДМС былі канчаткова прымацаваны да прадметных шклаў з дапамогай партатыўнага кароннага працэсара (Electro-Technic Products, Чыкага, Ілінойс), як апісана ў іншым месцы. Мікраканал, які выкарыстоўваўся ў гэтым даследаванні, мае памеры 200 мкм × 20 мкм (Ш × В) і даўжыню 3,6 см.
Паток вадкасці, выкліканы гідрастатычным ціскам унутры мікраканала, дасягаецца шляхам падтрымання ўзроўню вадкасці ва ўваходным рэзервуары вышэй за розніцу вышынь Δh39 у выхадным рэзервуары (мал. 1).
дзе f — каэфіцыент трэння, які вызначаецца як f = C/Re для ламінарнага патоку ў прамавугольным канале, дзе C — пастаянная велічыня, якая залежыць ад суадносін падоўжнасці канала, L — даўжыня мікраканала, Vav — сярэдняя хуткасць унутры мікраканала, Dh — гідраўлічны дыяметр канала, g — паскарэнне свабоднага падзелу. Выкарыстоўваючы гэтае ўраўненне, сярэднюю хуткасць канала можна разлічыць з дапамогай наступнага ўраўнення: