Ďakujeme za návštevu stránky Nature.com. Verzia prehliadača, ktorú používate, má obmedzenú podporu CSS. Pre dosiahnutie čo najlepšieho zážitku odporúčame používať aktualizovaný prehliadač (alebo vypnúť režim kompatibility v prehliadači Internet Explorer). Medzitým budeme stránku vykresľovať bez štýlov a JavaScriptu, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu.
Plodnosť vtákov závisí od ich schopnosti uchovávať dostatok životaschopných spermií dlhší čas v zásobných kanálikoch spermií (SST). Presný mechanizmus, akým spermie vstupujú do SST, zdržiavajú sa v ňom a opúšťajú ho, zostáva kontroverzný. Spermie sliepok šarkasi vykazovali vysoký sklon k aglutinácii, pričom tvorili mobilné vláknité zväzky obsahujúce veľa buniek. Vzhľadom na ťažkosti s pozorovaním pohyblivosti a správania spermií v nepriehľadnom vajcovode sme na štúdium aglutinácie a pohyblivosti spermií použili mikrofluidné zariadenie s prierezom mikrokanálikov podobným prierezu spermií. Táto štúdia sa zaoberá tým, ako sa zväzky spermií tvoria, ako sa pohybujú a ich možnou úlohou pri predlžovaní pobytu spermií v SST. Skúmali sme rýchlosť spermií a reologické správanie, keď bol tok tekutiny generovaný v mikrofluidnom kanáli hydrostatickým tlakom (prietok = 33 µm/s). Spermie majú tendenciu plávať proti prúdu (pozitívna reológia) a rýchlosť zväzku spermií je výrazne znížená v porovnaní s jednotlivými spermiami. Bolo pozorované, že zväzky spermií sa pohybujú špirálovito a zväčšujú sa na dĺžke a hrúbke, keď sa do nich zapája viac jednotlivých spermií. Bolo pozorované, ako sa zväzky spermií približujú a priľnú k bočným stenám mikrofluidných kanálov, aby sa predišlo ich strhnutiu rýchlosťou prúdenia tekutiny > 33 µm/s. Bolo pozorované, ako sa zväzky spermií približujú a priľnú k bočným stenám mikrofluidných kanálov, aby sa predišlo ich strhnutiu rýchlosťou prúdenia tekutiny > 33 µm/s. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к бостовынм микрофлюидных каналов, чтобы избежать сметания со скоростью потока жидкости> 3сти> Bolo pozorované, že zväzky spermií sa približujú a priľnú k bočným stenám mikrofluidných kanálov, aby sa zabránilo ich strhnutiu pri prietokoch tekutiny > 33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流佫赁速> 33 怟流速> s33 µm/s 扫过. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к бостовынм микрожидкостного канала, чтобы избежать сметания потоком жидкости со скорост3ь >. Bolo pozorované, že zväzky spermií sa približujú a priľnú k bočným stenám mikrofluidného kanála, aby sa vyhli ich strhnutiu prúdom tekutiny rýchlosťou > 33 µm/s.Skenovacia a transmisná elektrónová mikroskopia odhalila, že zväzky spermií boli podopreté bohatým hustým materiálom. Získané údaje preukazujú jedinečnú mobilitu spermií kurčiat Sharkazi, ako aj schopnosť spermií aglutinovať a tvoriť mobilné zväzky, čo prispieva k lepšiemu pochopeniu dlhodobého skladovania spermií v SMT.
Aby sa u ľudí a väčšiny zvierat dosiahlo oplodnenie, spermie a vajíčka musia doraziť na miesto oplodnenia v správnom čase. Preto musí k páreniu dôjsť pred ovuláciou alebo v čase nej. Na druhej strane, niektoré cicavce, ako sú psy, ako aj necicavčie druhy, ako je hmyz, ryby, plazy a vtáky, uchovávajú spermie vo svojich reprodukčných orgánoch dlhší čas, kým ich vajíčka nie sú pripravené na oplodnenie (asynchrónne oplodnenie 1 ). Vtáky si dokážu udržať životaschopnosť spermií schopných oplodniť vajíčka 2 – 10 týždňov2.
Toto je jedinečná vlastnosť, ktorá odlišuje vtáky od iných zvierat, pretože poskytuje vysokú pravdepodobnosť oplodnenia po jednorazovej inseminácii počas niekoľkých týždňov bez súčasného párenia a ovulácie. Hlavný orgán na ukladanie spermií, nazývaný spermioakumulačný tubul (SST), sa nachádza vo vnútorných slizničných záhyboch na uterovaginálnom prechode. Doteraz nie sú úplne objasnené mechanizmy, ktorými spermie vstupujú do banky spermií, zdržiavajú sa v nej a vystupujú z nej. Na základe predchádzajúcich štúdií bolo predložených mnoho hypotéz, ale žiadna z nich nebola potvrdená.
Forman4 predpokladal, že spermie si udržiavajú svoje miesto v dutine SST prostredníctvom neustáleho oscilačného pohybu proti smeru prúdenia tekutiny cez proteínové kanály umiestnené na epitelových bunkách SST (reológia). ATP sa vyčerpáva v dôsledku neustálej bičíkovej aktivity potrebnej na udržanie spermií v lúmene SST a ich motilita nakoniec klesá, až kým spermie nie sú prúdom tekutiny vynesené zo spermiovej banky a nezačnú novú cestu vzostupným vajcovodom, aby oplodnili spermiu. Vajíčko (Forman4). Tento model ukladania spermií je podporený detekciou akvapořínov 2, 3 a 9 prítomných v epitelových bunkách SST pomocou imunocytochémie. Doteraz chýbajú štúdie o reológii kuracích spermií a ich úlohe v ukladaní SST, vaginálnom výbere spermií a konkurencii spermií. U kurčiat vstupujú spermie do vagíny po prirodzenom párení, ale viac ako 80 % spermií je z vagíny vyvrhnutých krátko po párení. To naznačuje, že vagína je primárnym miestom pre výber spermií u vtákov. Okrem toho sa uvádza, že menej ako 1 % spermií oplodnených vo vagíne končí v SST2. Pri umelom oplodnení kurčiat vo vagíne má počet spermií dosiahnutých SST tendenciu zvyšovať sa 24 hodín po oplodnení. Mechanizmus výberu spermií počas tohto procesu nie je doteraz jasný a pohyblivosť spermií môže zohrávať dôležitú úlohu v príjme spermií v SST. Vzhľadom na hrubé a nepriehľadné steny vajcovodov je ťažké priamo monitorovať pohyblivosť spermií vo vajcovodoch vtákov. Preto nám chýbajú základné poznatky o tom, ako spermie po oplodnení prechádzajú do SST.
Reológia bola nedávno uznaná ako dôležitý faktor riadiaci transport spermií v genitáliách cicavcov. Na základe schopnosti pohyblivých spermií migrovať v protiprúde, Zaferani a kol.8 použili mikrofluidný systém Corra na pasívnu izoláciu pohyblivých spermií zo vzoriek spermií. Tento typ triedenia spermií je nevyhnutný pre liečbu neplodnosti a klinický výskum a je uprednostňovaný pred tradičnými metódami, ktoré sú časovo a prácne náročné a môžu ohroziť morfológiu a štrukturálnu integritu spermií. Doteraz však neboli vykonané žiadne štúdie o vplyve sekrétov z genitálií kurčiat na pohyblivosť spermií.
Bez ohľadu na mechanizmus, ktorý udržiava spermie uložené v SST, mnohí výskumníci pozorovali, že rezidentné spermie aglutinujú hlava na hlavu v SST kurčiat 9, 10, prepelíc 2 a moriek 11 za vzniku aglutinovaných zväzkov spermií. Autori naznačujú, že existuje súvislosť medzi touto aglutináciou a dlhodobým skladovaním spermií v SST.
Tingari a Lake12 zaznamenali silnú súvislosť medzi spermiami v žľaze prijímajúcej spermie u kurčiat a spochybnili, či vtáčie spermie aglutinujú rovnakým spôsobom ako spermie cicavcov. Domnievajú sa, že hlboké prepojenie medzi spermiami v semenovode môže byť spôsobené stresom spôsobeným prítomnosťou veľkého počtu spermií v malom priestore.
Pri hodnotení správania spermií na čerstvo zavesených podložných sklíčkach možno pozorovať prechodné známky aglutinácie, najmä na okrajoch kvapôčok spermií. Aglutinácia však bola často narušená rotačným pôsobením spojeným s neustálym pohybom, čo vysvetľuje prechodnú povahu tohto javu. Výskumníci si tiež všimli, že po pridaní riedidla do spermií sa objavili predĺžené „vláknité“ bunkové agregáty.
Prvé pokusy o napodobnenie spermie sa uskutočnili odstránením tenkého drôtu z visiacej kvapky, čo viedlo k predĺženému spermii podobnému vezikulu vyčnievajúcemu z kvapky spermií. Spermie sa okamžite zoradili paralelne vo vezikule, ale celá jednotka rýchlo zmizla kvôli 3D obmedzeniu. Preto je na štúdium aglutinácie spermií potrebné pozorovať pohyblivosť a správanie spermií priamo v izolovaných zásobných tubuloch spermií, čo je ťažké dosiahnuť. Preto je potrebné vyvinúť prístroj, ktorý napodobňuje spermie na podporu štúdií pohyblivosti a aglutinačného správania spermií. Brillard a kol.13 uviedli, že priemerná dĺžka zásobných tubulov spermií u dospelých kurčiat je 400 – 600 µm, ale niektoré SST môžu byť dlhé až 2 000 µm. Mero a Ogasawara14 rozdelili semenné žľazy na zväčšené a nezväčšené tubuly na ukladanie spermií, pričom obe mali rovnakú dĺžku (~500 µm) a šírku krčka (~38 µm), ale priemerný priemer lúmenu tubulov bol 56,6 a 56,6 µm, teda 11,2 μm. V tejto štúdii sme použili mikrofluidné zariadenie s veľkosťou kanála 200 µm × 20 µm (Š × V), ktorého prierez je trochu blízky prierezu amplifikovaného SST. Okrem toho sme skúmali pohyblivosť spermií a ich aglutinačné správanie v prúdiacej tekutine, čo je v súlade s Foremanovou hypotézou, že tekutina produkovaná epitelovými bunkami SST udržiava spermie v lúmene v protiprúdovom (reologickom) smere.
Cieľom tejto štúdie bolo prekonať problémy s pozorovaním pohyblivosti spermií vo vajíčkovode a vyhnúť sa ťažkostiam spojeným so štúdiom reológie a správania spermií v dynamickom prostredí. Bolo použité mikrofluidné zariadenie, ktoré vytvára hydrostatický tlak na simuláciu pohyblivosti spermií v genitáliách kurčaťa.
Keď sa do mikrokanálového zariadenia pridala kvapka zriedenej vzorky spermií (1:40), bolo možné identifikovať dva typy pohyblivosti spermií (izolované spermie a viazané spermie). Okrem toho mali spermie tendenciu plávať proti prúdu (pozitívna reológia; video 1, 2). Hoci zväzky spermií mali nižšiu rýchlosť ako rýchlosť osamelých spermií (p < 0,001), zvýšili percento spermií vykazujúcich pozitívnu reotaxiu (p < 0,001; tabuľka 2). Hoci zväzky spermií mali nižšiu rýchlosť ako rýchlosť osamelých spermií (p < 0,001), zvýšili percento spermií vykazujúcich pozitívnu reotaxiu (p < 0,001; tabuľka 2). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных стоперм 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов, демонстрирующих (положительный; 1с ре, 0,001 ремонстрирующих TABLIца 2). Hoci zväzky spermií mali nižšiu rýchlosť ako rýchlosť jednotlivých spermií (p < 0,001), zvýšili percento spermií vykazujúcich pozitívnu reotaxiu (p < 0,001; tabuľka 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0,001；表2）。尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001） ， 但 增加 了 增加 了 显态 昳显社 显性 昀百分比 （p <0,001 ； 2。。。。。。）））））） Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматовозоидов, <0,010, сперматовозоидов увеличивали процент сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Hoci rýchlosť zväzkov spermií bola nižšia ako rýchlosť jednotlivých spermií (p < 0,001), zvýšili percento spermií s pozitívnou reológiou (p < 0,001; tabuľka 2).Pozitívna reológia pre jednotlivé spermie a chumáče sa odhaduje na približne 53 %, respektíve 85 %.
Bolo pozorované, že spermie kurčiat sharkasi bezprostredne po ejakulácii tvoria lineárne zväzky pozostávajúce z desiatok jedincov. Tieto chumáče sa časom zväčšujú a zhrubujú a môžu zostať in vitro niekoľko hodín predtým, ako sa rozptýlia (video 3). Tieto vláknité zväzky majú tvar spermií echidny, ktoré sa tvoria na konci nadsemenníka. Zistilo sa, že spermie sliepok sharkashi majú vysokú tendenciu aglutinovať a tvoriť retikulárny zväzok za menej ako jednu minútu po odbere. Tieto lúče sú dynamické a dokážu sa prilepiť na akékoľvek blízke steny alebo statické predmety. Hoci zväzky spermií znižujú rýchlosť spermií, je zrejmé, že makroskopicky zvyšujú ich linearitu. Dĺžka zväzkov sa líši v závislosti od počtu spermií zozbieraných vo zväzkoch. Izolovali sa dve časti zväzku: počiatočná časť vrátane voľnej hlavy aglutinovanej spermie a terminálna časť vrátane chvosta a celého distálneho konca spermie. Pomocou vysokorýchlostnej kamery (950 fps) boli v počiatočnej časti zväzku pozorované voľné hlavičky aglutinovaných spermií, ktoré boli zodpovedné za pohyb zväzku vďaka svojmu oscilačnému pohybu a zvyšné spermie ťahali do zväzku špirálovým pohybom (Video 4). Avšak v dlhých chumáčoch sa pozorovalo, že niektoré voľné hlavičky spermií priľnuli k telu a koncová časť chumáča fungovala ako lopatky, ktoré pomáhali poháňať chumáč.
V pomalom prúdení tekutiny sa zväzky spermií pohybujú rovnobežne vedľa seba, no začnú sa prekrývať a prilepia sa na všetko, čo stojí, aby ich prúdenie neodplavilo so zvyšujúcou sa rýchlosťou prúdenia. Zväzky sa vytvoria, keď sa k sebe priblíži niekoľko spermií, začnú sa pohybovať synchrónne a ovíjať sa okolo seba a potom sa prilepia na lepkavú látku. Obrázky 1 a 2 znázorňujú, ako sa spermie približujú a vytvárajú spojenie, keď sa ich chvosty ovíjajú okolo seba.
Výskumníci aplikovali hydrostatický tlak na vytvorenie prúdenia tekutiny v mikrokanáliku s cieľom študovať reológiu spermií. Použil sa mikrokanál s rozmermi 200 µm × 20 µm (Š × V) a dĺžkou 3,6 µm. Medzi nádobami boli použité mikrokanály s pripevnenými striekačkami na koncoch. Na zvýšenie viditeľnosti kanálov sa použilo potravinárske farbivo.
Pripevnite prepojovacie káble a príslušenstvo k stene. Video bolo nasnímané fázovo kontrastným mikroskopom. Ku každému snímku sú prezentované snímky fázovo kontrastnej mikroskopie a mapovacie snímky. (A) Spojenie medzi dvoma prúdmi kladie odpor prúdeniu v dôsledku špirálového pohybu (červená šípka). (B) Spojenie medzi zväzkom rúrok a stenou kanála (červené šípky), zároveň sú spojené s dvoma ďalšími zväzkami (žlté šípky). (C) Zväzky spermií v mikrofluidnom kanáli sa začínajú navzájom spájať (červené šípky) a vytvárajú sieť zväzkov spermií. (D) Tvorba siete zväzkov spermií.
Keď sa do mikrofluidného zariadenia vložila kvapka zriedených spermií a vytvoril sa prúd, pozorovalo sa, že lúč spermií sa pohybuje proti smeru prúdenia. Zväzky tesne priliehajú k stenám mikrokanálikov a voľné hlavy v počiatočnej časti zväzkov tesne priliehajú k nim (video 5). Tiež sa prilepia na akékoľvek stacionárne častice v ich ceste, ako sú napríklad nečistoty, aby odolali strhnutiu prúdom. Postupom času sa tieto chumáče premenia na dlhé vlákna zachytávajúce iné jednotlivé spermie a kratšie chumáče (video 6). Ako sa tok začína spomaľovať, dlhé rady spermií začnú tvoriť sieť línií spermií (video 7; obrázok 2).
Pri vysokej rýchlosti prúdenia (V > 33 µm/s) sa špirálové pohyby vlákien zvyšujú v snahe zachytiť veľa jednotlivých zväzkov spermií, ktoré lepšie odolávajú unášacej sile prúdenia. Pri vysokej rýchlosti prúdenia (V > 33 µm/s) sa špirálové pohyby vlákien zvyšujú v snahe zachytiť veľa jednotlivých zväzkov spermií, ktoré lepšie odolávajú unášacej sile prúdenia. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиьливаютоско, пытаются поймать множество отдельных сперматозоидов, образующих пучорые коуторые противостоят дрейфующей силе потока. Pri vysokých prietokoch (V > 33 µm/s) sa špirálové pohyby vlákien zvyšujú, pretože sa snažia zachytiť veľa jednotlivých spermií a tvoriť zväzky, ktoré sú lepšie schopné odolávať unášacej sile prúdenia.在高流速 (V > 33 µm/s)时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成束的单个精子，从而更好地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形刐 杸丟 单从而 更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。. При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увелитытейваетсопе захватить множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, чтобры луьчтобры силам дрейфа потока. Pri vysokých prietokoch (V > 33 µm/s) sa špirálový pohyb vlákien zvyšuje v snahe zachytiť veľa jednotlivých spermií, ktoré tvoria zväzky, aby lepšie odolávali driftovým silám prúdenia.Taktiež sa pokúsili pripevniť mikrokanáliky na bočné steny.
Zväzky spermií boli identifikované ako zhluky hlavičiek spermií a stočených chvostíkov pomocou svetelnej mikroskopie (LM). Zväzky spermií s rôznymi agregátmi boli tiež identifikované ako skrútené hlavičky a bičíkové agregáty, viacnásobné zrastené chvostíky spermií, hlavičky spermií pripojené k chvostíku a hlavičky spermií s ohnutými jadrami ako viacnásobné zrastené jadrá. transmisná elektrónová mikroskopia (TEM). Skenovacia elektrónová mikroskopia (SEM) ukázala, že zväzky spermií boli obalené agregáty hlavičiek spermií a agregáty spermií vykazovali pripojenú sieť omotaných chvostíkov.
Morfológia a ultraštruktúra spermií, tvorba zväzkov spermií boli študované pomocou svetelnej mikroskopie (polovičný rez), skenovacej elektrónovej mikroskopie (SEM) a transmisnej elektrónovej mikroskopie (TEM), nátery spermií boli farbené akridínovou oranžovou a skúmané pomocou epifluorescenčnej mikroskopie.
Farbenie spermií akridínovou oranžovou (obr. 3B) ukázalo, že hlavičky spermií boli zlepené a pokryté sekrečným materiálom, čo viedlo k tvorbe veľkých chumáčov (obr. 3D). Zväzky spermií pozostávali z agregátov spermií so sieťou pripojených chvostíkov (obr. 4A-C). Zväzky spermií sa skladajú z chvostíkov mnohých spermií zlepených dohromady (obr. 4D). Sekrety (obr. 4E,F) pokrývali hlavičky zväzkov spermií.
Tvorba zväzku spermií Pomocou fázovo kontrastnej mikroskopie a náterov spermií zafarbených akridínovou oranžovou sa ukázalo, že hlavičky spermií sa držia pohromade. (A) Skorá tvorba trsov spermií začína jednou spermiou (biely kruh) a tromi spermiami (žltý kruh), pričom špirála začína na chvoste a končí na hlavičke. (B) Mikrofotografia náteru spermií zafarbeného akridínovou oranžovou zobrazujúca priľnuté hlavičky spermií (šípky). Výboj pokrýva hlavičku(-y). Zväčšenie × 1000. (C) Vývoj veľkého lúča transportovaného prúdením v mikrofluidnom kanáli (pomocou vysokorýchlostnej kamery pri 950 fps). (D) Mikrofotografia náteru spermií zafarbeného akridínovou oranžovou zobrazujúca veľké trsy (šípky). Zväčšenie: ×200.
Skenovací elektrónový mikroskop spermií a náter spermií zafarbený akridínovou oranžovou. (A, B, D, E) sú digitálne farebné skenovacie elektrónové mikroskopy spermií a C a F sú mikrofotografie náterov spermií zafarbených akridínovou oranžovou, ktoré zobrazujú prichytenie viacerých spermií obaľujúcich chvostovú membránu. (AC) Agregáty spermií sú zobrazené ako sieť pripojených chvostíkov (šípky). (D) Adhézia niekoľkých spermií (s lepiacou látkou, ružový obrys, šípka) obaľujúcich chvost. (E a ​​F) Agregáty hlavičiek spermií (ukazovatele) pokryté lepivým materiálom (ukazovatele). Spermie tvorili zväzky s niekoľkými vírovitými štruktúrami (F). (C) Zväčšenie ×400 a (F) ×200.
Pomocou transmisnej elektrónovej mikroskopie sme zistili, že zväzky spermií mali pripojené chvostíky (obr. 6A, C), hlavy pripojené k chvostíkom (obr. 6B) alebo hlavy pripojené k chvostíkom (obr. 6D). Hlavičky spermií vo zväzku sú zakrivené, pričom na reze predstavujú dve jadrové oblasti (obr. 6D). V incíznom zväzku mali spermie skrútenú hlavu s dvoma jadrovými oblasťami a viacerými bičíkovými oblasťami (obr. 5A).
Digitálna farebná elektrónová mikrofotografia zobrazujúca spojovacie chvosty vo zväzku spermií a aglutinačný materiál spájajúci hlavičky spermií. (A) Pripojený chvostík veľkého počtu spermií. Všimnite si, ako chvostík vyzerá v projekcii na výšku (šípka) aj na šírku (šípka). (B) Hlavička (šípka) spermie je spojená s chvostíkom (šípka). (C) Je pripojených niekoľko chvostíkov spermií (šípky). (D) Aglutinačný materiál (AS, modrý) spája štyri hlavičky spermií (fialová).
Na detekciu hlavičiek spermií vo zväzkoch spermií pokrytých sekrétmi alebo membránami (obrázok 6B) sa použila skenovacia elektrónová mikroskopia, čo naznačuje, že zväzky spermií boli ukotvené extracelulárnym materiálom. Aglutinovaný materiál sa koncentroval v hlavičke spermie (zostava podobná hlave medúzy; obr. 5B) a distálne sa rozšíril, pričom pod fluorescenčnou mikroskopiou pri farbení akridínovou oranžovou (obr. 6C) mal žiarivo žltý vzhľad. Táto látka je jasne viditeľná pod skenovacím mikroskopom a považuje sa za spojivo. Polotenké rezy (obr. 5C) a nátery spermií zafarbené akridínovou oranžovou ukázali zväzky spermií obsahujúce husto usporiadané hlavičky a stočené chvostíky (obr. 5D).
Rôzne mikrofotografie zobrazujúce agregáciu hlavičiek spermií a zložených chvostíkov pomocou rôznych metód. (A) Prierezová digitálna farebná transmisná elektrónová mikroskopia zväzku spermií zobrazujúca špirálovitú hlavičku spermie s dvojdielnym jadrom (modrá) a niekoľkými bičíkovými časťami (zelená). (B) Digitálna farebná skenovacia elektrónová mikroskopia zobrazujúca zhluk hlavičiek spermií podobných medúze (šípky), ktoré sa zdajú byť zakryté. (C) Polotenký rez zobrazujúci agregované hlavičky spermií (šípky) a zvlnené chvostíky (šípky). (D) Mikrofotografia náteru spermií zafarbeného akridínovou oranžovou zobrazujúca agregáty hlavičiek spermií (šípky) a zvlnené priľnuté chvostíky (šípky). Všimnite si, že hlavičku spermie pokrýva lepkavá látka (S). (D) Zväčšenie × 1000.
Pomocou transmisnej elektrónovej mikroskopie (obr. 7A) sa tiež zistilo, že hlavičky spermií boli skrútené a jadrá mali špirálovitý tvar, čo potvrdili aj nátery spermií zafarbené akridínovou oranžovou a vyšetrené fluorescenčnou mikroskopiou (obr. 7B).
(A) Digitálna farebná transmisná elektrónová mikroskopia a (B) Náter spermií zafarbený akridínovou oranžovou zobrazujúci stočené hlavičky a pripojenie hlavičiek a chvostíkov spermií (šípky). (B) Zväčšenie × 1000.
Zaujímavým zistením je, že Sharkaziho spermie sa zhlukujú a vytvárajú mobilné vláknité zväzky. Vlastnosti týchto zväzkov nám umožňujú pochopiť ich možnú úlohu pri absorpcii a ukladaní spermií v SST.
Po párení spermie vstupujú do vagíny a prechádzajú intenzívnym selekčným procesom, výsledkom čoho je, že do SST vstúpi iba obmedzený počet spermií15,16. Mechanizmy, ktorými spermie vstupujú a vystupujú z SST, nie sú doteraz jasné. U hydiny sú spermie uchovávané v SST dlhší čas, 2 až 10 týždňov, v závislosti od druhu6. O stave spermií počas skladovania v SST pretrváva kontroverzia. Sú v pohybe alebo v pokoji? Inými slovami, ako si spermie udržiavajú svoju polohu v SST tak dlho?
Forman4 navrhol, že pobyt a vyvrhnutie SST by sa dali vysvetliť z hľadiska pohyblivosti spermií. Autori predpokladajú, že spermie si udržiavajú svoju polohu plávaním proti prúdu tekutiny vytvorenému epitelom SST a že spermie sú z SST vyvrhnuté, keď ich rýchlosť klesne pod bod, v ktorom sa začnú pohybovať dozadu kvôli nedostatku energie. Zaniboni5 potvrdil prítomnosť akvapořínov 2, 3 a 9 v apikálnej časti epitelových buniek SST, čo môže nepriamo podporovať Foremanov model ukladania spermií. V súčasnej štúdii sme zistili, že takmer polovica Sharkashiho spermií vykazuje pozitívnu reológiu v prúdiacej tekutine a že aglutinované zväzky spermií zvyšujú počet spermií vykazujúcich pozitívnu reológiu, hoci aglutinácia ich spomaľuje. Spôsob, akým spermie putujú vajíčkovodom vtáka do miesta oplodnenia, nie je úplne objasnený. U cicavcov folikulárna tekutina chemoatraktuje spermie. Predpokladá sa však, že chemoatraktanty smerujú spermie k priblíženiu sa na veľké vzdialenosti7. Preto sú za transport spermií zodpovedné iné mechanizmy. Schopnosť spermií orientovať sa a prúdiť proti tekutine z vajíčkovodov uvoľnenej po párení sa považuje za hlavný faktor pri zacielení spermií u myší. Parker 17 naznačil, že spermie prechádzajú vajcovodmi plávaním proti prúdu riasiniek u vtákov a plazov. Hoci to nebolo experimentálne preukázané u vtákov, Adolphi 18 ako prvý zistil, že vtáčie spermie dávajú pozitívne výsledky, keď sa pomocou prúžku filtračného papiera vytvorí tenká vrstva tekutiny medzi krycím sklíčkom a podložným sklíčkom. Reológia. Hino a Yanagimachi [19] umiestnili myší komplex vaječníkov, vajíčkovodov a maternice do perfúzneho krúžku a vstrekli 1 µl atramentu do isthmu, aby vizualizovali tok tekutiny vo vajíčkovodoch. Všimli si veľmi aktívny pohyb kontrakcie a relaxácie vo vajíčkovode, pri ktorom sa všetky atramentové guľôčky stabilne pohybovali smerom k ampule vajíčkovodu. Autori zdôrazňujú dôležitosť toku tekutiny z dolných do horných vajíčkovodov pre vztlak a oplodnenie spermií. Brillard20 uviedol, že u kurčiat a moriek spermie migrujú aktívnym pohybom z vaginálneho vchodu, kde sú uložené, do uterovaginálneho prepojenia, kde sú uložené. Tento pohyb však nie je potrebný medzi uterovaginálnym prepojením a infundibulom, pretože spermie sú transportované pasívnym posunom. Vzhľadom na tieto predchádzajúce odporúčania a výsledky získané v súčasnej štúdii možno predpokladať, že schopnosť spermií pohybovať sa proti prúdu (reológia) je jednou z vlastností, na ktorých je založený proces výberu. To určuje prechod spermií cez vagínu a ich vstup do CCT na uskladnenie. Ako naznačil Forman4, môže to tiež uľahčiť proces vstupu spermií do SST a jeho biotopu na určitý čas a ich následného výstupu, keď sa ich rýchlosť začne spomaľovať.
Na druhej strane, Matsuzaki a Sasanami21 naznačili, že vtáčie spermie prechádzajú zmenami motility z dormancie do motility v samčích a samičích reprodukčných traktoch. Inhibícia motility rezidentných spermií v SST bola navrhnutá ako vysvetlenie dlhého času skladovania spermií a následného omladenia po opustení SST. Za hypoxických podmienok Matsuzaki a kol.1 zaznamenali vysokú produkciu a uvoľňovanie laktátu v SST, čo môže viesť k inhibícii motility rezidentných spermií. V tomto prípade sa dôležitosť reológie spermií odráža vo výbere a absorpcii spermií, a nie v ich skladovaní.
Vzorec aglutinácie spermií sa považuje za pravdepodobné vysvetlenie dlhého obdobia skladovania spermií v SST, pretože ide o bežný vzorec zadržiavania spermií u hydiny2,22,23. Bakst a kol.2 pozorovali, že väčšina spermií sa k sebe prilepila a tvorila fascikulárne agregáty, pričom jednotlivé spermie sa v CCM prepelice nachádzali zriedkavo. Na druhej strane, Wen a kol.24 pozorovali viac rozptýlených spermií a menej chumáčov spermií v lúmene SST u kurčiat. Na základe týchto pozorovaní možno predpokladať, že sklon k aglutinácii spermií sa medzi vtákmi a medzi spermiami v tom istom ejakuláte líši. Okrem toho Van Krey a kol.9 naznačili, že náhodná disociácia aglutinovaných spermií je zodpovedná za postupné prenikanie spermií do lúmenu vajcovodu. Podľa tejto hypotézy by mali byť spermie s nižšou aglutinačnou kapacitou vypudené z SST ako prvé. V tejto súvislosti môže byť schopnosť spermií aglutinovať faktorom ovplyvňujúcim výsledok súťaže spermií u špinavých vtákov. Okrem toho, čím dlhšie sa aglutinované spermie disociujú, tým dlhšie sa zachováva plodnosť.
Hoci agregácia spermií a agregácia do zväzkov bola pozorovaná v niekoľkých štúdiách2,22,24, neboli podrobne opísané kvôli zložitosti ich kinematického pozorovania v rámci SST. Bolo vykonaných niekoľko pokusov o štúdium aglutinácie spermií in vitro. Po odstránení tenkého drôtu z visiacej kvapky semena bola pozorovaná rozsiahla, ale prechodná agregácia. To viedlo k tomu, že z kvapky vyčnievala predĺžená bublina, ktorá napodobňovala semennú žľazu. Kvôli 3D obmedzeniam a krátkym časom schnutia kvapkou sa celý blok rýchlo rozpadol9. V súčasnej štúdii sme s použitím kurčiat Sharkashi a mikrofluidných čipov dokázali opísať, ako sa tieto chumáče tvoria a ako sa pohybujú. Zväzky spermií sa vytvorili bezprostredne po odbere spermií a zistilo sa, že sa pohybujú špirálovito, pričom pri prítomnosti v prúde vykazujú pozitívnu reológiu. Okrem toho sa pri makroskopickom pohľade pozorovala zväzky spermií zvýšená linearita pohyblivosti v porovnaní s izolovanými spermiami. To naznačuje, že k aglutinácii spermií môže dôjsť pred preniknutím SST a že produkcia spermií nie je obmedzená na malú oblasť v dôsledku stresu, ako sa predtým predpokladalo (Tingari a Lake12). Počas tvorby chumáčov spermie plávajú synchrónne, kým nevytvoria spojenie, potom sa ich chvosty ovinú okolo seba a hlavička spermie zostáva voľná, ale chvost a distálna časť spermie sa zlepia lepkavou látkou. Preto je za pohyb zodpovedná voľná hlavička väzu, ktorá ťahá zvyšok väzu. Skenovacia elektrónová mikroskopia zväzkov spermií ukázala pripojené hlavičky spermií pokryté množstvom lepkavého materiálu, čo naznačuje, že hlavičky spermií boli pripojené v pokojových zväzkoch, ku ktorým mohlo dôjsť po dosiahnutí miesta skladovania (SST).
Keď sa ster spermií zafarbí akridínovou oranžovou, pod fluorescenčným mikroskopom je možné vidieť extracelulárny adhezívny materiál okolo spermií. Táto látka umožňuje zväzkom spermií priľnúť a udržať sa na akýchkoľvek okolitých povrchoch alebo časticiach, takže sa neunášajú s okolitým prúdom. Naše pozorovania teda ukazujú úlohu adhézie spermií vo forme mobilných zväzkov. Ich schopnosť plávať proti prúdu a prilepiť sa na blízke povrchy umožňuje spermiám zostať dlhšie v SST.
Rothschild25 použil hemocytometrickú kameru na štúdium plávajúceho rozloženia hovädzieho semena v kvapke suspenzie, pričom zhotovil mikrofotografie pomocou kamery s vertikálnou aj horizontálnou optickou osou mikroskopu. Výsledky ukázali, že spermie boli priťahované k povrchu komory. Autori naznačujú, že medzi spermiami a povrchom môžu existovať hydrodynamické interakcie. Berúc do úvahy túto skutočnosť, spolu so schopnosťou spermií kurčiat Sharkashi tvoriť lepkavé chumáče, sa môže zvýšiť pravdepodobnosť, že spermie priľnú k stene SST a budú dlhodobo skladované.
Bccetti a Afzeliu26 uviedli, že glykokalyx spermií je potrebný na rozpoznanie a aglutináciu gamét. Forman10 pozoroval, že hydrolýza α-glykozidových väzieb v glykoproteín-glykolipidových povlakoch ošetrením vtáčej spermy neuraminidázou viedla k zníženej fertilite bez ovplyvnenia pohyblivosti spermií. Autori naznačujú, že účinok neuraminidázy na glykokalyx zhoršuje sekvestráciu spermií na uterovaginálnom spojení, čím sa znižuje fertilita. Ich pozorovania nemôžu ignorovať možnosť, že liečba neuraminidázou môže znížiť rozpoznávanie spermií a oocytov. Forman a Engel10 zistili, že fertilita sa znížila, keď boli sliepky intravaginálne inseminované spermiami ošetrenými neuraminidázou. Avšak IVF so spermiami ošetrenými neuraminidázou neovplyvnilo fertilitu v porovnaní s kontrolnými sliepkami. Autori dospeli k záveru, že zmeny v glykoproteínovom-glykolipidovom povlaku okolo membrány spermií znižujú schopnosť spermií oplodniť sa zhoršením sekvestrácie spermií na uterovaginálnom spojení, čo následne zvyšuje stratu spermií v dôsledku rýchlosti uterovaginálneho spojenia, ale neovplyvňuje rozpoznávanie spermií a vajíčok.
U moriek Bakst a Bauchan 11 našli malé vezikuly a fragmenty membrán v lúmene SST a pozorovali, že niektoré z týchto granúl sa spojili s membránou spermií. Autori naznačujú, že tieto vzťahy môžu prispievať k dlhodobému skladovaniu spermií v SST. Výskumníci však nešpecifikovali zdroj týchto častíc, či sú vylučované epitelovými bunkami CCT, produkované a vylučované samčím reprodukčným systémom alebo produkované samotnými spermiami. Tieto častice sú tiež zodpovedné za aglutináciu. Grützner a kol.27 uviedli, že epitelové bunky nadsemenníka produkujú a vylučujú špecifický proteín, ktorý je potrebný na tvorbu semenných ciest s jedným pórom. Autori tiež uvádzajú, že disperzia týchto zväzkov závisí od interakcie proteínov nadsemenníka. Nixon a kol.28 zistili, že adnexa vylučujú proteín, kyslý osteonektín bohatý na cysteín; SPARC sa podieľa na tvorbe chumáčov spermií u ježovcov a platýpusov s krátkym zobákom. Rozptyl týchto lúčov je spojený so stratou tohto proteínu.
V súčasnej štúdii ultraštrukturálna analýza pomocou elektrónovej mikroskopie ukázala, že spermie priľnuli k veľkému množstvu hustého materiálu. Predpokladá sa, že tieto látky sú zodpovedné za aglutináciu, ktorá kondenzuje medzi a okolo priľnutých hlavičiek, ale v nižších koncentráciách v oblasti chvosta. Predpokladáme, že táto aglutinačná látka sa vylučuje zo samčieho reprodukčného systému (epididymis alebo semenovod) spolu so spermiami, pretože počas ejakulácie často pozorujeme oddeľovanie spermií od lymfy a semennej plazmy. Bolo hlásené, že keď vtáčie spermie prechádzajú cez epididymis a semenovod, prechádzajú zmenami súvisiacimi s dozrievaním, ktoré podporujú ich schopnosť viazať proteíny a získavať glykoproteíny spojené s plazmatickou lemmou. Pretrvávanie týchto proteínov na rezidentných membránach spermií v SST naznačuje, že tieto proteíny môžu ovplyvniť získanie stability membrány spermií 30 a určiť ich fertilitu 31. Ahammad a kol.32 uviedli, že spermie získané z rôznych častí samčieho reprodukčného systému (od semenníkov až po distálny semenovod) vykazovali progresívny nárast životaschopnosti za podmienok skladovania v tekutine bez ohľadu na teplotu skladovania a životaschopnosť u kurčiat sa tiež zvyšuje vo vajcovodoch po umelom oplodnení.
Chomáče spermií kurčiat Sharkashi majú odlišné vlastnosti a funkcie ako iné druhy, ako sú ježovky, platýsky, lesné myši, jelene potkany a morčatá. U kurčiat Sharkasi tvorba zväzkov spermií znížila ich rýchlosť plávania v porovnaní s jednotlivými spermiami. Tieto zväzky však zvýšili percento reologicky pozitívnych spermií a zvýšili schopnosť spermií stabilizovať sa v dynamickom prostredí. Naše výsledky teda potvrdzujú predchádzajúci predpoklad, že aglutinácia spermií v SST je spojená s dlhodobým skladovaním spermií. Taktiež predpokladáme, že sklon spermií k tvorbe zväzkov môže kontrolovať rýchlosť straty spermií v SST, čo môže zmeniť výsledok súťaže spermií. Podľa tohto predpokladu spermie s nízkou aglutinačnou kapacitou uvoľňujú SST ako prvé, zatiaľ čo spermie s vysokou aglutinačnou kapacitou produkujú väčšinu potomstva. Tvorba zväzkov spermií s jedným pórom je prospešná a ovplyvňuje pomer rodičov a detí, ale využíva iný mechanizmus. U echidn a platypusov sú spermie usporiadané rovnobežne vedľa seba, aby sa zvýšila rýchlosť pohybu lúča. Zväzky echidn sa pohybujú približne trikrát rýchlejšie ako jednotlivé spermie. Predpokladá sa, že tvorba takýchto trsov spermií u echidn je evolučnou adaptáciou na udržanie dominancie, pretože samice sú promiskuitné a zvyčajne sa pária s niekoľkými samcami. Preto spermie z rôznych ejakulátov tvrdo súťažia o oplodnenie vajíčka.
Aglutinované spermie kurčiat sharkasi sa dajú ľahko vizualizovať pomocou fázovo kontrastnej mikroskopie, čo sa považuje za výhodné, pretože umožňuje jednoduché štúdium správania spermií in vitro. Mechanizmus, ktorým tvorba spermiových trsov podporuje reprodukciu u kurčiat sharkasi, sa tiež líši od mechanizmu pozorovaného u niektorých placentárnych cicavcov, ktoré predstavujú kooperatívne správanie spermií, ako sú napríklad myši lesné, kde niektoré spermie dosiahnu vajíčka, čím pomáhajú iným príbuzným jedincom dosiahnuť a poškodiť ich vajíčka. dokázať sa. altruistické správanie. Samooplodnenie 34. Ďalší príklad kooperatívneho správania u spermií bol zistený u myší jeleňovitých, kde sa spermie dokázali identifikovať a spojiť s geneticky najpríbuznejšími spermiami a vytvoriť kooperatívne skupiny, aby sa zvýšila ich rýchlosť v porovnaní s nepríbuznými spermiami35.
Výsledky získané v tejto štúdii nie sú v rozpore s Fomanovou teóriou dlhodobého skladovania spermií v SWS. Výskumníci uvádzajú, že spermie sa naďalej pohybujú v prúde epitelových buniek vystieľajúcich SST dlhší čas a po určitom čase sa zásoby energie spermií vyčerpajú, čo vedie k zníženiu rýchlosti, čo umožňuje vypudenie látok s nízkou molekulovou hmotnosťou. Energia spermií prúdom tekutiny z lúmenu SST sa znižuje. V súčasnej štúdii sme pozorovali, že polovica jednotlivých spermií vykazovala schopnosť plávať proti prúdiacim tekutinám a ich adhézia vo zväzku zvýšila ich schopnosť vykazovať pozitívnu reológiu. Naše údaje sú navyše v súlade s údajmi Matsuzakiho a kol. 1, ktorí uviedli, že zvýšená sekrécia laktátu v SST môže inhibovať pohyblivosť rezidentných spermií. Naše výsledky však opisujú tvorbu pohyblivých väzov spermií a ich reologické správanie v prítomnosti dynamického prostredia v mikrokanáliku v snahe objasniť ich správanie v SST. Budúci výskum sa môže zamerať na určenie chemického zloženia a pôvodu aglutinačného činidla, čo nepochybne pomôže výskumníkom vyvinúť nové spôsoby skladovania tekutých spermií a predĺžiť trvanie plodnosti.
V štúdii bolo ako darcov spermií vybraných pätnásť 30-týždňových samcov plemena sharkasi s holým krkom (homozygotne dominantné; Na-Na). Vtáky boli chované na Výskumnej hydinárskej farme Poľnohospodárskej fakulty Univerzity Ashit v governoráte Ashit v Egypte. Vtáky boli umiestnené v jednotlivých klietkach (30 x 40 x 40 cm), podrobené svetelnému programu (16 hodín svetla a 8 hodín tmy) a kŕmené stravou obsahujúcou 160 g surových bielkovín, 2800 kcal metabolizovateľnej energie, 35 g vápnika na kus a 5 gramov dostupného fosforu na kilogram stravy.
Podľa údajov 36, ​​37 boli spermie odobraté od samcov pomocou brušnej masáže. Celkovo bolo odobratých 45 vzoriek spermií od 15 mužov počas 3 dní. Spermie (n = 15/deň) boli okamžite zriedené v pomere 1:1 (v:v) s riedidlom na spermie Belsville Poultry, ktoré obsahuje difosforečnan draselný (1,27 g), monohydrát glutamanu sodného (0,867 g), fruktózu (0,5 d), bezvodý octan sodný (0,43 g), tris(hydroxymetyl)aminometán (0,195 g), monohydrát citrátu draselného (0,064 g), monofosforečnan draselný (0,065 g), chlorid horečnatý (0,034 g) a H2O (100 ml), pH = 7,5, osmolarita 333 mOsm/kg38. Zriedené vzorky spermií boli najprv vyšetrené pod svetelným mikroskopom, aby sa zabezpečila dobrá kvalita spermií (vlhkosť), a potom boli uskladnené vo vodnom kúpeli pri teplote 37 °C až do použitia do pol hodiny po odbere.
Kinematika a reológia spermií sú opísané pomocou systému mikrofluidických zariadení. Vzorky spermií boli ďalej zriedené na pomer 1:40 v riedidle Beltsville Avian Semen Diluent, vložené do mikrofluidického zariadenia (pozri nižšie) a kinetické parametre boli stanovené pomocou systému počítačovej analýzy spermií (CASA), ktorý bol predtým vyvinutý na charakterizáciu mikrofluidík. Doplnok je možné stiahnuť na adrese: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Bola meraná krivková rýchlosť (VCL, μm/s), lineárna rýchlosť (VSL, μm/s) a priemerná trajektóriová rýchlosť (VAP, μm/s). Videá spermií boli zhotovené pomocou invertovaného fázového kontrastného mikroskopu Optika XDS-3 (s objektívom 40x) pripojeného ku kamere Tucson ISH1000 pri 30 fps počas 3 s. Na štúdium aspoň troch oblastí a 500 trajektórií spermií na vzorku použite softvér CASA. Nahraté video bolo spracované pomocou domáceho softvéru CASA. Definícia motility v doplnku CASA je založená na rýchlosti plávania spermií v porovnaní s prietokom a nezahŕňa ďalšie parametre, ako je pohyb zo strany na stranu, pretože sa zistilo, že je spoľahlivejší pri prúdení tekutiny. Reologický pohyb je opísaný ako pohyb spermií proti smeru prúdenia tekutiny. Spermie s reologickými vlastnosťami boli vydelené počtom pohyblivých spermií; spermie, ktoré boli v pokoji, a spermie pohybujúce sa konvekčne boli z počtu vylúčené.
Všetky použité chemikálie boli získané od spoločnosti Elgomhoria Pharmaceuticals (Káhira, Egypt), pokiaľ nie je uvedené inak. Zariadenie bolo vyrobené podľa popisu El-sherryho a kol. 40 s niekoľkými úpravami. Materiály použité na výrobu mikrokanálov zahŕňali sklenené platne (Howard Glass, Worcester, MA), negatívny rezist SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA), diacetónalkohol (Sigma Aldrich, Steinheim, Nemecko) a polyacetón.-184, Dow Corning, Midland, Michigan). Mikrokanály sa vyrábajú pomocou mäkkej litografie. Najprv sa na tlačiarni s vysokým rozlíšením (Prismatic, Káhira, Egypt a Pacific Arts and Design, Markham, ON) vytlačila priehľadná ochranná maska ​​na tvár s požadovaným dizajnom mikrokanálov. Predlohy sa vyrobili s použitím sklenených platní ako substrátov. Platne sa vyčistili v acetóne, izopropanole a deionizovanej vode a potom sa potiahli 20 µm vrstvou SU8-25 odstreďovaním (3000 ot./min., 1 min.). Vrstvy SU-8 boli potom jemne vysušené (65 °C, 2 minúty a 95 °C, 10 minút) a vystavené UV žiareniu počas 50 sekúnd. Po expozícii boli zapečené pri teplote 65 °C a 95 °C počas 1 minúty a 4 minúty na zosieťovanie exponovaných vrstiev SU-8, po čom nasledovalo vyvolanie v diacetónalkohole počas 6,5 minúty. Vafle boli tvrdo zapečené (200 °C počas 15 minút), aby sa vrstva SU-8 ďalej stuhla.
PDMS sa pripravil zmiešaním monoméru a tvrdidla v hmotnostnom pomere 10:1, potom sa odplynil vo vákuovom exsikátore a nalial na hlavný rám SU-8. PDMS sa vytvrdil v peci (120 °C, 30 min), potom sa vyrezali kanály, oddelili od predlohy a perforovali, aby sa umožnilo pripojenie trubíc na vstupe a výstupe mikrokanála. Nakoniec sa mikrokanály PDMS trvalo pripevnili na podložné sklíčka mikroskopu pomocou prenosného korónového procesora (Electro-Technic Products, Chicago, IL), ako je opísané inde. Mikrokanál použitý v tejto štúdii meria 200 µm × 20 µm (Š × V) a je dlhý 3,6 cm.
Prúdenie tekutiny vyvolané hydrostatickým tlakom vo vnútri mikrokanála sa dosahuje udržiavaním hladiny tekutiny vo vstupnej nádrži nad výškovým rozdielom Δh39 vo výstupnej nádrži (obr. 1).
kde f je koeficient trenia, definovaný ako f = C/Re pre laminárne prúdenie v obdĺžnikovom kanáli, kde C je konštanta závislá od pomeru strán kanála, L je dĺžka mikrokanála, Vav je priemerná rýchlosť vo vnútri mikrokanála, Dh je hydraulický priemer kanála, g – gravitačné zrýchlenie. Pomocou tejto rovnice možno vypočítať priemernú rýchlosť kanála pomocou nasledujúcej rovnice: