Dėkojame, kad apsilankėte Nature.com. Jūsų naudojama naršyklės versija turi ribotą CSS palaikymą. Kad galėtumėte naudotis visomis įmanomomis funkcijomis, rekomenduojame naudoti atnaujintą naršyklę (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“). Tuo tarpu, siekdami užtikrinti nuolatinį palaikymą, svetainę pateiksime be stilių ir „JavaScript“.
Paukščių vaisingumas priklauso nuo jų gebėjimo ilgą laiką laikyti pakankamai gyvybingų spermatozoidų spermos kaupimo kanalėliuose (SST). Tikslus mechanizmas, kuriuo spermatozoidai patenka į SST, juose išlieka ir išeina iš jų, tebėra diskutuotinas. Sharkasi vištų sperma pasižymėjo dideliu polinkiu agliutinuotis, sudarydama mobilius filamentinius pluoštus, kuriuose yra daug ląstelių. Kadangi sunku stebėti spermatozoidų judrumą ir elgseną neskaidriame kiaušintakyje, spermatozoidų agliutinacijai ir judrumui tirti naudojome mikrofluidinį prietaisą, kurio mikrokanalo skerspjūvis panašus į spermatozoidų. Šiame tyrime aptariama, kaip susidaro spermatozoidų pluoštai, kaip jie juda ir koks jų galimas vaidmuo pailginant spermatozoidų buvimo SST laiką. Tyrėme spermatozoidų greitį ir reologinį elgesį, kai skysčio srautas mikrofluidiniame kanale buvo generuojamas hidrostatiniu slėgiu (srauto greitis = 33 µm/s). Spermatozoidai linkę plaukti prieš srovę (teigiama reologija), o spermatozoidų pluošto greitis yra žymiai mažesnis, palyginti su pavieniais spermatozoidais. Pastebėta, kad spermatozoidų pluoštai juda spirale ir didėja jų ilgis bei storis, kai pritraukiama daugiau pavienių spermatozoidų. Buvo pastebėta, kad spermatozoidų pluoštai artėja prie mikrofluidinių kanalų šoninių sienelių ir prie jų prilimpa, kad būtų išvengta skysčio tekėjimo greičio > 33 µm/s. Buvo pastebėta, kad spermatozoidų pluoštai artėja prie mikrofluidinių kanalų šoninių sienelių ir prie jų prilimpa, kad būtų išvengta skysčio tekėjimo greičio > 33 µm/s. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрофлюиканачтов, микрофлюиканачтов избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. Pastebėta, kad spermatozoidų pluoštai artėja prie mikrofluidinių kanalų šoninių sienelių ir prie jų prilimpa, kad nebūtų nuplauti esant didesniam nei 33 µm/s skysčio srautui.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速> 流体流速> 33 流µm/s33 µm/s 扫过. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожидкатостного, избежать сметания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. Pastebėta, kad spermatozoidų pluoštai artėja prie mikrofluidinio kanalo šoninių sienelių ir prie jų prilimpa, kad jų nenuplautų >33 µm/s greičio skysčio srautas.Skenuojančios ir transmisinės elektroninės mikroskopijos tyrimai parodė, kad spermatozoidų pluoštus laikė gausi tanki medžiaga. Gauti duomenys rodo unikalų Sharkazi vištų spermatozoidų judrumą, taip pat spermatozoidų gebėjimą agliutinuotis ir sudaryti judrius pluoštus, o tai padeda geriau suprasti ilgalaikį spermatozoidų saugojimą SMT.
Kad žmonės ir dauguma gyvūnų apvaisintų, spermatozoidai ir kiaušinėliai turi patekti į apvaisinimo vietą tinkamu laiku. Todėl poravimasis turi vykti prieš ovuliaciją arba jos metu. Kita vertus, kai kurie žinduoliai, pavyzdžiui, šunys, taip pat ne žinduolių rūšys, pavyzdžiui, vabzdžiai, žuvys, ropliai ir paukščiai, ilgą laiką kaupia spermą savo reprodukciniuose organuose, kol jų kiaušinėliai yra paruošti apvaisinimui (asinchroninis apvaisinimas1). Paukščiai gali išlaikyti spermatozoidų, galinčių apvaisinti kiaušinėlius, gyvybingumą 2–10 savaičių2.
Tai unikali savybė, skirianti paukščius nuo kitų gyvūnų, nes ji suteikia didelę apvaisinimo tikimybę po vieno apvaisinimo kelias savaites be vienalaikio poravimosi ir ovuliacijos. Pagrindinis spermos kaupimo organas, vadinamas spermos kaupimo kanalėliu (SST), yra vidinėse gleivinės raukšlėse ties gimdos ir makšties jungtimi. Iki šiol mechanizmai, kuriais spermatozoidai patenka į spermos banką, išlieka iš jo ir išeina iš jo, nėra iki galo išaiškinti. Remiantis ankstesniais tyrimais, buvo pateikta daug hipotezių, tačiau nė viena iš jų nebuvo patvirtinta.
Forman4 iškėlė hipotezę, kad spermatozoidai išlaiko savo buvimą SST ertmėje nuolat osciliuodami prieš skysčio tekėjimo kryptį baltymų kanalais, esančiais SST epitelio ląstelėse (reologija). ATP išeikvojamas dėl nuolatinio žiuželių aktyvumo, reikalingo spermatozoidams išlaikyti SST spindyje, ir judrumas galiausiai mažėja, kol spermatozoidai skysčio srautu išnešami iš spermos banko ir pradeda naują kelionę kylančiuoju kiaušintakiu, kad apvaisintų spermatozoidus. Kiaušialąstė (Forman4). Šį spermos saugojimo modelį patvirtina imunocitocheminiu būdu aptikti akvaporinai 2, 3 ir 9, esantys SST epitelio ląstelėse. Iki šiol trūksta tyrimų apie vištų spermos reologiją ir jos vaidmenį SST saugojime, makšties spermatozoidų atrankoje ir spermatozoidų konkurencijoje. Vištoms spermatozoidai patenka į makštį po natūralaus poravimosi, tačiau daugiau nei 80 % spermatozoidų išstumiami iš makšties netrukus po poravimosi. Tai rodo, kad makštis yra pagrindinė spermos atrankos vieta paukščiams. Be to, pranešta, kad mažiau nei 1 % makštyje apvaisintų spermatozoidų patenka į SST2. Dirbtinio viščiukų apvaisinimo makštyje metu spermatozoidų, pasiekiančių kiaušintakius (SST), skaičius paprastai padidėja praėjus 24 valandoms po apvaisinimo. Kol kas spermatozoidų atrankos mechanizmas šio proceso metu nėra aiškus, o spermatozoidų judrumas gali atlikti svarbų vaidmenį spermatozoidų pasisavinimui kiaušintakiuose. Dėl storų ir nepermatomų kiaušintakių sienelių sunku tiesiogiai stebėti spermatozoidų judrumą paukščių kiaušintakiuose. Todėl trūksta pagrindinių žinių apie tai, kaip spermatozoidai po apvaisinimo pereina į kiaušintakius.
Neseniai reologija pripažinta svarbiu veiksniu, kontroliuojančiu spermatozoidų pernašą žinduolių lytiniuose organuose. Remdamiesi judriųjų spermatozoidų gebėjimu migruoti priešpriešine kryptimi, Zaferani ir kt.8 panaudojo „Corra“ mikrofluidinę sistemą judriems spermatozoidams pasyviai išskirti iš rašiklių paimtų spermos mėginių. Šis spermos rūšiavimo būdas yra būtinas medicininiam nevaisingumo gydymui ir klinikiniams tyrimams, ir yra labiau pageidaujamas nei tradiciniai metodai, kurie yra daug laiko ir darbo reikalaujantys bei gali pakenkti spermos morfologijai ir struktūriniam vientisumui. Tačiau iki šiol nebuvo atlikta jokių tyrimų apie vištų lytinių organų išskyrų poveikį spermatozoidų judrumui.
Nepriklausomai nuo mechanizmo, kuris palaiko spermos saugojimą SST, daugelis tyrėjų pastebėjo, kad vištų 9, 10, putpelių 2 ir kalakutų 11 SST rezidentiniai spermatozoidai agliutinuojasi galva prie galvos ir sudaro agliutinuotus spermatozoidų pluoštus. Autoriai teigia, kad yra ryšys tarp šios agliutinacijos ir ilgalaikio spermatozoidų saugojimo SST.
Tingari ir Lake12 pranešė apie stiprų ryšį tarp spermatozoidų vištos spermą priimančioje liaukoje ir suabejojo, ar paukščių spermatozoidai agliutinuojasi taip pat, kaip žinduolių spermatozoidai. Jie mano, kad glaudūs ryšiai tarp spermatozoidų sėkliniame latake gali būti dėl streso, kurį sukelia didelis spermatozoidų skaičius mažoje erdvėje.
Vertinant spermatozoidų elgesį ant šviežiai pakabintų stiklinių preparatų, galima pastebėti trumpalaikius agliutinacijos požymius, ypač spermos lašelių kraštuose. Tačiau agliutinaciją dažnai sutrikdydavo su nuolatiniu judėjimu susijęs sukimosi veiksmas, o tai paaiškina šio reiškinio trumpalaikį pobūdį. Tyrėjai taip pat pastebėjo, kad į spermą įpylus skiediklio, atsirasdavo pailgų, „siūlo pavidalo“ ląstelių sankaupų.
Ankstyvieji bandymai imituoti spermatozoidą buvo atliekami nuimant ploną vielą nuo kabančio lašo, dėl ko iš spermos lašo kyšojo pailga, į spermatozoidus panaši pūslelė. Spermatozoidai pūslelės viduje iš karto išsirikiavo lygiagrečiai, tačiau visas vienetas greitai išnyko dėl 3D apribojimo. Todėl norint tirti spermatozoidų agliutinaciją, būtina stebėti spermatozoidų judrumą ir elgseną tiesiogiai izoliuotuose spermatozoidų kaupimo kanalėliuose, o tai sunku pasiekti. Todėl būtina sukurti prietaisą, kuris imituotų spermatozoidus, kad būtų galima atlikti spermatozoidų judrumo ir agliutinacijos elgsenos tyrimus. Brillard ir kt.13 pranešė, kad vidutinis spermatozoidų kaupimo kanalėlių ilgis suaugusių viščiukų organizme yra 400–600 µm, tačiau kai kurie SST gali būti net 2000 µm ilgio. Mero ir Ogasawara14 sėklines liaukas suskirstė į padidėjusius ir nepadidėjusius spermatozoidų kaupimo kanalėlius, kurie abu buvo vienodo ilgio (~500 µm) ir kaklelio pločio (~38 µm), tačiau vidutinis kanalėlių spindžio skersmuo buvo atitinkamai 56,6 ir 56,6 µm, t. y. 11,2 μm. Šiame tyrime naudojome mikrofluidinį įrenginį, kurio kanalo dydis yra 200 µm × 20 µm (plotis × aukštis), o jo skerspjūvis yra šiek tiek artimas amplifikuoto SST skerspjūviui. Be to, ištyrėme spermatozoidų judrumą ir agliutinacijos elgseną tekančiame skystyje, o tai atitinka Foremano hipotezę, kad SST epitelio ląstelių gaminamas skystis išlaiko spermatozoidus spindyje priešpriešinės (reologinės) krypties kryptimi.
Šio tyrimo tikslas buvo įveikti spermatozoidų judrumo stebėjimo kiaušintakiuose problemas ir išvengti sunkumų tiriant spermatozoidų reologiją ir elgesį dinamiškoje aplinkoje. Buvo naudojamas mikrofluidinis įrenginys, kuris sukuria hidrostatinį slėgį, siekiant imituoti spermatozoidų judrumą vištos lytiniuose organuose.
Kai į mikrokanalinį prietaisą buvo įlašintas praskiesto spermos mėginio (1:40) lašas, buvo galima nustatyti dviejų tipų spermatozoidų judrumą (izoliuoti spermatozoidai ir surišti spermatozoidai). Be to, spermatozoidai buvo linkę plaukti prieš srovę (teigiama reologija; 1, 2 vaizdo įrašas). Nors spermatozoidų pluoštelių greitis buvo mažesnis nei vienišų spermatozoidų (p < 0,001), jie padidino spermatozoidų, kuriems pasireiškė teigiama reotaksė, procentą (p < 0,001; 2 lentelė). Nors spermatozoidų pluoštelių greitis buvo mažesnis nei vienišų spermatozoidų (p < 0,001), jie padidino spermatozoidų, kuriems pasireiškė teigiama reotaksė, procentą (p < 0,001; 2 lentelė). Хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), валоичу процент сперматозоидов, демонстрирующих положительный реотаксис (p < 0,001; таблица 2). Nors spermatozoidų pluoštų greitis buvo mažesnis nei pavienių spermatozoidų (p < 0,001), jie padidino spermatozoidų, kuriems pasireiškė teigiama reotaksė, procentą (p < 0,001; 2 lentelė).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0,001；表2）.尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001）百分比 (p <0,001 ； 2。。。。。。)））））） Хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увелиличперматозоидов сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). Nors spermatozoidų pluoštelių judėjimo greitis buvo mažesnis nei pavienių spermatozoidų (p < 0,001), jie padidino teigiamą reologiją turinčių spermatozoidų procentinę dalį (p < 0,001; 2 lentelė).Teigiama pavienių spermatozoidų ir kuokštelių reologija yra atitinkamai maždaug 53 % ir 85 %.
Pastebėta, kad sharkashi vištų spermatozoidai iškart po ejakuliacijos suformuoja linijinius pluoštus, sudarytus iš dešimčių individų. Šie kuokšteliai laikui bėgant ilgėja ir storėja ir gali išlikti in vitro kelias valandas, kol išsisklaido (3 vaizdo įrašas). Šie siūliniai pluoštai yra echidnos spermatozoidų, kurie susidaro prielipo gale, formos. Nustatyta, kad sharkashi vištų sperma turi didelį polinkį agliutinuotis ir suformuoti tinklinį pluoštą per mažiau nei minutę po surinkimo. Šie pluoštai yra dinamiški ir gali prilipti prie bet kokių netoliese esančių sienų ar statinių objektų. Nors spermatozoidų pluoštai sumažina spermatozoidų greitį, akivaizdu, kad makroskopiškai jie padidina jų linijiškumą. Ryšulių ilgis kinta priklausomai nuo pluoštuose surinktų spermatozoidų skaičiaus. Buvo išskirtos dvi pluošto dalys: pradinė dalis, įskaitant laisvą agliutinuoto spermatozoido galvą, ir galinė dalis, įskaitant uodegą ir visą spermos distalinį galą. Naudojant didelės spartos kamerą (950 kadrų per sekundę), pradinėje pluošto dalyje buvo stebėtos laisvos agliutinuotų spermatozoidų galvutės, kurios dėl savo osciliacinio judesio atsakingos už pluošto judėjimą, o likusias į pluoštą tempia spiraliniu judesiu (4 vaizdo įrašas). Tačiau ilguose kuokštuose pastebėta, kad kai kurios laisvos spermatozoidų galvutės prilipo prie kūno, o galinė kuokšto dalis veikia kaip mentės, padedančios stumti kuokštą.
Lėtame skysčio tekėjime spermatozoidų pluoštai juda lygiagrečiai vienas kitam, tačiau jie pradeda persidengti ir prilipti prie visko, kas nejuda, kad jų nenuplautų srovė, didėjant srauto greičiui. Ryšuliai susidaro, kai saujelė spermatozoidų artėja viena prie kitos, jie pradeda judėti sinchroniškai ir apsivynioja vienas aplink kitą, o tada prilimpa prie lipnios medžiagos. 1 ir 2 paveiksluose parodyta, kaip spermatozoidai artėja vienas prie kito, sudarydami jungtį, kai jų uodegėlės apsivynioja viena aplink kitą.
Tyrėjai, tirdami spermos reologiją, mikrokanale sukūrė hidrostatinį slėgį, kad sukurtų skysčio tekėjimą. Buvo naudojamas 200 µm × 20 µm (plotis × aukštis) ir 3,6 µm ilgio mikrokanalas. Tarp talpyklų buvo naudojami mikrokanalai, kurių galuose buvo pritvirtinti švirkštai. Kad kanalai būtų geriau matomi, buvo naudojami maistiniai dažai.
Pritvirtinkite jungiamuosius kabelius ir priedus prie sienos. Vaizdo įrašas buvo nufilmuotas fazinio kontrasto mikroskopu. Su kiekvienu vaizdu pateikiami fazinio kontrasto mikroskopijos ir žemėlapių vaizdai. (A) Dviejų srautų jungtis priešinasi srautui dėl spiralinio judėjimo (raudona rodyklė). (B) Vamzdelio pluošto ir kanalo sienelės jungtis (raudonos rodyklės), tuo pačiu metu jie yra sujungti su dviem kitais pluoštais (geltonos rodyklės). (C) Spermatozoidų pluoštai mikrofluidiniame kanale pradeda jungtis vienas su kitu (raudonos rodyklės), sudarydami spermatozoidų pluoštų tinklą. (D) Spermatozoidų pluoštų tinklo formavimasis.
Kai į mikrofluidinį įrenginį buvo įlašintas praskiesto spermatozoidų lašas ir sukurta srovė, pastebėta, kad spermatozoidų pluoštas juda prieš srauto kryptį. Ryšuliai tvirtai priglunda prie mikrokanalų sienelių, o laisvos galvutės pradinėje pluoštų dalyje tvirtai prie jų priglunda (5 vaizdo įrašas). Jie taip pat prilimpa prie bet kokių nejudančių dalelių savo kelyje, pavyzdžiui, šiukšlių, kad srovė jų nenuneštų. Laikui bėgant, šie kuokšteliai tampa ilgais siūlais, kurie sulaiko kitus pavienius spermatozoidus ir trumpesnius kuokštelius (6 vaizdo įrašas). Srautui lėtėjant, ilgos spermatozoidų eilutės pradeda formuoti spermatozoidų linijų tinklą (7 vaizdo įrašas; 2 pav.).
Esant dideliam srauto greičiui (V > 33 µm/s), siūlų spiraliniai judesiai padidėja, nes bandoma sugauti daug atskirų spermatozoidų, formuojančių pluoštus, kad geriau atsispirtų srauto dreifo jėgai. Esant dideliam srauto greičiui (V > 33 µm/s), siūlų spiraliniai judesiai padidėja, nes bandoma sugauti daug atskirų spermatozoidų, formuojančių pluoštus, kad geriau atsispirtų srauto dreifo jėgai. При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку они пытаются отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дрейфующей силе потока. Esant dideliam srautui (V > 33 µm/s), spiraliniai gijų judesiai didėja, nes jos bando pagauti daug atskirų spermatozoidų, sudarydamos pluoštus, kurie geriau atsispiria srauto dreifo jėgai.在高流速 (V > 33 µm/s)时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成束的单个精子，从而更好地抵抗流动的漂移力.在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 箭多 形成 束 束从而 更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。. При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в попытке захватить захватить сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейфа потока. Esant dideliam srautui (V > 33 µm/s), filamentų spiralinis judėjimas didėja, siekiant pagauti daug atskirų spermatozoidų, sudarančių pluoštus, kad būtų geriau atsispirta srauto dreifo jėgoms.Jie taip pat bandė pritvirtinti mikrokanalus prie šoninių sienelių.
Šviesos mikroskopija (LM) parodė, kad spermatozoidų pluoštai yra spermatozoidų galvučių ir susisukusių uodegėlių sankaupos. Spermatozoidų pluoštai su įvairiais agregatais taip pat buvo identifikuoti kaip susuktos galvutės ir žiuželių agregatai, kelios susiliejusios spermatozoidų uodegėlės, prie uodegėlės pritvirtintos spermatozoidų galvutės ir spermatozoidų galvutės su sulenktais branduoliais kaip keli susilieję branduoliai. Skenuojančioji elektroninė mikroskopija (SEM) parodė, kad spermatozoidų pluoštai buvo apvalkalu apgaubti spermatozoidų galvų agregatai, o spermatozoidų agregatai rodė prisitvirtinusį apsivyniojusių uodegėlių tinklą.
Spermatozoidų morfologija ir ultrastruktūra, spermatozoidų pluoštų formavimasis buvo tirti naudojant šviesos mikroskopiją (pusė pjūvio), skenuojančiąją elektroninę mikroskopiją (SEM) ir transmisinę elektroninę mikroskopiją (TEM), spermatozoidų tepinėliai buvo dažomi akridino oranžine spalva ir tiriami epifluorescencine mikroskopija.
Spermos tepinėlio dažymas akridino oranžiniu dažikliu (3B pav.) parodė, kad spermatozoidų galvutės buvo sulipusios ir padengtos sekretuojančia medžiaga, dėl ko susidarė dideli kuokšteliai (3D pav.). Spermatozoidų pluoštai sudaryti iš spermatozoidų agregatų su pritvirtintų uodegėlių tinklu (4A–C pav.). Spermatozoidų pluoštai sudaryti iš daugelio sulipusių spermatozoidų uodegėlių (4D pav.). Spermatozoidų pluoštų galvutes dengė sekretas (4E, F pav.).
Spermatozoidų pluoštelio formavimasis. Fazinio kontrasto mikroskopijos ir akridino oranžine spalva nudažytų spermatozoidų tepinėlių tyrimai parodė, kad spermatozoidų galvutės sulimpa. (A) Ankstyvas spermatozoidų kuokštelio formavimasis prasideda nuo spermatozoido (baltas apskritimas) ir trijų spermatozoidų (geltonas apskritimas), spiralei prasidedant nuo uodegėlės ir baigiant galvute. (B) Akridino oranžine spalva nudažyto spermatozoidų tepinėlio fotomikrografas, kuriame matomos prilipusios spermatozoidų galvutės (rodyklės). Išskyros dengia galvą (-es). Padidinimas × 1000. (C) Didelio spindulio, pernešamo srautu mikrofluidiniame kanale, vystymasis (naudojant didelės spartos kamerą 950 kadrų per sekundę greičiu). (D) Akridino oranžine spalva nudažyto spermatozoidų tepinėlio mikrografas, kuriame matomi dideli kuokšteliai (rodyklės). Padidinimas: × 200.
Spermatozoidų pluošto ir akridino oranžine spalva nudažyto spermatozoidų tepinėlio skenuojančios elektroninės mikrografijos. (A, B, D, E) yra skaitmeninės spalvotos spermatozoidų skenuojančios elektroninės mikrografijos, o C ir F yra akridino oranžine spalva nudažytų spermatozoidų tepinėlių mikrografijos, rodančios kelių spermatozoidų prisitvirtinimą, apvyniojantį uodegos tinklelį. (AC) Spermatozoidų sankaupos pavaizduotos kaip prisitvirtinusių uodegėlių tinklas (rodyklės). (D) Kelių spermatozoidų (su lipnia medžiaga, rausvas kontūras, rodyklė), apvyniojančių uodegėlę, sukibimas. (E ir F) Spermatozoidų galvučių sankaupos (rodyklės), padengtos lipnia medžiaga (rodyklės). Spermatozoidai suformavo pluoštus su keliomis sūkurio formos struktūromis (F). (C) ×400 ir (F) ×200 padidinimai.
Naudodami transmisinę elektroninę mikroskopiją, nustatėme, kad spermatozoidų pluošteliai turėjo pritvirtintas uodegėles (6A, C pav.), prie uodegėlių pritvirtintas galvas (6B pav.) arba prie uodegėlių pritvirtintas galvas (6D pav.). Spermatozoidų galvutės pluoštelyje yra išlenktos, pjūvyje matomos dvi branduolio sritys (6D pav.). Pjūvio pluoštelyje spermatozoidai turėjo susuktą galvą su dviem branduolio sritimis ir keliais žiuželiniais regionais (5A pav.).
Skaitmeninė spalvota elektroninė mikrografija, kurioje rodomos jungiamosios uodegėlės spermatozoidų pluoštelyje ir agliutinuojanti medžiaga, jungianti spermatozoidų galvutes. (A) Pritvirtinta daugybės spermatozoidų uodegėlė. Atkreipkite dėmesį, kaip uodegėlė atrodo tiek vertikalioje (rodyklė), tiek horizontalioje (rodyklė) projekcijose. (B) Spermatozoido galvutė (rodyklė) yra sujungta su uodegėle (rodyklė). (C) Kelios pritvirtintos spermatozoidų uodegėlės (rodyklės). (D) Agliutinacinė medžiaga (AS, mėlyna) jungia keturias spermatozoidų galvutes (violetinė).
Skenuojančios elektroninės mikroskopijos metodu buvo aptiktos spermatozoidų galvutės spermatozoidų pluoštuose, padengtuose sekretais arba membranomis (6B pav.). Tai rodo, kad spermatozoidų pluoštai buvo įtvirtinti tarpląsteline medžiaga. Agliutinuota medžiaga buvo koncentruota spermatozoidų galvoje (medūzos galvos formos darinys; 5B pav.) ir išsiplėtė distaliai, todėl, nudažyta akridino oranžiniu dažikliu, fluorescencinėje mikroskopijoje ji atrodė ryškiai geltona (6C pav.). Ši medžiaga aiškiai matoma skenuojančiu mikroskopu ir laikoma rišamąja medžiaga. Pusiau ploni pjūviai (5C pav.) ir akridino oranžiniu dažikliu nudažyti spermatozoidų tepinėliai matė spermatozoidų pluoštus su tankiai supakuotomis galvomis ir susisukusiomis uodegėlėmis (5D pav.).
Įvairios fotomikrografijos, kuriose matyti spermatozoidų galvučių ir sulankstytų uodegėlių sankaupos, gautos naudojant įvairius metodus. (A) Spermatozoidų pluoštelio skerspjūvio skaitmeninė spalvota transmisinė elektroninė mikrografija, kurioje matyti susisukusi spermatozoidų galvutė su dviejų dalių branduoliu (mėlyna) ir keliomis žiuželinėmis dalimis (žalia). (B) Skaitmeninė spalvota skenuojanti elektroninė mikrografija, kurioje matyti medūzų pavidalo spermatozoidų galvučių sankaupa (rodyklės), kurios, atrodo, yra padengtos. (C) Pusiau plonas pjūvis, kuriame matyti susikaupusios spermatozoidų galvutės (rodyklės) ir susisukusios uodegėlės (rodyklės). (D) Akridino oranžiniu dažais nudažyto spermatozoidų tepinėlio mikrografija, kurioje matyti spermatozoidų galvučių sankaupos (rodyklės) ir susisukusios prilipusios uodegėlės (rodyklės). Atkreipkite dėmesį, kad spermatozoido galvą dengia lipni medžiaga (S). (D) × 1000 padidinimas.
Naudojant transmisijinę elektroninę mikroskopiją (7A pav.), taip pat pastebėta, kad spermatozoidų galvutės buvo susisukusios, o branduoliai – spiralinės formos, tai patvirtino akridino oranžiniu dažais nudažyti ir fluorescencine mikroskopija ištirti spermatozoidų tepinėliai (7B pav.).
(A) Skaitmeninė spalvota elektroninė mikrografija ir (B) akridino oranžine spalva nudažytas spermatozoidų tepinėlis, kuriame matomos susisukusios galvutės ir spermatozoidų galvų bei uodegėlių prisitvirtinimas (rodyklės). (B) × 1000 padidinimas.
Įdomus atradimas yra tas, kad Sharkazi spermatozoidai jungiasi ir sudaro judrius siūlinius pluoštus. Šių pluoštų savybės leidžia suprasti jų galimą vaidmenį spermatozoidų absorbcijoje ir saugojime SST.
Po poravimosi spermatozoidai patenka į makštį ir patiria intensyvų atrankos procesą, kurio metu į makšties sandariklį patenka tik ribotas spermatozoidų skaičius15,16. Iki šiol mechanizmai, kuriais spermatozoidai patenka į makštį ir išeina iš jos, nėra aiškūs. Naminių paukščių spermatozoidai makštyje laikomi ilgą laiką – nuo ​​2 iki 10 savaičių, priklausomai nuo rūšies6. Vis dar diskutuojama apie spermos būklę laikant ją makštyje. Ar ji juda, ar ramybės būsenoje? Kitaip tariant, kaip spermatozoidai taip ilgai išlaiko savo padėtį makštyje?
Formanas4 teigė, kad folikulinio skysčio (ST) buvimą ir išstūmimą galima paaiškinti spermatozoidų judrumu. Autoriai kelia hipotezę, kad spermatozoidai išlaiko savo padėtį plaukdami prieš SST epitelio sukuriamą skysčio srautą ir kad spermatozoidai išmetami iš SST, kai jų greitis nukrenta žemiau taško, kuriame jie pradeda judėti atgal dėl energijos trūkumo. Zaniboni5 patvirtino akvaporinų 2, ​​3 ir 9 buvimą SST epitelio ląstelių viršūninėje dalyje, o tai gali netiesiogiai patvirtinti Foremano spermatozoidų kaupimo modelį. Šiame tyrime nustatėme, kad beveik pusė Sharkashi spermatozoidų tekančiame skystyje pasižymi teigiama reologija ir kad agliutinuoti spermatozoidų pluoštai padidina teigiamą reologiją turinčių spermatozoidų skaičių, nors agliutinacija juos sulėtina. Kaip spermatozoidai paukščio kiaušintakiu keliauja į apvaisinimo vietą, nėra iki galo suprantama. Žinduoliams folikulinis skystis chemoatraktorius pritraukia spermatozoidus. Tačiau manoma, kad chemoatraktorius nukreipia spermatozoidus artėti dideliais atstumais7. Todėl už spermatozoidų pernašą atsakingi kiti mechanizmai. Pranešta, kad spermatozoidų gebėjimas orientuotis ir tekėti prieš kiaušintakių skystį, išsiskiriantį po poravimosi, yra pagrindinis veiksnys, lemiantis spermatozoidų poveikį pelėms. Parker 17 teigė, kad paukščių ir roplių spermatozoidai kerta kiaušintakius plaukdami prieš blakstieninę srovę. Nors tai nebuvo eksperimentiškai įrodyta su paukščiais, Adolphi 18 pirmasis nustatė, kad paukščių sperma duoda teigiamų rezultatų, kai filtro popieriaus juostele tarp dengiamojo stiklelio ir stiklelio sukuriamas plonas skysčio sluoksnis. Reologija. Hino ir Yanagimachi [19] įdėjo pelės kiaušidės, kiaušintakio ir gimdos kompleksą į perfuzijos žiedą ir įšvirkštė 1 µl rašalo į sąnarį, kad vizualizuotų skysčio tekėjimą kiaušintakiuose. Jie pastebėjo labai aktyvų susitraukimo ir atsipalaidavimo judėjimą kiaušintakyje, kuriame visi rašalo kamuoliukai tolygiai judėjo link kiaušintakio ampulės. Autoriai pabrėžia kiaušintakių skysčio tekėjimo iš apatinių į viršutinius kiaušintakius svarbą spermatozoidų kilimui ir apvaisinimui. Brillard20 pranešė, kad vištų ir kalakutų spermatozoidai migruoja aktyviai judėdami iš makšties angos, kur jie laikomi, į gimdos ir makšties jungtį, kur jie yra laikomi. Tačiau šis judėjimas tarp gimdos ir makšties angos ir pilvo ertmės nėra būtinas, nes spermatozoidai transportuojami pasyviai. Žinant šias ankstesnes rekomendacijas ir šiame tyrime gautus rezultatus, galima daryti prielaidą, kad spermatozoidų gebėjimas judėti prieš srovę (reologija) yra viena iš savybių, kuriomis grindžiamas atrankos procesas. Tai lemia spermatozoidų praėjimą per makštį ir patekimą į gimdos ir makšties ertmę saugojimui. Kaip teigė Forman4, tai taip pat gali palengvinti spermatozoidų patekimą į makšties ertmę ir jos buveinę tam tikrą laiką, o vėliau išėjimą, kai jų greitis pradeda lėtėti.
Kita vertus, Matsuzaki ir Sasanami21 teigė, kad paukščių spermatozoidų judrumas keičiasi nuo ramybės būsenos iki judrumo patinų ir patelių reprodukciniuose traktuose. Buvo pasiūlyta, kad rezidentinių spermatozoidų judrumo slopinimas SST paaiškina ilgą spermatozoidų laikymo laiką ir vėliau atsinaujinimą po palikimo SST. Hipoksinėmis sąlygomis Matsuzaki ir kt.1 pranešė apie didelę laktato gamybą ir išsiskyrimą SST, o tai gali lemti rezidentinių spermatozoidų judrumo slopinimą. Šiuo atveju spermatozoidų reologijos svarba atsispindi spermatozoidų atrankoje ir absorbcijoje, o ne jų saugojime.
Spermatozoidų agliutinacijos modelis laikomas patikimu ilgo spermos laikymo kiaušintakių ertmėje (SST) paaiškinimu, nes tai yra įprastas spermos sulaikymo naminiams paukščiams modelis2,22,23. Bakst ir kt.2 pastebėjo, kad dauguma spermatozoidų sulipo vienas prie kito, sudarydami pluoštelius, o pavieniai spermatozoidai putpelių kiaušintakių sėklidėse (CCM) buvo retai randami. Kita vertus, Wen ir kt.24 vištų SST spindyje pastebėjo daugiau išsibarsčiusių spermatozoidų ir mažiau spermatozoidų kuokštelių. Remiantis šiais stebėjimais, galima daryti prielaidą, kad spermatozoidų agliutinacijos polinkis skiriasi tarp paukščių ir tarp spermatozoidų tame pačiame ejakuliate. Be to, Van Krey ir kt.9 teigė, kad atsitiktinė agliutinuotų spermatozoidų disociacija yra atsakinga už laipsnišką spermatozoidų prasiskverbimą į kiaušintakių spindį. Remiantis šia hipoteze, pirmiausia iš SST turėtų būti pašalinti spermatozoidai, kurių agliutinacijos pajėgumas mažesnis. Šiame kontekste spermatozoidų gebėjimas agliutinuotis gali būti veiksnys, turintis įtakos spermatozoidų konkurencijos rezultatams nešvariuose paukščiuose. Be to, kuo ilgiau agliutinuoti spermatozoidai disocijuojasi, tuo ilgiau išlieka vaisingumas.
Nors spermatozoidų agregacija ir agregacija į pluoštus buvo pastebėta keliuose tyrimuose2,22,24, dėl jų kinematinio stebėjimo sudėtingumo SST sistemoje jie nebuvo išsamiai aprašyti. Buvo atlikta keletas bandymų tirti spermatozoidų agliutinaciją in vitro. Nuėmus ploną vielą nuo kabančio sėklos lašo, buvo pastebėta didelė, bet trumpalaikė agregacija. Dėl to iš lašo išsikiša pailgas burbulas, imituojantis sėklinę liauką. Dėl 3D apribojimų ir trumpo lašelinio džiovinimo laiko visas blokas greitai sunyko9. Šiame tyrime, naudodami Sharkashi viščiukus ir mikrofluidinius lustus, galėjome aprašyti, kaip šie kuokšteliai formuojasi ir kaip jie juda. Spermatozoidų pluoštai susiformavo iškart po spermos surinkimo ir, kaip nustatyta, juda spirale, rodydami teigiamą reologiją, kai yra sraute. Be to, žiūrint makroskopiškai, pastebėta, kad spermatozoidų pluoštų judrumas yra tiesiškesnis, palyginti su izoliuotais spermatozoidais. Tai rodo, kad spermatozoidų agliutinacija gali įvykti prieš SST prasiskverbimą ir kad spermatozoidų gamyba neapsiriboja mažu plotu dėl streso, kaip buvo minėta anksčiau (Tingari ir Lake12). Kuokštelių formavimosi metu spermatozoidai plaukioja sinchroniškai, kol suformuoja jungtį, tada jų uodegos apsivynioja viena aplink kitą ir spermatozoido galva lieka laisva, tačiau spermatozoido uodega ir distalinė dalis sulimpa lipnia medžiaga. Todėl už judėjimą atsakinga laisva raiščio galva, tempianti likusį raiščio galą. Spermatozoidų pluoštų skenuojančioji elektroninė mikroskopija parodė pritvirtintas spermatozoidų galvutes, padengtas daugybe lipnios medžiagos, o tai rodo, kad spermatozoidų galvutės buvo pritvirtintos ramybės būsenos pluoštuose, kas galėjo įvykti pasiekus saugojimo vietą (SST).
Kai spermos tepinėlis dažomas akridino oranžine spalva, fluorescenciniu mikroskopu galima pamatyti tarpląstelinę lipnią medžiagą aplink spermatozoidus. Ši medžiaga leidžia spermatozoidų pluoštams prilipti prie bet kokių aplinkinių paviršių ar dalelių, kad jie nedreifuotų kartu su aplinkiniu srautu. Taigi, mūsų stebėjimai rodo spermatozoidų sukibimo vaidmenį mobilių pluoštų pavidalu. Jų gebėjimas plaukti prieš srovę ir prilipti prie netoliese esančių paviršių leidžia spermatozoidams ilgiau išlikti SST.
Rothschild25 naudojo hemocitometrijos kamerą, kad ištirtų galvijų spermos plūduriuojantį pasiskirstymą suspensijos laše, darydamas fotomikrografijas per kamerą, kurios mikroskopo optinė ašis buvo vertikali ir horizontali. Rezultatai parodė, kad spermatozoidai buvo pritraukti prie kameros paviršiaus. Autoriai teigia, kad tarp spermatozoidų ir paviršiaus gali būti hidrodinaminės sąveikos. Atsižvelgiant į tai, kartu su Sharkashi viščiuko spermos gebėjimu sudaryti lipnius kuokštelius, tai gali padidinti tikimybę, kad sperma prilips prie SST sienelės ir bus laikoma ilgą laiką.
Bccetti ir Afzeliu26 pranešė, kad spermos glikokaliksas yra būtinas gametų atpažinimui ir agliutinacijai. Forman10 pastebėjo, kad α-glikozidinių jungčių hidrolizė glikoproteinų-glikolipidų dangose, apdorojant paukščių spermą neuraminidaze, sumažino vaisingumą nepaveikdama spermatozoidų judrumo. Autoriai teigia, kad neuraminidazės poveikis glikokaliksui sutrikdo spermatozoidų sekvestraciją gimdos ir makšties jungtyje, taip sumažindamas vaisingumą. Jų stebėjimai negali ignoruoti galimybės, kad gydymas neuraminidaze gali sumažinti spermatozoidų ir oocitų atpažinimą. Forman ir Engel10 nustatė, kad vaisingumas sumažėjo, kai vištos buvo apvaisinamos intravaginaliai sperma, apdorota neuraminidaze. Tačiau dirbtinis apvaisinimas su neuraminidaze apdorota sperma neturėjo įtakos vaisingumui, palyginti su kontrolinėmis vištomis. Autoriai padarė išvadą, kad glikoproteinų-glikolipidų dangos aplink spermos membraną pokyčiai sumažino spermatozoidų gebėjimą apvaisinti, sutrikdydami spermatozoidų sekvestraciją gimdos ir makšties jungtyje, o tai savo ruožtu padidino spermatozoidų netekimą dėl gimdos ir makšties jungties greičio, bet neturėjo įtakos spermatozoidų ir kiaušialąsčių atpažinimui.
Kalakutų sėklidės plėvelės spindyje Bakstas ir Bauchanas 11 rado mažų pūslelių ir membranos fragmentų ir pastebėjo, kad kai kurios iš šių granulių susiliejo su spermos membrana. Autoriai teigia, kad šie ryšiai gali prisidėti prie ilgalaikio spermatozoidų saugojimo sėklidės plėvelėje. Tačiau tyrėjai nenurodė šių dalelių šaltinio: ar jas išskiria CCT epitelio ląstelės, ar jas gamina ir išskiria patinų reprodukcinė sistema, ar jas gamina pats spermatozoidas. Be to, šios dalelės yra atsakingos už agliutinaciją. Grützner ir kt. 27 pranešė, kad sėklidės prielipo epitelio ląstelės gamina ir išskiria specifinį baltymą, kuris yra būtinas vienos poros sėklinių takų formavimuisi. Autoriai taip pat praneša, kad šių pluoštų išsisklaidymas priklauso nuo sėklidės prielipo baltymų sąveikos. Nixon ir kt. 28 nustatė, kad priedai išskiria baltymą – rūgštinį cisteinu turtingą osteonektiną; SPARC dalyvauja spermatozoidų kuokštelių formavime trumpasnapėse echidnose ir aukšlėse. Šių spindulių išsisklaidymas yra susijęs su šio baltymo praradimu.
Šiame tyrime atlikta ultrastruktūrinė analizė, naudojant elektroninę mikroskopiją, parodė, kad spermatozoidai prilipo prie didelio kiekio tankios medžiagos. Manoma, kad šios medžiagos yra atsakingos už agliutinaciją, kuri kondensuojasi tarp ir aplink prilipusias galvutes, tačiau mažesnėmis koncentracijomis uodegos srityje. Manome, kad ši agliutinuojanti medžiaga išsiskiria iš patinų reprodukcinės sistemos (sėklidžio prielipo arba sėklinio latako) kartu su sperma, nes dažnai stebime, kaip sperma atsiskiria nuo limfos ir sėklinės plazmos ejakuliacijos metu. Buvo pranešta, kad paukščių spermatozoidams, praeinant per prielipą ir sėklinį lataką, vyksta su brendimu susiję pokyčiai, kurie palaiko jų gebėjimą jungtis su baltymais ir įgyti su plazmos lema susijusių glikoproteinų. Šių baltymų išlikimas ant rezidentinių spermatozoidų membranų SST rodo, kad šie baltymai gali turėti įtakos spermatozoidų membranų stabilumo įgijimui30 ir nulemti jų vaisingumą31. Ahammad ir kt.32 pranešė, kad spermatozoidai, gauti iš įvairių patinų reprodukcinės sistemos dalių (nuo sėklidžių iki distalinio sėklidės latako), laikant skystyje, nepriklausomai nuo laikymo temperatūros, parodė laipsnišką gyvybingumo didėjimą, o vištų gyvybingumas taip pat padidėja kiaušintakiuose po dirbtinio apvaisinimo.
Šarkaši vištų spermatozoidų kuokšteliai pasižymi kitokiomis savybėmis ir funkcijomis nei kitų rūšių, tokių kaip echidnos, ančiuviai, miškinės pelės, elninės žiurkės ir jūrų kiaulytės. Šarkaši vištoms spermatozoidų pluoštų susidarymas sumažino jų plaukimo greitį, palyginti su pavieniais spermatozoidais. Tačiau šie pluoštai padidino reologiškai teigiamų spermatozoidų procentinę dalį ir padidino spermatozoidų gebėjimą stabilizuotis dinamiškoje aplinkoje. Taigi, mūsų rezultatai patvirtina ankstesnę prielaidą, kad spermatozoidų agliutinacija SST metu yra susijusi su ilgalaikiu spermatozoidų saugojimu. Mes taip pat keliame hipotezę, kad spermatozoidų polinkis formuoti kuokštelius gali kontroliuoti spermatozoidų netekimo greitį SST metu, o tai gali pakeisti spermatozoidų konkurencijos rezultatus. Remiantis šia prielaida, spermatozoidai, turintys mažą agliutinacijos pajėgumą, pirmiausia išskiria SST, o spermatozoidai, turintys didelį agliutinacijos pajėgumą, sukuria didžiąją dalį palikuonių. Vienaporių spermatozoidų pluoštų susidarymas yra naudingas ir veikia tėvų ir vaikų santykį, tačiau naudoja kitokį mechanizmą. Echidnų ir aukšlinių blakių spermatozoidai išsidėstę lygiagrečiai vienas kitam, kad padidėtų spindulio greitis. Echidnų pluoštai juda maždaug tris kartus greičiau nei pavieniai spermatozoidai. Manoma, kad tokių spermatozoidų kuokštelių susidarymas echidnoms yra evoliucinė adaptacija siekiant išlaikyti dominavimą, nes patelės yra palaidos ir paprastai poruojasi su keliais patinais. Todėl skirtingų ejakuliatų spermatozoidai aršiai konkuruoja dėl kiaušialąstės apvaisinimo.
Šarkasi vištų agliutinuotus spermatozoidus lengva vizualizuoti naudojant fazinio kontrasto mikroskopiją, kuri laikoma privalumu, nes leidžia lengvai tirti spermatozoidų elgesį in vitro. Mechanizmas, kuriuo spermatozoidų kuokštelių formavimasis skatina dauginimąsi šarkasi vištose, taip pat skiriasi nuo mechanizmo, stebimo kai kuriuose placentos žinduoliuose, kurie reprezentuoja kooperatyvų spermatozoidų elgesį, pavyzdžiui, miškinėse pelėse, kur kai kurie spermatozoidai pasiekia kiaušinėlius, padėdami kitiems giminingiems individams pasiekti ir pažeisti jų kiaušinėlius. įrodyti save. altruistinis elgesys. savęs apvaisinimas 34. Kitas kooperatyvaus spermatozoidų elgesio pavyzdys buvo rastas elnių pelėse, kur spermatozoidai sugebėjo identifikuoti ir susijungti su genetiškai labiausiai susijusiais spermatozoidais ir sudaryti kooperatyvines grupes, kad padidintų savo greitį, palyginti su negiminingais spermatozoidais 35.
Šio tyrimo rezultatai neprieštarauja Fomano teorijai apie ilgalaikį spermatozoidų saugojimą kiaušintakiuose (SWS). Tyrėjai teigia, kad spermatozoidai ilgą laiką juda SST dengiančių epitelio ląstelių sraute, o po tam tikro laiko spermatozoidų energijos atsargos išeikvojamos, todėl sumažėja greitis, o tai leidžia išstumti mažos molekulinės masės medžiagas. Šiame tyrime pastebėjome, kad pusė pavienių spermatozoidų gebėjo plaukti prieš tekančius skysčius, o jų sukibimas su ryšuliu padidino jų gebėjimą parodyti teigiamą reologiją. Be to, mūsų duomenys atitinka Matsuzaki ir kt. duomenis, kurie pranešė, kad padidėjusi laktato sekrecija SST gali slopinti rezidentų spermatozoidų judrumą. Tačiau mūsų rezultatai apibūdina spermatozoidų judriųjų raiščių susidarymą ir jų reologinį elgesį dinamiškoje aplinkoje mikrokanale, siekiant išsiaiškinti jų elgesį SST. Būsimi tyrimai gali būti sutelkti į agliutinuojančio agento cheminės sudėties ir kilmės nustatymą, o tai neabejotinai padės tyrėjams sukurti naujus skystos spermos laikymo būdus ir padidinti vaisingumo trukmę.
Tyrimui spermos donorais buvo atrinkti penkiolika 30 savaičių amžiaus plikų kaklių šarkašių patinų (homozigotiniai dominantiniai; Na Na). Paukščiai buvo auginami Ašito universiteto Žemės ūkio fakulteto, Ašito gubernijos, Egipto, tyrimų paukštyne. Paukščiai buvo laikomi atskiruose narvuose (30 x 40 x 40 cm), jiems buvo taikoma šviesos programa (16 valandų šviesos ir 8 valandos tamsos) ir šeriami pašaru, kuriame buvo 160 g žalių baltymų, 2800 kcal metabolizuojamos energijos, 35 g kalcio kiekviename. 5 gramai fosforo vienam pašaro kilogramui.
Remiantis 36, 37 duomenimis, sperma iš patinų buvo surinkta atliekant pilvo masažą. Iš viso per 3 dienas iš 15 vyrų buvo surinkti 45 spermos mėginiai. Sperma (n = 15/dieną) buvo nedelsiant praskiesta santykiu 1:1 (v:v) „Belsville Poultry Semen Diluent“, kurio sudėtyje yra kalio difosfato (1,27 g), mononatrio glutamato monohidrato (0,867 g), fruktozės (0,5 d), bevandenio natrio acetato (0,43 g), tris(hidroksimetil)aminometano (0,195 g), kalio citrato monohidrato (0,064 g), kalio monofosfato (0,065 g), magnio chlorido (0,034 g) ir H2O (100 ml), pH = 7,5, osmoliariškumas 333 mOsm/kg38. Praskiestos spermos mėginiai pirmiausia buvo ištirti šviesos mikroskopu, siekiant užtikrinti gerą spermos kokybę (drėgmę), o po to laikomi vandens vonioje 37 °C temperatūroje iki panaudojimo per pusvalandį po surinkimo.
Spermatozoidų kinematika ir reologija aprašomos naudojant mikrofluidinių prietaisų sistemą. Spermos mėginiai buvo toliau praskiesti iki 1:40 Beltsville paukščių spermos skiedikliu, įkelti į mikrofluidinį prietaisą (žr. toliau), o kinetiniai parametrai nustatyti naudojant kompiuterizuotą spermos analizės (CASA) sistemą, anksčiau sukurtą mikrofluidinei charakterizacijai. tyrimas dėl spermatozoidų judrumo skystoje terpėje (Mechanikos inžinerijos katedra, Inžinerijos fakultetas, Asjuto universitetas, Egiptas). Įskiepį galima atsisiųsti adresu: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Buvo išmatuotas kreivės greitis (VCL, μm/s), linijinis greitis (VSL, μm/s) ir vidutinis trajektorijos greitis (VAP, μm/s). Spermatozoidų vaizdo įrašai buvo daromi naudojant apverstą „Optika XDS-3“ fazinio kontrasto mikroskopą (su 40x objektyvu), prijungtą prie „Tucson ISH1000“ kameros, 30 kadrų per sekundę greičiu 3 s. Naudokite CASA programinę įrangą, kad ištirtumėte bent tris sritis ir 500 spermatozoidų trajektorijas kiekvienam mėginiui. Įrašytas vaizdo įrašas buvo apdorotas naudojant savadarbę CASA programą. Judrumo apibrėžimas CASA įskiepyje pagrįstas spermatozoidų plaukimo greičiu, palyginti su tekėjimo greičiu, ir neapima kitų parametrų, tokių kaip judėjimas iš vienos pusės į kitą, nes nustatyta, kad jis yra patikimesnis skysčių tekėjimo metu. Reologinis judėjimas apibūdinamas kaip spermatozoidų judėjimas prieš skysčio tekėjimo kryptį. Spermatozoidai, turintys reologinių savybių, buvo padalyti iš judriųjų spermatozoidų skaičiaus; ramybės būsenos ir konvekciškai judantys spermatozoidai buvo neįtraukti į skaičių.
Visos naudotos cheminės medžiagos buvo gautos iš „Elgomhoria Pharmaceuticals“ (Kairas, Egiptas), jei nenurodyta kitaip. Įrenginys buvo pagamintas pagal El-sherry ir kt.40 aprašymą su tam tikrais pakeitimais. Mikrokanalų gamybai naudotos šios medžiagos: stiklo plokštės („Howard Glass“, Vusteris, Masačusetsas), neigiamas rezistas SU-8-25 („MicroChem“, Niutonas, Kalifornija), diacetono alkoholis („Sigma Aldrich“, Steinheimas, Vokietija) ir poliacetonas 0,-184, „Dow Corning“, Midlandas, Mičiganas). Mikrokanalai gaminami naudojant minkštąją litografiją. Pirmiausia didelės skiriamosios gebos spausdintuvu („Prismatic“, Kairas, Egiptas ir „Pacific Arts and Design“, Markamas, Ontarijas) buvo atspausdinta skaidri apsauginė veido kaukė su norimu mikrokanalų dizainu. Šablonai buvo pagaminti naudojant stiklo plokštes kaip pagrindą. Plokštelės buvo valomos acetone, izopropanolyje ir dejonizuotame vandenyje, o po to padengtos 20 µm SU8-25 sluoksniu centrifuginiu padengimu (3000 aps./min., 1 min.). Tada SU-8 sluoksniai buvo švelniai džiovinami (65 °C, 2 min. ir 95 °C, 10 min.) ir 50 s veikiami UV spinduliais. Po ekspozicijos kepami 65 °C ir 95 °C temperatūroje 1 min. ir 4 min., kad susijungtų paveikti SU-8 sluoksniai, po to 6,5 min. ryškinamas diacetono alkoholyje. Vafliai kietai kepami (200 °C temperatūroje 15 min.), kad SU-8 sluoksnis dar labiau sukietėtų.
PDMS buvo paruoštas sumaišant monomerą ir kietiklį santykiu 10:1, po to degazuotas vakuuminiame eksikatoriuje ir supiltas ant SU-8 pagrindinio rėmo. PDMS buvo kietinamas orkaitėje (120 °C, 30 min.), tada kanalai buvo išpjauti, atskirti nuo pagrindinio mišinio ir perforuoti, kad vamzdelius būtų galima pritvirtinti prie mikrokanalo įleidimo ir išleidimo angų. Galiausiai PDMS mikrokanalai buvo visam laikui pritvirtinti prie mikroskopo skaidrių naudojant nešiojamąjį vainikinių spindulių procesorių („Electro-Technic Products“, Čikaga, IL), kaip aprašyta kitur. Šiame tyrime naudoto mikrokanalo matmenys yra 200 µm × 20 µm (plotis × aukštis), o ilgis – 3,6 cm.
Mikrokanalo viduje hidrostatinio slėgio sukeltas skysčio srautas pasiekiamas palaikant skysčio lygį įleidimo rezervuare virš aukščio skirtumo Δh39 išleidimo rezervuare (1 pav.).
kur f yra trinties koeficientas, apibrėžiamas kaip f = C/Re laminariniam srautui stačiakampiame kanale, kur C yra konstanta, priklausanti nuo kanalo kraštinių santykio, L yra mikrokanalo ilgis, Vav yra vidutinis greitis mikrokanalo viduje, Dh yra kanalo hidraulinis skersmuo, g – sunkio pagreitis. Naudojant šią lygtį, vidutinį kanalo greitį galima apskaičiuoti pagal šią lygtį: