Hvala, ker ste obiskali Nature.com. Različica brskalnika, ki jo uporabljate, ima omejeno podporo za CSS. Za najboljšo izkušnjo priporočamo, da uporabite posodobljen brskalnik (ali onemogočite način združljivosti v Internet Explorerju). Medtem bomo za zagotovitev nadaljnje podpore spletno mesto prikazali brez slogov in JavaScripta.
Plodnost ptic je odvisna od njihove sposobnosti, da v tubulih za shranjevanje sperme (SST) dlje časa shranjujejo dovolj živih semenčic. Natančen mehanizem, s katerim spermiji vstopijo, se zadržujejo in zapustijo SST, ostaja sporen. Spermiji kokoši šarkasi so pokazali visoko nagnjenost k aglutinaciji, pri čemer so tvorili mobilne nitaste snope, ki vsebujejo veliko celic. Zaradi težav pri opazovanju gibljivosti in vedenja semenčic v neprozornem jajcevodu smo za preučevanje aglutinacije in gibljivosti semenčic uporabili mikrofluidno napravo s prečnim prerezom mikrokanala, podobnim prerezu semenčic. Ta študija obravnava, kako nastajajo snopi semenčic, kako se premikajo in njihovo možno vlogo pri podaljšanju bivanja semenčic v SST. Raziskali smo hitrost in reološko vedenje semenčic, ko je bil pretok tekočine ustvarjen znotraj mikrofluidnega kanala s hidrostatskim tlakom (hitrost pretoka = 33 µm/s). Spermiji ponavadi plavajo proti toku (pozitivna reologija), hitrost snopa semenčic pa je v primerjavi s posameznimi semenčici bistveno manjša. Opazili so, da se snopi spermijev gibljejo v spirali ter se povečujejo v dolžino in debelino, ko se vanje vključi več posameznih spermijev. Opazili so snope sperme, ki so se približevali stranskim stenam mikrofluidnih kanalov in se jih oprijemali, da bi se izognili pometenju s hitrostjo pretoka tekočine > 33 µm/s. Opazili so snope sperme, ki so se približevali stranskim stenam mikrofluidnih kanalov in se jih oprijemali, da bi se izognili pometenju s hitrostjo pretoka tekočine > 33 µm/s. Zabeleženo je, da se spermatozoidi približajo in prilijejo k bočnim stenkam mikrofluidnih kanalov, da bi se izognili odmetavanju s hitrostjo pretoka tekočine> 33 mkm / s. Opazili so, da se snopi sperme približujejo in oprimejo stranskih sten mikrofluidnih kanalov, da jih ne bi odneslo pri pretoku tekočine > 33 µm/s.观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速> 33 µm/s 扫过。33 µm/s 扫过。 Zabeleženo je, da se spermatozoidi približajo in prilepijo k bočnim stenkam mikrožidkostnega kanala, da bi se izognili odmetavanju toka tekočine s hitrostjo > 33 mkm/s. Opazili so, da se snopi sperme približujejo stranskim stenam mikrofluidnega kanala in se nanje oprimejo, da jih ne bi odnesel pretok tekočine s hitrostjo > 33 µm/s.Vrstična in transmisijska elektronska mikroskopija sta pokazali, da so snopi sperme podprti z obilnim gostim materialom. Pridobljeni podatki dokazujejo edinstveno mobilnost spermijev piščancev Sharkazi, pa tudi sposobnost spermijev, da se aglutinirajo in tvorijo mobilne snope, kar prispeva k boljšemu razumevanju dolgoročnega shranjevanja spermijev v SMT.
Da bi pri ljudeh in večini živali prišlo do oploditve, morajo spermiji in jajčeca prispeti na mesto oploditve ob pravem času. Zato se mora parjenje zgoditi pred ovulacijo ali med njo. Po drugi strani pa nekateri sesalci, kot so psi, pa tudi nesesalske vrste, kot so žuželke, ribe, plazilci in ptice, shranjujejo spermo v svojih reproduktivnih organih dlje časa, dokler njihova jajčeca niso pripravljena za oploditev (asinhrono oploditev 1 ). Ptice lahko ohranijo sposobnost preživetja spermijev, ki so sposobni oploditi jajčeca, 2–10 tednov2.
To je edinstvena lastnost, ki ptice loči od drugih živali, saj zagotavlja veliko verjetnost oploditve po enkratni osemenitveni oploditvi več tednov brez sočasnega parjenja in ovulacije. Glavni organ za shranjevanje sperme, imenovan tubul za shranjevanje sperme (SST), se nahaja v notranjih sluznih gubah na uterovaginalnem stiku. Do danes mehanizmi, s katerimi sperma vstopi, se zadržuje in izstopi iz banke sperme, niso povsem razumljeni. Na podlagi prejšnjih študij je bilo postavljenih veliko hipotez, vendar nobena od njih ni bila potrjena.
Forman4 je postavil hipotezo, da spermiji ohranjajo svoje bivališče v votlini SST z nenehnim nihanjem v nasprotni smeri pretoka tekočine skozi beljakovinske kanale, ki se nahajajo na epitelijskih celicah SST (reologija). ATP se izčrpa zaradi stalne aktivnosti bičkov, ki je potrebna za ohranjanje sperme v lumnu SST, gibljivost pa se sčasoma zmanjša, dokler sperme ne odnese tok tekočine iz banke sperme in začne novo pot po ascendentnem jajcevodu, da oplodi spermo. Jajčece (Forman4). Ta model shranjevanja sperme podpira imunocitokemijska detekcija akvaporinov 2, 3 in 9, prisotnih v epitelijskih celicah SST. Do danes ni študij o reologiji piščančje sperme in njeni vlogi pri shranjevanju SST, vaginalni selekciji sperme in tekmovanju sperme. Pri piščancih sperma vstopi v nožnico po naravnem parjenju, vendar se več kot 80 % sperme izvrže iz nožnice kmalu po parjenju. To kaže, da je nožnica primarno mesto za selekcijo sperme pri pticah. Poleg tega je bilo poročano, da manj kot 1 % semenčic, oplojenih v nožnici, konča v SST2. Pri umetni oploditvi piščancev v nožnici se število semenčic, ki dosežejo SST, običajno poveča 24 ur po oploditvi. Zaenkrat mehanizem izbire semenčic med tem postopkom ni jasen, gibljivost semenčic pa ima lahko pomembno vlogo pri privzemu semenčic v SST. Zaradi debelih in neprozornih sten jajcevodov je težko neposredno spremljati gibljivost semenčic v jajcevodih ptic. Zato nam primanjkuje osnovnega znanja o tem, kako semenčice po oploditvi preidejo v SST.
Reologija je bila nedavno prepoznana kot pomemben dejavnik, ki nadzoruje transport sperme v genitalijah sesalcev. Na podlagi sposobnosti gibljivih spermijev, da migrirajo v nasprotnem toku, so Zaferani in sodelavci8 uporabili mikrofluidni sistem Corra za pasivno izolacijo gibljivih spermijev iz vzorcev semena. Ta vrsta sortiranja semena je bistvena za medicinsko zdravljenje neplodnosti in klinične raziskave ter je prednostnejša od tradicionalnih metod, ki so časovno in delovno intenzivne ter lahko ogrozijo morfologijo in strukturno celovitost sperme. Vendar do danes ni bilo izvedenih nobenih študij o vplivu izločkov iz spolnih organov piščancev na gibljivost sperme.
Ne glede na mehanizem, ki ohranja shranjeno spermo v SST, so mnogi raziskovalci opazili, da se rezidenčne spermiji aglutinirajo glava na glavo v SST piščancev 9, 10, prepelic 2 in puranov 11 in tvorijo aglutinirane snope sperme. Avtorji menijo, da obstaja povezava med to aglutinacijo in dolgotrajnim shranjevanjem sperme v SST.
Tingari in Lake12 sta poročala o močni povezavi med spermiji v žlezi, ki sprejema sperme pri piščancu, in se spraševala, ali se ptičji spermiji aglutinirajo na enak način kot sesalski spermiji. Menita, da so globoke povezave med spermiji v semenovodu lahko posledica stresa, ki ga povzroča prisotnost velikega števila spermijev v majhnem prostoru.
Pri ocenjevanju vedenja spermijev na sveže visečih steklenih preparatih je mogoče opaziti prehodne znake aglutinacije, zlasti na robovih kapljic sperme. Vendar pa je bila aglutinacija pogosto motena zaradi rotacijskega delovanja, povezanega z nenehnim gibanjem, kar pojasnjuje prehodno naravo tega pojava. Raziskovalci so opazili tudi, da so se ob dodajanju redčila spermi pojavili podolgovati, "nitastim" celični agregati.
Zgodnji poskusi posnemanja spermatozoidov so bili narejeni z odstranitvijo tanke žice iz viseče kapljice, kar je povzročilo podolgovat mehurček, podoben spermi, ki je štrlel iz kapljice sperme. Spermiji so se v mehurčku takoj poravnali vzporedno, vendar je celotna enota zaradi 3D omejitve hitro izginila. Zato je za preučevanje aglutinacije spermatozoidov potrebno opazovati gibljivost in vedenje spermatozoidov neposredno v izoliranih tubulih za shranjevanje sperme, kar je težko doseči. Zato je treba razviti instrument, ki posnema spermatozoide, da bi podprli študije gibljivosti in aglutinacijskega vedenja sperme. Brillard in sod.13 so poročali, da je povprečna dolžina tubulov za shranjevanje sperme pri odraslih piščancih 400–600 µm, nekateri SST pa so lahko dolgi tudi do 2000 µm. Mero in Ogasawara14 sta semenske žleze razdelila na povečane in nepovečane tubule za shranjevanje sperme, ki sta bili enake dolžine (~500 µm) in širine vratu (~38 µm), vendar je bil povprečni premer lumna tubulov 56,6 oziroma 56,6 µm, kar je 11,2 μm. V tej študiji smo uporabili mikrofluidno napravo z velikostjo kanala 200 µm × 20 µm (Š × V), katere prečni prerez je nekoliko podoben prečnemu prerezu ojačanega SST. Poleg tega smo preučili gibljivost sperme in njeno aglutinacijsko vedenje v tekoči tekočini, kar je skladno s Foremanovo hipotezo, da tekočina, ki jo proizvajajo epitelijske celice SST, zadržuje sperme v lumnu v protitočni (reološki) smeri.
Cilj te študije je bil premagati težave pri opazovanju gibljivosti semenčic v jajcevodu in se izogniti težavam pri preučevanju reologije in vedenja semenčic v dinamičnem okolju. Uporabljena je bila mikrofluidna naprava, ki ustvarja hidrostatični tlak za simulacijo gibljivosti semenčic v genitalijah piščanca.
Ko smo v mikrokanalno napravo naložili kapljico razredčenega vzorca sperme (1:40), smo lahko prepoznali dve vrsti gibljivosti sperme (izolirano spermo in vezano spermo). Poleg tega so spermiji ponavadi plavali proti toku (pozitivna reologija; video 1, 2). Čeprav so imeli snopi spermijev manjšo hitrost kot samotni spermiji (p < 0,001), so povečali odstotek spermijev s pozitivno reotaksijo (p < 0,001; tabela 2). Čeprav so imeli snopi spermijev manjšo hitrost kot samotni spermiji (p < 0,001), so povečali odstotek spermijev s pozitivno reotaksijo (p < 0,001; tabela 2). Čeprav so bile količine spermatozoidov bolj nizke, kot pri enih spermatozoidih (p < 0,001), so povečale odstotek spermatozoidov, ki kažejo pozitiven reotaksis (p < 0,001; tabela 2). Čeprav so imeli snopi spermatozoidov nižjo hitrost kot posamezni spermatozoidi (p < 0,001), so povečali odstotek spermatozoidov s pozitivno reotaksijo (p < 0,001; tabela 2).尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0,001，但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0,001；表2）。尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0,001） ， 但 增加 了 显示 阳性 流变性 精子百分比 （p <0,001 ； 2。。。。。。）））)）) Čeprav je bila hitrost spermatozoidov nižja kot pri posameznih spermatozoidih (p < 0,001), so povečali odstotek spermatozoidov s pozitivno reologijo (p < 0,001; tabela 2). Čeprav je bila hitrost snopov spermijev nižja kot pri posameznih spermijih (p < 0,001), so povečali odstotek spermijev s pozitivno reologijo (p < 0,001; tabela 2).Pozitivna reologija za posamezne spermije in šopke je ocenjena na približno 53 % oziroma 85 %.
Ugotovljeno je bilo, da spermiji kokoši šarkaši takoj po ejakulaciji tvorijo linearne snope, ki jih sestavlja več deset posameznikov. Ti šopi se sčasoma povečajo v dolžino in debelino ter lahko ostanejo in vitro več ur, preden se razpršijo (videoposnetek 3). Ti nitasti snopi so oblikovani kot spermiji ježka, ki se oblikujejo na koncu epididimisa. Ugotovljeno je bilo, da ima sperma kokoši šarkaši veliko nagnjenost k aglutinaciji in tvorbi mrežastega snopa v manj kot eni minuti po odvzemu. Ti snopi so dinamični in se lahko prilepijo na bližnje stene ali statične predmete. Čeprav snopi sperme zmanjšujejo hitrost semenčic, je jasno, da makroskopsko povečajo njihovo linearnost. Dolžina snopov se razlikuje glede na število zbranih spermijev v snopih. Izolirana sta bila dva dela snopa: začetni del, vključno s prosto glavo aglutinirane sperme, in terminalni del, vključno z repom in celotnim distalnim koncem sperme. Z uporabo visokohitrostne kamere (950 sličic na sekundo) so v začetnem delu snopa opazili proste glave aglutiniranih spermijev, ki so zaradi svojega nihajnega gibanja odgovorne za gibanje snopa in preostale vlečejo v snop s spiralnim gibanjem (videoposnetek 4). Vendar pa je bilo pri dolgih šopih opaženo, da so se nekatere proste glave spermijev oprijele telesa, končni del šopa pa deluje kot lopatice, ki pomagajo pri premikanju šopa.
Med počasnim tokom tekočine se snopi spermijev premikajo vzporedno drug z drugim, vendar se začnejo prekrivati ​​in se lepiti na vse, kar miruje, da jih ne bi odnesel tok, ko se hitrost pretoka poveča. Snopi nastanejo, ko se peščica spermijev približa druga drugi, začnejo se sinhrono premikati in ovijati druga okoli druge, nato pa se prilepijo na lepljivo snov. Sliki 1 in 2 prikazujeta, kako se spermiji približata druga drugi in tvorijo stičišče, ko se repa ovijeta drug okoli drugega.
Raziskovalci so s hidrostatičnim tlakom ustvarili pretok tekočine v mikrokanalu, da bi preučili reologijo sperme. Uporabljen je bil mikrokanal velikosti 200 µm × 20 µm (Š × V) in dolžine 3,6 µm. Med posodami so bili nameščeni mikrokanali z brizgami, nameščenimi na koncih. Za večjo vidnost kanalov so uporabili živilsko barvilo.
Privežite medsebojne kable in dodatke na steno. Videoposnetek je bil posnet s faznokontrastnim mikroskopom. Z vsako sliko so predstavljene slike faznokontrastne mikroskopije in kartiranja. (A) Povezava med dvema tokovoma se upira toku zaradi vijačnega gibanja (rdeča puščica). (B) Povezava med snopom cevi in ​​steno kanala (rdeče puščice), hkrati sta povezana z dvema drugima snopoma (rumene puščice). (C) Snopi sperme v mikrofluidnem kanalu se začnejo povezovati med seboj (rdeče puščice) in tvorijo mrežo snopov sperme. (D) Nastanek mreže snopov sperme.
Ko je bila v mikrofluidno napravo naložena kapljica razredčene sperme in je bil ustvarjen tok, je bilo opaziti, da se je snop sperme premikal v nasprotni smeri toka. Snopi se tesno prilegajo stenam mikrokanalov, proste glave v začetnem delu snopov pa se tesno prilegajo njim (videoposnetek 5). Prav tako se oprimejo vseh mirujočih delcev na svoji poti, kot so ostanki, da jih tok ne odnese. Sčasoma se ti snopi spremenijo v dolge nitke, ki ujamejo druge posamezne spermije in krajše snope (videoposnetek 6). Ko se tok začne upočasnjevati, dolge linije sperme začnejo tvoriti mrežo linij sperme (videoposnetek 7; slika 2).
Pri visoki hitrosti pretoka (V > 33 µm/s) se spiralno gibanje niti poveča, saj poskušajo ujeti več posameznih spermijev, ki tvorijo snope, da bi se bolje uprli sili odnašanja toka. Pri visoki hitrosti pretoka (V > 33 µm/s) se spiralno gibanje niti poveča, saj poskušajo ujeti več posameznih spermijev, ki tvorijo snope, da bi se bolje uprli sili odnašanja toka. Pri visoki hitrosti toka (V > 33 mkm/s) se spiralevidna gibanja nitej usilivajo, ker poskušajo zajeti več posameznih spermatozoidov, ki tvorijo lupine, ki se najbolje upirajo drejfujočemu silnemu toku. Pri visokih pretokih (V > 33 µm/s) se spiralno gibanje pramenov poveča, saj poskušajo ujeti veliko posameznih spermijev in tvorijo snope, ki se bolje upirajo sili odnašanja toka.在高流速 (V > 33 µm/s)时，螺纹的螺旋运动增加，以试图捕捉许多形成束的单个精子，从而更好地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 ， 的 螺旋 运动 增加 ， 以 试图 许多 形成 束 单 个 精子 ，从而 更 地 抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。 Pri visokih hitrostih toka (V > 33 mkm/s) se spiralno gibanje nitej poveča v poskusu zajetja množice posameznih spermatozoidov, ki tvorijo jajca, da se bolje soprotstavijo sili drejfa toka. Pri visokih pretokih (V > 33 µm/s) se vijačno gibanje filamentov poveča v poskusu, da bi zajeli več posameznih spermijev, ki tvorijo snope, da bi se bolje uprli silam odnašanja toka.Poskušali so tudi pritrditi mikrokanale na stranske stene.
S pomočjo svetlobne mikroskopije (LM) so bili snopi spermijev identificirani kot skupki glav spermijev in zvitih repov. Snopi spermijev z različnimi agregati so bili identificirani tudi kot zvite glave in bičkasti agregati, več zraščenih repov spermijev, glave spermijev, pritrjene na rep, in glave spermijev z upognjenimi jedri kot več zraščenih jeder. Transmisijska elektronska mikroskopija (TEM). Vrstična elektronska mikroskopija (SEM) je pokazala, da so snopi spermijev obloženi agregati glav spermijev, agregati spermijev pa so kazali pritrjeno mrežo zavitih repov.
Morfologijo in ultrastrukturo spermatozoidov ter nastanek snopov spermatozoidov smo preučevali s svetlobno mikroskopijo (polovični prerez), vrstično elektronsko mikroskopijo (SEM) in transmisijsko elektronsko mikroskopijo (TEM), razmaze sperme smo obarvali z akridin oranžom in pregledali z epifluorescenčno mikroskopijo.
Barvanje razmaza sperme z akridinskim oranžom (slika 3B) je pokazalo, da so bile glave spermijev zlepljene skupaj in prekrite z izločevalnim materialom, kar je povzročilo nastanek velikih šopov (slika 3D). Snopi spermijev so bili sestavljeni iz agregatov spermijev z mrežo pritrjenih repov (slika 4A-C). Snopi spermijev so sestavljeni iz repov številnih spermijev, zlepljenih skupaj (slika 4D). Izločbe (slika 4E, F) so prekrivale glave snopov spermijev.
Nastanek snopa spermijev Z uporabo faznokontrastne mikroskopije in razmaza sperme, obarvanega z akridin oranžom, smo pokazali, da se glave spermijev držijo skupaj. (A) Zgodnje nastajanje šopov spermijev se začne s spermijem (bel krog) in tremi spermiji (rumen krog), pri čemer se spirala začne pri repu in konča pri glavi. (B) Fotomikrografija razmaza sperme, obarvanega z akridin oranžom, ki prikazuje prilepljene glave spermijev (puščice). Izcedek prekriva glavo(-e). Povečava × 1000. (C) Razvoj velikega snopa, ki ga prenaša tok v mikrofluidnem kanalu (z uporabo visokohitrostne kamere pri 950 sličicah na sekundo). (D) Mikrografija razmaza sperme, obarvanega z akridin oranžom, ki prikazuje velike šope (puščice). Povečava: ×200.
Slika snopa sperme in razmaz sperme, obarvan z akridin oranžo, posneta z vrstičnim elektronskim mikrografijem. (A, B, D, E) so digitalne barvne vrstične elektronske mikrografije spermatozoidov, C in F pa sta mikrografiji razmazov sperme, obarvanih z akridin oranžo, ki prikazujejo pritrditev več spermatozoidov, ki ovijajo repno mrežo. (AC) Agregati sperme so prikazani kot mreža pritrjenih repov (puščice). (D) Adhezija več spermatozoidov (z lepilno snovjo, rožnat obris, puščica), ki se ovijajo okoli repa. (E in F) Agregati glav sperme (kazalci), prekriti z lepilnim materialom (kazalci). Spermatozoidi so tvorili snope z več vrtinčastimi strukturami (F). Povečave (C) ×400 in (F) ×200.
Z uporabo transmisijske elektronske mikroskopije smo ugotovili, da imajo snopi spermijev pritrjene repke (slika 6A, C), glave, pritrjene na repke (slika 6B), ali glave, pritrjene na repke (slika 6D). Glave spermijev v snopu so ukrivljene, na prerezu pa predstavljajo dve jedrni območji (slika 6D). V zareznem snopu so imeli spermiji zavito glavo z dvema jedrnima območjema in več flagelarnimi območji (slika 5A).
Digitalna barvna elektronska mikrografija, ki prikazuje povezovalne repe v snopu spermijev in aglutinacijski material, ki povezuje glave spermijev. (A) Pritrjen rep velikega števila spermijev. Bodite pozorni na to, kako je rep videti v pokončni (puščica) in ležeči (puščica) projekciji. (B) Glava (puščica) spermijev je povezana z repom (puščica). (C) Pritrjenih je več repov spermijev (puščice). (D) Aglutinacijski material (AS, moder) povezuje štiri glave spermijev (vijolična).
Za odkrivanje glav semenčic v snopkih semenčic, prekritih z izločki ali membranami (slika 6B), je bila uporabljena vrstična elektronska mikroskopija, kar kaže, da so bili snopi semenčic zasidrani z zunajceličnim materialom. Aglutinirani material se je koncentriral v glavi semenčic (združitev, podobna glavi meduze; slika 5B) in se distalno razširil, kar je pod fluorescenčno mikroskopijo, obarvana z akridin oranžno (slika 6C), dalo briljantno rumen videz. Ta snov je jasno vidna pod vrstičnim mikroskopom in velja za vezivo. Poltanki rezi (slika 5C) in razmazi sperme, obarvani z akridin oranžno, so pokazali snope semenčic, ki so vsebovali gosto zbrane glave in zavite repke (slika 5D).
Različne fotomikrografije, ki prikazujejo agregacijo glav in zvitih repov semenčic z uporabo različnih metod. (A) Prečni prerez digitalne barvne transmisijske elektronske mikrografije snopa semenčic, ki prikazuje zvito glavo semenčic z dvodelnim jedrom (modro) in več bičkovimi deli (zeleno). (B) Digitalna barvna vrstična elektronska mikrografija, ki prikazuje skupek glav semenčic, podobnih meduzam (puščice), ki so videti prekrite. (C) Poltanek prerez, ki prikazuje agregirane glave semenčic (puščice) in zvite repe (puščice). (D) Mikrografija razmaza sperme, obarvanega z akridinskim oranžom, ki prikazuje agregate glav semenčic (puščice) in zvite prilepljene repe (puščice). Upoštevajte, da lepljiva snov (S) prekriva glavo semenčica. (D) Povečava × 1000.
Z uporabo transmisijske elektronske mikroskopije (slika 7A) je bilo ugotovljeno tudi, da so bile glave spermijev zvite, jedra pa so imela spiralno obliko, kar so potrdili razmazi sperme, obarvani z akridin oranžom in pregledani s fluorescenčno mikroskopijo (slika 7B).
(A) Digitalna barvna transmisijska elektronska mikrografija in (B) razmaz sperme, obarvan z akridinskim oranžom, ki prikazuje zvite glave in pritrditev glav in repov spermijev (puščice). (B) × 1000-kratna povečava.
Zanimiva ugotovitev je, da se Sharkazijeva sperma združuje v mobilne nitaste snope. Lastnosti teh snopov nam omogočajo razumevanje njihove morebitne vloge pri absorpciji in shranjevanju spermijev v SST.
Po parjenju spermiji vstopijo v nožnico in so podvrženi intenzivnemu procesu selekcije, zaradi česar v SST vstopi le omejeno število spermijev15,16. Do danes mehanizmi, s katerimi spermiji vstopajo in izstopajo iz SST, niso jasni. Pri perutnini se spermiji shranjujejo v SST dlje časa, od 2 do 10 tednov, odvisno od vrste6. O stanju sperme med shranjevanjem v SST še vedno obstajajo polemike. Ali se gibljejo ali mirujejo? Z drugimi besedami, kako spermiji tako dolgo ohranjajo svoj položaj v SST?
Forman4 je predlagal, da bi lahko zadrževanje in izmet SST pojasnili z gibljivostjo spermijev. Avtorji postavljajo hipotezo, da spermiji ohranjajo svoj položaj s plavanjem proti toku tekočine, ki ga ustvarja epitelij SST, in da se spermiji izvržejo iz SST, ko njihova hitrost pade pod točko, kjer se zaradi pomanjkanja energije začnejo premikati nazaj. Zaniboni5 je potrdil prisotnost akvaporinov 2, 3 in 9 v apikalnem delu epitelijskih celic SST, kar lahko posredno podpira Foremanov model shranjevanja sperme. V trenutni študiji smo ugotovili, da skoraj polovica Sharkashijevih spermijev kaže pozitivno reologijo v tekoči tekočini in da aglutinirani snopi spermijev povečajo število spermijev s pozitivno reologijo, čeprav jih aglutinacija upočasni. Kako spermiji potujejo po jajcevodu ptice do mesta oploditve, ni povsem razumljeno. Pri sesalcih folikularna tekočina kemoatraktantov usmerja spermije, da se približajo na dolge razdalje7. Zato so za transport sperme odgovorni drugi mehanizmi. Sposobnost sperme, da se orientira in teče proti tekočini jajcevoda, ki se sprosti po parjenju, naj bi bila glavni dejavnik pri ciljanju sperme pri miših. Parker17 je predlagal, da spermiji prečkajo jajcevode tako, da plavajo proti ciliarnemu toku pri pticah in plazilcih. Čeprav to pri pticah ni bilo eksperimentalno dokazano, je Adolphi18 prvi ugotovil, da ptičja sperma daje pozitivne rezultate, ko se s trakom filtrirnega papirja ustvari tanka plast tekočine med krovnim stekelcem in stekelcem. Reologija. Hino in Yanagimachi [19] sta mišji kompleks jajčnikov, jajcevodov in maternice postavila v perfuzijski obroč in vbrizgala 1 µl črnila v prežino, da bi vizualizirala pretok tekočine v jajcevodih. Opazila sta zelo aktivno gibanje krčenja in sproščanja v jajcevodu, pri katerem so se vse kroglice črnila enakomerno premikale proti ampuli jajcevoda. Avtorja poudarjata pomen pretoka tekočine v jajcevodih iz spodnjega v zgornji del jajcevoda za dvig in oploditev sperme. Brillard20 je poročal, da se pri piščancih in puranih spermiji aktivno premikajo od vaginalnega vhoda, kjer se shranjujejo, do uterovaginalnega stika, kjer se shranjujejo. Vendar to gibanje ni potrebno med uterovaginalnim stikom in infundibulumom, ker se spermiji prenašajo s pasivnim premikanjem. Glede na ta prejšnja priporočila in rezultate, pridobljene v trenutni študiji, lahko sklepamo, da je sposobnost spermatozoidov, da se premikajo navzgor (reologija), ena od lastnosti, na katerih temelji proces selekcije. To določa prehod spermatozoidov skozi nožnico in njihov vstop v CCT za shranjevanje. Kot je predlagal Forman4, lahko to olajša tudi proces vstopa sperme v SST in njen habitat za določeno obdobje ter nato izstopa, ko se njihova hitrost začne upočasnjevati.
Po drugi strani pa sta Matsuzaki in Sasanami21 predlagala, da se gibljivost ptičjih spermijev v moškem in ženskem reproduktivnem traktu spremeni iz mirovanja v gibljivost. Zaviranje gibljivosti rezidenčnih spermijev v SST je bilo predlagano kot pojasnilo za dolg čas shranjevanja sperme in nato pomlajevanje po odhodu iz SST. V hipoksičnih pogojih so Matsuzaki in sod.1 poročali o visoki proizvodnji in sproščanju laktata v SST, kar lahko vodi do zaviranja gibljivosti rezidenčnih spermijev. V tem primeru se pomen reologije spermijev odraža v izbiri in absorpciji spermijev, ne pa v njihovem shranjevanju.
Vzorec aglutinacije sperme velja za verjetno razlago za dolgo obdobje shranjevanja sperme v SST, saj je to pogost vzorec zadrževanja sperme pri perutnini2,22,23. Bakst in sod.2 so opazili, da se je večina spermijev oprijela drug drugega in tvorila fascikularne agregate, posamezne spermije pa so redko našli v prepeličji CCM. Po drugi strani pa so Wen in sod.24 opazili več razpršenih spermijev in manj šopkov spermijev v lumnu SST pri piščancih. Na podlagi teh opažanj lahko sklepamo, da se nagnjenost k aglutinaciji sperme razlikuje med pticami in med spermiji v istem ejakulatu. Poleg tega so Van Krey in sod.9 predlagali, da je naključna disociacija aglutiniranih spermijev odgovorna za postopno prodiranje spermijev v lumen jajcevoda. V skladu s to hipotezo bi morali spermiji z nižjo aglutinacijsko sposobnostjo najprej izločiti iz SST. V tem kontekstu je lahko sposobnost aglutinacije semenčic dejavnik, ki vpliva na izid tekmovanja semenčic pri umazanih pticah. Poleg tega, dlje ko se aglutinirana sperma disociira, dlje se ohranja plodnost.
Čeprav so v več študijah2,22,24 opazili agregacijo in agregacijo spermijev v snope, zaradi kompleksnosti njihovega kinematičnega opazovanja v SST niso bili podrobno opisani. Večkrat so poskušali preučiti aglutinacijo spermijev in vitro. Obsežno, a prehodno agregacijo so opazili, ko so tanko žico odstranili iz viseče kapljice semena. To vodi do dejstva, da iz kapljice štrli podolgovat mehurček, ki posnema semensko žlezo. Zaradi 3D-omejitev in kratkih časov sušenja s kapljanjem je celoten blok hitro propadel9. V trenutni študiji smo z uporabo piščancev Sharkashi in mikrofluidnih čipov lahko opisali, kako ti snopi nastanejo in kako se premikajo. Snopi spermijev so se oblikovali takoj po odvzemu sperme in ugotovili, da se gibljejo v spirali, kar kaže na pozitivno reologijo, ko so prisotni v toku. Poleg tega so pri makroskopskem pregledu opazili, da snopi spermijev povečajo linearnost gibljivosti v primerjavi z izoliranimi spermiji. To nakazuje, da lahko do aglutinacije spermijev pride pred penetracijo SST in da proizvodnja spermijev ni omejena na majhno območje zaradi stresa, kot je bilo prej predlagano (Tingari in Lake12). Med nastajanjem čopov spermiji plavajo sinhrono, dokler ne tvorijo stičišča, nato se njihovi repi ovijejo drug okoli drugega in glava spermatozoida ostane prosta, rep in distalni del spermatozoida pa se zlepita z lepljivo snovjo. Zato je za gibanje odgovorna prosta glava vezi, ki vleče preostanek vezi. Vrstična elektronska mikroskopija snopov spermijev je pokazala pritrjene glave spermijev, prekrite z veliko lepljive snovi, kar kaže na to, da so bile glave spermijev pritrjene v mirujočih snopih, kar se je morda zgodilo po dosegu mesta shranjevanja (SST).
Ko razmaz sperme obarvamo z akridin oranžom, lahko pod fluorescentnim mikroskopom vidimo zunajcelični adhezivni material okoli semenčic. Ta snov omogoča, da se snopi sperme oprimejo in prilepijo na vse okoliške površine ali delce, tako da jih ne odnaša okoliški tok. Naša opazovanja tako kažejo na vlogo adhezije spermijev v obliki mobilnih snopov. Njihova sposobnost plavanja proti toku in oprijemanja bližnjih površin omogoča spermi, da dlje ostanejo v SST.
Rothschild25 je uporabil hemocitometrično kamero za preučevanje lebdeče porazdelitve goveje sperme v kapljici suspenzije, pri čemer je posnel fotomikrografije s kamero z navpično in vodoravno optično osjo mikroskopa. Rezultati so pokazali, da so spermiji privlačeni na površino komore. Avtorji domnevajo, da lahko pride do hidrodinamičnih interakcij med spermo in površino. Če upoštevamo to, skupaj s sposobnostjo sperme piščancev Sharkashi, da tvori lepljive šope, se lahko poveča verjetnost, da se bo sperma oprijela stene SST in se bo shranjevala dlje časa.
Bccetti in Afzeliu26 sta poročala, da je glikokaliks sperme potreben za prepoznavanje in aglutinacijo gamet. Forman10 je opazil, da je hidroliza α-glikozidnih vezi v glikoproteinsko-glikolipidnih oblogah z obdelavo ptičje sperme z nevraminidazo povzročila zmanjšano plodnost, ne da bi to vplivalo na gibljivost sperme. Avtorja menita, da učinek nevraminidaze na glikokaliks poslabša sekvestracijo sperme na uterovaginalnem stiku, s čimer se zmanjša plodnost. Njuna opažanja ne morejo prezreti možnosti, da lahko zdravljenje z nevraminidazo zmanjša prepoznavanje sperme in oocitov. Forman in Engel10 sta ugotovila, da se je plodnost zmanjšala, ko so bile kokoši intravaginalno osemenjene s spermo, obdelano z nevraminidazo. Vendar pa IVF s spermo, obdelano z nevraminidazo, ni vplival na plodnost v primerjavi s kontrolnimi piščanci. Avtorji so zaključili, da spremembe v glikoproteinsko-glikolipidni prevleki okoli membrane sperme zmanjšajo sposobnost oploditve sperme, saj poslabšajo sekvestracijo sperme na uterovaginalnem stiku, kar posledično poveča izgubo sperme zaradi hitrosti uterovaginalnega stiku, vendar ne vpliva na prepoznavanje sperme in jajčec.
Pri puranih sta Bakst in Bauchan 11 v lumnu SST odkrila majhne vezikle in delce membrane ter opazila, da so se nekatere od teh granul zlile z membrano sperme. Avtorja menita, da lahko te povezave prispevajo k dolgotrajnemu shranjevanju spermijev v SST. Vendar raziskovalci niso navedli vira teh delcev, ali jih izločajo epitelijske celice CCT, jih proizvaja in izloča moški reproduktivni sistem ali pa jih proizvaja sama sperma. Ti delci so odgovorni tudi za aglutinacijo. Grützner in sod.27 so poročali, da epitelijske celice epididimisa proizvajajo in izločajo specifično beljakovino, ki je potrebna za tvorbo semenskih poti z eno poro. Avtorja poročata tudi, da je razpršitev teh snopov odvisna od interakcije epididimalnih beljakovin. Nixon in sod.28 so ugotovili, da adneksi izločajo beljakovino, kisli osteonektin, bogat s cisteinom; SPARC sodeluje pri tvorbi snopov sperme pri kratkokljunih ehidnah in platipusih. Razprševanje teh žarkov je povezano z izgubo te beljakovine.
V trenutni študiji je ultrastrukturna analiza z uporabo elektronske mikroskopije pokazala, da so se spermiji oprijeli velike količine gostega materiala. Domneva se, da so te snovi odgovorne za aglutinacijo, ki se kondenzira med in okoli oprijetih glavic, vendar v nižjih koncentracijah v repnem predelu. Predvidevamo, da se ta aglutinacijska snov izloča iz moškega reproduktivnega sistema (epididimis ali semenovod) skupaj s semenom, saj pogosto opazimo, da se seme med ejakulacijo loči od limfe in semenske plazme. Poročali so, da ptičji spermiji, ko prehajajo skozi epididimis in semenovod, doživijo spremembe, povezane z zorenjem, ki podpirajo njihovo sposobnost vezave beljakovin in pridobivanja glikoproteinov, povezanih z lemo plazme. Obstojnost teh beljakovin na membranah rezidenčnih spermijev v SST kaže, da lahko te beljakovine vplivajo na pridobitev stabilnosti membrane spermijev 30 in določajo njihovo plodnost 31. Ahammad in sod.32 so poročali, da so spermiji, pridobljeni iz različnih delov moškega reproduktivnega sistema (od mod do distalnega semenovoda), pokazali postopno povečanje viabilnosti v tekočih pogojih shranjevanja, ne glede na temperaturo shranjevanja, viabilnost pri piščancih pa se poveča tudi v jajcevodih po umetni oploditvi.
Šopi sperme pri piščancih šarkaši imajo drugačne značilnosti in funkcije kot pri drugih vrstah, kot so ehidne, platipusi, lesne miši, jelenje podgane in morski prašički. Pri piščancih šarkaši je tvorba snopov sperme zmanjšala njihovo hitrost plavanja v primerjavi s posameznimi spermiji. Vendar pa so ti snopi povečali odstotek reološko pozitivnih spermijev in povečali sposobnost spermijev, da se stabilizirajo v dinamičnem okolju. Tako naši rezultati potrjujejo prejšnjo domnevo, da je aglutinacija sperme pri SST povezana z dolgotrajnim shranjevanjem sperme. Prav tako postavljamo hipotezo, da lahko nagnjenost sperme k tvorbi šopov nadzoruje hitrost izgube sperme pri SST, kar lahko spremeni izid tekmovanja sperme. V skladu s to predpostavko spermiji z nizko aglutinacijsko sposobnostjo najprej sprostijo SST, medtem ko spermiji z visoko aglutinacijsko sposobnostjo proizvedejo večino potomcev. Tvorba snopov sperme z eno poro je koristna in vpliva na razmerje med starši in otroki, vendar uporablja drugačen mehanizem. Pri ehidnah in platipusih so spermiji razporejeni vzporedno drug ob drugem, da se poveča hitrost gibanja žarka naprej. Snopi ehidn se gibljejo približno trikrat hitreje kot posamezni spermiji. Domneva se, da je nastanek takšnih šopkov spermijev pri ehidnah evolucijska prilagoditev za ohranjanje prevlade, saj so samice promiskuitetne in se običajno parijo z več samci. Zato se spermiji iz različnih ejakulatov ostro potegujejo za oploditev jajčeca.
Aglutinirane spermiji pri piščancih sharkasi so enostavni za vizualizacijo s fazno kontrastno mikroskopijo, kar velja za prednost, saj omogoča enostavno preučevanje vedenja spermijev in vitro. Mehanizem, s katerim tvorba snopov spermijev spodbuja razmnoževanje pri piščancih sharkasi, se razlikuje tudi od mehanizma, ki ga opazimo pri nekaterih placentnih sesalcih, ki predstavljajo kooperativno vedenje spermijev, kot so gozdne miši, kjer nekateri spermiji dosežejo jajčeca in pomagajo drugim sorodnim posameznikom doseči in poškodovati njihova jajčeca. dokazati se. altruistično vedenje. Samooploditev 34. Drug primer kooperativnega vedenja pri spermijih so našli pri jelenjih miših, kjer so se spermiji lahko identificirali in združili z genetsko najbolj sorodnimi spermiji ter oblikovali kooperativne skupine, da bi povečali svojo hitrost v primerjavi s nepovezanimi spermiji35.
Rezultati te študije ne nasprotujejo Fomanovi teoriji o dolgotrajnem shranjevanju spermijev v SST. Raziskovalci poročajo, da se spermiji dalj časa gibljejo v toku epitelijskih celic, ki obdajajo SST, in po določenem času se zaloge energije v spermijih izčrpajo, kar povzroči zmanjšanje hitrosti, kar omogoča izgon snovi z majhno molekulsko maso. V tej študiji smo opazili, da je polovica posameznih spermijev pokazala sposobnost plavanja proti tekočim tekočinam, njihova adhezija v snopu pa je povečala njihovo sposobnost pozitivne reologije. Poleg tega so naši podatki skladni s podatki Matsuzaki in sodelavcev, ki so poročali, da lahko povečano izločanje laktata v SST zavira gibljivost rezidenčnih spermijev. Vendar pa naši rezultati opisujejo nastanek gibljivih vezi spermijev in njihovo reološko vedenje v prisotnosti dinamičnega okolja znotraj mikrokanala, da bi pojasnili njihovo vedenje v SST. Prihodnje raziskave se bodo morda osredotočile na določanje kemične sestave in izvora aglutinirajočega sredstva, kar bo raziskovalcem nedvomno pomagalo razviti nove načine shranjevanja tekoče sperme in podaljšati trajanje plodnosti.
V študiji je bilo kot darovalcev sperme izbranih petnajst 30 tednov starih golovratih samcev šarkasijev (homozigotno dominantni; Na-Na). Ptice so bile vzrejene na Raziskovalni perutninski farmi Fakultete za kmetijstvo Univerze Ashit v governoratu Ashit v Egiptu. Ptice so bile nastanjene v posameznih kletkah (30 x 40 x 40 cm), izpostavljene svetlobnemu programu (16 ur svetlobe in 8 ur teme) in hranjene s hrano, ki je vsebovala 160 g surovih beljakovin, 2800 kcal presnovne energije in 35 g kalcija na osebo. 5 gramov razpoložljivega fosforja na kilogram hrane.
Glede na podatke 36 in 37 je bila sperma pri moških odvzeta z masažo trebuha. V 3 dneh je bilo od 15 moških odvzetih skupno 45 vzorcev sperme. Sperma (n = 15/dan) je bila takoj razredčena v razmerju 1:1 (v:v) z razredčilom za perutninsko spermo Belsville, ki vsebuje kalijev difosfat (1,27 g), mononatrijev glutamat monohidrat (0,867 g), fruktozo (0,5 d), brezvodni natrijev acetat (0,43 g), tris(hidroksimetil)aminometan (0,195 g), kalijev citrat monohidrat (0,064 g), kalijev monofosfat (0,065 g), magnezijev klorid (0,034 g) in H2O (100 ml), pH = 7,5, osmolarnost 333 mOsm/kg38. Razredčene vzorce semena smo najprej pregledali pod svetlobnim mikroskopom, da bi zagotovili dobro kakovost semena (vlažnost), nato pa smo jih shranili v vodni kopeli pri 37 °C do uporabe v pol ure po odvzemu.
Kinematika in reologija spermatozoidov sta opisani z uporabo sistema mikrofluidnih naprav. Vzorci sperme so bili dodatno razredčeni na 1:40 v razredčilu Beltsville Avian Semen Diluent, naloženi v mikrofluidno napravo (glej spodaj), kinetični parametri pa so bili določeni z uporabo sistema za računalniško analizo sperme (CASA), ki je bil predhodno razvit za mikrofluidno karakterizacijo. Vtičnik lahko prenesete na: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. Izmerjene so bile hitrost krivulje (VCL, μm/s), linearna hitrost (VSL, μm/s) in povprečna hitrost trajektorije (VAP, μm/s). Videoposnetki spermatozoidov so bili posneti z inverznim faznokontrastnim mikroskopom Optika XDS-3 (z objektivom 40x), priključenim na kamero Tucson ISH1000, pri 30 sličicah na sekundo 3 sekunde. S programsko opremo CASA preučite vsaj tri območja in 500 trajektorij sperme na vzorec. Posneti videoposnetek je bil obdelan z doma izdelano programsko opremo CASA. Definicija gibljivosti v vtičniku CASA temelji na hitrosti plavanja sperme v primerjavi s pretokom in ne vključuje drugih parametrov, kot je gibanje z ene strani na drugo, saj se je izkazalo, da je to zanesljivejše pri pretoku tekočine. Reološko gibanje je opisano kot gibanje semenčic v nasprotni smeri pretoka tekočine. Spermiji z reološkimi lastnostmi so bili deljeni s številom gibljivih spermijev; spermiji, ki so bili v mirovanju, in konvektivno gibajoči se spermiji so bili iz štetja izključeni.
Vse uporabljene kemikalije so bile pridobljene od podjetja Elgomhoria Pharmaceuticals (Kairo, Egipt), razen če ni navedeno drugače. Naprava je bila izdelana, kot so opisali El-sherry in sod. 40, z nekaj spremembami. Materiali, uporabljeni za izdelavo mikrokanalov, so vključevali steklene plošče (Howard Glass, Worcester, MA), negativni rezist SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA), diacetonski alkohol (Sigma Aldrich, Steinheim, Nemčija) in poliaceton .-184, Dow Corning, Midland, Michigan). Mikrokanali so bili izdelani z mehko litografijo. Najprej je bila na visokoločljivostnem tiskalniku (Prismatic, Kairo, Egipt in Pacific Arts and Design, Markham, ON) natisnjena prozorna zaščitna maska ​​za obraz z želeno zasnovo mikrokanalov. Masterji so bili izdelani z uporabo steklenih plošč kot substratov. Plošče so bile očiščene v acetonu, izopropanolu in deionizirani vodi ter nato prevlečene z 20 µm plastjo SU8-25 s centrifugiranjem (3000 vrt/min, 1 min). Plasti SU-8 so bile nato nežno posušene (65 °C, 2 min in 95 °C, 10 min) in izpostavljene UV-sevanju 50 sekund. Po izpostavljenosti so bile izpostavljene plasti SU-8 pečene pri 65 °C in 95 °C 1 minuto in 4 minute, da so se zamrežile, nato pa so bile izpostavljene plasti SU-8 razvite v diacetonskem alkoholu 6,5 minut. Vaflje so bile trdo pečene (200 °C, 15 min), da so se plast SU-8 dodatno strdile.
PDMS smo pripravili z mešanjem monomera in trdilca v masnem razmerju 10:1, nato pa smo ga razplinili v vakuumskem eksikatorju in vlili na glavni okvir SU-8. PDMS smo utrdili v pečici (120 °C, 30 min), nato smo izrezali kanale, jih ločili od matrice in perforirali, da smo omogočili pritrditev cevi na vhodu in izhodu mikrokanala. Nazadnje smo mikrokanale PDMS trajno pritrdili na mikroskopska stekelca s prenosnim koronskim procesorjem (Electro-Technic Products, Chicago, IL), kot je opisano drugje. Mikrokanal, uporabljen v tej študiji, meri 200 µm × 20 µm (Š × V) in je dolg 3,6 cm.
Pretok tekočine, ki ga povzroča hidrostatični tlak znotraj mikrokanala, se doseže z vzdrževanjem nivoja tekočine v vhodnem rezervoarju nad višinsko razliko Δh39 v izhodnem rezervoarju (slika 1).
kjer je f koeficient trenja, definiran kot f = C/Re za laminarni tok v pravokotnem kanalu, kjer je C konstanta, odvisna od razmerja stranic kanala, L je dolžina mikrokanala, Vav je povprečna hitrost znotraj mikrokanala, Dh je hidravlični premer kanala, g – gravitacijski pospešek. Z uporabo te enačbe lahko izračunamo povprečno hitrost kanala po naslednji enačbi: