ขอบคุณที่เข้าชม Nature.com เบราว์เซอร์ที่คุณใช้อยู่มีการรองรับ CSS อย่างจำกัด เพื่อประสบการณ์การใช้งานที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์เวอร์ชันล่าสุด (หรือปิดโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer) ในระหว่างนี้ เพื่อให้มั่นใจว่าเว็บไซต์จะยังคงได้รับการสนับสนุนต่อไป เราจะแสดงผลเว็บไซต์โดยไม่มีสไตล์และ JavaScript
ความสามารถในการสืบพันธุ์ของนกขึ้นอยู่กับความสามารถในการเก็บรักษาสเปิร์มที่ยังมีชีวิตอยู่ได้เพียงพอในระยะเวลานานในท่อเก็บสเปิร์ม (SST) กลไกที่สเปิร์มเข้าสู่ อาศัยอยู่ และออกจาก SST ยังคงเป็นที่ถกเถียงกันอยู่ สเปิร์มของไก่พันธุ์ชาร์กาซีแสดงแนวโน้มสูงที่จะจับตัวกันเป็นก้อน ก่อตัวเป็นมัดเส้นใยที่เคลื่อนที่ได้ซึ่งประกอบด้วยเซลล์จำนวนมาก เนื่องจากความยากลำบากในการสังเกตการเคลื่อนที่และพฤติกรรมของสเปิร์มในท่อนำไข่ที่ไม่โปร่งใส เราจึงใช้เครื่องมือไมโครฟลูอิดิกที่มีหน้าตัดของไมโครแชนเนลคล้ายกับสเปิร์มเพื่อศึกษาการจับตัวกันเป็นก้อนและการเคลื่อนที่ของสเปิร์ม การศึกษานี้จะกล่าวถึงวิธีการก่อตัวของมัดสเปิร์ม วิธีการเคลื่อนที่ และบทบาทที่เป็นไปได้ในการยืดระยะเวลาการอาศัยอยู่ใน SST ของสเปิร์ม เราได้ตรวจสอบความเร็วและพฤติกรรมทางรีโอโลยีของสเปิร์มเมื่อเกิดการไหลของของเหลวภายในไมโครฟลูอิดิกแชนเนลโดยแรงดันไฮโดรสแตติก (อัตราการไหล = 33 µm/s) อสุจิมีแนวโน้มที่จะว่ายทวนกระแสน้ำ (คุณสมบัติทางรีโอโลยีเป็นบวก) และความเร็วของกลุ่มอสุจิจะลดลงอย่างมากเมื่อเทียบกับอสุจิเดี่ยวๆ มีการสังเกตว่ากลุ่มอสุจิเคลื่อนที่ในลักษณะเป็นเกลียว และมีความยาวและความหนาเพิ่มขึ้นเมื่อมีอสุจิเดี่ยวๆ เข้ามามากขึ้น พบว่ากลุ่มสเปิร์มเคลื่อนที่เข้าใกล้และเกาะติดกับผนังด้านข้างของช่องไมโครฟลูอิดิกเพื่อหลีกเลี่ยงการถูกพัดพาไปด้วยความเร็วการไหลของของเหลวที่มากกว่า 33 ไมโครเมตร/วินาที พบว่ากลุ่มสเปิร์มเคลื่อนที่เข้าใกล้และเกาะติดกับผนังด้านข้างของช่องไมโครฟลูอิดิกเพื่อหลีกเลี่ยงการถูกพัดพาไปด้วยความเร็วการไหลของของเหลวที่มากกว่า 33 ไมโครเมตร/วินาที Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрофлюидных каналов, чтобы избежать сметания со скоростью потока жидкости> 33 мкм / с. มีการสังเกตพบว่ากลุ่มสเปิร์มจะเข้าใกล้และเกาะติดกับผนังด้านข้างของช่องไมโครฟลูอิดิกเพื่อหลีกเลี่ยงการถูกพัดพาไปเมื่ออัตราการไหลของของเหลวมากกว่า 33 ไมโครเมตร/วินาที观察到精子束接近并粘附在微流体通道的侧壁上，以避免被流体流速> 33 µm/s 扫过。33 µm/s ไมโครเมตร. Было замечено, что пучки сперматозоидов приближаются и прилипают к боковым стенкам микрожидкостного канала, чтобы избежать сметания потоком жидкости со скоростью > 33 мкм/с. มีการสังเกตพบว่ากลุ่มสเปิร์มจะเข้าใกล้และเกาะติดกับผนังด้านข้างของช่องไมโครฟลูอิดิกเพื่อหลีกเลี่ยงการถูกพัดพาไปโดยกระแสของเหลวที่มีความเร็วมากกว่า 33 ไมโครเมตรต่อวินาทีการใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบสแกนและแบบส่งผ่านเผยให้เห็นว่ากลุ่มสเปิร์มได้รับการรองรับด้วยวัสดุหนาแน่นจำนวนมาก ข้อมูลที่ได้แสดงให้เห็นถึงความสามารถในการเคลื่อนที่อันเป็นเอกลักษณ์ของสเปิร์มไก่สายพันธุ์ Sharkazi รวมถึงความสามารถของสเปิร์มในการรวมตัวและก่อตัวเป็นกลุ่มที่เคลื่อนที่ได้ ซึ่งมีส่วนช่วยให้เข้าใจการเก็บรักษาสเปิร์มในระยะยาวใน SMT ได้ดียิ่งขึ้น
เพื่อให้เกิดการปฏิสนธิในมนุษย์และสัตว์ส่วนใหญ่ อสุจิและไข่ต้องมาถึงบริเวณที่เกิดการปฏิสนธิในเวลาที่เหมาะสม ดังนั้น การผสมพันธุ์ต้องเกิดขึ้นก่อนหรือในเวลาเดียวกับการตกไข่ ในทางกลับกัน สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมบางชนิด เช่น สุนัข รวมถึงสัตว์ที่ไม่ใช่สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม เช่น แมลง ปลา สัตว์เลื้อยคลาน และนก สามารถเก็บอสุจิไว้ในอวัยวะสืบพันธุ์ได้เป็นเวลานานจนกว่าไข่จะพร้อมสำหรับการปฏิสนธิ (การปฏิสนธิแบบไม่พร้อมกัน 1) นกสามารถรักษาความสามารถในการปฏิสนธิของอสุจิที่สามารถผสมกับไข่ได้นาน 2-10 สัปดาห์ 2
นี่เป็นลักษณะเฉพาะที่โดดเด่นซึ่งทำให้สัตว์ปีกแตกต่างจากสัตว์อื่นๆ เนื่องจากทำให้มีโอกาสสูงที่จะเกิดการปฏิสนธิหลังจากการผสมเทียมเพียงครั้งเดียวเป็นเวลาหลายสัปดาห์โดยไม่ต้องมีการผสมพันธุ์และการตกไข่พร้อมกัน อวัยวะเก็บอสุจิหลักที่เรียกว่าท่อเก็บอสุจิ (SST) ตั้งอยู่ในรอยพับของเยื่อบุภายในบริเวณรอยต่อระหว่างมดลูกและช่องคลอด จนถึงปัจจุบัน กลไกที่อสุจิเข้า อยู่ใน และออกจากธนาคารอสุจิยังไม่เป็นที่เข้าใจอย่างถ่องแท้ จากการศึกษาในอดีต มีการตั้งสมมติฐานมากมาย แต่ยังไม่มีสมมติฐานใดได้รับการยืนยัน
Forman4 ตั้งสมมติฐานว่าสเปิร์มคงอยู่ในโพรง SST ผ่านการเคลื่อนไหวแบบสั่นอย่างต่อเนื่องสวนทางกับทิศทางการไหลของของเหลวผ่านช่องโปรตีนที่อยู่บนเซลล์เยื่อบุผิว SST (รีโอโลยี) ATP จะลดลงเนื่องจากกิจกรรมของแฟลเจลลาอย่างต่อเนื่องที่จำเป็นในการรักษาสเปิร์มให้อยู่ในลูเมน SST และความสามารถในการเคลื่อนที่ก็จะลดลงในที่สุดจนกระทั่งสเปิร์มถูกพัดพาออกจากธนาคารสเปิร์มโดยการไหลของของเหลวและเริ่มต้นการเดินทางใหม่ลงไปตามท่อนำไข่เพื่อปฏิสนธิกับไข่ (Forman4) แบบจำลองการเก็บรักษาสเปิร์มนี้ได้รับการสนับสนุนจากการตรวจพบอะควาพอริน 2, 3 และ 9 ที่มีอยู่ในเซลล์เยื่อบุผิว SST โดยวิธีอิมมูโนไซโตเคมี จนถึงปัจจุบัน การศึกษาเกี่ยวกับรีโอโลยีของน้ำอสุจิไก่และบทบาทของมันในการเก็บรักษา SST การคัดเลือกสเปิร์มในช่องคลอด และการแข่งขันของสเปิร์มยังขาดอยู่ ในไก่ สเปิร์มจะเข้าสู่ช่องคลอดหลังจากการผสมพันธุ์ตามธรรมชาติ แต่สเปิร์มมากกว่า 80% จะถูกขับออกจากช่องคลอดหลังจากผสมพันธุ์ไม่นาน สิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่าช่องคลอดเป็นแหล่งหลักในการคัดเลือกอสุจิในนก นอกจากนี้ ยังมีรายงานว่าอสุจิที่ได้รับการปฏิสนธิในช่องคลอดน้อยกว่า 1% เท่านั้นที่จะไปอยู่ในท่อนำอสุจิ (SST)2 ในการผสมเทียมลูกไก่ในช่องคลอด จำนวนอสุจิที่ไปถึงท่อนำอสุจิมีแนวโน้มเพิ่มขึ้น 24 ชั่วโมงหลังการผสมเทียม อย่างไรก็ตาม กลไกการคัดเลือกอสุจิในกระบวนการนี้ยังไม่ชัดเจน และการเคลื่อนที่ของอสุจิอาจมีบทบาทสำคัญในการดูดซึมอสุจิเข้าสู่ท่อนำอสุจิ เนื่องจากผนังท่อนำไข่มีความหนาและทึบแสง จึงยากที่จะตรวจสอบการเคลื่อนที่ของอสุจิในท่อนำไข่ของนกโดยตรง ดังนั้นเราจึงขาดความรู้พื้นฐานเกี่ยวกับวิธีการที่อสุจิเปลี่ยนไปสู่ท่อนำอสุจิหลังการปฏิสนธิ
เมื่อไม่นานมานี้ เรโอโลยีได้รับการยอมรับว่าเป็นปัจจัยสำคัญที่ควบคุมการเคลื่อนที่ของอสุจิในอวัยวะสืบพันธุ์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม โดยอาศัยความสามารถของอสุจิที่เคลื่อนไหวได้ในการเคลื่อนที่สวนทาง Zaferani และคณะ8 ได้ใช้ระบบไมโครฟลูอิดิกแบบคอร์ราเพื่อแยกอสุจิที่เคลื่อนไหวได้ออกจากตัวอย่างน้ำอสุจิที่เก็บไว้ในคอก การคัดแยกน้ำอสุจิแบบนี้มีความสำคัญต่อการรักษาภาวะมีบุตรยากทางการแพทย์และการวิจัยทางคลินิก และเป็นที่นิยมมากกว่าวิธีการแบบดั้งเดิมที่ใช้เวลาและแรงงานมาก และอาจส่งผลเสียต่อรูปร่างและโครงสร้างของอสุจิ อย่างไรก็ตาม จนถึงปัจจุบัน ยังไม่มีการศึกษาใดที่ดำเนินการเกี่ยวกับผลกระทบของสารคัดหลั่งจากอวัยวะสืบพันธุ์ของไก่ต่อการเคลื่อนไหวของอสุจิ
ไม่ว่ากลไกใดที่ช่วยรักษาสเปิร์มที่เก็บไว้ใน SST นักวิจัยหลายคนสังเกตเห็นว่าสเปิร์มที่อาศัยอยู่ใน SST จะจับกลุ่มกันแบบหัวต่อหัวในไก่ 9, 10, นกกระทา 2 และไก่งวง 11 เพื่อสร้างกลุ่มสเปิร์มที่จับกลุ่มกัน ผู้เขียนแนะนำว่ามีความเชื่อมโยงระหว่างการจับกลุ่มนี้กับการเก็บรักษาสเปิร์มใน SST ในระยะยาว
Tingari และ Lake12 รายงานถึงความสัมพันธ์ที่แน่นแฟ้นระหว่างสเปิร์มในต่อมรับสเปิร์มของไก่ และตั้งคำถามว่าสเปิร์มของนกจับตัวกันในลักษณะเดียวกับสเปิร์มของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมหรือไม่ พวกเขาเชื่อว่าการเชื่อมต่อที่ลึกซึ้งระหว่างสเปิร์มในท่ออสุจิอาจเกิดจากความเครียดที่เกิดจากการมีสเปิร์มจำนวนมากอยู่ในพื้นที่แคบๆ
เมื่อประเมินพฤติกรรมของอสุจิบนสไลด์แก้วแขวนสด จะพบสัญญาณการจับกลุ่มกันชั่วคราว โดยเฉพาะที่ขอบของหยดน้ำอสุจิ อย่างไรก็ตาม การจับกลุ่มกันมักถูกรบกวนจากการหมุนที่เกิดจากการเคลื่อนไหวอย่างต่อเนื่อง ซึ่งอธิบายถึงลักษณะชั่วคราวของปรากฏการณ์นี้ นักวิจัยยังสังเกตเห็นว่า เมื่อเติมสารเจือจางลงในน้ำอสุจิ จะปรากฏกลุ่มเซลล์ที่มีลักษณะเป็น "เส้นใย" ยาวๆ ขึ้นมา
ความพยายามในระยะแรกในการจำลองสเปิร์มนั้นทำได้โดยการดึงลวดเส้นบางๆ ออกจากหยดน้ำอสุจิที่แขวนอยู่ ซึ่งส่งผลให้เกิดถุงคล้ายสเปิร์มที่ยื่นออกมาจากหยดน้ำอสุจิ สเปิร์มจะเรียงตัวขนานกันภายในถุงนั้นทันที แต่หน่วยทั้งหมดจะหายไปอย่างรวดเร็วเนื่องจากข้อจำกัดของโครงสร้างสามมิติ ดังนั้น เพื่อศึกษาการรวมตัวของสเปิร์ม จึงจำเป็นต้องสังเกตการเคลื่อนที่และพฤติกรรมของสเปิร์มโดยตรงในท่อเก็บสเปิร์มที่แยกออกมา ซึ่งทำได้ยาก ดังนั้นจึงจำเป็นต้องพัฒนาเครื่องมือที่จำลองสเปิร์มเพื่อสนับสนุนการศึกษาการเคลื่อนที่และพฤติกรรมการรวมตัวของสเปิร์ม Brillard และคณะ¹³ รายงานว่าความยาวเฉลี่ยของท่อเก็บสเปิร์มในลูกไก่โตเต็มวัยคือ 400–600 ไมโครเมตร แต่บางท่อเก็บสเปิร์มอาจยาวถึง 2000 ไมโครเมตร Mero และ Ogasawara14 แบ่งต่อมสร้างอสุจิออกเป็นท่อเก็บอสุจิที่ขยายใหญ่และไม่ขยายใหญ่ ซึ่งทั้งสองแบบมีความยาวเท่ากัน (~500 µm) และความกว้างของคอท่อเท่ากัน (~38 µm) แต่เส้นผ่านศูนย์กลางภายในเฉลี่ยของท่อคือ 56.6 และ 56.6 µm ตามลำดับ ในการศึกษาครั้งนี้ เราใช้เครื่องมือไมโครฟลูอิดิกที่มีขนาดช่อง 200 µm × 20 µm (กว้าง × สูง) ซึ่งมีหน้าตัดใกล้เคียงกับ SST ที่ขยายใหญ่ขึ้น นอกจากนี้ เรายังตรวจสอบการเคลื่อนที่และพฤติกรรมการรวมตัวของอสุจิในของเหลวที่ไหล ซึ่งสอดคล้องกับสมมติฐานของ Foreman ที่ว่าของเหลวที่ผลิตโดยเซลล์เยื่อบุผิว SST จะกักเก็บอสุจิไว้ในท่อในทิศทางไหลสวนทาง (ทางรีโอโลยี)
งานวิจัยนี้มีจุดมุ่งหมายเพื่อแก้ไขปัญหาในการสังเกตการเคลื่อนที่ของอสุจิในท่อนำไข่ และหลีกเลี่ยงความยากลำบากในการศึกษาคุณสมบัติทางรีโอโลยีและพฤติกรรมของอสุจิในสภาพแวดล้อมแบบไดนามิก จึงได้ใช้เครื่องมือไมโครฟลูอิดิกที่สร้างแรงดันไฮโดรสแตติกเพื่อจำลองการเคลื่อนที่ของอสุจิในอวัยวะสืบพันธุ์ของไก่
เมื่อหยดตัวอย่างน้ำอสุจิที่เจือจางแล้ว (1:40) ลงในอุปกรณ์ไมโครแชนเนล จะสามารถระบุการเคลื่อนที่ของอสุจิได้สองประเภท (อสุจิที่แยกเดี่ยวและอสุจิที่เกาะติด) นอกจากนี้ อสุจิยังมีแนวโน้มที่จะว่ายทวนกระแส (การไหลแบบบวก; วิดีโอ 1, 2) แม้ว่ากลุ่มสเปิร์มจะมีอัตความเร็วต่ำกว่าสเปิร์มที่อยู่โดดเดี่ยว (p < 0.001) แต่ก็เพิ่มเปอร์เซ็นต์ของสเปิร์มที่แสดงพฤติกรรมตอบสนองต่อกระแสน้ำในเชิงบวก (p < 0.001; ตารางที่ 2) แม้ว่ากลุ่มสเปิร์มจะมีอัตความเร็วต่ำกว่าสเปิร์มที่อยู่โดดเดี่ยว (p < 0.001) แต่ก็เพิ่มเปอร์เซ็นต์ของสเปิร์มที่แสดงพฤติกรรมตอบสนองต่อกระแสน้ำในเชิงบวก (p < 0.001; ตารางที่ 2) хотя пучки сперматозоидов имели более низкую скорость, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов, демонстрирущих положительный реотаксис (p < 0,001; таблица 2). แม้ว่ากลุ่มสเปิร์มจะมีอัตความเร็วต่ำกว่าสเปิร์มเดี่ยว (p < 0.001) แต่ก็เพิ่มเปอร์เซ็นต์ของสเปิร์มที่แสดงการเคลื่อนที่ตามกระแสน้ำในเชิงบวก (p < 0.001; ตารางที่ 2)尽管精子束的速度低于孤独精子的速度（p < 0.001），但它们增加了显示阳性流变性的精子百分比（p < 0.001;表2).尽管 精子束 的 速度 低于 孤独 的 速度 （p <0.001） , 但 增加 了 显示 阳性 流变性 精子 百分比 （p <0.001 ; 2。。。。。。）))))) хотя скорость пучков сперматозоидов была ниже, чем у одиночных сперматозоидов (p < 0,001), они увеличивали процент сперматозоидов с положительной реологией (p < 0,001; таблица 2). แม้ว่าความเร็วของกลุ่มสเปิร์มจะต่ำกว่าความเร็วของสเปิร์มเดี่ยว (p < 0.001) แต่กลุ่มสเปิร์มกลับเพิ่มเปอร์เซ็นต์ของสเปิร์มที่มีคุณสมบัติทางรีโอโลยีเป็นบวก (p < 0.001; ตารางที่ 2)ค่าการไหลที่เป็นบวกสำหรับอสุจิเดี่ยวและกลุ่มอสุจิอยู่ที่ประมาณ 53% และ 85% ตามลำดับ
จากการสังเกตพบว่า อสุจิของไก่พันธุ์ชาร์กาชิจะรวมตัวกันเป็นมัดเส้นตรงทันทีหลังการหลั่ง โดยแต่ละมัดประกอบด้วยอสุจิหลายสิบตัว มัดเหล่านี้จะยาวและหนาขึ้นเรื่อยๆ และอาจคงอยู่ในหลอดทดลองได้นานหลายชั่วโมงก่อนที่จะสลายไป (วิดีโอ 3) มัดเส้นใยเหล่านี้มีรูปร่างคล้ายอสุจิของเม่นหนามที่ก่อตัวขึ้นที่ปลายท่อเก็บอสุจิ พบว่าน้ำอสุจิของไก่ชาร์กาชิมีแนวโน้มสูงที่จะจับตัวกันเป็นมัดและก่อตัวเป็นตาข่ายภายในเวลาไม่ถึงหนึ่งนาทีหลังจากเก็บ มัดเหล่านี้มีความเคลื่อนไหวและสามารถเกาะติดกับผนังหรือวัตถุใดๆ ที่อยู่ใกล้เคียงได้ แม้ว่ามัดอสุจิจะลดความเร็วของเซลล์อสุจิ แต่เห็นได้ชัดว่าในระดับมหภาคแล้วมันทำให้รูปร่างของอสุจิยาวขึ้น ความยาวของกลุ่มอสุจิจะแตกต่างกันไปขึ้นอยู่กับจำนวนอสุจิที่เก็บได้ในแต่ละมัด สามารถแยกกลุ่มอสุจิออกเป็นสองส่วน ได้แก่ ส่วนเริ่มต้น ซึ่งรวมถึงหัวอิสระของอสุจิที่จับตัวกันเป็นมัด และส่วนปลาย ซึ่งรวมถึงหางและปลายสุดทั้งหมดของอสุจิ จากการใช้กล้องความเร็วสูง (950 เฟรมต่อวินาที) พบว่าส่วนหัวของสเปิร์มที่เกาะกลุ่มกันอยู่นั้น ลอยอยู่เป็นอิสระในส่วนต้นของกลุ่มสเปิร์ม และเป็นสาเหตุที่ทำให้กลุ่มสเปิร์มเคลื่อนที่เนื่องจากการเคลื่อนที่แบบสั่น ทำให้ส่วนที่เหลือถูกดึงเข้าไปในกลุ่มด้วยการเคลื่อนที่แบบเกลียว (วิดีโอ 4) อย่างไรก็ตาม ในกลุ่มสเปิร์มที่ยาว พบว่าส่วนหัวของสเปิร์มบางส่วนเกาะติดกับลำตัว และส่วนปลายของกลุ่มสเปิร์มทำหน้าที่เหมือนใบเรือช่วยผลักดันกลุ่มสเปิร์มให้เคลื่อนที่ไปข้างหน้า
ขณะที่อยู่ในกระแสน้ำที่ไหลช้าๆ กลุ่มสเปิร์มจะเคลื่อนที่ขนานกัน แต่พวกมันจะเริ่มซ้อนทับกันและเกาะติดกับทุกสิ่งที่อยู่นิ่ง เพื่อไม่ให้ถูกกระแสน้ำพัดพาไปเมื่อความเร็วของกระแสน้ำเพิ่มขึ้น กลุ่มสเปิร์มจะก่อตัวขึ้นเมื่อเซลล์สเปิร์มจำนวนหนึ่งเข้าใกล้กัน พวกมันจะเริ่มเคลื่อนที่พร้อมกันและพันรอบกัน จากนั้นจึงเกาะติดกับสารเหนียว รูปที่ 1 และ 2 แสดงให้เห็นว่าสเปิร์มเข้าใกล้กันอย่างไร โดยก่อตัวเป็นจุดเชื่อมต่อเมื่อหางของสเปิร์มพันรอบกัน
นักวิจัยใช้แรงดันไฮโดรสแตติกเพื่อสร้างการไหลของของเหลวในไมโครแชนเนลเพื่อศึกษาคุณสมบัติทางรีโอโลยีของอสุจิ โดยใช้ไมโครแชนเนลที่มีขนาด 200 µm × 20 µm (กว้าง × สูง) และความยาว 3.6 µm ใช้ไมโครแชนเนลระหว่างภาชนะที่มีกระบอกฉีดยาติดอยู่ที่ปลาย และใช้สีผสมอาหารเพื่อให้มองเห็นแชนเนลได้ชัดเจนยิ่งขึ้น
ผูกสายเคเบิลเชื่อมต่อและอุปกรณ์เสริมเข้ากับผนัง วิดีโอนี้ถ่ายด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบเฟสคอนทราสต์ ในแต่ละภาพจะมีภาพจากกล้องจุลทรรศน์แบบเฟสคอนทราสต์และภาพแผนที่แสดงอยู่ (A) การเชื่อมต่อระหว่างสองสายต้านทานการไหลเนื่องจากการเคลื่อนที่แบบเกลียว (ลูกศรสีแดง) (B) การเชื่อมต่อระหว่างกลุ่มท่อและผนังช่อง (ลูกศรสีแดง) ในขณะเดียวกันก็เชื่อมต่อกับกลุ่มท่ออีกสองกลุ่ม (ลูกศรสีเหลือง) (C) กลุ่มสเปิร์มในช่องไมโครฟลูอิดิกเริ่มเชื่อมต่อกัน (ลูกศรสีแดง) ก่อตัวเป็นโครงข่ายของกลุ่มสเปิร์ม (D) การก่อตัวของเครือข่ายกลุ่มสเปิร์ม
เมื่อหยดสเปิร์มที่เจือจางแล้วลงในอุปกรณ์ไมโครฟลูอิดิกและสร้างกระแสไหล สเปิร์มจะเคลื่อนที่สวนทางกับทิศทางการไหล กลุ่มสเปิร์มจะแนบชิดกับผนังของไมโครแชนเนล และส่วนหัวอิสระในส่วนแรกของกลุ่มจะแนบชิดกับผนังเช่นกัน (วิดีโอ 5) พวกมันยังเกาะติดกับอนุภาคที่อยู่กับที่ในเส้นทาง เช่น เศษซาก เพื่อต้านทานการถูกกระแสน้ำพัดพาไป เมื่อเวลาผ่านไป กลุ่มสเปิร์มเหล่านี้จะกลายเป็นเส้นใยยาวที่ดักจับสเปิร์มเดี่ยวอื่นๆ และกลุ่มสเปิร์มที่สั้นกว่า (วิดีโอ 6) เมื่อกระแสไหลเริ่มช้าลง เส้นสเปิร์มยาวๆ จะเริ่มก่อตัวเป็นเครือข่ายของเส้นสเปิร์ม (วิดีโอ 7; รูปที่ 2)
ที่ความเร็วการไหลสูง (V > 33 µm/s) การเคลื่อนที่แบบเกลียวของเส้นใยจะเพิ่มขึ้นเพื่อพยายามจับตัวอสุจิแต่ละตัวจำนวนมากที่รวมตัวกันเป็นมัด เพื่อต้านทานแรงพัดของกระแสน้ำได้ดีขึ้น ที่ความเร็วการไหลสูง (V > 33 µm/s) การเคลื่อนที่แบบเกลียวของเส้นใยจะเพิ่มขึ้นเพื่อพยายามจับตัวอสุจิแต่ละตัวจำนวนมากที่รวมตัวกันเป็นมัด เพื่อต้านทานแรงพัดของกระแสน้ำได้ดีขึ้น При высокой скорости потока (V > 33 мкм/с) спиралевидные движения нитей усиливаются, поскольку они пытаются поймать множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, которые лучше противостоят дрейфующей силе потока. ที่อัตราการไหลสูง (V > 33 µm/s) การเคลื่อนที่แบบเกลียวของเส้นใยจะเพิ่มขึ้น เนื่องจากพวกมันพยายามจับสเปิร์มแต่ละตัวจำนวนมาก ทำให้เกิดการรวมตัวกันเป็นมัด ซึ่งสามารถต้านทานแรงพัดของกระแสน้ำได้ดีขึ้น在高流速(V > 33 µm/s)时，螺纹的螺旋运动增加，以试上捕捉许多形成束的单个精子，从而更好地抵抗流动的漂移力。在 高 流速 (v> 33 µm/s) 时 , 的 螺旋 运动 增加 , 以 试上 许多 形成 束 单 个 精子 , 从而 更 地抵抗 的 漂移力。。。。。。。。。。 При высоких скоростях потока (V > 33 мкм/с) спиральное движение нитей увеличивается в попытке захватить множество отдельных сперматозоидов, образующих пучки, чтобы лучше сопротивляться силам дрейфа потока. ที่อัตราการไหลสูง (V > 33 µm/s) การเคลื่อนที่แบบเกลียวของเส้นใยจะเพิ่มขึ้นเพื่อพยายามจับสเปิร์มแต่ละตัวจำนวนมาก ทำให้เกิดการรวมตัวกันเป็นมัดเพื่อต้านทานแรงพัดของกระแสน้ำได้ดียิ่งขึ้นนอกจากนี้ พวกเขายังพยายามติดตั้งไมโครแชนเนลเข้ากับผนังด้านข้างด้วย
จากการใช้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง (LM) พบว่ากลุ่มของหัวสเปิร์มและหางที่ม้วนงอเป็นกลุ่มๆ นอกจากนี้ยังพบกลุ่มของหัวสเปิร์มที่มีการรวมตัวกันหลายรูปแบบ เช่น หัวที่บิดงอ กลุ่มของหางสเปิร์ม หางสเปิร์มที่เชื่อมติดกันหลายอัน หัวสเปิร์มที่ติดอยู่กับหาง และหัวสเปิร์มที่มีนิวเคลียสโค้งงอเป็นนิวเคลียสที่เชื่อมติดกันหลายอัน ส่วนการใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่งผ่าน (TEM) และกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบสแกน (SEM) พบว่ากลุ่มของหัวสเปิร์มเป็นกลุ่มของหัวสเปิร์มที่ถูกห่อหุ้ม และกลุ่มของสเปิร์มแสดงให้เห็นเครือข่ายของหางที่พันกันอยู่
ได้ทำการศึกษาลักษณะทางสัณฐานวิทยาและโครงสร้างระดับจุลภาคของอสุจิ รวมถึงการรวมกลุ่มของอสุจิ โดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง (แบบตัดครึ่ง) กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบสแกน (SEM) และกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่งผ่าน (TEM) โดยนำตัวอย่างอสุจิมาย้อมด้วยอะคริดีนออเรนจ์และตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบเอพิฟลูออเรสเซนซ์
การย้อมสีตัวอย่างอสุจิด้วยอะคริดีนออเรนจ์ (รูปที่ 3B) แสดงให้เห็นว่าหัวของอสุจิเกาะติดกันและถูกปกคลุมด้วยสารคัดหลั่ง ซึ่งนำไปสู่การก่อตัวเป็นกลุ่มก้อนขนาดใหญ่ (รูปที่ 3D) กลุ่มก้อนอสุจิประกอบด้วยกลุ่มของอสุจิที่มีหางเชื่อมต่อกันเป็นเครือข่าย (รูปที่ 4A-C) กลุ่มก้อนอสุจิประกอบด้วยหางของอสุจิหลายตัวที่เกาะติดกัน (รูปที่ 4D) สารคัดหลั่ง (รูปที่ 4E,F) ปกคลุมหัวของกลุ่มก้อนอสุจิ
การก่อตัวของกลุ่มเซลล์อสุจิ การใช้กล้องจุลทรรศน์แบบเฟสคอนทราสต์และการย้อมเซลล์อสุจิด้วยอะคริดีนออเรนจ์ แสดงให้เห็นว่าส่วนหัวของเซลล์อสุจิเกาะติดกัน (A) การก่อตัวของกลุ่มเซลล์อสุจิในระยะเริ่มต้น เริ่มจากเซลล์อสุจิหนึ่งตัว (วงกลมสีขาว) และสามตัว (วงกลมสีเหลือง) โดยเริ่มจากส่วนหางและสิ้นสุดที่ส่วนหัว (B) ภาพถ่ายจุลทรรศน์ของตัวอย่างเซลล์อสุจิที่ย้อมด้วยอะคริดีนออเรนจ์ แสดงให้เห็นส่วนหัวของเซลล์อสุจิที่เกาะติดกัน (ลูกศร) ของเหลวที่ไหลออกมาปกคลุมส่วนหัว กำลังขยาย × 1000 (C) การพัฒนาของลำแสงขนาดใหญ่ที่เคลื่อนที่ไปตามการไหลในช่องไมโครฟลูอิดิก (โดยใช้กล้องความเร็วสูงที่ 950 เฟรมต่อวินาที) (D) ภาพถ่ายจุลทรรศน์ของตัวอย่างเซลล์อสุจิที่ย้อมด้วยอะคริดีนออเรนจ์ แสดงให้เห็นกลุ่มเซลล์อสุจิขนาดใหญ่ (ลูกศร) กำลังขยาย: ×200
ภาพถ่ายอิเล็กตรอนแบบสแกนของลำแสงสเปิร์มและสเมียร์สเปิร์มที่ย้อมด้วยอะคริดีนออเรนจ์ (A, B, D, E) เป็นภาพถ่ายอิเล็กตรอนแบบสแกนสีดิจิทัลของสเปิร์ม และ C และ F เป็นภาพถ่ายของสเมียร์สเปิร์มที่ย้อมด้วยอะคริดีนออเรนจ์ แสดงให้เห็นการเกาะติดของสเปิร์มหลายตัวที่พันรอบส่วนหาง (AC) กลุ่มสเปิร์มแสดงเป็นเครือข่ายของหางที่เกาะติดกัน (ลูกศร) (D) การเกาะติดของสเปิร์มหลายตัว (มีสารยึดเกาะ เส้นขอบสีชมพู ลูกศร) พันรอบหาง (E และ F) กลุ่มหัวสเปิร์ม (ตัวชี้) ถูกปกคลุมด้วยวัสดุยึดเกาะ (ตัวชี้) สเปิร์มก่อตัวเป็นมัดที่มีโครงสร้างคล้ายกระแวนวนหลายอัน (F) (C) กำลังขยาย ×400 และ (F) กำลังขยาย ×200
จากการใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่งผ่าน เราพบว่ากลุ่มสเปิร์มมีหางที่ติดกัน (รูปที่ 6A, C) หัวที่ติดกับหาง (รูปที่ 6B) หรือหัวที่ติดกับหาง (รูปที่ 6D) หัวของสเปิร์มในกลุ่มมีลักษณะโค้งงอ โดยในส่วนตัดจะเห็นบริเวณนิวเคลียสสองส่วน (รูปที่ 6D) ในกลุ่มที่ถูกผ่า สเปิร์มมีหัวที่บิดงอโดยมีบริเวณนิวเคลียสสองส่วนและบริเวณหางหลายส่วน (รูปที่ 5A)
ภาพถ่ายอิเล็กตรอนสีดิจิทัลแสดงส่วนหางที่เชื่อมต่อกันในกลุ่มสเปิร์มและสารที่ทำให้เกิดการจับกลุ่มซึ่งเชื่อมต่อส่วนหัวของสเปิร์ม (A) ส่วนหางที่ติดกันของสเปิร์มจำนวนมาก สังเกตลักษณะของส่วนหางทั้งในแนวตั้ง (ลูกศร) และแนวนอน (ลูกศร) (B) ส่วนหัว (ลูกศร) ของสเปิร์มเชื่อมต่อกับส่วนหาง (ลูกศร) (C) ส่วนหางของสเปิร์มหลายตัว (ลูกศร) ติดกัน (D) สารที่ทำให้เกิดการจับกลุ่ม (AS, สีน้ำเงิน) เชื่อมต่อส่วนหัวของสเปิร์มสี่ตัว (สีม่วง)
การใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบสแกนช่วยตรวจจับหัวสเปิร์มในกลุ่มสเปิร์มที่ปกคลุมด้วยสารคัดหลั่งหรือเยื่อหุ้ม (ภาพที่ 6B) ซึ่งบ่งชี้ว่ากลุ่มสเปิร์มถูกยึดไว้ด้วยวัสดุภายนอกเซลล์ วัสดุที่จับตัวกันเป็นก้อนนั้นมีความเข้มข้นอยู่ในหัวสเปิร์ม (โครงสร้างคล้ายหัวแมงกะพรุน; ภาพที่ 5B) และขยายตัวออกไปทางด้านปลาย ทำให้มีลักษณะสีเหลืองสดใสภายใต้กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์เมื่อย้อมด้วยอะคริดีนออเรนจ์ (ภาพที่ 6C) สารนี้สามารถมองเห็นได้อย่างชัดเจนภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบสแกนและถือว่าเป็นสารยึดเกาะ ส่วนตัดบาง (ภาพที่ 5C) และสเมียร์สเปิร์มที่ย้อมด้วยอะคริดีนออเรนจ์แสดงให้เห็นกลุ่มสเปิร์มที่มีหัวอัดแน่นและหางม้วนงอ (ภาพที่ 5D)
ภาพถ่ายจุลทรรศน์หลายภาพแสดงการรวมกลุ่มของหัวสเปิร์มและหางที่พับงอโดยใช้วิธีการต่างๆ (A) ภาพตัดขวางจากกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่งผ่านสีดิจิทัลของกลุ่มสเปิร์ม แสดงให้เห็นหัวสเปิร์มที่ขดตัวพร้อมนิวเคลียสสองส่วน (สีน้ำเงิน) และส่วนของหางหลายส่วน (สีเขียว) (B) ภาพสแกนอิเล็กตรอนแบบดิจิทัลสี แสดงให้เห็นกลุ่มของหัวสเปิร์มที่มีลักษณะคล้ายแมงกะพรุน (ลูกศร) ที่ดูเหมือนถูกปกคลุม (C) ภาพตัดขวางแบบกึ่งบาง แสดงให้เห็นหัวสเปิร์มที่รวมตัวกัน (ลูกศร) และหางที่ม้วนงอ (ลูกศร) (D) ภาพจุลทรรศน์ของตัวอย่างสเปิร์มที่ย้อมด้วยอะคริดีนออเรนจ์ แสดงให้เห็นกลุ่มของหัวสเปิร์ม (ลูกศร) และหางที่ม้วนงอและเกาะติด (ลูกศร) โปรดสังเกตว่ามีสารเหนียว (S) ปกคลุมหัวของสเปิร์ม (D) กำลังขยาย × 1000
จากการใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่งผ่าน (ภาพที่ 7A) พบว่าหัวของสเปิร์มบิดงอ และนิวเคลียสมีรูปร่างเป็นเกลียว ซึ่งได้รับการยืนยันโดยการตรวจตัวอย่างสเปิร์มที่ย้อมด้วยอะคริดีนออเรนจ์และตรวจสอบโดยใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง (ภาพที่ 7B)
(A) ภาพถ่ายอิเล็กตรอนแบบส่งผ่านสีดิจิทัล และ (B) ภาพสไลด์สเปิร์มที่ย้อมด้วยอะคริดีนออเรนจ์ แสดงให้เห็นหัวสเปิร์มที่ขดตัว และการยึดติดของหัวและหางสเปิร์ม (ลูกศร) (B) กำลังขยาย × 1000
สิ่งที่น่าสนใจอย่างหนึ่งคือ อสุจิของ Sharkazi รวมตัวกันเป็นกลุ่มเส้นใยที่เคลื่อนที่ได้ คุณสมบัติของกลุ่มเส้นใยเหล่านี้ช่วยให้เราเข้าใจบทบาทที่เป็นไปได้ในการดูดซึมและเก็บรักษาอสุจิใน SST ได้
หลังจากผสมพันธุ์แล้ว อสุจิจะเข้าสู่ช่องคลอดและผ่านกระบวนการคัดเลือกอย่างเข้มข้น ส่งผลให้มีอสุจิเพียงจำนวนจำกัดเท่านั้นที่เข้าสู่ SST15,16 จนถึงปัจจุบัน กลไกที่อสุจิเข้าและออกจาก SST ยังไม่เป็นที่ชัดเจน ในสัตว์ปีก อสุจิจะถูกเก็บไว้ใน SST เป็นระยะเวลานาน 2 ถึง 10 สัปดาห์ ขึ้นอยู่กับสายพันธุ์6 ยังคงมีข้อถกเถียงเกี่ยวกับสภาพของน้ำอสุจิในระหว่างการเก็บรักษาใน SST ว่าพวกมันกำลังเคลื่อนที่หรือหยุดนิ่ง กล่าวอีกนัยหนึ่ง เซลล์อสุจิรักษาตำแหน่งใน SST ได้อย่างไรเป็นเวลานานเช่นนั้น
Forman4 เสนอว่าการคงอยู่และการขับออกของ SST สามารถอธิบายได้ในแง่ของการเคลื่อนที่ของสเปิร์ม ผู้เขียนตั้งสมมติฐานว่าสเปิร์มรักษาตำแหน่งของตนเองโดยการว่ายน้ำต้านกระแสของเหลวที่สร้างขึ้นโดยเยื่อบุผิว SST และสเปิร์มจะถูกขับออกจาก SST เมื่อความเร็วของพวกมันลดลงต่ำกว่าจุดที่พวกมันเริ่มเคลื่อนที่ถอยหลังเนื่องจากขาดพลังงาน Zaniboni5 ยืนยันการมีอยู่ของอะควาพอริน 2, 3 และ 9 ในส่วนปลายของเซลล์เยื่อบุผิว SST ซึ่งอาจสนับสนุนแบบจำลองการเก็บรักษาสเปิร์มของ Foreman โดยอ้อม ในการศึกษาปัจจุบัน เราพบว่าสเปิร์มของ Sharkashi เกือบครึ่งหนึ่งแสดงคุณสมบัติทางรีโอโลยีเป็นบวกในของเหลวที่ไหล และกลุ่มสเปิร์มที่จับตัวกันจะเพิ่มจำนวนสเปิร์มที่แสดงคุณสมบัติทางรีโอโลยีเป็นบวก แม้ว่าการจับตัวกันจะทำให้พวกมันเคลื่อนที่ช้าลงก็ตาม วิธีที่เซลล์สเปิร์มเดินทางขึ้นไปตามท่อนำไข่ของนกไปยังบริเวณที่เกิดการปฏิสนธิยังไม่เป็นที่เข้าใจอย่างถ่องแท้ ในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม ของเหลวในถุงไข่จะดึงดูดสเปิร์มด้วยสารเคมี อย่างไรก็ตาม เชื่อกันว่าสารเคมีดึงดูดจะนำสเปิร์มให้เข้าใกล้ในระยะทางไกล7 ดังนั้น กลไกอื่นๆ จึงมีส่วนรับผิดชอบในการขนส่งสเปิร์ม ความสามารถของสเปิร์มในการวางแนวและไหลสวนทางกับของเหลวในท่อนำไข่ที่ปล่อยออกมาหลังการผสมพันธุ์ได้รับการรายงานว่าเป็นปัจจัยสำคัญในการกำหนดเป้าหมายของสเปิร์มในหนู Parker 17 แนะนำว่าสเปิร์มจะข้ามท่อนำไข่โดยการว่ายน้ำสวนทางกับกระแสซีเลียในนกและสัตว์เลื้อยคลาน แม้ว่าจะยังไม่ได้รับการพิสูจน์ทางทดลองในนก แต่ Adolphi18 เป็นคนแรกที่พบว่าสเปิร์มของนกให้ผลลัพธ์เป็นบวกเมื่อสร้างชั้นของเหลวบางๆ ระหว่างแผ่นปิดและสไลด์ด้วยแถบกระดาษกรอง การไหลเวียนของของเหลว Hino และ Yanagimachi [19] วางคอมเพล็กซ์รังไข่-ท่อนำไข่-มดลูกของหนูไว้ในวงแหวนการไหลเวียนและฉีดหมึก 1 µl เข้าไปในส่วนคอดเพื่อแสดงภาพการไหลของของเหลวในท่อนำไข่ พวกเขาพบการเคลื่อนไหวของการหดตัวและการคลายตัวที่เกิดขึ้นอย่างมากในท่อนำไข่ ซึ่งลูกหมึกทั้งหมดเคลื่อนที่อย่างต่อเนื่องไปยังส่วนปลายของท่อนำไข่ ผู้เขียนเน้นย้ำถึงความสำคัญของการไหลของของเหลวในท่อนำไข่จากส่วนล่างไปยังส่วนบนเพื่อการยกตัวของอสุจิและการปฏิสนธิ Brillard20 รายงานว่าในไก่และไก่งวง อสุจิจะเคลื่อนที่โดยการเคลื่อนไหวอย่างกระฉับกระเฉงจากทางเข้าช่องคลอดซึ่งเป็นที่เก็บไว้ ไปยังรอยต่อระหว่างมดลูกและช่องคลอดซึ่งเป็นที่เก็บไว้เช่นกัน อย่างไรก็ตาม การเคลื่อนไหวนี้ไม่จำเป็นระหว่างรอยต่อระหว่างมดลูกและช่องคลอดกับส่วนปลายของท่อนำไข่ เนื่องจากอสุจิถูกขนส่งโดยการแทนที่แบบพาสซีฟ เมื่อทราบคำแนะนำก่อนหน้านี้และผลลัพธ์ที่ได้จากการศึกษาในปัจจุบัน จึงสามารถสันนิษฐานได้ว่าความสามารถของอสุจิในการเคลื่อนที่ขึ้นไป (การไหลเวียน) เป็นหนึ่งในคุณสมบัติที่ใช้ในกระบวนการคัดเลือก ซึ่งเป็นตัวกำหนดการผ่านของอสุจิผ่านช่องคลอดและการเข้าสู่ CCT เพื่อเก็บรักษา ตามที่ Forman4 แนะนำไว้ สิ่งนี้อาจช่วยอำนวยความสะดวกให้สเปิร์มเข้าสู่ SST และแหล่งที่อยู่อาศัยของมันในช่วงระยะเวลาหนึ่ง แล้วจึงออกจาก SST เมื่อความเร็วของสเปิร์มเริ่มลดลง
ในทางกลับกัน Matsuzaki และ Sasanami 21 เสนอว่าอสุจิของนกมีการเปลี่ยนแปลงการเคลื่อนที่จากภาวะพักตัวไปสู่การเคลื่อนที่ในระบบสืบพันธุ์ของทั้งเพศผู้และเพศเมีย การยับยั้งการเคลื่อนที่ของอสุจิที่อยู่ใน SST ได้รับการเสนอเพื่ออธิบายระยะเวลาการเก็บรักษาอสุจิที่ยาวนานและการฟื้นคืนชีพหลังจากออกจาก SST ภายใต้สภาวะที่มีออกซิเจนต่ำ Matsuzaki et al. 1 รายงานว่ามีการผลิตและปล่อยแลคเตทใน SST ในปริมาณสูง ซึ่งอาจนำไปสู่การยับยั้งการเคลื่อนที่ของอสุจิที่อยู่ใน SST ในกรณีนี้ ความสำคัญของคุณสมบัติทางรีโอโลยีของอสุจิสะท้อนให้เห็นในการคัดเลือกและการดูดซึมของอสุจิ ไม่ใช่ในการเก็บรักษา
รูปแบบการจับกลุ่มของสเปิร์มถือเป็นคำอธิบายที่สมเหตุสมผลสำหรับระยะเวลาการเก็บรักษาสเปิร์มใน SST ที่ยาวนาน เนื่องจากเป็นรูปแบบการเก็บรักษาสเปิร์มที่พบได้ทั่วไปในสัตว์ปีก2,22,23 Bakst et al. 2 สังเกตว่าสเปิร์มส่วนใหญ่เกาะติดกันเป็นกลุ่มก้อน และพบสเปิร์มเดี่ยวๆ ได้น้อยมากใน CCM ของนกกระทา ในทางกลับกัน Wen et al. 24 สังเกตว่าสเปิร์มกระจายตัวมากกว่าและมีกลุ่มสเปิร์มน้อยกว่าในช่องว่างของ SST ในไก่ จากการสังเกตเหล่านี้ สามารถสันนิษฐานได้ว่าแนวโน้มการจับกลุ่มของสเปิร์มแตกต่างกันระหว่างนกและระหว่างสเปิร์มในน้ำอสุจิเดียวกัน นอกจากนี้ Van Krey et al. 9 แนะนำว่าการแยกตัวแบบสุ่มของสเปิร์มที่จับกลุ่มกันเป็นสาเหตุของการแทรกซึมของสเปิร์มเข้าไปในช่องว่างของท่อนำไข่อย่างค่อยเป็นค่อยไป ตามสมมติฐานนี้ อสุจิที่มีความสามารถในการรวมกลุ่มต่ำควรถูกขับออกจาก SST ก่อน ในบริบทนี้ ความสามารถในการรวมกลุ่มของอสุจิอาจเป็นปัจจัยที่มีอิทธิพลต่อผลลัพธ์ของการแข่งขันของอสุจิในนกที่สกปรก นอกจากนี้ ยิ่งอสุจิที่รวมกลุ่มกันแยกตัวออกจากกันนานเท่าใด ความสามารถในการสืบพันธุ์ก็จะยิ่งคงอยู่ได้นานขึ้นเท่านั้น
แม้ว่าการรวมตัวของสเปิร์มและการรวมกลุ่มเป็นมัดจะถูกสังเกตพบในหลายการศึกษา2,22,24 แต่ก็ยังไม่มีการอธิบายรายละเอียดเนื่องจากความซับซ้อนของการสังเกตการเคลื่อนที่ภายใน SST มีความพยายามหลายครั้งในการศึกษาการรวมกลุ่มของสเปิร์มในหลอดทดลอง พบการรวมกลุ่มอย่างกว้างขวางแต่ชั่วคราวเมื่อนำลวดเส้นเล็กออกจากหยดเมล็ดที่ห้อยอยู่ ซึ่งนำไปสู่ข้อเท็จจริงที่ว่าฟองอากาศยาวๆ ยื่นออกมาจากหยด เลียนแบบต่อมน้ำอสุจิ เนื่องจากข้อจำกัดของ 3 มิติและเวลาในการทำให้แห้งแบบหยดที่สั้น บล็อกทั้งหมดจึงเสื่อมสภาพอย่างรวดเร็ว9 ในการศึกษาปัจจุบันนี้ โดยใช้ไก่ Sharkashi และชิปไมโครฟลูอิดิก เราสามารถอธิบายได้ว่ากลุ่มเหล่านี้ก่อตัวขึ้นอย่างไรและเคลื่อนที่อย่างไร มัดสเปิร์มก่อตัวขึ้นทันทีหลังจากเก็บน้ำอสุจิและพบว่าเคลื่อนที่เป็นเกลียว แสดงให้เห็นถึงคุณสมบัติทางรีโอโลยีที่เป็นบวกเมื่ออยู่ในกระแสไหล นอกจากนี้ เมื่อพิจารณาในระดับมหภาค พบว่ากลุ่มสเปิร์มมีการเคลื่อนที่เชิงเส้นมากขึ้นเมื่อเทียบกับสเปิร์มที่แยกเดี่ยว ซึ่งบ่งชี้ว่าการรวมกลุ่มของสเปิร์มอาจเกิดขึ้นก่อนการเจาะ SST และการผลิตสเปิร์มไม่ได้จำกัดอยู่เฉพาะพื้นที่เล็กๆ เนื่องจากความเครียดดังที่เคยเสนอไว้ก่อนหน้านี้ (Tingari และ Lake12) ในระหว่างการก่อตัวของกลุ่ม สเปิร์มจะว่ายน้ำพร้อมกันจนกระทั่งเกิดการเชื่อมต่อ จากนั้นหางของพวกมันจะพันกัน และหัวของสเปิร์มจะยังคงเป็นอิสระ แต่หางและส่วนปลายของสเปิร์มจะติดกันด้วยสารเหนียว ดังนั้น หัวที่เป็นอิสระของเอ็นจึงเป็นส่วนที่รับผิดชอบในการเคลื่อนที่ โดยลากส่วนที่เหลือของเอ็นไปด้วย การใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบสแกนตรวจสอบกลุ่มสเปิร์ม พบว่าหัวสเปิร์มที่ติดกันถูกปกคลุมด้วยสารเหนียวจำนวนมาก ซึ่งบ่งชี้ว่าหัวสเปิร์มติดกันในกลุ่มที่พักตัว ซึ่งอาจเกิดขึ้นหลังจากไปถึงบริเวณเก็บ (SST)
เมื่อนำตัวอย่างอสุจิไปย้อมด้วยอะคริดีนออเรนจ์ จะสามารถมองเห็นสารยึดเกาะนอกเซลล์ที่อยู่รอบๆ เซลล์อสุจิได้ภายใต้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง สารนี้ช่วยให้กลุ่มอสุจิเกาะติดกับพื้นผิวหรืออนุภาคโดยรอบ ทำให้พวกมันไม่ลอยไปตามกระแสน้ำ ดังนั้น การสังเกตของเราจึงแสดงให้เห็นถึงบทบาทของการยึดเกาะของอสุจิในรูปแบบของกลุ่มที่เคลื่อนที่ได้ ความสามารถในการว่ายทวนกระแสน้ำและเกาะติดกับพื้นผิวใกล้เคียงช่วยให้อสุจิอยู่ในระบบน้ำใสได้นานขึ้น
Rothschild25 ใช้กล้องฮีโมไซโตเมตรีเพื่อศึกษาการกระจายตัวแบบลอยตัวของน้ำอสุจิวัวในหยดสารแขวนลอย โดยถ่ายภาพไมโครกราฟผ่านกล้องที่มีแกนแสงทั้งแนวตั้งและแนวนอนของกล้องจุลทรรศน์ ผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่าสเปิร์มถูกดึงดูดไปยังพื้นผิวของห้องทดลอง ผู้เขียนเสนอว่าอาจมีปฏิสัมพันธ์ทางอุทกพลศาสตร์ระหว่างสเปิร์มกับพื้นผิว เมื่อพิจารณาถึงเรื่องนี้ร่วมกับความสามารถของน้ำอสุจิไก่ Sharkashi ในการสร้างกลุ่มเหนียว อาจเพิ่มโอกาสที่น้ำอสุจิจะเกาะติดกับผนัง SST และเก็บรักษาไว้ได้เป็นเวลานาน
Bccetti และ Afzeliu26 รายงานว่าไกลโคคาลิกซ์ของอสุจิมีความจำเป็นต่อการจดจำและการรวมกลุ่มของเซลล์สืบพันธุ์ Forman10 สังเกตว่าการไฮโดรไลซิสของพันธะ α-ไกลโคไซด์ในสารเคลือบไกลโคโปรตีน-ไกลโคลิปิดโดยการบำบัดน้ำอสุจิของนกด้วยนิวรามินิเดสส่งผลให้ความสามารถในการสืบพันธุ์ลดลงโดยไม่ส่งผลกระทบต่อการเคลื่อนที่ของอสุจิ ผู้เขียนแนะนำว่าผลของนิวรามินิเดสต่อไกลโคคาลิกซ์ทำให้การกักเก็บอสุจิที่บริเวณรอยต่อระหว่างมดลูกและช่องคลอดบกพร่อง จึงทำให้ความสามารถในการสืบพันธุ์ลดลง การสังเกตของพวกเขาไม่สามารถละเลยความเป็นไปได้ที่การบำบัดด้วยนิวรามินิเดสอาจลดการจดจำของอสุจิและไข่ Forman และ Engel10 พบว่าความสามารถในการสืบพันธุ์ลดลงเมื่อไก่ได้รับการผสมเทียมทางช่องคลอดด้วยน้ำอสุจิที่ได้รับการบำบัดด้วยนิวรามินิเดส อย่างไรก็ตาม การทำ IVF ด้วยอสุจิที่ได้รับการบำบัดด้วยนิวรามินิเดสไม่ได้ส่งผลกระทบต่อความสามารถในการสืบพันธุ์เมื่อเทียบกับไก่กลุ่มควบคุม ผู้เขียนสรุปว่า การเปลี่ยนแปลงในชั้นเคลือบไกลโคโปรตีน-ไกลโคลิปิดรอบเยื่อหุ้มเซลล์อสุจิ ลดความสามารถในการปฏิสนธิของอสุจิโดยทำให้การกักเก็บอสุจิที่บริเวณรอยต่อระหว่างมดลูกและช่องคลอดบกพร่อง ซึ่งส่งผลให้มีการสูญเสียอสุจิเพิ่มขึ้นเนื่องจากความเร็วในการเคลื่อนตัวของรอยต่อระหว่างมดลูกและช่องคลอด แต่ไม่ส่งผลกระทบต่อการจดจำระหว่างอสุจิและไข่
ในไก่งวง Bakst และ Bauchan 11 พบถุงเล็กๆ และชิ้นส่วนของเยื่อหุ้มเซลล์ในช่องว่างของ SST และสังเกตว่าเม็ดเล็กๆ เหล่านี้บางส่วนได้หลอมรวมกับเยื่อหุ้มเซลล์ของอสุจิ ผู้เขียนแนะนำว่าความสัมพันธ์เหล่านี้อาจมีส่วนช่วยในการเก็บรักษาอสุจิใน SST ในระยะยาว อย่างไรก็ตาม นักวิจัยไม่ได้ระบุแหล่งที่มาของอนุภาคเหล่านี้ ไม่ว่าจะเป็นการหลั่งโดยเซลล์เยื่อบุผิว CCT การผลิตและการหลั่งโดยระบบสืบพันธุ์เพศผู้ หรือการผลิตโดยตัวอสุจิเอง นอกจากนี้ อนุภาคเหล่านี้ยังเป็นสาเหตุของการจับกลุ่มกัน Grützner et al27 รายงานว่าเซลล์เยื่อบุผิวของท่ออสุจิผลิตและหลั่งโปรตีนเฉพาะที่จำเป็นสำหรับการสร้างท่อน้ำอสุจิแบบรูเดียว ผู้เขียนยังรายงานว่าการกระจายตัวของกลุ่มเหล่านี้ขึ้นอยู่กับปฏิสัมพันธ์ของโปรตีนในท่ออสุจิ Nixon et al28 พบว่าอวัยวะสืบพันธุ์เพศผู้และเพศเมียหลั่งโปรตีนที่เรียกว่า osteonectin ซึ่งอุดมไปด้วยซิสเทอีนและมีฤทธิ์เป็นกรด โปรตีน SPARC มีส่วนเกี่ยวข้องกับการสร้างกลุ่มอสุจิในเม่นปากสั้นและตุ่นปากเป็ด การกระเจิงของลำแสงเหล่านี้เกี่ยวข้องกับการสูญเสียโปรตีนชนิดนี้
ในการศึกษาปัจจุบัน การวิเคราะห์โครงสร้างระดับจุลภาคโดยใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแสดงให้เห็นว่าอสุจิเกาะติดกับสารที่มีความหนาแน่นสูงจำนวนมาก สารเหล่านี้เชื่อว่าเป็นสาเหตุของการเกาะกลุ่มกันซึ่งควบแน่นระหว่างและรอบๆ ส่วนหัวที่เกาะติด แต่มีความเข้มข้นต่ำกว่าในบริเวณหาง เราสันนิษฐานว่าสารที่ทำให้เกิดการเกาะกลุ่มนี้ถูกขับออกมาจากระบบสืบพันธุ์เพศผู้ (เอพิไดดิมิสหรือท่ออสุจิ) พร้อมกับน้ำอสุจิ เนื่องจากเรามักสังเกตเห็นน้ำอสุจิแยกออกจากน้ำเหลืองและพลาสมาน้ำอสุจิในระหว่างการหลั่ง มีรายงานว่าเมื่ออสุจิของนกผ่านเอพิไดดิมิสและท่ออสุจิ พวกมันจะมีการเปลี่ยนแปลงที่เกี่ยวข้องกับการเจริญเติบโตซึ่งสนับสนุนความสามารถในการจับกับโปรตีนและได้รับไกลโคโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับเลมมาพลาสมา การคงอยู่ของโปรตีนเหล่านี้บนเยื่อหุ้มอสุจิใน SST บ่งชี้ว่าโปรตีนเหล่านี้อาจมีอิทธิพลต่อการได้รับความเสถียรของเยื่อหุ้มอสุจิ 30 และกำหนดความสามารถในการสืบพันธุ์ 31 Ahammad et al32 รายงานว่าอสุจิที่ได้จากส่วนต่างๆ ของระบบสืบพันธุ์เพศชาย (ตั้งแต่ลูกอัณฑะไปจนถึงท่ออสุจิส่วนปลาย) แสดงให้เห็นถึงความมีชีวิตที่เพิ่มขึ้นอย่างต่อเนื่องภายใต้สภาวะการเก็บรักษาในของเหลว โดยไม่คำนึงถึงอุณหภูมิในการเก็บรักษา และความมีชีวิตในไก่ก็เพิ่มขึ้นในท่อนำไข่หลังจากการผสมเทียมด้วย
กลุ่มอสุจิของไก่ชาร์กาชิมีลักษณะและหน้าที่แตกต่างจากสัตว์ชนิดอื่นๆ เช่น เม่นหนาม ตุ่นปากเป็ด หนูไม้ หนูเดียร์ และหนูตะเภา ในไก่ชาร์กาชิ การรวมตัวกันเป็นกลุ่มของอสุจิทำให้ความเร็วในการว่ายน้ำลดลงเมื่อเทียบกับอสุจิเดี่ยว อย่างไรก็ตาม กลุ่มอสุจิเหล่านี้เพิ่มเปอร์เซ็นต์ของอสุจิที่มีคุณสมบัติทางรีโอโลยีเป็นบวก และเพิ่มความสามารถของอสุจิในการทรงตัวในสภาพแวดล้อมที่เปลี่ยนแปลงตลอดเวลา ดังนั้น ผลการวิจัยของเราจึงยืนยันข้อเสนอแนะก่อนหน้านี้ที่ว่า การรวมตัวของอสุจิใน SST เกี่ยวข้องกับการเก็บรักษาอสุจิในระยะยาว เรายังตั้งสมมติฐานว่า แนวโน้มของอสุจิในการรวมตัวกันเป็นกลุ่มอาจควบคุมอัตราการสูญเสียอสุจิใน SST ซึ่งอาจเปลี่ยนแปลงผลลัพธ์ของการแข่งขันของอสุจิ ตามสมมติฐานนี้ อสุจิที่มีความสามารถในการรวมตัวต่ำจะปล่อย SST ออกมาก่อน ในขณะที่อสุจิที่มีความสามารถในการรวมตัวสูงจะผลิตลูกหลานส่วนใหญ่ การรวมตัวกันเป็นกลุ่มของอสุจิที่มีรูพรุนเดี่ยวนั้นมีประโยชน์และส่งผลต่ออัตราส่วนของพ่อแม่ต่อลูก แต่ใช้กลไกที่แตกต่างกัน ในเม่นหนามและตุ่นปากเป็ด อสุจิจะเรียงตัวขนานกันเพื่อเพิ่มความเร็วในการเคลื่อนที่ไปข้างหน้า กลุ่มอสุจิของเม่นหนามเคลื่อนที่เร็วกว่าอสุจิเดี่ยวประมาณสามเท่า เชื่อกันว่าการรวมตัวกันเป็นกลุ่มของอสุจิในเม่นหนามเป็นการปรับตัวทางวิวัฒนาการเพื่อรักษาความเหนือกว่า เนื่องจากตัวเมียมีพฤติกรรมสำส่อนและมักผสมพันธุ์กับตัวผู้หลายตัว ดังนั้นอสุจิจากน้ำอสุจิที่ต่างกันจึงแข่งขันกันอย่างดุเดือดเพื่อปฏิสนธิกับไข่
สามารถมองเห็นกลุ่มอสุจิของไก่ชาร์กาซีได้ง่ายโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบเฟสคอนทราสต์ ซึ่งถือเป็นข้อดีเพราะช่วยให้ศึกษาพฤติกรรมของอสุจิในหลอดทดลองได้ง่าย กลไกที่การก่อตัวของกลุ่มอสุจิช่วยส่งเสริมการสืบพันธุ์ในไก่ชาร์กาซีก็แตกต่างจากที่พบในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมที่มีรกบางชนิดที่แสดงพฤติกรรมการทำงานร่วมกันของอสุจิ เช่น หนูไม้ ซึ่งอสุจิบางตัวไปถึงไข่ ช่วยให้ตัวอื่นๆ ที่เกี่ยวข้องไปถึงและทำลายไข่ได้ เพื่อพิสูจน์ตัวเอง พฤติกรรมเสียสละ การผสมพันธุ์ในตัวเอง 34. ตัวอย่างอื่นๆ ของพฤติกรรมการทำงานร่วมกันในอสุจิพบในหนูเดียร์ ซึ่งอสุจิสามารถระบุและรวมตัวกับอสุจิที่มีความสัมพันธ์ทางพันธุกรรมมากที่สุดและสร้างกลุ่มความร่วมมือเพื่อเพิ่มความเร็วเมื่อเทียบกับอสุจิที่ไม่เกี่ยวข้อง 35.
ผลลัพธ์ที่ได้จากการศึกษาครั้งนี้ไม่ขัดแย้งกับทฤษฎีการเก็บรักษาสเปิร์มใน SWS ในระยะยาวของ Foman นักวิจัยรายงานว่าเซลล์สเปิร์มยังคงเคลื่อนที่ไปตามกระแสของเซลล์เยื่อบุผิวที่เรียงตัวอยู่ภายใน SST เป็นระยะเวลานาน และหลังจากนั้นระยะหนึ่ง พลังงานสะสมของเซลล์สเปิร์มจะหมดลง ส่งผลให้ความเร็วลดลง ซึ่งทำให้มีการขับสารที่มีโมเลกุลขนาดเล็กออกไปพร้อมกับการไหลของของเหลวจากโพรงของ SST ในท่อนำไข่ ในการศึกษาครั้งนี้ เราพบว่าครึ่งหนึ่งของสเปิร์มเดี่ยวแสดงความสามารถในการว่ายน้ำต้านกระแสของเหลว และการยึดเกาะกันเป็นกลุ่มทำให้ความสามารถในการแสดงคุณสมบัติทางรีโอโลยีที่ดีขึ้น นอกจากนี้ ข้อมูลของเรายังสอดคล้องกับข้อมูลของ Matsuzaki et al. 1 ที่รายงานว่าการหลั่งแลคเตทที่เพิ่มขึ้นใน SST อาจยับยั้งการเคลื่อนที่ของสเปิร์มที่อยู่ในนั้น อย่างไรก็ตาม ผลการศึกษาของเราอธิบายถึงการก่อตัวของเอ็นที่เคลื่อนที่ได้ของอสุจิและพฤติกรรมทางรีโอโลยีของพวกมันภายใต้สภาพแวดล้อมแบบไดนามิกภายในไมโครแชนเนล เพื่อพยายามอธิบายพฤติกรรมของพวกมันใน SST การวิจัยในอนาคตอาจมุ่งเน้นไปที่การกำหนดองค์ประกอบทางเคมีและที่มาของสารที่ทำให้เกิดการจับตัวกัน ซึ่งจะช่วยให้นักวิจัยพัฒนาวิธีการใหม่ในการเก็บรักษาน้ำอสุจิเหลวและเพิ่มระยะเวลาการเจริญพันธุ์ได้อย่างแน่นอน
ในการศึกษาครั้งนี้ ได้คัดเลือกไก่ชาร์กาซีเพศผู้ อายุ 30 สัปดาห์ จำนวน 15 ตัว (โฮโมไซกัสแบบเด่น; Na Na) มาใช้เป็นผู้ให้สเปิร์ม ไก่เหล่านี้ได้รับการเลี้ยงดูที่ฟาร์มวิจัยสัตว์ปีก คณะเกษตรศาสตร์ มหาวิทยาลัยอาชิต จังหวัดอาชิต ประเทศอียิปต์ ไก่ถูกเลี้ยงในกรงเดี่ยว (30 x 40 x 40 ซม.) ภายใต้โปรแกรมแสง (แสง 16 ชั่วโมง และความมืด 8 ชั่วโมง) และได้รับอาหารที่มีโปรตีนดิบ 160 กรัม พลังงานที่ร่างกายสามารถนำไปใช้ได้ 2800 กิโลแคลอรี แคลเซียม 35 กรัม และฟอสฟอรัสที่ใช้ได้ 5 กรัม ต่อกิโลกรัมของอาหาร
ตามข้อมูล 36, ​​37 ได้มีการเก็บน้ำอสุจิจากตัวผู้โดยการนวดหน้าท้อง โดยเก็บตัวอย่างน้ำอสุจิทั้งหมด 45 ตัวอย่างจากตัวผู้ 15 ตัว เป็นเวลา 3 วัน น้ำอสุจิ (n = 15/วัน) ถูกเจือจางทันทีในอัตราส่วน 1:1 (v:v) ด้วยน้ำยาเจือจางน้ำอสุจิสัตว์ปีก Belsville ซึ่งประกอบด้วยโพแทสเซียมไดฟอสเฟต (1.27 กรัม), โมโนโซเดียมกลูตาเมตโมโนไฮเดรต (0.867 กรัม), ฟรุกโตส (0.5 กรัม), โซเดียมอะซิเตตปราศจากน้ำ (0.43 กรัม), ไตรส์(ไฮดรอกซีเมทิล)อะมิโนมีเทน (0.195 กรัม), โพแทสเซียมซิเตรตโมโนไฮเดรต (0.064 กรัม), โพแทสเซียมโมโนฟอสเฟต (0.065 กรัม), แมกนีเซียมคลอไรด์ (0.034 กรัม) และน้ำ (100 มิลลิลิตร), pH = 7.5, ออสโมลาริตี 333 mOsm/kg38 ตัวอย่างน้ำอสุจิที่เจือจางแล้วจะถูกตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงก่อน เพื่อให้แน่ใจว่าน้ำอสุจิมีคุณภาพดี (มีความชื้น) จากนั้นจึงเก็บไว้ในอ่างน้ำที่อุณหภูมิ 37°C จนกว่าจะนำไปใช้ภายในครึ่งชั่วโมงหลังจากเก็บตัวอย่าง
มีการอธิบายจลนศาสตร์และพลศาสตร์ของสเปิร์มโดยใช้ระบบอุปกรณ์ไมโครฟลูอิดิก ตัวอย่างน้ำอสุจิถูกเจือจางเพิ่มเติมเป็น 1:40 ในน้ำยาเจือจางน้ำอสุจินก Beltsville บรรจุลงในอุปกรณ์ไมโครฟลูอิดิก (ดูด้านล่าง) และกำหนดพารามิเตอร์จลนศาสตร์โดยใช้ระบบวิเคราะห์น้ำอสุจิด้วยคอมพิวเตอร์ (CASA) ที่พัฒนาขึ้นก่อนหน้านี้สำหรับการวิเคราะห์ลักษณะเฉพาะของไมโครฟลูอิดิกเกี่ยวกับการเคลื่อนที่ของสเปิร์มในตัวกลางของเหลว (ภาควิชาวิศวกรรมเครื่องกล คณะวิศวกรรมศาสตร์ มหาวิทยาลัยอัสยูท ประเทศอียิปต์) สามารถดาวน์โหลดปลั๊กอินได้ที่: http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39 วัดความเร็วเชิงเส้นโค้ง (VCL, μm/s) ความเร็วเชิงเส้น (VSL, μm/s) และความเร็ววิถีเฉลี่ย (VAP, μm/s) บันทึกวิดีโอของอสุจิโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบเฟสคอนทราสต์ Optika XDS-3 แบบกลับหัว (พร้อมเลนส์กำลังขยาย 40 เท่า) ที่เชื่อมต่อกับกล้อง Tucson ISH1000 ที่ 30 เฟรมต่อวินาที เป็นเวลา 3 วินาที ใช้ซอฟต์แวร์ CASA เพื่อศึกษาอย่างน้อยสามพื้นที่และเส้นทางการเคลื่อนที่ของอสุจิ 500 เส้นต่อตัวอย่าง วิดีโอที่บันทึกไว้ได้รับการประมวลผลโดยใช้ CASA ที่สร้างขึ้นเอง คำจำกัดความของการเคลื่อนที่ในปลั๊กอิน CASA นั้นอิงตามความเร็วในการว่ายน้ำของอสุจิเมื่อเทียบกับอัตราการไหล และไม่รวมพารามิเตอร์อื่น ๆ เช่น การเคลื่อนที่ไปด้านข้าง เนื่องจากพบว่ามีความน่าเชื่อถือมากกว่าในการไหลของของเหลว การเคลื่อนที่ทางรีโอโลยีอธิบายว่าเป็นการเคลื่อนที่ของเซลล์อสุจิสวนทางกับทิศทางการไหลของของเหลว อสุจิที่มีคุณสมบัติทางรีโอโลยีถูกหารด้วยจำนวนอสุจิที่เคลื่อนที่ได้ อสุจิที่อยู่นิ่งและอสุจิที่เคลื่อนที่แบบพาความร้อนถูกยกเว้นจากการนับ
สารเคมีทั้งหมดที่ใช้จัดหามาจาก Elgomhoria Pharmaceuticals (ไคโร ประเทศอียิปต์) เว้นแต่จะระบุไว้เป็นอย่างอื่น อุปกรณ์นี้ผลิตขึ้นตามที่ El-sherry et al. 40 อธิบายไว้ โดยมีการปรับเปลี่ยนบางส่วน วัสดุที่ใช้ในการผลิตไมโครแชนเนลประกอบด้วยแผ่นกระจก (Howard Glass, Worcester, MA), สารต้านทานเชิงลบ SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA), ไดอะซีโตนแอลกอฮอล์ (Sigma Aldrich, Steinheim, เยอรมนี) และโพลีอะซีโตน (-184, Dow Corning, Midland, Michigan) ไมโครแชนเนลถูกสร้างขึ้นโดยใช้ซอฟต์ลิโทกราฟี ขั้นแรก พิมพ์หน้ากากป้องกันใสที่มีการออกแบบไมโครแชนเนลที่ต้องการบนเครื่องพิมพ์ความละเอียดสูง (Prismatic, ไคโร ประเทศอียิปต์ และ Pacific Arts and Design, Markham, ON) แม่พิมพ์ทำขึ้นโดยใช้แผ่นกระจกเป็นพื้นผิว แผ่นกระจกถูกทำความสะอาดในอะซีโตน ไอโซโพรพานอล และน้ำปราศจากไอออน จากนั้นเคลือบด้วยชั้น SU8-25 หนา 20 µm โดยการเคลือบแบบหมุน (3000 รอบต่อนาที, 1 นาที) จากนั้น นำชั้น SU-8 ไปอบแห้งอย่างอ่อนโยน (65°C เป็นเวลา 2 นาที และ 95°C เป็นเวลา 10 นาที) และฉายรังสี UV เป็นเวลา 50 วินาที อบหลังการฉายรังสีที่อุณหภูมิ 65°C และ 95°C เป็นเวลา 1 นาที และ 4 นาที ตามลำดับ เพื่อเชื่อมโยงโมเลกุลของชั้น SU-8 ที่ได้รับรังสี จากนั้นทำการล้างด้วยไดอะซีโตนแอลกอฮอล์เป็นเวลา 6.5 นาที อบวาฟเฟิลให้แข็งตัว (200°C เป็นเวลา 15 นาที) เพื่อให้ชั้น SU-8 แข็งตัวยิ่งขึ้น
เตรียม PDMS โดยผสมโมโนเมอร์และสารเร่งปฏิกิริยาในอัตราส่วนน้ำหนัก 10:1 จากนั้นไล่ฟองอากาศในเครื่องดูดความชื้นแบบสุญญากาศและเทลงบนโครงหลัก SU-8 นำ PDMS ไปอบให้แข็งตัวในเตาอบ (120°C, 30 นาที) จากนั้นตัดช่องออกมาแยกจากแม่พิมพ์ และเจาะรูเพื่อให้สามารถติดท่อที่ทางเข้าและทางออกของไมโครแชนเนลได้ สุดท้าย ไมโครแชนเนล PDMS ถูกติดเข้ากับสไลด์กล้องจุลทรรศน์อย่างถาวรโดยใช้เครื่องประมวลผลโคโรนาแบบพกพา (Electro-Technic Products, Chicago, IL) ดังที่ได้อธิบายไว้ในที่อื่น ไมโครแชนเนลที่ใช้ในการศึกษานี้มีขนาด 200 µm × 20 µm (กว้าง × สูง) และยาว 3.6 ซม.
การไหลของของเหลวที่เกิดจากแรงดันไฮโดรสแตติกภายในไมโครแชนเนลเกิดขึ้นได้โดยการรักษาระดับของเหลวในอ่างเก็บน้ำทางเข้าให้อยู่เหนือความแตกต่างของระดับความสูง Δh39 ในอ่างเก็บน้ำทางออก (รูปที่ 1)
โดยที่ f คือสัมประสิทธิ์แรงเสียดทาน ซึ่งกำหนดโดย f = C/Re สำหรับการไหลแบบลามินาร์ในช่องสี่เหลี่ยมผืนผ้า โดยที่ C เป็นค่าคงที่ขึ้นอยู่กับอัตราส่วนด้านของช่อง L คือความยาวของไมโครแชนเนล Vav คือความเร็วเฉลี่ยภายในไมโครแชนเนล Dh คือเส้นผ่านศูนย์กลางไฮดรอลิกของช่อง และ g คือความเร่งโน้มถ่วง เมื่อใช้สมการนี้ ความเร็วเฉลี่ยของช่องสามารถคำนวณได้โดยใช้สมการต่อไปนี้: