Спасибо за посещение сайта Nature.com. Версия вашего браузера имеет ограниченную поддержку CSS. Для наилучшего взаимодействия с сайтом мы рекомендуем использовать обновлённую версию браузера (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). В настоящее время, для обеспечения дальнейшей поддержки, мы будем отображать сайт без стилей и JavaScript.
Эволюция микробных паразитов включает в себя противодействие между естественным отбором, который приводит к улучшению паразитов, и генетическим дрейфом, который приводит к потере паразитами генов и накоплению вредных мутаций. Здесь, чтобы понять, как это противодействие происходит в масштабе одной макромолекулы, мы описываем криоэлектронно-микроскопическую структуру рибосомы Encephalitozoon cuniculi, эукариотического организма с одним из самых маленьких геномов в природе. Крайнее сокращение рРНК в рибосомах E. cuniculi сопровождается беспрецедентными структурными изменениями, такими как эволюция ранее неизвестных слитых линкеров рРНК и рРНК без выпуклостей. Кроме того, рибосома E. cuniculi пережила потерю фрагментов рРНК и белков, развив способность использовать малые молекулы в качестве структурных имитаторов деградированных фрагментов рРНК и белков. В целом, мы показываем, что молекулярные структуры, которые долгое время считались редуцированными, дегенерированными и подверженными изнурительным мутациям, обладают рядом компенсаторных механизмов, которые поддерживают их активность, несмотря на экстремальные молекулярные сокращения.
Поскольку большинство групп микробных паразитов обладают уникальными молекулярными инструментами для использования своих хозяев, нам часто приходится разрабатывать разные терапевтические средства для разных групп паразитов1,2. Однако новые данные свидетельствуют о том, что некоторые аспекты эволюции паразитов являются конвергентными и в значительной степени предсказуемыми, что указывает на потенциальную основу для широкого спектра терапевтических вмешательств в отношении микробных паразитов3,4,5,6,7,8,9.
Предыдущие исследования выявили общую эволюционную тенденцию у микробных паразитов, называемую редукцией генома или деградацией генома10,11,12,13. Современные исследования показывают, что когда микроорганизмы отказываются от своего свободноживущего образа жизни и становятся внутриклеточными паразитами (или эндосимбионтами), их геномы претерпевают медленные, но удивительные метаморфозы в течение миллионов лет9,11. В процессе, известном как деградация генома, микробные паразиты накапливают вредные мутации, которые превращают многие ранее важные гены в псевдогены, что приводит к постепенной потере генов и мутационному коллапсу14,15. Этот коллапс может уничтожить до 95% генов у самых древних внутриклеточных организмов по сравнению с близкородственными свободноживущими видами. Таким образом, эволюция внутриклеточных паразитов представляет собой борьбу между двумя противоборствующими силами: дарвиновским естественным отбором, ведущим к улучшению паразитов, и коллапсом генома, предрекающим исчезновение паразитов. Как паразиту удалось вырваться из этой борьбы и сохранить активность своей молекулярной структуры, остается неясным.
Хотя механизм деградации генома до конца не изучен, по-видимому, он происходит главным образом из-за частого генетического дрейфа. Поскольку паразиты живут в небольших, бесполых и генетически ограниченных популяциях, они не могут эффективно устранять вредные мутации, которые иногда возникают во время репликации ДНК. Это приводит к необратимому накоплению вредных мутаций и уменьшению генома паразита. В результате паразит теряет не только гены, которые больше не нужны для его выживания во внутриклеточной среде. Именно неспособность популяций паразитов эффективно устранять спорадические вредные мутации приводит к накоплению этих мутаций по всему геному, включая их наиболее важные гены.
Большая часть нашего современного понимания редукции генома основана исключительно на сравнении последовательностей генома, при этом меньше внимания уделяется изменениям в самих молекулах, выполняющих основные функции и являющихся потенциальными мишенями для лекарственных препаратов. Сравнительные исследования показали, что бремя вредных внутриклеточных микробных мутаций, по-видимому, предрасполагает белки и нуклеиновые кислоты к неправильному сворачиванию и агрегации, делая их более зависимыми от шаперонов и гиперчувствительными к теплу19,20,21,22,23. Кроме того, различные паразиты — независимое развитие которых иногда разделялось до 2,5 миллиардов лет — испытали аналогичную потерю центров контроля качества в синтезе белков5,6 и механизмах репарации ДНК24. Однако мало что известно о влиянии внутриклеточного образа жизни на все другие свойства клеточных макромолекул, включая молекулярную адаптацию к возрастающему бремени вредных мутаций.
В данной работе, чтобы лучше понять эволюцию белков и нуклеиновых кислот внутриклеточных микроорганизмов, мы определили структуру рибосом внутриклеточного паразита Encephalitozoon cuniculi. E. cuniculi — это грибоподобный организм, принадлежащий к группе паразитических микроспоридий, которые имеют необычно малые эукариотические геномы и поэтому используются в качестве модельных организмов для изучения деградации генома25,26,27,28,29,30. Недавно была определена структура рибосом методом криоэлектронной микроскопии для умеренно редуцированных геномов микроспоридий, Paranosema locustae и Vairimorpha necatrix31,32 (~3,2 Мб геном). Эти структуры предполагают, что некоторая потеря амплификации рРНК компенсируется развитием новых контактов между соседними рибосомными белками или приобретением новых рибосомных белков msL131,32. Вид Encephalitozoon (геном ~2,5 миллиона пар оснований), наряду со своим ближайшим родственником Ordospora, демонстрирует наивысшую степень редукции генома среди эукариот – у них менее 2000 генов, кодирующих белки, и ожидается, что их рибосомы не только лишены фрагментов расширения рРНК (фрагментов рРНК, отличающих эукариотические рибосомы от бактериальных), но и содержат четыре рибосомальных белка из-за отсутствия гомологов в геноме E. cuniculi26,27,28. Таким образом, мы пришли к выводу, что рибосома E. cuniculi может раскрыть ранее неизвестные стратегии молекулярной адаптации к деградации генома.
Наша криоэлектронно-микроскопическая структура представляет собой самую маленькую из когда-либо охарактеризованных эукариотических цитоплазматических рибосом и позволяет понять, как предельная степень редукции генома влияет на структуру, сборку и эволюцию молекулярного механизма, являющегося неотъемлемой частью клетки. Мы обнаружили, что рибосома E. cuniculi нарушает многие широко распространенные принципы сворачивания РНК и сборки рибосом, и обнаружили новый, ранее неизвестный рибосомальный белок. Совершенно неожиданно мы показали, что рибосомы микроспоридий приобрели способность связывать малые молекулы, и выдвинули гипотезу, что усечения в рРНК и белках запускают эволюционные инновации, которые в конечном итоге могут придать рибосоме полезные качества.
Для улучшения понимания эволюции белков и нуклеиновых кислот во внутриклеточных организмах мы решили выделить споры E. cuniculi из культур инфицированных клеток млекопитающих, чтобы очистить их рибосомы и определить структуру этих рибосом. Получить большое количество паразитических микроспоридий сложно, поскольку микроспоридии нельзя культивировать в питательной среде. Вместо этого они растут и размножаются только внутри клетки-хозяина. Поэтому, чтобы получить биомассу E. cuniculi для очистки рибосом, мы инфицировали линию клеток почек млекопитающих RK13 спорами E. cuniculi и культивировали эти инфицированные клетки в течение нескольких недель, чтобы позволить E. cuniculi расти и размножаться. Используя монослой инфицированных клеток площадью около половины квадратного метра, мы смогли очистить около 300 мг спор микроспоридий и использовать их для выделения рибосом. Затем мы разрушили очищенные споры с помощью стеклянных шариков и выделили неочищенные рибосомы, используя поэтапное фракционирование лизатов полиэтиленгликолем. Это позволило нам получить приблизительно 300 мкг неочищенных рибосом E. cuniculi для структурного анализа.
Затем мы получили криоэлектронно-микроскопические изображения, используя полученные образцы рибосом, и обработали эти изображения с помощью масок, соответствующих большой субъединице рибосомы, головке малой субъединицы и малой субъединице. В ходе этого процесса мы получили изображения примерно 108 000 рибосомных частиц и вычислили криоэлектронно-микроскопические изображения с разрешением 2,7 Å (дополнительные рисунки 1-3). Затем мы использовали криоэлектронно-микроскопические изображения для моделирования рРНК, рибосомного белка и фактора спячки Mdf1, ассоциированных с рибосомами E. cuniculi (рис. 1a, b).
a) Структура рибосомы E. cuniculi в комплексе с фактором спячки Mdf1 (идентификатор pdb 7QEP). b) Карта фактора спячки Mdf1, ассоциированного с рибосомой E. cuniculi. c) Карта вторичной структуры, сравнивающая восстановленную рРНК у видов Microsporidia с известными структурами рибосом. На панелях показано расположение амплифицированных фрагментов рРНК (ES) и активных центров рибосомы, включая сайт декодирования (DC), сарцинициновую петлю (SRL) и центр пептидилтрансферазы (PTC). d) Электронная плотность, соответствующая центру пептидилтрансферазы рибосомы E. cuniculi, предполагает, что этот каталитический сайт имеет одинаковую структуру у паразита E. cuniculi и его хозяев, включая H. sapiens. e, f Соответствующая электронная плотность декодирующего центра (e) и схематическая структура декодирующего центра (f) указывают на то, что у E. cuniculi вместо A1491 (нумерация E. coli), как у многих других эукариот, присутствуют остатки U1491. Это изменение предполагает, что E. cuniculi может быть чувствителен к антибиотикам, воздействующим на этот активный центр.
В отличие от ранее установленных структур рибосом V. necatrix и P. locustae (обе структуры представляют одно и то же семейство микроспоридий Nosematidae и очень похожи друг на друга), 31,32 рибосомы E. cuniculi подвергаются многочисленным процессам фрагментации рРНК и белков. Дальнейшая денатурация (дополнительные рисунки 4-6). В рРНК наиболее заметные изменения включали полную потерю амплифицированного фрагмента 25S рРНК ES12L и частичную дегенерацию спиралей h39, h41 и H18 (рис. 1c, дополнительный рис. 4). Среди рибосомальных белков наиболее заметные изменения включали полную потерю белка eS30 и укорочение белков eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 и eS7 (дополнительные рисунки 4, 5).
Таким образом, крайнее сокращение геномов видов Encephalotozoon/Ordospora отражается в структуре их рибосом: рибосомы E. cuniculi претерпевают наиболее значительную потерю белкового содержимого среди эукариотических цитоплазматических рибосом, подвергнутых структурной характеристике, и в них отсутствуют даже те фрагменты рРНК и белков, которые широко консервативны не только у эукариот, но и во всех трех доменах жизни. Структура рибосомы E. cuniculi представляет собой первую молекулярную модель этих изменений и раскрывает эволюционные события, которые были упущены из виду как сравнительной геномикой, так и исследованиями внутриклеточной биомолекулярной структуры (дополнительный рис. 7). Ниже мы описываем каждое из этих событий, а также их вероятное эволюционное происхождение и потенциальное влияние на функцию рибосом.
Затем мы обнаружили, что, помимо больших усечений рРНК, рибосомы E. cuniculi имеют вариации рРНК в одном из своих активных центров. Хотя пептидилтрансферазный центр рибосомы E. cuniculi имеет ту же структуру, что и другие эукариотические рибосомы (рис. 1d), декодирующий центр отличается из-за вариации последовательности в нуклеотиде 1491 (нумерация E. coli, рис. 1e, f). Это наблюдение важно, поскольку декодирующий сайт эукариотических рибосом обычно содержит остатки G1408 и A1491 по сравнению с остатками A1408 и G1491 бактериального типа. Эта вариация лежит в основе различной чувствительности бактериальных и эукариотических рибосом к семейству аминогликозидов — рибосомных антибиотиков — и другим малым молекулам, которые воздействуют на декодирующий сайт. В месте декодирования рибосомы E. cuniculi остаток A1491 был заменен на U1491, что потенциально создает уникальный интерфейс связывания для малых молекул, нацеленных на этот активный центр. Тот же вариант A14901 также присутствует в других микроспоридиях, таких как P. locustae и V. necatrix, что предполагает его широкое распространение среди видов микроспоридий (рис. 1f).
Поскольку образцы рибосом E. cuniculi были выделены из метаболически неактивных спор, мы проверили крио-ЭМ карту E. cuniculi на предмет ранее описанного связывания рибосом в условиях стресса или голодания. Факторы спячки 31,32,36,37, 38. Мы сопоставили ранее установленную структуру спячки рибосомы с крио-ЭМ картой рибосомы E. cuniculi. Для стыковки использовали рибосомы S. cerevisiae в комплексе с фактором спячки Stm138, рибосомы саранчи в комплексе с фактором Lso232 и рибосомы V. necatrix в комплексе с факторами Mdf1 и Mdf231. Одновременно мы обнаружили крио-ЭМ плотность, соответствующую остаточному фактору Mdf1. Подобно связыванию Mdf1 с рибосомой V. necatrix, Mdf1 также связывается с рибосомой E. cuniculi, где блокирует E-сайт рибосомы, возможно, способствуя высвобождению рибосом, когда споры паразита становятся метаболически неактивными после инактивации организма (Рисунок 2).
Белок Mdf1 блокирует E-сайт рибосомы, что, по-видимому, способствует инактивации рибосомы, когда споры паразита становятся метаболически неактивными. В структуре рибосомы E. cuniculi мы обнаружили, что Mdf1 образует ранее неизвестный контакт со стеблем рибосомы L1, частью рибосомы, которая облегчает высвобождение деацетилированной тРНК из рибосомы во время синтеза белка. Эти контакты предполагают, что Mdf1 диссоциирует от рибосомы, используя тот же механизм, что и деацетилированная тРНК, что дает возможное объяснение тому, как рибосома удаляет Mdf1 для реактивации синтеза белка.
Однако наша структура выявила неизвестный контакт между Mdf1 и рибосомной ножкой L1 (частью рибосомы, которая помогает высвобождать деацилированную тРНК из рибосомы во время синтеза белка). В частности, Mdf1 использует те же контакты, что и локтевой сегмент деацилированной молекулы тРНК (рис. 2). Это ранее неизвестное молекулярное моделирование показало, что Mdf1 диссоциирует от рибосомы, используя тот же механизм, что и деацетилированная тРНК, что объясняет, как рибосома удаляет этот фактор гибернации для повторной активации синтеза белка.
При построении модели рРНК мы обнаружили, что рибосома E. cuniculi имеет аномально свернутые фрагменты рРНК, которые мы назвали слитой рРНК (рис. 3). В рибосомах, охватывающих три домена жизни, рРНК сворачивается в структуры, в которых большинство оснований рРНК либо образуют пары и сворачиваются друг с другом, либо взаимодействуют с рибосомальными белками38,39,40. Однако в рибосомах E. cuniculi рРНК, по-видимому, нарушают этот принцип сворачивания, превращая некоторые из своих спиралей в несвернутые участки рРНК.
Структура спирали H18 25S рРНК у S. cerevisiae, V. necatrix и E. cuniculi. Как правило, в рибосомах, охватывающих три домена жизни, этот линкер сворачивается в спираль РНК, содержащую от 24 до 34 аминокислотных остатков. У микроспоридий, напротив, этот линкер рРНК постепенно сокращается до двух одноцепочечных линкеров, богатых уридином, содержащих всего 12 аминокислотных остатков. Большинство этих остатков доступны для растворителей. На рисунке показано, что паразитические микроспоридии, по-видимому, нарушают общие принципы сворачивания рРНК, где основания рРНК обычно связаны с другими основаниями или участвуют во взаимодействиях рРНК-белок. У микроспоридий некоторые фрагменты рРНК принимают неблагоприятную форму, при которой бывшая спираль рРНК становится одноцепочечным фрагментом, вытянутым почти по прямой линии. Наличие этих необычных участков позволяет рРНК микроспоридий связываться с отдаленными фрагментами рРНК, используя минимальное количество оснований РНК.
Наиболее яркий пример этого эволюционного перехода можно наблюдать в спирали 25S рРНК H18 (рис. 3). У видов от E. coli до человека основания этой спирали рРНК содержат 24-32 нуклеотида, образуя слегка неправильную спираль. В ранее идентифицированных рибосомных структурах V. necatrix и P. locustae31,32 основания спирали H18 частично раскручены, но спаривание нуклеотидных оснований сохраняется. Однако у E. cuniculi этот фрагмент рРНК становится самыми короткими линкерами 228UUUGU232 и 301UUUUUUUUU307. В отличие от типичных фрагментов рРНК, эти богатые уридином линкеры не скручиваются и не вступают в обширный контакт с рибосомными белками. Вместо этого они принимают открытые для растворителя и полностью развернутые структуры, в которых нити рРНК вытянуты почти прямо. Эта вытянутая конформация объясняет, как E. cuniculi использует всего 12 оснований РНК для заполнения зазора в 33 Å между спиралями рРНК H16 и H18, в то время как другим видам требуется как минимум вдвое больше оснований рРНК для заполнения этого зазора.
Таким образом, мы можем продемонстрировать, что паразитические микроспоридии, благодаря энергетически невыгодному сворачиванию, разработали стратегию сокращения даже тех сегментов рРНК, которые остаются в целом консервативными у разных видов во всех трех доменах жизни. По-видимому, накапливая мутации, которые превращают спирали рРНК в короткие поли-U линкеры, E. cuniculi может образовывать необычные фрагменты рРНК, содержащие как можно меньше нуклеотидов для лигирования дистальных фрагментов рРНК. Это помогает объяснить, как микроспоридии достигли резкого сокращения своей основной молекулярной структуры, не теряя при этом структурной и функциональной целостности.
Еще одна необычная особенность рРНК E. cuniculi — отсутствие утолщений (рис. 4). Выступы — это нуклеотиды без пар оснований, которые выкручиваются из спирали РНК, а не прячутся в ней. Большинство выступов рРНК действуют как молекулярные адгезивы, помогая связывать соседние рибосомальные белки или другие фрагменты рРНК. Некоторые из выступов действуют как шарниры, позволяя спирали рРНК оптимально изгибаться и складываться для продуктивного синтеза белка 41.
a) Выступ рРНК (нумерация S. cerevisiae) отсутствует в структуре рибосомы E. cuniculi, но присутствует в большинстве других эукариот. b) Внутренние рибосомы E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens и E. cuniculi лишены многих древних, высококонсервативных выступов рРНК. Эти утолщения стабилизируют структуру рибосомы; следовательно, их отсутствие у микроспоридий указывает на снижение стабильности сворачивания рРНК у паразитов-микроспоридий. Сравнение с P-стеблями (стебли L7/L12 у бактерий) показывает, что потеря выступов рРНК иногда совпадает с появлением новых выступов рядом с утраченными. Спираль H42 в 23S/28S рРНК имеет древний выступ (U1206 у Saccharomyces cerevisiae), возраст которого оценивается как минимум в 3,5 миллиарда лет, благодаря его защите в трех доменах жизни. У микроспоридий этот выступ исчезает. Однако рядом с утраченным выступом появился новый (A1306 у E. cuniculi).
Примечательно, что мы обнаружили, что рибосомы E. cuniculi лишены большинства выступов рРНК, обнаруженных у других видов, включая более 30 выступов, сохранившихся у других эукариот (рис. 4a). Эта потеря устраняет многие контакты между субъединицами рибосомы и соседними спиралями рРНК, иногда создавая большие пустоты внутри рибосомы, что делает рибосому E. cuniculi более пористой по сравнению с более традиционными рибосомами (рис. 4b). Примечательно, что мы обнаружили, что большинство этих выступов также отсутствовали в ранее идентифицированных структурах рибосом V. necatrix и P. locustae, которые были упущены из виду в предыдущих структурных анализах31,32.
Иногда потеря утолщений рРНК сопровождается образованием новых утолщений рядом с утраченным. Например, рибосомальный P-стебель содержит утолщение U1208 (у Saccharomyces cerevisiae), которое сохранилось от E. coli до человека и, следовательно, оценивается в 3,5 миллиарда лет. Во время синтеза белка это утолщение помогает P-стеблю переходить между открытой и закрытой конформациями, чтобы рибосома могла привлекать факторы трансляции и доставлять их к активному центру. В рибосомах E. cuniculi это утолщение отсутствует; однако новое утолщение (G883), расположенное всего в трех парах оснований, может способствовать восстановлению оптимальной гибкости P-стебля (рис. 4c).
Наши данные по рРНК без выпуклостей позволяют предположить, что минимизация рРНК не ограничивается потерей элементов рРНК на поверхности рибосомы, но может также затрагивать ядро ​​рибосомы, создавая специфический для паразита молекулярный дефект, который не был описан в свободноживущих клетках. Наблюдаются живые виды.
После моделирования канонических рибосомальных белков и рРНК мы обнаружили, что обычные рибосомальные компоненты не могут объяснить три части крио-ЭМ изображения. Два из этих фрагментов представляют собой небольшие молекулы (рис. 5, дополнительный рис. 8). Первый сегмент расположен между рибосомальными белками uL15 и eL18 в положении, обычно занимаемом С-концом eL18, который укорочен у E. cuniculi. Хотя мы не можем определить идентичность этой молекулы, размер и форма этого островка плотности хорошо объясняются присутствием молекул спермидина. Его связывание с рибосомой стабилизируется специфическими для микроспоридий мутациями в белках uL15 (Asp51 и Arg56), которые, по-видимому, увеличивают сродство рибосомы к этой небольшой молекуле, поскольку позволяют uL15 обернуть небольшую молекулу в рибосомальную структуру (дополнительный рис. 2). 8, дополнительные данные 1, 2).
Криоэлектронная микроскопия, демонстрирующая наличие нуклеотидов вне рибозы, связанной с рибосомой E. cuniculi. В рибосоме E. cuniculi этот нуклеотид занимает то же место, что и нуклеотид 25S рРНК A3186 (нумерация Saccharomyces cerevisiae) в большинстве других эукариотических рибосом. b В рибосомной структуре E. cuniculi этот нуклеотид расположен между рибосомными белками uL9 и eL20, тем самым стабилизируя контакт между двумя белками. cd Анализ сохранения последовательности eL20 среди видов микроспоридий. Филогенетическое дерево видов Microsporidia (c) и множественное выравнивание последовательностей белка eL20 (d) показывают, что нуклеотид-связывающие остатки F170 и K172 консервативны у большинства типичных Microsporidia, за исключением S. lophii, за исключением ранних ветвящихся Microsporidia, которые сохранили расширение рРНК ES39L. e На этом рисунке показано, что нуклеотид-связывающие остатки F170 и K172 присутствуют только в eL20 сильно редуцированного генома Microsporidia, но не у других эукариот. В целом, эти данные предполагают, что рибосомы Microsporidia разработали сайт связывания нуклеотидов, который, по-видимому, связывает молекулы AMP и использует их для стабилизации белково-белковых взаимодействий в структуре рибосомы. Высокая консервативность этого сайта связывания у Microsporidia и его отсутствие у других эукариот предполагает, что этот сайт может обеспечивать селективное преимущество для выживания Microsporidia. Таким образом, нуклеотид-связывающий карман в рибосоме микроспоридий, по-видимому, не является вырожденной особенностью или конечной формой деградации рРНК, как было описано ранее, а скорее полезным эволюционным нововведением, позволяющим рибосоме микроспоридий напрямую связывать малые молекулы, используя их в качестве молекулярных строительных блоков. Это открытие делает рибосому микроспоридий единственной известной рибосомой, использующей один нуклеотид в качестве структурного строительного блока. Гипотетический эволюционный путь, вытекающий из связывания нуклеотидов.
Вторая низкомолекулярная плотность расположена на границе раздела между рибосомальными белками uL9 и eL30 (рис. 5a). Эта граница раздела ранее была описана в структуре рибосомы Saccharomyces cerevisiae как место связывания нуклеотида 25S рРНК A3186 (часть расширения рРНК ES39L)38. Было показано, что в вырожденных рибосомах P. locustae ES39L эта граница раздела связывает неизвестный единственный нуклеотид31, и предполагается, что этот нуклеотид представляет собой редуцированную конечную форму рРНК, длина которой составляет ~130-230 оснований. ES39L редуцирован до одного нуклеотида32.43. Наши криоэлектронно-микроскопические изображения подтверждают идею о том, что плотность может быть объяснена нуклеотидами. Однако более высокое разрешение нашей структуры показало, что этот нуклеотид является внерибосомальной молекулой, возможно, AMP (рис. 5a, b).
Затем мы задались вопросом, появился ли сайт связывания нуклеотидов в рибосоме E. cuniculi или существовал ранее. Поскольку связывание нуклеотидов в основном опосредуется остатками Phe170 и Lys172 в рибосомальном белке eL30, мы оценили консервативность этих остатков у 4396 репрезентативных эукариот. Как и в случае с uL15 выше, мы обнаружили, что остатки Phe170 и Lys172 высококонсервативны только у типичных микроспоридий, но отсутствуют у других эукариот, включая нетипичные микроспоридии Mitosporidium и Amphiamblys, у которых фрагмент рРНК ES39L не редуцирован 44, 45, 46 (рис. 5c). -e).
В совокупности эти данные подтверждают идею о том, что E. cuniculi и, возможно, другие канонические микроспоридии развили способность эффективно захватывать большое количество малых метаболитов в структуре рибосомы, чтобы компенсировать снижение уровня рРНК и белков. При этом они приобрели уникальную способность связывать нуклеотиды вне рибосомы, демонстрируя, что паразитические молекулярные структуры компенсируют это, захватывая большое количество малых метаболитов и используя их в качестве структурных имитаций деградированных фрагментов РНК и белков.
Третья несмоделированная часть нашей крио-ЭМ карты, обнаруженная в большой рибосомной субъединице. Относительно высокое разрешение (2,6 Å) нашей карты предполагает, что эта плотность принадлежит белкам с уникальными комбинациями крупных боковых цепей, что позволило нам идентифицировать эту плотность как ранее неизвестный рибосомный белок, который мы назвали msL2 (специфичный для микроспоридий белок L2) (методы, рисунок 6). Наш поиск гомологии показал, что msL2 консервативен в кладе микроспоридий рода Encephaliter и Orosporidium, но отсутствует в других видах, включая другие микроспоридии. В рибосомной структуре msL2 занимает пробел, образованный потерей удлиненной рРНК ES31L. В этом пустоте msL2 помогает стабилизировать сворачивание рРНК и может компенсировать потерю ES31L (рисунок 6).
a) Электронная плотность и модель специфичного для микроспоридий рибосомального белка msL2, обнаруженного в рибосомах E. cuniculi. b) У большинства эукариотических рибосом, включая 80S рибосому Saccharomyces cerevisiae, амплификация рРНК ES19L утрачена у большинства видов микроспоридий. Ранее установленная структура рибосомы микроспоридий V. necatrix предполагает, что потеря ES19L у этих паразитов компенсируется эволюцией нового рибосомального белка msL1. В этом исследовании мы обнаружили, что рибосома E. cuniculi также развила дополнительный белок-имитатор рибосомальной РНК в качестве очевидной компенсации потери ES19L. Однако msL2 (в настоящее время аннотированный как гипотетический белок ECU06_1135) и msL1 имеют различное структурное и эволюционное происхождение. Это открытие, свидетельствующее о генерации эволюционно неродственных рибосомных белков msL1 и msL2, предполагает, что если рибосомы накапливают вредные мутации в своей рРНК, они могут достичь беспрецедентного уровня композиционного разнообразия даже в небольшой группе близкородственных видов. Это открытие может помочь прояснить происхождение и эволюцию митохондриальной рибосомы, которая известна своей сильно редуцированной рРНК и аномальной изменчивостью белкового состава у разных видов.
Затем мы сравнили белок msL2 с ранее описанным белком msL1, единственным известным рибосомальным белком, специфичным для микроспоридий, обнаруженным в рибосоме V. necatrix. Мы хотели проверить, связаны ли msL1 и msL2 эволюционно. Наш анализ показал, что msL1 и msL2 занимают одну и ту же полость в рибосомальной структуре, но имеют разные первичные и третичные структуры, что указывает на их независимое эволюционное происхождение (рис. 6). Таким образом, наше открытие msL2 свидетельствует о том, что группы компактных эукариотических видов могут независимо эволюционировать со структурно различными рибосомальными белками, чтобы компенсировать потерю фрагментов рРНК. Это открытие примечательно тем, что большинство цитоплазматических эукариотических рибосом содержат инвариантный белок, включая одно и то же семейство из 81 рибосомального белка. Появление msL1 и msL2 в различных кладах микроспоридий в ответ на потерю удлиненных сегментов рРНК предполагает, что деградация молекулярной архитектуры паразита заставляет паразитов искать компенсаторные мутации, которые в конечном итоге могут привести к их приобретению в различных популяциях паразитов.
Наконец, после завершения работы над моделью, мы сравнили состав рибосомы E. cuniculi с составом, предсказанным на основе последовательности генома. Ранее считалось, что несколько рибосомных белков, включая eL14, eL38, eL41 и eS30, отсутствуют в геноме E. cuniculi из-за очевидного отсутствия их гомологов в геноме E. cuniculi. Потеря многих рибосомных белков также прогнозируется у большинства других сильно редуцированных внутриклеточных паразитов и эндосимбионтов. Например, хотя большинство свободноживущих бактерий содержат одно и то же семейство из 54 рибосомных белков, только 11 из этих семейств белков имеют обнаруживаемые гомологи в каждом анализируемом геноме бактерий, ограниченных определенным хозяином. В подтверждение этой гипотезы экспериментально наблюдалась потеря рибосомальных белков у микроспоридий V. necatrix и P. locustae, у которых отсутствуют белки eL38 и eL4131,32.
Однако наши структуры показывают, что в рибосоме E. cuniculi фактически утрачиваются только eL38, eL41 и eS30. Белок eL14 был консервативен, и наша структура показала, почему этот белок не был обнаружен при поиске гомологии (рис. 7). В рибосомах E. cuniculi большая часть сайта связывания eL14 утрачивается из-за деградации амплифицированного рРНК ES39L. В отсутствие ES39L eL14 теряет большую часть своей вторичной структуры, и только 18% последовательности eL14 идентичны у E. cuniculi и S. cerevisiae. Такая низкая сохранность последовательности примечательна, поскольку даже Saccharomyces cerevisiae и Homo sapiens — организмы, эволюционировавшие с разницей в 1,5 миллиарда лет — имеют более 51% общих остатков в eL14. Эта аномальная потеря консервативности объясняет, почему белок E. cuniculi eL14 в настоящее время аннотируется как предполагаемый белок M970_061160, а не как рибосомальный белок eL1427.
Рибосома микроспоридий утратила расширение рРНК ES39L, что частично устранило сайт связывания рибосомального белка eL14. В отсутствие ES39L белок микроспор eL14 теряет вторичную структуру, при этом бывшая α-спираль, связывающая рРНК, вырождается в петлю минимальной длины. b Множественное выравнивание последовательностей показывает, что белок eL14 высококонсервативен у эукариотических видов (57% идентичности последовательностей между дрожжевыми и человеческими гомологами), но плохо консервативен и дивергентен у микроспоридий (у которых не более 24% остатков идентичны гомологу eL14). (из S. cerevisiae или H. sapiens). Эта низкая консервация последовательности и изменчивость вторичной структуры объясняют, почему гомолог eL14 никогда не был обнаружен у E. cuniculi и почему считается, что этот белок был утрачен у E. cuniculi. Напротив, белок E. cuniculi eL14 ранее был аннотирован как предполагаемый белок M970_061160. Это наблюдение предполагает, что разнообразие генома микроспоридий в настоящее время переоценено: некоторые гены, которые в настоящее время считаются утраченными у микроспоридий, на самом деле сохранились, хотя и в сильно дифференцированных формах; вместо этого некоторые из них, которые, как считается, кодируют гены микроспоридий, кодирующие специфические для червей белки (например, гипотетический белок M970_061160), на самом деле кодируют очень разнообразные белки, обнаруженные у других эукариот.
Это открытие предполагает, что денатурация рРНК может привести к резкой потере консервативности последовательности в соседних рибосомальных белках, что делает эти белки необнаружимыми при поиске гомологии. Таким образом, мы можем переоценивать фактическую степень молекулярной деградации в организмах с малым геномом, поскольку некоторые белки, которые считались утраченными, на самом деле сохраняются, хотя и в сильно измененных формах.
Как паразитам удаётся сохранять функциональность своих молекулярных машин в условиях экстремального сокращения генома? Наше исследование отвечает на этот вопрос, описывая сложную молекулярную структуру (рибосому) E. cuniculi, организма с одним из самых маленьких эукариотических геномов.
Уже почти два десятилетия известно, что молекулы белков и РНК у микробных паразитов часто отличаются от своих гомологичных молекул у свободноживущих видов, поскольку у них отсутствуют центры контроля качества, их размер уменьшен до 50% от размера свободноживущих микробов и т. д., а также из-за множества ослабляющих мутаций, нарушающих сворачивание и функцию. Например, рибосомы организмов с малым геномом, включая многих внутриклеточных паразитов и эндосимбионтов, предположительно лишены нескольких рибосомных белков и до одной трети нуклеотидов рРНК по сравнению со свободноживущими видами 27, 29, 30, 49. Однако механизм функционирования этих молекул у паразитов остается в значительной степени загадкой, изучаемой главным образом с помощью сравнительной геномики.
Наше исследование показывает, что структура макромолекул может выявить многие аспекты эволюции, которые трудно извлечь из традиционных сравнительных геномных исследований внутриклеточных паразитов и других организмов, ограниченных определенными хозяевами (дополнительный рис. 7). Например, пример белка eL14 показывает, что мы можем переоценивать фактическую степень деградации молекулярного аппарата у паразитических видов. Считается, что энцефалитические паразиты имеют сотни генов, специфичных для микроспоридий. Однако наши результаты показывают, что некоторые из этих, казалось бы, специфических генов на самом деле являются лишь очень разными вариантами генов, распространенных у других эукариот. Более того, пример белка msL2 показывает, как мы упускаем из виду новые рибосомальные белки и недооцениваем содержание молекулярных машин паразитов. Пример малых молекул показывает, как мы можем упускать из виду самые гениальные инновации в молекулярных структурах паразитов, которые могут придать им новую биологическую активность.
В совокупности эти результаты улучшают наше понимание различий между молекулярными структурами организмов, ограниченных определенным хозяином, и их аналогами в свободноживущих организмах. Мы показываем, что молекулярные машины, которые долгое время считались редуцированными, дегенеративными и подверженными различным ослабляющим мутациям, на самом деле обладают набором систематически упускаемых из виду необычных структурных особенностей.
С другой стороны, обнаруженные нами в рибосомах E. cuniculi негромоздкие фрагменты рРНК и слитые фрагменты позволяют предположить, что редукция генома может изменить даже те части основного молекулярного механизма, которые сохранились во всех трех доменах жизни – после почти 3,5 миллиардов лет независимой эволюции видов.
Фрагменты рРНК без выпуклостей и слитые фрагменты в рибосомах E. cuniculi представляют особый интерес в свете предыдущих исследований молекул РНК в эндосимбиотических бактериях. Например, у эндосимбионта тли Buchnera aphidicola было показано, что молекулы рРНК и тРНК имеют термочувствительные структуры из-за смещения состава A+T и высокой доли неканонических пар оснований20,50. Считается, что эти изменения в РНК, а также изменения в молекулах белков, ответственны за чрезмерную зависимость эндосимбионтов от партнеров и неспособность эндосимбионтов передавать тепло21,23. Хотя рРНК паразитических микроспоридий имеет структурно отличающиеся изменения, характер этих изменений предполагает, что снижение термостабильности и более высокая зависимость от белков-шаперонов могут быть общими чертами молекул РНК в организмах с редуцированными геномами.
С другой стороны, наши структурные данные показывают, что паразитические микроспоридии развили уникальную способность противостоять широко консервативным фрагментам рРНК и белков, развив способность использовать многочисленные и легкодоступные малые метаболиты в качестве структурных имитаторов вырожденных фрагментов рРНК и белков. Деградация молекулярной структуры. Это мнение подтверждается тем фактом, что малые молекулы, компенсирующие потерю фрагментов белка в рРНК и рибосомах E. cuniculi, связываются со специфическими для микроспоридий остатками в белках uL15 и eL30. Это предполагает, что связывание малых молекул с рибосомами может быть продуктом положительного отбора, при котором специфические для микроспоридий мутации в рибосомальных белках были отобраны за их способность повышать сродство рибосом к малым молекулам, что может привести к более эффективным рибосомальным организмам. Это открытие выявляет умную инновацию в молекулярной структуре микробных паразитов и позволяет нам лучше понять, как молекулярные структуры паразитов сохраняют свою функцию, несмотря на редуктивную эволюцию.
В настоящее время идентификация этих малых молекул остается неясной. Непонятно, почему появление этих малых молекул в структуре рибосом различается у разных видов микроспоридий. В частности, неясно, почему связывание нуклеотидов наблюдается в рибосомах E. cuniculi и P. locustae, а не в рибосомах V. necatrix, несмотря на наличие остатка F170 в белках eL20 и K172 V. necatrix. Это удаление может быть вызвано остатком 43 uL6 (расположенным рядом с карманом связывания нуклеотидов), который является тирозином у V. necatrix, а не треонином у E. cuniculi и P. locustae. Объёмная ароматическая боковая цепь Tyr43 может препятствовать связыванию нуклеотидов из-за стерического перекрытия. В качестве альтернативного объяснения, кажущаяся делеция нуклеотидов может быть обусловлена ​​низким разрешением криоэлектронной микроскопии, что затрудняет моделирование рибосомных фрагментов V. necatrix.
С другой стороны, наша работа предполагает, что процесс деградации генома может быть новаторской силой. В частности, структура рибосомы E. cuniculi указывает на то, что потеря фрагментов рРНК и белков в рибосоме микроспоридий создает эволюционное давление, способствующее изменениям в структуре рибосомы. Эти варианты встречаются далеко от активного центра рибосомы и, по-видимому, помогают поддерживать (или восстанавливать) оптимальную сборку рибосомы, которая в противном случае была бы нарушена из-за уменьшения количества рРНК. Это говорит о том, что одним из главных нововведений рибосомы микроспоридий, по-видимому, стала необходимость сглаживать дрейф генов.
Возможно, лучше всего это иллюстрируется связыванием нуклеотидов, которое до сих пор не наблюдалось у других организмов. Тот факт, что остатки, связывающие нуклеотиды, присутствуют в типичных микроспоридиях, но отсутствуют у других эукариот, предполагает, что сайты связывания нуклеотидов — это не просто реликты, ожидающие исчезновения, или конечный сайт для восстановления рРНК в форме отдельных нуклеотидов. Вместо этого, этот сайт, по-видимому, является полезной особенностью, которая могла развиться в течение нескольких раундов положительного отбора. Сайты связывания нуклеотидов могут быть побочным продуктом естественного отбора: после деградации ES39L микроспоридии вынуждены искать компенсацию для восстановления оптимального биогенеза рибосом в отсутствие ES39L. Поскольку этот нуклеотид может имитировать молекулярные контакты нуклеотида A3186 в ES39L, молекула нуклеотида становится строительным блоком рибосомы, связывание которой дополнительно улучшается мутацией последовательности eL30.
Что касается молекулярной эволюции внутриклеточных паразитов, наше исследование показывает, что силы дарвиновского естественного отбора и генетического дрейфа, приводящего к деградации генома, действуют не параллельно, а колеблются. Во-первых, генетический дрейф устраняет важные особенности биомолекул, что делает крайне необходимой компенсацию. Только когда паразиты удовлетворяют эту потребность посредством дарвиновского естественного отбора, их макромолекулы получают шанс развить свои наиболее впечатляющие и инновационные признаки. Важно отметить, что эволюция сайтов связывания нуклеотидов в рибосоме E. cuniculi предполагает, что этот паттерн молекулярной эволюции «потеря-приобретение» не только амортизирует вредные мутации, но иногда и наделяет паразитические макромолекулы совершенно новыми функциями.
Эта идея согласуется с теорией движущегося равновесия Сьюэлла Райта, которая утверждает, что строгая система естественного отбора ограничивает способность организмов к инновациям51,52,53. Однако, если генетический дрейф нарушает естественный отбор, эти дрейфы могут приводить к изменениям, которые сами по себе не являются адаптивными (или даже вредными), но приводят к дальнейшим изменениям, обеспечивающим более высокую приспособленность или новую биологическую активность. Наша модель подтверждает эту идею, показывая, что тот же тип мутации, который уменьшает структуру и функцию биомолекулы, по-видимому, является основным триггером ее улучшения. В соответствии с эволюционной моделью «выигрыш-выигрыш», наше исследование показывает, что деградация генома, традиционно рассматриваемая как дегенеративный процесс, также является основным двигателем инноваций, иногда, а возможно, даже часто позволяя макромолекулам приобретать новые паразитические виды деятельности.