Спасибо за посещение Nature.com. Версия браузера, которую вы используете, имеет ограниченную поддержку CSS. Для наилучшего опыта мы рекомендуем вам использовать обновленный браузер (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). В то же время, чтобы обеспечить постоянную поддержку, мы будем отображать сайт без стилей и JavaScript.
Эволюция микробных паразитов включает противодействие между естественным отбором, который заставляет паразитов совершенствоваться, и генетическим дрейфом, который заставляет паразитов терять гены и накапливать вредные мутации. Здесь, чтобы понять, как это противодействие происходит в масштабе одной макромолекулы, мы описываем крио-ЭМ структуру рибосомы Encephalitozoon cuniculi, эукариотического организма с одним из самых маленьких геномов в природе. Экстремальное сокращение рРНК в рибосомах E. cuniculi сопровождается беспрецедентными структурными изменениями, такими как эволюция ранее неизвестных слитых линкеров рРНК и рРНК без выступов. Кроме того, рибосома E. cuniculi пережила потерю фрагментов рРНК и белков, развив способность использовать малые молекулы в качестве структурных имитаторов деградированных фрагментов рРНК и белков. В целом мы показываем, что молекулярные структуры, которые долгое время считались редуцирующимися, дегенерирующими и подверженными разрушительным мутациям, имеют ряд компенсаторных механизмов, которые поддерживают их активность, несмотря на экстремальные молекулярные сокращения.
Поскольку большинство групп микробных паразитов имеют уникальные молекулярные инструменты для эксплуатации своих хозяев, нам часто приходится разрабатывать различные терапевтические средства для разных групп паразитов1,2. Однако новые данные свидетельствуют о том, что некоторые аспекты эволюции паразитов являются конвергентными и в значительной степени предсказуемыми, что указывает на потенциальную основу для широких терапевтических вмешательств в отношении микробных паразитов3,4,5,6,7,8,9.
Предыдущие работы выявили общую эволюционную тенденцию у микробных паразитов, называемую редукцией генома или распадом генома10,11,12,13. Текущие исследования показывают, что когда микроорганизмы отказываются от своего свободноживущего образа жизни и становятся внутриклеточными паразитами (или эндосимбионтами), их геномы претерпевают медленные, но удивительные метаморфозы в течение миллионов лет9,11. В процессе, известном как распад генома, микробные паразиты накапливают вредные мутации, которые превращают многие ранее важные гены в псевдогены, что приводит к постепенной потере генов и мутационному коллапсу14,15. Этот коллапс может уничтожить до 95% генов у самых старых внутриклеточных организмов по сравнению с близкородственными свободноживущими видами. Таким образом, эволюция внутриклеточных паразитов представляет собой перетягивание каната между двумя противоборствующими силами: дарвиновским естественным отбором, приводящим к улучшению паразитов, и коллапсом генома, отправляющим паразитов в небытие. Как паразиту удалось выйти из этой перетягивания каната и сохранить активность своей молекулярной структуры, остается неясным.
Хотя механизм распада генома не полностью изучен, он, по-видимому, происходит в основном из-за частого генетического дрейфа. Поскольку паразиты живут небольшими, бесполыми и генетически ограниченными популяциями, они не могут эффективно устранять вредные мутации, которые иногда возникают во время репликации ДНК. Это приводит к необратимому накоплению вредных мутаций и сокращению генома паразита. В результате паразит не только теряет гены, которые больше не нужны для его выживания во внутриклеточной среде. Именно неспособность популяций паразитов эффективно устранять спорадические вредные мутации приводит к тому, что эти мутации накапливаются по всему геному, включая их самые важные гены.
Большая часть нашего текущего понимания редукции генома основана исключительно на сравнении последовательностей генома, с меньшим вниманием к изменениям в реальных молекулах, которые выполняют функции домашнего хозяйства и служат потенциальными мишенями для лекарств. Сравнительные исследования показали, что бремя вредных внутриклеточных микробных мутаций, по-видимому, предрасполагает белки и нуклеиновые кислоты к неправильному сворачиванию и агрегации, делая их более зависимыми от шаперонов и гиперчувствительными к теплу19,20,21,22,23. Кроме того, различные паразиты — независимая эволюция, иногда разделенная 2,5 миллиардами лет — испытали аналогичную потерю центров контроля качества в своих механизмах синтеза белка5,6 и репарации ДНК24. Однако мало что известно о влиянии внутриклеточного образа жизни на все другие свойства клеточных макромолекул, включая молекулярную адаптацию к растущему бремени вредных мутаций.
В данной работе для лучшего понимания эволюции белков и нуклеиновых кислот внутриклеточных микроорганизмов мы определили структуру рибосом внутриклеточного паразита Encephalitozoon cuniculi. E. cuniculi — грибоподобный организм, принадлежащий к группе паразитических микроспоридий, которые имеют необычно маленькие эукариотические геномы и поэтому используются в качестве модельных организмов для изучения распада генома25,26,27,28,29,30. Недавно была определена структура рибосомы с помощью крио-ЭМ для умеренно редуцированных геномов Microsporidia, Paranosema locustae и Vairimorpha necatrix31,32 (геном ~3,2 Мб). Эти структуры предполагают, что некоторая потеря амплификации рРНК компенсируется развитием новых контактов между соседними рибосомными белками или приобретением новых рибосомных белков msL131,32. Вид Encephalitozoon (геном ~2,5 млн пн), наряду с их ближайшим родственником Ordospora, демонстрирует предельную степень редукции генома у эукариот – у них менее 2000 генов, кодирующих белки, и ожидается, что их рибосомы не только лишены фрагментов расширения рРНК (фрагментов рРНК, которые отличают эукариотические рибосомы от бактериальных рибосом), но и имеют четыре рибосомных белка из-за отсутствия гомологов в геноме E. cuniculi26,27,28. Поэтому мы пришли к выводу, что рибосома E. cuniculi может выявить ранее неизвестные стратегии молекулярной адаптации к распаду генома.
Наша крио-ЭМ структура представляет собой наименьшую эукариотическую цитоплазматическую рибосому, которая была охарактеризована, и дает представление о том, как конечная степень редукции генома влияет на структуру, сборку и эволюцию молекулярного механизма, который является неотъемлемой частью клетки. Мы обнаружили, что рибосома E. cuniculi нарушает многие широко распространенные принципы сворачивания РНК и сборки рибосомы, и открыли новый, ранее неизвестный рибосомный белок. Совершенно неожиданно мы показываем, что рибосомы микроспоридий развили способность связывать малые молекулы, и выдвигаем гипотезу, что усечения в рРНК и белках запускают эволюционные инновации, которые в конечном итоге могут придать рибосоме полезные качества.
Чтобы улучшить наше понимание эволюции белков и нуклеиновых кислот во внутриклеточных организмах, мы решили выделить споры E. cuniculi из культур инфицированных клеток млекопитающих, чтобы очистить их рибосомы и определить структуру этих рибосом. Получить большое количество паразитических микроспоридий сложно, поскольку микроспоридии невозможно культивировать в питательной среде. Вместо этого они растут и размножаются только внутри клетки-хозяина. Поэтому, чтобы получить биомассу E. cuniculi для очистки рибосом, мы заразили линию клеток почек млекопитающих RK13 спорами E. cuniculi и культивировали эти инфицированные клетки в течение нескольких недель, чтобы позволить E. cuniculi расти и размножаться. Используя монослой инфицированных клеток площадью около половины квадратного метра, мы смогли очистить около 300 мг спор Microsporidia и использовать их для выделения рибосом. Затем мы разрушили очищенные споры стеклянными шариками и изолировали сырые рибосомы с помощью поэтапного фракционирования лизатов полиэтиленгликолем. Это позволило нам получить около 300 мкг сырых рибосом E. cuniculi для структурного анализа.
Затем мы собрали крио-ЭМ изображения, используя полученные образцы рибосом, и обработали эти изображения, используя маски, соответствующие большой рибосомной субъединице, головке малой субъединицы и малой субъединице. В ходе этого процесса мы собрали изображения около 108 000 рибосомных частиц и вычислили крио-ЭМ изображения с разрешением 2,7 Å (дополнительные рисунки 1–3). Затем мы использовали крио-ЭМ изображения для моделирования рРНК, рибосомного белка и фактора гибернации Mdf1, связанных с рибосомами E. cuniculi (рис. 1a, b).
a Структура рибосомы E. cuniculi в комплексе с фактором гибернации Mdf1 (pdb id 7QEP). b Карта фактора гибернации Mdf1, связанного с рибосомой E. cuniculi. c Карта вторичной структуры, сравнивающая восстановленную рРНК у видов микроспоридий с известными рибосомными структурами. На панелях показано расположение амплифицированных фрагментов рРНК (ES) и активных участков рибосомы, включая участок декодирования (DC), петлю сарциницина (SRL) и пептидилтрансферазный центр (PTC). d Электронная плотность, соответствующая пептидилтрансферазному центру рибосомы E. cuniculi, предполагает, что этот каталитический участок имеет одинаковую структуру у паразита E. cuniculi и его хозяев, включая H. sapiens. e, f Соответствующая электронная плотность декодирующего центра (e) и схематическая структура декодирующего центра (f) указывают на то, что E. cuniculi имеет остатки U1491 вместо A1491 (нумерация E. coli) во многих других эукариотах. Это изменение предполагает, что E. cuniculi может быть чувствителен к антибиотикам, которые нацелены на этот активный сайт.
В отличие от ранее установленных структур рибосом V. necatrix и P. locustae (обе структуры представляют одно и то же семейство микроспоридий Nosematidae и очень похожи друг на друга), 31,32 рибосомы E. cuniculi подвергаются многочисленным процессам фрагментации рРНК и белка. Дальнейшая денатурация (Дополнительные рисунки 4-6). В рРНК наиболее поразительные изменения включали полную потерю амплифицированного фрагмента 25S рРНК ES12L и частичную дегенерацию спиралей h39, h41 и H18 (рис. 1c, дополнительный рисунок 4). Среди рибосомальных белков наиболее яркими изменениями стали полная потеря белка eS30 и укорочение белков eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 и eS7 (дополнительные рисунки 4, 5).
Таким образом, экстремальная редукция геномов видов Encephalotozoon/Ordospora отражена в их рибосомной структуре: рибосомы E. cuniculi испытывают самую резкую потерю белкового содержания среди эукариотических цитоплазматических рибосом, подлежащих структурной характеристике, и у них даже нет тех рРНК и фрагментов белков, которые широко сохраняются не только у эукариот, но и в трех доменах жизни. Структура рибосомы E. cuniculi обеспечивает первую молекулярную модель для этих изменений и раскрывает эволюционные события, которые были упущены из виду как сравнительной геномикой, так и исследованиями внутриклеточной биомолекулярной структуры (Дополнительный рис. 7). Ниже мы описываем каждое из этих событий вместе с их вероятным эволюционным происхождением и их потенциальным влиянием на функцию рибосом.
Затем мы обнаружили, что в дополнение к большим укорочениям рРНК рибосомы E. cuniculi имеют вариации рРНК в одном из своих активных участков. Хотя пептидилтрансферазный центр рибосомы E. cuniculi имеет ту же структуру, что и другие эукариотические рибосомы (рис. 1d), декодирующий центр отличается из-за вариации последовательности в нуклеотиде 1491 (нумерация E. coli, рис. 1e, f). Это наблюдение важно, поскольку декодирующий участок эукариотических рибосом обычно содержит остатки G1408 и A1491 по сравнению с остатками бактериального типа A1408 и G1491. Эта вариация лежит в основе различной чувствительности бактериальных и эукариотических рибосом к семейству аминогликозидов рибосомальных антибиотиков и другим малым молекулам, которые нацелены на декодирующий участок. В декодирующем сайте рибосомы E. cuniculi остаток A1491 был заменен на U1491, что потенциально создает уникальный интерфейс связывания для малых молекул, нацеленных на этот активный сайт. Тот же вариант A14901 также присутствует в других микроспоридиях, таких как P. locustae и V. necatrix, что позволяет предположить его широкое распространение среди видов микроспоридий (рис. 1f).
Поскольку наши образцы рибосом E. cuniculi были выделены из метаболически неактивных спор, мы протестировали крио-ЭМ-карту E. cuniculi на предмет ранее описанного связывания рибосом в условиях стресса или голодания. Факторы гибернации 31,32,36,37, 38. Мы сопоставили ранее установленную структуру гибернирующей рибосомы с крио-ЭМ-картой рибосомы E. cuniculi. Для стыковки рибосомы S. cerevisiae использовались в комплексе с фактором гибернации Stm138, рибосомы саранчи в комплексе с фактором Lso232 и рибосомы V. necatrix в комплексе с факторами Mdf1 и Mdf231. В то же время мы обнаружили плотность крио-ЭМ, соответствующую фактору покоя Mdf1. Подобно связыванию Mdf1 с рибосомой V. necatrix, Mdf1 также связывается с рибосомой E. cuniculi, где он блокирует участок E рибосомы, возможно, помогая сделать рибосомы доступными, когда споры паразита становятся метаболически неактивными после инактивации организма (рисунок 2). ).
Mdf1 блокирует сайт E рибосомы, что, по-видимому, помогает инактивировать рибосому, когда споры паразита становятся метаболически неактивными. В структуре рибосомы E. cuniculi мы обнаружили, что Mdf1 образует ранее неизвестный контакт со стержнем рибосомы L1, частью рибосомы, которая облегчает высвобождение деацилированной тРНК из рибосомы во время синтеза белка. Эти контакты предполагают, что Mdf1 диссоциирует от рибосомы, используя тот же механизм, что и деацетилированная тРНК, что дает возможное объяснение тому, как рибосома удаляет Mdf1 для реактивации синтеза белка.
Однако наша структура выявила неизвестный контакт между Mdf1 и ногой рибосомы L1 (часть рибосомы, которая помогает высвобождать деацилированную тРНК из рибосомы во время синтеза белка). В частности, Mdf1 использует те же контакты, что и сегмент локтя деацилированной молекулы тРНК (рис. 2). Это ранее неизвестное молекулярное моделирование показало, что Mdf1 диссоциирует от рибосомы, используя тот же механизм, что и деацилированная тРНК, что объясняет, как рибосома удаляет этот фактор гибернации для реактивации синтеза белка.
При построении модели рРНК мы обнаружили, что рибосома E. cuniculi имеет аномально свернутые фрагменты рРНК, которые мы назвали слитыми рРНК (рис. 3). В рибосомах, которые охватывают три домена жизни, рРНК сворачивается в структуры, в которых большинство оснований рРНК либо спариваются и сворачиваются друг с другом, либо взаимодействуют с рибосомными белками38,39,40. Однако в рибосомах E. cuniculi рРНК, по-видимому, нарушают этот принцип сворачивания, превращая некоторые из своих спиралей в развернутые области рРНК.
Структура спирали рРНК H18 25S у S. cerevisiae, V. necatrix и E. cuniculi. Обычно в рибосомах, охватывающих три домена жизни, этот линкер скручивается в спираль РНК, содержащую от 24 до 34 остатков. У Microsporidia, напротив, этот линкер рРНК постепенно редуцируется до двух одноцепочечных линкеров, богатых уридином, содержащих всего 12 остатков. Большинство этих остатков подвергаются воздействию растворителей. На рисунке показано, что паразитические микроспоридии, по-видимому, нарушают общие принципы сворачивания рРНК, где основания рРНК обычно связаны с другими основаниями или участвуют во взаимодействиях рРНК-белок. У microsporidia некоторые фрагменты рРНК принимают неблагоприятную складку, при которой бывшая спираль рРНК становится одноцепочечным фрагментом, вытянутым почти в прямую линию. Наличие этих необычных участков позволяет рРНК микроспоридий связывать отдаленные фрагменты рРНК, используя минимальное количество оснований РНК.
Наиболее яркий пример этого эволюционного перехода можно наблюдать в спирали рРНК H18 25S (рис. 3). У видов от E. coli до человека основания этой спирали рРНК содержат 24-32 нуклеотида, образуя слегка нерегулярную спираль. В ранее идентифицированных рибосомных структурах от V. necatrix и P. locustae,31,32 основания спирали H18 частично раскручены, но спаривание нуклеотидных оснований сохранено. Однако у E. cuniculi этот фрагмент рРНК становится самыми короткими линкерами 228UUUGU232 и 301UUUUUUUUU307. В отличие от типичных фрагментов рРНК, эти богатые уридином линкеры не скручиваются и не образуют обширного контакта с рибосомными белками. Вместо этого они принимают открытые для растворителя и полностью развернутые структуры, в которых нити рРНК вытянуты почти прямо. Эта вытянутая конформация объясняет, как E. cuniculi использует всего 12 оснований РНК для заполнения промежутка в 33 Å между спиралями рРНК H16 и H18, в то время как другим видам требуется как минимум вдвое больше оснований рРНК для заполнения промежутка.
Таким образом, мы можем продемонстрировать, что посредством энергетически невыгодного сворачивания паразитические микроспоридии разработали стратегию сокращения даже тех сегментов рРНК, которые остаются широко сохраненными у разных видов в трех доменах жизни. По-видимому, накапливая мутации, которые преобразуют спирали рРНК в короткие поли-U-линкеры, E. cuniculi может формировать необычные фрагменты рРНК, содержащие как можно меньше нуклеотидов для лигирования дистальных фрагментов рРНК. Это помогает объяснить, как микроспоридии достигли резкого сокращения своей базовой молекулярной структуры, не теряя при этом своей структурной и функциональной целостности.
Еще одной необычной особенностью рРНК E. cuniculi является появление рРНК без утолщений (рис. 4). Выступы представляют собой нуклеотиды без пар оснований, которые выкручиваются из спирали РНК, а не прячутся в ней. Большинство выступов рРНК действуют как молекулярные клеи, помогая связывать соседние рибосомные белки или другие фрагменты рРНК. Некоторые из выступов действуют как шарниры, позволяя спирали рРНК изгибаться и складываться оптимально для продуктивного синтеза белка 41 .
a Выступ рРНК (нумерация S. cerevisiae) отсутствует в структуре рибосомы E. cuniculi, но присутствует у большинства других эукариот b Внутренние рибосомы E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens и E. cuniculi. паразиты лишены многих древних, высококонсервативных выступов рРНК. Эти утолщения стабилизируют структуру рибосомы; поэтому их отсутствие у микроспоридий указывает на сниженную стабильность сворачивания рРНК у паразитов микроспоридий. Сравнение со стеблями P (стебли L7/L12 у бактерий) показывает, что потеря выступов рРНК иногда совпадает с появлением новых выступов рядом с утраченными. Спираль H42 в 23S/28S рРНК имеет древнюю выпуклость (U1206 у Saccharomyces cerevisiae), возраст которой оценивается по меньшей мере в 3,5 миллиарда лет из-за ее защиты в трех доменах жизни. У микроспоридий эта выпуклость устранена. Однако рядом с утраченной выпуклостью появилась новая выпуклость (A1306 у E. cuniculi).
Поразительно, но мы обнаружили, что рибосомы E. cuniculi лишены большинства выпуклостей рРНК, обнаруженных у других видов, включая более 30 выпуклостей, сохранившихся у других эукариот (рис. 4а). Эта потеря устраняет многие контакты между субъединицами рибосомы и соседними спиралями рРНК, иногда создавая большие полые пустоты внутри рибосомы, делая рибосому E. cuniculi более пористой по сравнению с более традиционными рибосомами (рис. 4b). В частности, мы обнаружили, что большинство этих выпуклостей также были утрачены в ранее идентифицированных структурах рибосомы V. necatrix и P. locustae, которые были проигнорированы предыдущими структурными анализами31,32.
Иногда потеря выступов рРНК сопровождается развитием новых выступов рядом с утраченным выступом. Например, рибосомный P-стебель содержит выступ U1208 (у Saccharomyces cerevisiae), который сохранился от E. coli до человека и, следовательно, его возраст оценивается в 3,5 миллиарда лет. Во время синтеза белка этот выступ помогает P-стеблю перемещаться между открытой и закрытой конформациями, чтобы рибосома могла привлекать факторы трансляции и доставлять их в активный центр. В рибосомах E. cuniculi это утолщение отсутствует; однако новое утолщение (G883), расположенное только в трех парах оснований, может способствовать восстановлению оптимальной гибкости P-стебля (рис. 4c).
Наши данные по рРНК без выступов свидетельствуют о том, что минимизация рРНК не ограничивается потерей элементов рРНК на поверхности рибосомы, но может также затрагивать ядро ​​рибосомы, создавая специфический для паразита молекулярный дефект, который не был описан в свободноживущих клетках. наблюдаются живые виды.
После моделирования канонических рибосомных белков и рРНК мы обнаружили, что обычные рибосомные компоненты не могут объяснить три части крио-ЭМ изображения. Два из этих фрагментов являются небольшими молекулами по размеру (рис. 5, дополнительный рис. 8). Первый сегмент зажат между рибосомными белками uL15 и eL18 в положении, обычно занимаемом C-концом eL18, который укорочен у E. cuniculi. Хотя мы не можем определить идентичность этой молекулы, размер и форма этого острова плотности хорошо объясняются присутствием молекул спермидина. Его связывание с рибосомой стабилизируется специфическими для микроспоридий мутациями в белках uL15 (Asp51 и Arg56), которые, по-видимому, увеличивают сродство рибосомы к этой небольшой молекуле, поскольку они позволяют uL15 обернуть небольшую молекулу в рибосомную структуру. дополнительный рисунок 2). 8, дополнительные данные 1, 2).
Крио-ЭМ-визуализация, показывающая наличие нуклеотидов за пределами рибозы, связанной с рибосомой E. cuniculi. В рибосоме E. cuniculi этот нуклеотид занимает то же место, что и нуклеотид 25S рРНК A3186 (нумерация Saccharomyces cerevisiae) в большинстве других эукариотических рибосом. b В рибосомальной структуре E. cuniculi этот нуклеотид расположен между рибосомальными белками uL9 и eL20, тем самым стабилизируя контакт между двумя белками. cd Анализ сохранения последовательности eL20 среди видов микроспоридий. Филогенетическое дерево видов Microsporidia (c) и множественное выравнивание последовательностей белка eL20 (d) показывают, что нуклеотидсвязывающие остатки F170 и K172 сохраняются в большинстве типичных Microsporidia, за исключением S. lophii, за исключением ранних ветвящихся Microsporidia, которые сохранили расширение рРНК ES39L. e На этом рисунке показано, что нуклеотидсвязывающие остатки F170 и K172 присутствуют только в eL20 сильно редуцированного генома Microsporidia, но не в других эукариотах. В целом, эти данные свидетельствуют о том, что рибосомы Microsporidia развили сайт связывания нуклеотидов, который, по-видимому, связывает молекулы AMP и использует их для стабилизации белок-белковых взаимодействий в рибосомальной структуре. Высокая консервативность этого сайта связывания у Microsporidia и его отсутствие у других эукариот предполагает, что этот сайт может обеспечивать селективное преимущество выживания для Microsporidia. Таким образом, нуклеотидсвязывающий карман в рибосоме микроспоридии, по-видимому, не является вырожденной особенностью или конечной формой деградации рРНК, как было описано ранее, а скорее полезным эволюционным новшеством, которое позволяет рибосоме микроспоридии напрямую связывать небольшие молекулы, используя их в качестве молекулярных строительных блоков. строительных блоков для рибосом. Это открытие делает рибосому микроспоридии единственной рибосомой, которая, как известно, использует один нуклеотид в качестве своего структурного строительного блока. f Гипотетический эволюционный путь, полученный из связывания нуклеотидов.
Вторая низкомолекулярная плотность расположена на интерфейсе между рибосомными белками uL9 и eL30 (рис. 5а). Этот интерфейс был ранее описан в структуре рибосомы Saccharomyces cerevisiae как сайт связывания для нуклеотида 25S рРНК A3186 (часть расширения рРНК ES39L)38. Было показано, что в вырожденных рибосомах P. locustae ES39L этот интерфейс связывает неизвестный одиночный нуклеотид 31, и предполагается, что этот нуклеотид является восстановленной конечной формой рРНК, в которой длина рРНК составляет ~130-230 оснований. ES39L восстановлен до одного нуклеотида 32.43. Наши крио-ЭМ изображения подтверждают идею о том, что плотность может быть объяснена нуклеотидами. Однако более высокое разрешение нашей структуры показало, что этот нуклеотид представляет собой внерибосомальную молекулу, возможно, AMP (рис. 5а, б).
Затем мы задались вопросом, появился ли сайт связывания нуклеотидов в рибосоме E. cuniculi или он существовал ранее. Поскольку связывание нуклеотидов в основном опосредовано остатками Phe170 и Lys172 в рибосомальном белке eL30, мы оценили консервативность этих остатков у 4396 репрезентативных эукариот. Как и в случае с uL15 выше, мы обнаружили, что остатки Phe170 и Lys172 высококонсервативны только у типичных Microsporidia, но отсутствуют у других эукариот, включая нетипичные Microsporidia Mitosporidium и Amphiamblys, у которых фрагмент рРНК ES39L не восстановлен 44, 45, 46 (рис. 5c). -e).
В совокупности эти данные подтверждают идею о том, что E. cuniculi и, возможно, другие канонические микроспоридии развили способность эффективно захватывать большое количество мелких метаболитов в структуре рибосомы, чтобы компенсировать снижение уровней рРНК и белка. При этом они развили уникальную способность связывать нуклеотиды вне рибосомы, показывая, что паразитические молекулярные структуры компенсируют это, захватывая обильные мелкие метаболиты и используя их в качестве структурных имитаторов деградированных фрагментов РНК и белка.
Третья несимулированная часть нашей крио-ЭМ карты, обнаруженная в большой рибосомной субъединице. Относительно высокое разрешение (2,6 Å) нашей карты предполагает, что эта плотность принадлежит белкам с уникальными комбинациями остатков большой боковой цепи, что позволило нам идентифицировать эту плотность как ранее неизвестный рибосомный белок, который мы идентифицировали как Он был назван msL2 (Microsporidia-specific protein L2) (методы, рисунок 6). Наш поиск гомологии показал, что msL2 сохраняется в кладе Microsporidia рода Encephaliter и Orosporidium, но отсутствует в других видах, включая другие Microsporidia. В рибосомной структуре msL2 занимает пробел, образованный потерей удлиненной рРНК ES31L. В этой пустоте msL2 помогает стабилизировать сворачивание рРНК и может компенсировать потерю ES31L (рисунок 6).
a Электронная плотность и модель специфичного для микроспоридий рибосомального белка msL2, обнаруженного в рибосомах E. cuniculi. b Большинство эукариотических рибосом, включая рибосому 80S Saccharomyces cerevisiae, имеют амплификацию рРНК ES19L, утраченную у большинства видов микроспоридий. Ранее установленная структура рибосомы микроспоридий V. necatrix предполагает, что потеря ES19L у этих паразитов компенсируется эволюцией нового рибосомального белка msL1. В этом исследовании мы обнаружили, что рибосома E. cuniculi также выработала дополнительный белок-миметик рибосомальной РНК в качестве очевидной компенсации потери ES19L. Однако msL2 (в настоящее время аннотируемый как гипотетический белок ECU06_1135) и msL1 имеют разное структурное и эволюционное происхождение. c Это открытие генерации эволюционно не связанных рибосомных белков msL1 и msL2 предполагает, что если рибосомы накапливают вредные мутации в своей рРНК, они могут достичь беспрецедентных уровней композиционного разнообразия даже в небольшой подгруппе близкородственных видов. Это открытие может помочь прояснить происхождение и эволюцию митохондриальной рибосомы, которая известна своей сильно редуцированной рРНК и аномальной изменчивостью в составе белка между видами.
Затем мы сравнили белок msL2 с ранее описанным белком msL1, единственным известным специфичным для микроспоридий рибосомальным белком, обнаруженным в рибосоме V. necatrix. Мы хотели проверить, являются ли msL1 и msL2 эволюционно связанными. Наш анализ показал, что msL1 и msL2 занимают одну и ту же полость в рибосомальной структуре, но имеют разные первичные и третичные структуры, что указывает на их независимое эволюционное происхождение (рис. 6). Таким образом, наше открытие msL2 свидетельствует о том, что группы компактных эукариотических видов могут независимо эволюционировать структурно различные рибосомальные белки для компенсации потери фрагментов рРНК. Это открытие примечательно тем, что большинство цитоплазматических эукариотических рибосом содержат инвариантный белок, включая одно и то же семейство из 81 рибосомального белка. Появление msL1 и msL2 в различных кладах микроспоридий в ответ на потерю расширенных сегментов рРНК позволяет предположить, что деградация молекулярной архитектуры паразита заставляет паразитов искать компенсаторные мутации, которые в конечном итоге могут привести к их приобретению в различных популяциях паразитов. структур.
Наконец, когда наша модель была завершена, мы сравнили состав рибосомы E. cuniculi с предсказанным из последовательности генома. Ранее считалось, что несколько рибосомных белков, включая eL14, eL38, eL41 и eS30, отсутствуют в геноме E. cuniculi из-за явного отсутствия их гомологов в геноме E. cuniculi. Потеря многих рибосомных белков также прогнозируется у большинства других сильно редуцированных внутриклеточных паразитов и эндосимбионтов. Например, хотя большинство свободноживущих бактерий содержат одно и то же семейство из 54 рибосомных белков, только 11 из этих семейств белков имеют обнаруживаемые гомологи в каждом проанализированном геноме бактерий, ограниченных хозяином. В поддержку этой идеи экспериментально наблюдалась потеря рибосомальных белков у микроспоридий V. necatrix и P. locustae, у которых отсутствуют белки eL38 и eL4131,32.
Однако наши структуры показывают, что в рибосоме E. cuniculi фактически утеряны только eL38, eL41 и eS30. Белок eL14 сохранился, и наша структура показала, почему этот белок не удалось найти при поиске гомологии (рис. 7). В рибосомах E. cuniculi большая часть сайта связывания eL14 утеряна из-за деградации амплифицированного рРНК ES39L. В отсутствие ES39L eL14 утратил большую часть своей вторичной структуры, и только 18% последовательности eL14 были идентичны у E. cuniculi и S. cerevisiae. Такая плохая сохранность последовательности примечательна, поскольку даже Saccharomyces cerevisiae и Homo sapiens — организмы, которые эволюционировали с разницей в 1,5 миллиарда лет — разделяют более 51% одинаковых остатков в eL14. Эта аномальная потеря консерватизма объясняет, почему E. cuniculi eL14 в настоящее время аннотируется как предполагаемый белок M970_061160, а не как рибосомальный белок eL1427.
и Рибосома Microsporidia потеряла расширение рРНК ES39L, что частично устранило сайт связывания рибосомного белка eL14. В отсутствие ES39L белок микроспоры eL14 претерпевает потерю вторичной структуры, при которой бывшая рРНК-связывающая α-спираль вырождается в петлю минимальной длины. b Множественное выравнивание последовательностей показывает, что белок eL14 высококонсервативен у эукариотических видов (57% идентичности последовательностей между дрожжевыми и человеческими гомологами), но плохо консервативен и расходится у микроспоридий (у которых не более 24% остатков идентичны гомологу eL14). от S. cerevisiae или H. sapiens). Эта плохая консервация последовательностей и изменчивость вторичной структуры объясняют, почему гомолог eL14 никогда не был обнаружен у E. cuniculi и почему этот белок, как полагают, был утрачен у E. cuniculi. Напротив, E. cuniculi eL14 ранее аннотировался как предполагаемый белок M970_061160. Это наблюдение предполагает, что разнообразие генома микроспоридий в настоящее время переоценено: некоторые гены, которые в настоящее время считаются утраченными в микроспоридиях, на самом деле сохранились, хотя и в высокодифференцированных формах; вместо этого некоторые, как полагают, кодируют гены микроспоридий для белков, специфичных для червей (например, гипотетический белок M970_061160), на самом деле кодируют очень разнообразные белки, обнаруженные у других эукариот.
Это открытие предполагает, что денатурация рРНК может привести к резкой потере сохранения последовательности в соседних рибосомных белках, делая эти белки необнаружимыми для поиска гомологии. Таким образом, мы можем переоценить фактическую степень молекулярной деградации в небольших геномных организмах, поскольку некоторые белки, которые считаются потерянными, на самом деле сохраняются, хотя и в сильно измененных формах.
Как паразиты могут сохранять функцию своих молекулярных машин в условиях экстремальной редукции генома? Наше исследование отвечает на этот вопрос, описывая сложную молекулярную структуру (рибосому) E. cuniculi, организма с одним из самых маленьких эукариотических геномов.
Уже почти два десятилетия известно, что молекулы белка и РНК у микробных паразитов часто отличаются от их гомологичных молекул у свободноживущих видов, поскольку у них отсутствуют центры контроля качества, они уменьшены до 50% от своего размера у свободноживущих микробов и т. д. . множество ослабляющих мутаций, которые нарушают фолдинг и функционирование. Например, рибосомы организмов с малым геномом, включая многих внутриклеточных паразитов и эндосимбионтов, как ожидается, будут лишены нескольких рибосомных белков и до одной трети нуклеотидов рРНК по сравнению со свободноживущими видами 27, 29, 30, 49. Однако то, как эти молекулы функционируют у паразитов, остается во многом загадкой, изучаемой в основном с помощью сравнительной геномики.
Наше исследование показывает, что структура макромолекул может раскрыть многие аспекты эволюции, которые трудно извлечь из традиционных сравнительных геномных исследований внутриклеточных паразитов и других организмов, ограниченных хозяином (Дополнительный рис. 7). Например, пример белка eL14 показывает, что мы можем переоценить фактическую степень деградации молекулярного аппарата у паразитических видов. Сейчас считается, что у энцефалитических паразитов есть сотни генов, специфичных для микроспоридий. Однако наши результаты показывают, что некоторые из этих, казалось бы, специфических генов на самом деле являются просто очень разными вариантами генов, которые распространены у других эукариот. Более того, пример белка msL2 показывает, как мы упускаем из виду новые рибосомальные белки и недооцениваем содержание паразитических молекулярных машин. Пример малых молекул показывает, как мы можем упустить из виду самые гениальные инновации в паразитических молекулярных структурах, которые могут дать им новую биологическую активность.
В совокупности эти результаты улучшают наше понимание различий между молекулярными структурами организмов, ограниченных хозяином, и их аналогами в свободноживущих организмах. Мы показываем, что молекулярные машины, которые долгое время считались редуцированными, дегенерирующими и подверженными различным ослабляющим мутациям, вместо этого имеют набор систематически упускаемых из виду необычных структурных особенностей.
С другой стороны, необъемные фрагменты рРНК и слитые фрагменты, которые мы обнаружили в рибосомах E. cuniculi, позволяют предположить, что редукция генома может изменить даже те части базового молекулярного механизма, которые сохранились в трех доменах жизни — спустя почти 3,5 миллиарда лет независимой эволюции видов.
Фрагменты рРНК без выступов и слитые фрагменты рРНК в рибосомах E. cuniculi представляют особый интерес в свете предыдущих исследований молекул РНК в эндосимбиотических бактериях. Например, в эндосимбионте тли Buchnera aphidicola было показано, что молекулы рРНК и тРНК имеют чувствительные к температуре структуры из-за смещения состава A+T и высокой доли неканонических пар оснований20,50. Эти изменения в РНК, а также изменения в молекулах белков, в настоящее время считаются ответственными за чрезмерную зависимость эндосимбионтов от партнеров и неспособность эндосимбионтов переносить тепло21,23. Хотя рРНК паразитических микроспоридий имеет структурно различные изменения, природа этих изменений предполагает, что сниженная термостабильность и более высокая зависимость от белков-шаперонов могут быть общими чертами молекул РНК в организмах с редуцированными геномами.
С другой стороны, наши структуры показывают, что паразитические микроспоридии развили уникальную способность противостоять широко консервативным фрагментам рРНК и белков, развивая способность использовать обильные и легкодоступные небольшие метаболиты в качестве структурных имитаторов вырожденных фрагментов рРНК и белков. Деградация молекулярной структуры. . Это мнение подтверждается тем фактом, что небольшие молекулы, которые компенсируют потерю фрагментов белка в рРНК и рибосомах E. cuniculi, связываются со специфичными для микроспоридий остатками в белках uL15 и eL30. Это предполагает, что связывание малых молекул с рибосомами может быть продуктом положительного отбора, в котором специфичные для микроспоридий мутации в рибосомальных белках были отобраны по их способности увеличивать сродство рибосом к малым молекулам, что может привести к более эффективным рибосомальным организмам. Это открытие демонстрирует инновационное молекулярное строение микробных паразитов и позволяет нам лучше понять, как молекулярные структуры паразитов сохраняют свою функцию, несмотря на редукционную эволюцию.
В настоящее время идентификация этих малых молекул остается неясной. Неясно, почему внешний вид этих малых молекул в рибосомальной структуре отличается между видами микроспоридий. В частности, неясно, почему связывание нуклеотидов наблюдается в рибосомах E. cuniculi и P. locustae, а не в рибосомах V. necatrix, несмотря на наличие остатка F170 в белках eL20 и K172 V. necatrix. Эта делеция может быть вызвана остатком 43 uL6 (расположенным рядом с карманом связывания нуклеотидов), который является тирозином в V. necatrix, а не треонином в E. cuniculi и P. locustae. Громоздкая ароматическая боковая цепь Tyr43 может мешать связыванию нуклеотидов из-за стерического перекрытия. С другой стороны, кажущаяся делеция нуклеотидов может быть обусловлена ​​низким разрешением крио-ЭМ-визуализации, что затрудняет моделирование рибосомных фрагментов V. necatrix.
С другой стороны, наша работа предполагает, что процесс распада генома может быть изобретательной силой. В частности, структура рибосомы E. cuniculi предполагает, что потеря рРНК и фрагментов белка в рибосоме микроспоридии создает эволюционное давление, которое способствует изменениям в структуре рибосомы. Эти варианты встречаются далеко от активного центра рибосомы и, по-видимому, помогают поддерживать (или восстанавливать) оптимальную сборку рибосомы, которая в противном случае была бы нарушена уменьшенной рРНК. Это предполагает, что основное новшество рибосомы микроспоридии, по-видимому, эволюционировало в необходимость буферизации дрейфа генов.
Возможно, это лучше всего иллюстрируется связыванием нуклеотидов, которое никогда не наблюдалось у других организмов до сих пор. Тот факт, что остатки связывания нуклеотидов присутствуют в типичных микроспоридиях, но не у других эукариот, предполагает, что сайты связывания нуклеотидов — это не просто реликты, ожидающие исчезновения, или конечный сайт для восстановления рРНК в форме отдельных нуклеотидов. Вместо этого этот сайт кажется полезной особенностью, которая могла развиться в течение нескольких раундов позитивного отбора. Сайты связывания нуклеотидов могут быть побочным продуктом естественного отбора: как только ES39L деградирует, микроспоридии вынуждены искать компенсацию для восстановления оптимального биогенеза рибосомы в отсутствие ES39L. Поскольку этот нуклеотид может имитировать молекулярные контакты нуклеотида A3186 в ES39L, молекула нуклеотида становится строительным блоком рибосомы, связывание которой дополнительно улучшается за счет мутации последовательности eL30.
Что касается молекулярной эволюции внутриклеточных паразитов, наше исследование показывает, что силы дарвиновского естественного отбора и генетического дрейфа распада генома не действуют параллельно, а колеблются. Во-первых, генетический дрейф устраняет важные особенности биомолекул, делая компенсацию крайне необходимой. Только когда паразиты удовлетворяют эту потребность посредством дарвиновского естественного отбора, их макромолекулы получают шанс развить свои самые впечатляющие и инновационные черты. Важно отметить, что эволюция участков связывания нуклеотидов в рибосоме E. cuniculi предполагает, что эта модель молекулярной эволюции «потери-приобретения» не только амортизирует вредные мутации, но иногда и наделяет паразитические макромолекулы совершенно новыми функциями.
Эта идея согласуется с теорией движущегося равновесия Сьюэлла Райта, которая утверждает, что строгая система естественного отбора ограничивает способность организмов к инновациям51,52,53. Однако, если генетический дрейф нарушает естественный отбор, эти дрейфы могут вызывать изменения, которые сами по себе не являются адаптивными (или даже вредными), но приводят к дальнейшим изменениям, которые обеспечивают более высокую приспособленность или новую биологическую активность. Наша структура поддерживает эту идею, иллюстрируя, что тот же тип мутации, который уменьшает складку и функцию биомолекулы, по-видимому, является основным триггером для ее улучшения. В соответствии с беспроигрышной эволюционной моделью, наше исследование показывает, что распад генома, традиционно рассматриваемый как дегенеративный процесс, также является основным двигателем инноваций, иногда и, возможно, даже часто позволяя макромолекулам приобретать новые паразитические действия. могут использовать их.