Hvala, ker ste obiskali Nature.com. Različica brskalnika, ki jo uporabljate, ima omejeno podporo za CSS. Za najboljšo izkušnjo priporočamo, da uporabite posodobljen brskalnik (ali onemogočite način združljivosti v Internet Explorerju). Medtem bomo za zagotovitev nadaljnje podpore spletno mesto prikazali brez slogov in JavaScripta.
Razvoj mikrobnih parazitov vključuje protiučinek med naravno selekcijo, ki povzroča izboljšanje parazitov, in genetskim driftom, zaradi katerega paraziti izgubljajo gene in kopičijo škodljive mutacije. Da bi razumeli, kako se ta protiučinek pojavlja na ravni ene same makromolekule, tukaj opisujemo krio-EM strukturo ribosoma Encephalitozoon cuniculi, evkariontskega organizma z enim najmanjših genomov v naravi. Ekstremno zmanjšanje rRNA v ribosomih E. cuniculi spremljajo brez primere strukturne spremembe, kot je razvoj prej neznanih spojenih povezovalcev rRNA in rRNA brez izboklin. Poleg tega je ribosom E. cuniculi preživel izgubo fragmentov rRNA in beljakovin tako, da je razvil sposobnost uporabe majhnih molekul kot strukturnih posnemkov degradiranih fragmentov rRNA in beljakovin. Na splošno kažemo, da imajo molekularne strukture, za katere se je dolgo mislilo, da so reducirane, degenerirane in podvržene izčrpavajočim mutacijam, številne kompenzacijske mehanizme, ki jih ohranjajo aktivne kljub ekstremnim molekularnim krčenjem.
Ker ima večina skupin mikrobnih parazitov edinstvena molekularna orodja za izkoriščanje svojih gostiteljev, moramo pogosto razviti različna zdravila za različne skupine parazitov1,2. Vendar pa novi dokazi kažejo, da so nekateri vidiki evolucije parazitov konvergentni in v veliki meri predvidljivi, kar kaže na potencialno osnovo za široke terapevtske posege pri mikrobnih parazitih3,4,5,6,7,8,9.
Prejšnje delo je odkrilo skupen evolucijski trend pri mikrobnih parazitih, imenovan redukcija genoma ali razpad genoma10,11,12,13. Trenutne raziskave kažejo, da ko mikroorganizmi opustijo svoj prostoživeči način življenja in postanejo znotrajcelični paraziti (ali endosimbionti), njihovi genomi v milijonih let doživljajo počasne, a neverjetne metamorfoze9,11. V procesu, znanem kot razpad genoma, mikrobni paraziti kopičijo škodljive mutacije, ki številne prej pomembne gene spremenijo v psevdogene, kar vodi do postopne izgube genov in mutacijskega kolapsa14,15. Ta kolaps lahko uniči do 95 % genov v najstarejših znotrajceličnih organizmih v primerjavi s tesno sorodnimi prostoživečimi vrstami. Tako je evolucija znotrajceličnih parazitov boj med dvema nasprotujočima si silama: darvinistično naravno selekcijo, ki vodi do izboljšanja parazitov, in razpadom genoma, ki parazite vrže v pozabo. Kako se je parazitu uspelo izviti iz tega boja in ohraniti aktivnost svoje molekularne strukture, ostaja nejasno.
Čeprav mehanizem razpada genoma ni povsem razumljen, se zdi, da se pojavlja predvsem zaradi pogostega genskega drifta. Ker paraziti živijo v majhnih, nespolnih in genetsko omejenih populacijah, ne morejo učinkovito odpraviti škodljivih mutacij, ki se včasih pojavijo med podvajanjem DNK. To vodi do nepovratnega kopičenja škodljivih mutacij in zmanjšanja genoma parazita. Posledično parazit ne izgubi le genov, ki niso več potrebni za njegovo preživetje v znotrajceličnem okolju. Prav nezmožnost populacij parazitov, da bi učinkovito odpravile sporadične škodljive mutacije, povzroči, da se te mutacije kopičijo po celotnem genomu, vključno z njihovimi najpomembnejšimi geni.
Velik del našega trenutnega razumevanja redukcije genoma temelji izključno na primerjavah zaporedij genoma, z manjšo pozornostjo do sprememb v dejanskih molekulah, ki opravljajo gospodinjske funkcije in služijo kot potencialne tarče zdravil. Primerjalne študije so pokazale, da breme škodljivih znotrajceličnih mikrobnih mutacij očitno predisponira beljakovine in nukleinske kisline k napačnemu zvijanju in agregaciji, zaradi česar so bolj odvisne od šaperonov in preobčutljive na toploto19,20,21,22,23. Poleg tega so različni paraziti – neodvisna evolucija, včasih ločena s kar 2,5 milijarde let – doživeli podobno izgubo centrov za nadzor kakovosti v sintezi beljakovin5,6 in mehanizmih popravljanja DNK24. Vendar pa je malo znanega o vplivu znotrajceličnega načina življenja na vse druge lastnosti celičnih makromolekul, vključno z molekularno prilagoditvijo na naraščajoče breme škodljivih mutacij.
V tem delu smo za boljše razumevanje evolucije beljakovin in nukleinskih kislin znotrajceličnih mikroorganizmov določili strukturo ribosomov znotrajceličnega parazita Encephalitozoon cuniculi. E. cuniculi je glivi podoben organizem, ki spada v skupino parazitskih mikrosporidij z nenavadno majhnimi evkariontskimi genomi in se zato uporabljajo kot modelni organizmi za preučevanje razpadanja genoma25,26,27,28,29,30. Nedavno je bila s krio-EM metodo določena struktura ribosomov za zmerno reducirane genome Microsporidia, Paranosema locustae in Vairimorpha necatrix31,32 (genom velikosti ~3,2 Mb). Te strukture kažejo, da se del izgube amplifikacije rRNA kompenzira z razvojem novih stikov med sosednjimi ribosomskimi beljakovinami ali s pridobitvijo novih ribosomskih beljakovin msL131,32. Vrsta Encephalitozoon (genom ~2,5 milijona bp) skupaj z najbližjim sorodnikom Ordospora kaže najvišjo stopnjo redukcije genoma pri evkariontih – ima manj kot 2000 genov, ki kodirajo beljakovine, in pričakuje se, da njihovi ribosomi niso le brez ekspanzijskih fragmentov rRNA (fragmenti rRNA, ki ločujejo evkariontske ribosome od bakterijskih ribosomov), ampak imajo tudi štiri ribosomske beljakovine zaradi pomanjkanja homologov v genomu E. cuniculi26,27,28. Zato smo sklepali, da lahko ribosom E. cuniculi razkrije prej neznane strategije za molekularno prilagoditev razpadu genoma.
Naša krio-EM struktura predstavlja najmanjši evkariontski citoplazemski ribosom, ki ga je bilo mogoče okarakterizirati, in ponuja vpogled v to, kako končna stopnja redukcije genoma vpliva na strukturo, sestavljanje in razvoj molekularnega mehanizma, ki je sestavni del celice. Ugotovili smo, da ribosom E. cuniculi krši številna široko ohranjena načela zvijanja RNK in sestavljanja ribosomov, ter odkrili nov, prej neznan ribosomski protein. Precej nepričakovano smo pokazali, da so ribosomi mikrosporidij razvili sposobnost vezave majhnih molekul, in postavili hipotezo, da skrajšanja v rRNA in proteinih sprožijo evolucijske inovacije, ki lahko ribosomu na koncu dajo uporabne lastnosti.
Da bi izboljšali naše razumevanje evolucije beljakovin in nukleinskih kislin v znotrajceličnih organizmih, smo se odločili, da iz kultur okuženih sesalskih celic izoliramo spore E. cuniculi, da bi očistili njihove ribosome in določili njihovo strukturo. Težko je pridobiti veliko število parazitskih mikrosporidij, ker mikrosporidij ni mogoče gojiti v hranilnem mediju. Namesto tega rastejo in se razmnožujejo le znotraj gostiteljske celice. Zato smo za pridobitev biomase E. cuniculi za čiščenje ribosomov okužili linijo sesalskih ledvic RK13 s sporami E. cuniculi in te okužene celice gojili več tednov, da bi E. cuniculi lahko rasla in se razmnoževala. Z uporabo okužene celične monosloje, velike približno pol kvadratnega metra, smo lahko očistili približno 300 mg spor mikrosporidij in jih uporabili za izolacijo ribosomov. Nato smo očiščene spore razbili s steklenimi kroglicami in izolirali surove ribosome s postopnim frakcioniranjem lizatov s polietilen glikolom. To nam je omogočilo, da smo pridobili približno 300 µg surovih ribosomov E. cuniculi za strukturno analizo.
Nato smo z uporabo nastalih vzorcev ribosomov zbrali krio-EM slike in te slike obdelali z maskami, ki ustrezajo veliki ribosomski podenoti, glavi male podenote in majhni podenoti. Med tem postopkom smo zbrali slike približno 108.000 ribosomskih delcev in izračunali krio-EM slike z ločljivostjo 2,7 Å (dodatne slike 1–3). Nato smo s krio-EM slikami modelirali rRNA, ribosomski protein in faktor hibernacije Mdf1, povezanega z ribosomi E. cuniculi (slika 1a, b).
a Struktura ribosoma E. cuniculi v kompleksu s faktorjem hibernacije Mdf1 (pdb id 7QEP). b Zemljevid faktorja hibernacije Mdf1, povezanega z ribosomom E. cuniculi. c Zemljevid sekundarne strukture, ki primerja obnovljeno rRNA v vrstah mikrosporidijev z znanimi ribosomskimi strukturami. Plošče prikazujejo lokacijo amplificiranih fragmentov rRNA (ES) in aktivnih mest ribosoma, vključno z dekodirnim mestom (DC), sarcinicinsko zanko (SRL) in peptidil transferaznim centrom (PTC). d Elektronska gostota, ki ustreza peptidil transferaznemu centru ribosoma E. cuniculi, kaže, da ima to katalitično mesto enako strukturo v parazitu E. cuniculi in njegovih gostiteljih, vključno s H. sapiens. e, f Ustrezna elektronska gostota dekodirnega centra (e) in shematska struktura dekodirnega centra (f) kažeta, da ima E. cuniculi ostanke U1491 namesto A1491 (številčenje E. coli) v mnogih drugih evkariontih. Ta sprememba kaže, da je E. cuniculi lahko občutljiv na antibiotike, ki ciljajo na to aktivno mesto.
V nasprotju s prej ugotovljenimi strukturami ribosomov V. necatrix in P. locustae (obe strukturi predstavljata isto družino mikrosporidij Nosematidae in sta si zelo podobni),31,32 ribosomi E. cuniculi podvržejo številnim procesom fragmentacije rRNA in beljakovin. Nadaljnja denaturacija (dodatne slike 4-6). Pri rRNA so bile najbolj opazne spremembe popolna izguba amplificiranega fragmenta 25S rRNA ES12L in delna degeneracija vijačnic h39, h41 in H18 (slika 1c, dodatna slika 4). Med ribosomskimi beljakovinami so bile najbolj opazne spremembe popolna izguba beljakovine eS30 in skrajšanje beljakovin eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 in eS7 (dodatne slike 4, 5).
Tako se ekstremno zmanjšanje genomov vrst Encephalotozoon/Ordospora odraža v njihovi strukturi ribosomov: ribosomi E. cuniculi doživljajo najbolj dramatično izgubo vsebnosti beljakovin v evkariontskih citoplazemskih ribosomih, ki so predmet strukturne karakterizacije, in nimajo niti tistih rRNA in beljakovinskih fragmentov, ki so široko ohranjeni ne le pri evkariontih, temveč tudi v treh domenah življenja. Struktura ribosoma E. cuniculi ponuja prvi molekularni model za te spremembe in razkriva evolucijske dogodke, ki so bili spregledani tako v primerjalni genomiki kot v študijah znotrajcelične biomolekularne strukture (dodatna slika 7). Spodaj opisujemo vsakega od teh dogodkov skupaj z njihovim verjetnim evolucijskim izvorom in njihovim potencialnim vplivom na delovanje ribosomov.
Nato smo ugotovili, da imajo ribosomi E. cuniculi poleg velikih skrajšanih rRNA tudi variacije rRNA na enem od svojih aktivnih mest. Čeprav ima peptidil transferazni center ribosoma E. cuniculi enako strukturo kot drugi evkariontski ribosomi (slika 1d), se dekodirni center razlikuje zaradi variacije zaporedja pri nukleotidu 1491 (številčenje E. coli, slika 1e, f). To opažanje je pomembno, ker dekodirno mesto evkariontskih ribosomov običajno vsebuje ostanke G1408 in A1491 v primerjavi z ostanki bakterijskega tipa A1408 in G1491. Ta variacija je osnova za različno občutljivost bakterijskih in evkariontskih ribosomov na družino aminoglikozidov ribosomskih antibiotikov in druge majhne molekule, ki ciljajo na dekodirno mesto. Na dekodirnem mestu ribosoma E. cuniculi je bil ostanek A1491 nadomeščen z U1491, kar je potencialno ustvarilo edinstven vezni vmesnik za majhne molekule, ki ciljajo na to aktivno mesto. Ista varianta A14901 je prisotna tudi v drugih mikrosporidijah, kot sta P. locustae in V. necatrix, kar kaže na to, da je razširjena med vrstami mikrosporidijev (slika 1f).
Ker so bili naši vzorci ribosomov E. cuniculi izolirani iz metabolno neaktivnih spor, smo testirali krio-EM zemljevid E. cuniculi za prej opisano vezavo ribosomov v stresnih ali stradalnih pogojih. Faktorji hibernacije 31, 32, 36, 37, 38. Predhodno ugotovljeno strukturo hibernirajočega ribosoma smo primerjali s krio-EM zemljevidom ribosoma E. cuniculi. Za spajanje smo uporabili ribosome S. cerevisiae v kompleksu s faktorjem hibernacije Stm138, ribosome kobilic v kompleksu s faktorjem Lso232 in ribosome V. necatrix v kompleksu s faktorjema Mdf1 in Mdf231. Hkrati smo ugotovili, da gostota krio-EM ustreza faktorju počitka Mdf1. Podobno kot se Mdf1 veže na ribosom V. necatrix, se Mdf1 veže tudi na ribosom E. cuniculi, kjer blokira mesto E ribosoma, kar morda pomaga, da so ribosomi na voljo, ko spore parazitov postanejo presnovno neaktivne po inaktivaciji telesa (slika 2).
Mdf1 blokira mesto E ribosoma, kar očitno pomaga pri inaktivaciji ribosoma, ko spore parazita postanejo presnovno neaktivne. V strukturi ribosoma E. cuniculi smo ugotovili, da Mdf1 tvori prej neznan stik s steblom ribosoma L1, delom ribosoma, ki olajša sproščanje deacilirane tRNA iz ribosoma med sintezo beljakovin. Ti stiki kažejo, da se Mdf1 disociira iz ribosoma z uporabo istega mehanizma kot deacetilirana tRNA, kar ponuja možno razlago za to, kako ribosom odstrani Mdf1, da ponovno aktivira sintezo beljakovin.
Vendar pa je naša struktura razkrila neznan stik med Mdf1 in ribosomskim krakom L1 (del ribosoma, ki pomaga sproščati deacilirano tRNA iz ribosoma med sintezo beljakovin). Mdf1 uporablja iste stike kot komolecni segment deacilirane molekule tRNA (slika 2). To prej neznano molekularno modeliranje je pokazalo, da se Mdf1 disociira od ribosoma z uporabo istega mehanizma kot deacetilirana tRNA, kar pojasnjuje, kako ribosom odstrani ta faktor hibernacije, da ponovno aktivira sintezo beljakovin.
Pri konstruiranju modela rRNA smo ugotovili, da ima ribosom E. cuniculi nenormalno zvite fragmente rRNA, ki smo jih poimenovali spojena rRNA (slika 3). V ribosomih, ki segajo čez tri domene življenja, se rRNA zloži v strukture, v katerih se večina baz rRNA bodisi pari in zloži med seboj bodisi interagira z ribosomskimi beljakovinami38,39,40. Vendar pa se zdi, da v ribosomih E. cuniculi rRNA kršijo to načelo zvijanja, tako da nekatere svoje vijačnice pretvorijo v nezvita območja rRNA.
Struktura vijačnice H18 25S rRNA pri S. cerevisiae, V. necatrix in E. cuniculi. Običajno se v ribosomih, ki segajo čez tri življenjske domene, ta povezovalec zvije v vijačnico RNA, ki vsebuje 24 do 34 ostankov. Pri mikrosporidijah pa se ta povezovalec rRNA postopoma reducira na dva enoverižna povezovalca, bogata z uridinom, ki vsebujeta le 12 ostankov. Večina teh ostankov je izpostavljena topilom. Slika kaže, da parazitske mikrosporidije očitno kršijo splošna načela zvijanja rRNA, kjer so baze rRNA običajno sklopljene z drugimi bazami ali vključene v interakcije rRNA-beljakovine. Pri mikrosporidijah nekateri fragmenti rRNA dobijo neugodno gubo, pri kateri se nekdanja vijačnica rRNA spremeni v enoverižni fragment, podolgovat skoraj v ravni črti. Prisotnost teh nenavadnih regij omogoča rRNA mikrosporidijev, da se veže na oddaljene fragmente rRNA z uporabo minimalnega števila baz RNA.
Najbolj presenetljiv primer tega evolucijskega prehoda lahko opazimo v vijačnici H18 25S rRNA (slika 3). Pri vrstah od E. coli do ljudi baze te vijačnice rRNA vsebujejo 24–32 nukleotidov, ki tvorijo rahlo nepravilno vijačnico. V predhodno identificiranih ribosomskih strukturah V. necatrix in P. locustae31,32 so baze vijačnice H18 delno odvite, vendar je parjenje nukleotidnih baz ohranjeno. Vendar pa pri E. cuniculi ta fragment rRNA postane najkrajša povezovalca 228UUUGU232 in 301UUUUUUUUUU307. Za razliko od tipičnih fragmentov rRNA se ti povezovalci, bogati z uridinom, ne zvijajo ali ne vzpostavljajo obsežnega stika z ribosomskimi beljakovinami. Namesto tega prevzamejo odprte za topilo in popolnoma odvite strukture, v katerih so verige rRNA raztegnjene skoraj naravnost. Ta raztegnjena konformacija pojasnjuje, kako E. cuniculi uporablja le 12 baz RNA za zapolnitev 33 Å vrzeli med vijačnicama rRNA H16 in H18, medtem ko druge vrste potrebujejo vsaj dvakrat toliko baz rRNA za zapolnitev vrzeli.
Tako lahko dokažemo, da so parazitske mikrosporidije z energetsko neugodnim zvijanjem razvile strategijo za krčenje celo tistih segmentov rRNA, ki ostajajo v veliki meri ohranjeni pri vseh vrstah v treh domenah življenja. Očitno lahko E. cuniculi z kopičenjem mutacij, ki vijačnice rRNA pretvorijo v kratke poli-U povezovalce, tvori nenavadne fragmente rRNA, ki vsebujejo čim manj nukleotidov za ligacijo distalnih fragmentov rRNA. To pomaga razložiti, kako so mikrosporidije dosegle dramatično zmanjšanje svoje osnovne molekularne strukture, ne da bi pri tem izgubile svojo strukturno in funkcionalno integriteto.
Druga nenavadna značilnost rRNA E. cuniculi je videz rRNA brez odebelitev (slika 4). Izbokline so nukleotidi brez baznih parov, ki se iz vijačnice RNK izvijajo, namesto da bi se skrivali vanjo. Večina izboklin rRNA deluje kot molekularna lepila, ki pomagajo vezati sosednje ribosomske beljakovine ali druge fragmente rRNA. Nekatere izbokline delujejo kot tečaji, kar omogoča, da se vijačnica rRNA optimalno upogne in zvije za produktivno sintezo beljakovin 41.
a Izboklina rRNA (številčenje S. cerevisiae) ni prisotna v strukturi ribosoma E. cuniculi, je pa prisotna pri večini drugih evkariontov b Notranji ribosomi E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens in E. cuniculi. Paraziti nimajo številnih starodavnih, visoko ohranjenih izboklin rRNA. Te odebelitve stabilizirajo strukturo ribosoma; zato njihova odsotnost v mikrosporidijah kaže na zmanjšano stabilnost zvijanja rRNA pri parazitih mikrosporidijah. Primerjava s stebli P (stebla L7/L12 pri bakterijah) kaže, da izguba izboklin rRNA včasih sovpada s pojavom novih izboklin poleg izgubljenih izboklin. Vijak H42 v rRNA 23S/28S ima starodavno izboklino (U1206 pri Saccharomyces cerevisiae), ki je zaradi zaščite na treh področjih življenja ocenjena na vsaj 3,5 milijarde let. Pri mikrosporidijah je ta izboklina odpravljena. Vendar se je poleg izgubljene izbokline pojavila nova izboklina (A1306 pri E. cuniculi).
Presenetljivo smo ugotovili, da ribosomom E. cuniculi manjka večina izboklin rRNA, ki jih najdemo pri drugih vrstah, vključno z več kot 30 izboklinami, ki so ohranjene pri drugih evkariontih (slika 4a). Ta izguba odpravi številne stike med ribosomskimi podenotami in sosednjimi vijačnicami rRNA, včasih pa ustvari velike votle praznine znotraj ribosoma, zaradi česar je ribosom E. cuniculi bolj porozen v primerjavi z bolj tradicionalnimi ribosomi (slika 4b). Omeniti velja, da smo ugotovili, da je bila večina teh izboklin izgubljenih tudi v prej identificiranih strukturah ribosomov V. necatrix in P. locustae, ki so bile pri prejšnjih strukturnih analizah spregledane31,32.
Včasih izgubo izboklin rRNA spremlja razvoj novih izboklin poleg izgubljene izbokline. Na primer, ribosomsko P-deblo vsebuje izboklino U1208 (pri Saccharomyces cerevisiae), ki je preživela od E. coli do ljudi in je zato ocenjena na 3,5 milijarde let. Med sintezo beljakovin ta izboklina pomaga P-deblu premikati se med odprto in zaprto konformacijo, tako da lahko ribosom rekrutira translacijske faktorje in jih dostavi na aktivno mesto. V ribosomih E. cuniculi te odebelitve ni; vendar pa lahko nova odebelitev (G883), ki se nahaja le v treh baznih parih, prispeva k obnovi optimalne prožnosti P-debla (slika 4c).
Naši podatki o rRNA brez izboklin kažejo, da minimizacija rRNA ni omejena le na izgubo elementov rRNA na površini ribosoma, temveč lahko vključuje tudi jedro ribosoma, kar ustvarja molekularno napako, specifično za parazita, ki je v prostoživečih celicah še niso opisali. Opažene so žive vrste.
Po modeliranju kanoničnih ribosomskih proteinov in rRNA smo ugotovili, da običajne ribosomske komponente ne morejo pojasniti treh delov krio-EM slike. Dva od teh fragmentov sta majhni molekuli (slika 5, dopolnilna slika 8). Prvi segment je stisnjen med ribosomska proteina uL15 in eL18 na mestu, ki ga običajno zaseda C-terminalni konec eL18, ki je pri E. cuniculi skrajšan. Čeprav ne moremo določiti identitete te molekule, je velikost in oblika tega otoka gostote dobro pojasnjena s prisotnostjo molekul spermidina. Njegovo vezavo na ribosom stabilizirajo mutacije v proteinih uL15 (Asp51 in Arg56), specifične za mikrosporidije, ki očitno povečajo afiniteto ribosoma za to majhno molekulo, saj omogočajo uL15, da majhno molekulo ovije v ribosomsko strukturo. Dodatna slika 2). 8, dodatni podatki 1, 2).
Krio-EM slikanje prikazuje prisotnost nukleotidov zunaj riboze, vezane na ribosom E. cuniculi. V ribosomu E. cuniculi ta nukleotid zaseda isto mesto kot nukleotid 25S rRNA A3186 (številčenje Saccharomyces cerevisiae) v večini drugih evkariontskih ribosomov. b V ribosomski strukturi E. cuniculi se ta nukleotid nahaja med ribosomskima proteinoma uL9 in eL20, s čimer stabilizira stik med proteinoma. cd Analiza ohranjenosti zaporedja eL20 med vrstami mikrosporidij. Filogenetsko drevo vrst mikrosporidij (c) in večkratna poravnava zaporedja proteina eL20 (d) kažeta, da so ostanki F170 in K172, ki vežejo nukleotide, ohranjeni v večini tipičnih mikrosporidij, z izjemo S. lophii, z izjemo zgodnje razvejanih mikrosporidij, ki so ohranile podaljšek ES39L rRNA. e Ta slika kaže, da so ostanki F170 in K172, ki vežejo nukleotide, prisotni le v eL20 močno reduciranega genoma mikrosporidij, ne pa tudi pri drugih evkariontih. Na splošno ti podatki kažejo, da so ribosomi mikrosporidij razvili vezavno mesto za nukleotide, ki se zdi, da veže molekule AMP in jih uporablja za stabilizacijo interakcij med beljakovinami v strukturi ribosomov. Visoka ohranjenost tega vezavnega mesta pri mikrosporidijah in njegova odsotnost pri drugih evkariontih kaže na to, da bi to mesto lahko mikrosporidijam zagotovilo selektivno prednost pri preživetju. Tako se zdi, da žep za vezavo nukleotidov v ribosomu mikrosporidij ni degenerirana značilnost ali končna oblika razgradnje rRNA, kot je bilo opisano prej, temveč uporabna evolucijska inovacija, ki ribosomu mikrosporidij omogoča, da se neposredno veže na majhne molekule in jih uporablja kot molekularne gradnike za ribosome. Zaradi tega odkritja je ribosom mikrosporidij edini ribosom, za katerega je znano, da uporablja en sam nukleotid kot svoj strukturni gradnik. f Hipotetična evolucijska pot, ki izhaja iz vezave nukleotidov.
Druga nizka molekulska gostota se nahaja na vmesniku med ribosomskimi proteini uL9 in eL30 (slika 5a). Ta vmesnik je bil predhodno opisan v strukturi ribosoma Saccharomyces cerevisiae kot vezavno mesto za 25S nukleotid rRNA A3186 (del podaljška ES39L rRNA)38. Pokazalo se je, da se v degeneriranih ribosomih P. locustae ES39L ta vmesnik veže na neznani posamezni nukleotid 31 in domneva se, da je ta nukleotid reducirana končna oblika rRNA, v kateri je dolžina rRNA ~130-230 baz. ES39L je reduciran na en sam nukleotid 32,43. Naše krio-EM slike podpirajo idejo, da je gostoto mogoče razložiti z nukleotidi. Vendar pa je višja ločljivost naše strukture pokazala, da je ta nukleotid ekstraribosomska molekula, morda AMP (slika 5a, b).
Nato smo se vprašali, ali se vezavno mesto nukleotidov pojavlja v ribosomu E. cuniculi ali je obstajalo že prej. Ker vezavo nukleotidov posredujejo predvsem ostanki Phe170 in Lys172 v ribosomskem proteinu eL30, smo ocenili ohranjenost teh ostankov pri 4396 reprezentativnih evkariontih. Kot v primeru uL15 zgoraj smo ugotovili, da so ostanki Phe170 in Lys172 visoko ohranjeni le pri tipičnih mikrosporidijah, vendar jih ni pri drugih evkariontih, vključno z atipičnimi mikrosporidijami Mitosporidium in Amphiamblys, pri katerih fragment ES39L rRNA ni reduciran 44, 45, 46 (slika 5c). -e).
Ti podatki skupaj podpirajo idejo, da so E. cuniculi in morda druge kanonične mikrosporidije razvile sposobnost učinkovitega zajemanja velikega števila majhnih metabolitov v strukturi ribosoma, da bi kompenzirale upad ravni rRNA in beljakovin. Pri tem so razvile edinstveno sposobnost vezave nukleotidov zunaj ribosoma, kar kaže, da parazitske molekularne strukture to kompenzirajo z zajemanjem obilnih majhnih metabolitov in njihovo uporabo kot strukturnih posnemovalcev razgrajenih fragmentov RNA in beljakovin.
Tretji nesimulirani del našega krio-EM zemljevida, ki ga najdemo v veliki ribosomski podenoti. Relativno visoka ločljivost (2,6 Å) našega zemljevida kaže, da ta gostota pripada beljakovinam z edinstvenimi kombinacijami velikih stranskih verig, kar nam je omogočilo, da smo to gostoto identificirali kot prej neznan ribosomski protein, ki smo ga identificirali kot ... Poimenovali smo ga msL2 (mikrosporidijsko specifičen protein L2) (metode, slika 6). Naše iskanje homologije je pokazalo, da je msL2 ohranjen v kladu mikrosporidij rodu Encephaliter in Orosporidium, vendar ga ni pri drugih vrstah, vključno z drugimi mikrosporidijami. V ribosomski strukturi msL2 zavzema vrzel, ki nastane zaradi izgube razširjene rRNA ES31L. V tej praznini msL2 pomaga stabilizirati zvijanje rRNA in lahko kompenzira izgubo ES31L (slika 6).
a Elektronska gostota in model ribosomskega proteina msL2, specifičnega za mikrosporidijsko regijo, ki ga najdemo v ribosomih E. cuniculi. b Večina evkariontskih ribosomov, vključno z ribosomom 80S Saccharomyces cerevisiae, ima pri večini vrst mikrosporidijev izgubljeno amplifikacijo ES19L rRNA. Predhodno ugotovljena struktura ribosoma mikrosporidijev V. necatrix kaže, da izgubo ES19L pri teh parazitih kompenzira razvoj novega ribosomskega proteina msL1. V tej študiji smo ugotovili, da je ribosom E. cuniculi razvil tudi dodaten protein, ki posnema ribosomsko RNA, kot očitno kompenzacijo za izgubo ES19L. Vendar pa imata msL2 (trenutno označen kot hipotetični protein ECU06_1135) in msL1 različen strukturni in evolucijski izvor. c To odkritje nastajanja evolucijsko nepovezanih ribosomskih proteinov msL1 in msL2 nakazuje, da lahko ribosomi, če kopičijo škodljive mutacije v svoji rRNA, dosežejo izjemno raven sestavne raznolikosti celo v majhni podskupini tesno sorodnih vrst. To odkritje bi lahko pomagalo razjasniti izvor in evolucijo mitohondrijskega ribosoma, ki je znan po svoji močno reducirani rRNA in nenormalni variabilnosti v sestavi beljakovin med vrstami.
Nato smo protein msL2 primerjali s prej opisanim proteinom msL1, edinim znanim ribosomskim proteinom, specifičnim za mikrosporidije, ki ga najdemo v ribosomu V. necatrix. Želeli smo preveriti, ali sta msL1 in msL2 evolucijsko povezana. Naša analiza je pokazala, da msL1 in msL2 zasedata isto votlino v ribosomski strukturi, vendar imata različni primarni in terciarni strukturi, kar kaže na njun neodvisen evolucijski izvor (slika 6). Naše odkritje msL2 tako dokazuje, da lahko skupine kompaktnih evkariontskih vrst neodvisno razvijejo strukturno različne ribosomske proteine, da nadomestijo izgubo fragmentov rRNA. Ta ugotovitev je pomembna, saj večina citoplazemskih evkariontskih ribosomov vsebuje invariantni protein, vključno z isto družino 81 ribosomskih proteinov. Pojav msL1 in msL2 v različnih kladah mikrosporidij kot odgovor na izgubo razširjenih segmentov rRNA kaže, da degradacija molekularne arhitekture parazita povzroči, da paraziti iščejo kompenzacijske mutacije, kar lahko sčasoma privede do njihove pridobitve v različnih populacijah parazitov.
Ko je bil naš model dokončan, smo primerjali sestavo ribosoma E. cuniculi s sestavo, ki jo predvidevamo na podlagi zaporedja genoma. Prej smo mislili, da v genomu E. cuniculi manjka več ribosomskih beljakovin, vključno z eL14, eL38, eL41 in eS30, zaradi očitne odsotnosti njihovih homologov v genomu E. cuniculi. Izguba številnih ribosomskih beljakovin je napovedana tudi pri večini drugih močno reduciranih znotrajceličnih parazitov in endosimbiontov. Na primer, čeprav večina prostoživečih bakterij vsebuje isto družino 54 ribosomskih beljakovin, ima le 11 od teh družin beljakovin zaznavne homologe v vsakem analiziranem genomu bakterij, ki so omejene na gostitelja. V podporo tej trditvi je bila eksperimentalno opažena izguba ribosomskih beljakovin pri mikrosporidijah V. necatrix in P. locustae, ki nimajo beljakovin eL38 in eL4131,32.
Vendar pa naše strukture kažejo, da so v ribosomu E. cuniculi dejansko izgubljeni le eL38, eL41 in eS30. Protein eL14 je bil ohranjen in naša struktura je pokazala, zakaj tega proteina ni bilo mogoče najti pri iskanju homologije (slika 7). V ribosomih E. cuniculi je večina vezavnega mesta eL14 izgubljena zaradi razgradnje z rRNA pomnoženega ES39L. V odsotnosti ES39L je eL14 izgubil večino svoje sekundarne strukture in le 18 % zaporedja eL14 je bilo identičnega v E. cuniculi in S. cerevisiae. Ta slaba ohranjenost zaporedja je izjemna, saj si celo Saccharomyces cerevisiae in Homo sapiens – organizmi, ki so se razvili 1,5 milijarde let narazen – delijo več kot 51 % istih ostankov v eL14. Ta anomalna izguba ohranjenosti pojasnjuje, zakaj je E. cuniculi eL14 trenutno označen kot domnevni protein M970_061160 in ne kot ribosomski protein eL1427.
in Ribosom mikrosporidij je izgubil podaljšek rRNA ES39L, kar je delno odpravilo vezavno mesto ribosomskega proteina eL14. V odsotnosti ES39L protein mikrospor eL14 izgubi sekundarno strukturo, pri čemer se nekdanja α-vijačnica, ki veže rRNA, degenerira v zanko minimalne dolžine. b Večkratna poravnava zaporedja kaže, da je protein eL14 visoko ohranjen pri evkariontskih vrstah (57-odstotna identiteta zaporedja med kvasovkami in človeškimi homologi), vendar slabo ohranjen in divergenten pri mikrosporidijah (pri katerih je največ 24 % ostankov identičnih homologu eL14). iz S. cerevisiae ali H. sapiens). Ta slaba ohranjenost zaporedja in variabilnost sekundarne strukture pojasnjuje, zakaj homolog eL14 ni bil nikoli najden pri E. cuniculi in zakaj naj bi bil ta protein izgubljen pri E. cuniculi. Nasprotno pa je bil eL14 E. cuniculi prej označen kot domnevni protein M970_061160. To opažanje kaže, da je raznolikost genoma mikrosporidij trenutno precenjena: nekateri geni, za katere se trenutno domneva, da so v mikrosporidijah izgubljeni, so dejansko ohranjeni, čeprav v zelo diferenciranih oblikah; namesto tega naj bi nekateri kodirali gene mikrosporidij za beljakovine, specifične za črve (npr. hipotetični protein M970_061160), ki dejansko kodira zelo raznolike beljakovine, ki jih najdemo v drugih evkariontih.
Ta ugotovitev kaže, da lahko denaturacija rRNA povzroči dramatično izgubo ohranjenosti zaporedja v sosednjih ribosomskih beljakovinah, zaradi česar te beljakovine niso zaznavne za iskanje homologije. Zato lahko precenjujemo dejansko stopnjo molekularne razgradnje pri organizmih z majhnim genomom, saj nekatere beljakovine, za katere velja, da so izgubljene, dejansko obstajajo, čeprav v zelo spremenjenih oblikah.
Kako lahko paraziti ohranijo delovanje svojih molekularnih strojev v pogojih ekstremne redukcije genoma? Naša študija odgovarja na to vprašanje z opisom kompleksne molekularne strukture (ribosoma) E. cuniculi, organizma z enim najmanjših evkariontskih genomov.
Že skoraj dve desetletji je znano, da se molekule beljakovin in RNA v mikrobnih parazitih pogosto razlikujejo od svojih homolognih molekul pri prostoživečih vrstah, ker nimajo centrov za nadzor kakovosti, so pri prostoživečih mikrobih zmanjšane na 50 % svoje velikosti itd., zaradi številnih izčrpavajočih mutacij, ki poslabšajo zvijanje in delovanje. Na primer, ribosomi organizmov z majhnim genomom, vključno s številnimi znotrajceličnimi paraziti in endosimbionti, naj bi v primerjavi s prostoživečimi vrstami imeli manj ribosomskih beljakovin in do tretjine nukleotidov rRNA 27, 29, 30, 49. Vendar pa način delovanja teh molekul pri parazitih ostaja v veliki meri skrivnost, ki jo preučujemo predvsem s primerjalno genomiko.
Naša študija kaže, da lahko struktura makromolekul razkrije številne vidike evolucije, ki jih je težko izluščiti iz tradicionalnih primerjalnih genomskih študij znotrajceličnih parazitov in drugih organizmov, omejenih na gostitelja (dodatna slika 7). Na primer, primer proteina eL14 kaže, da lahko precenimo dejansko stopnjo razgradnje molekularnega aparata pri parazitskih vrstah. Danes velja, da imajo encefalitični paraziti na stotine genov, specifičnih za mikrosporidije. Vendar pa naši rezultati kažejo, da so nekateri od teh na videz specifičnih genov pravzaprav le zelo različne različice genov, ki so pogosti pri drugih evkariontih. Poleg tega primer proteina msL2 kaže, kako spregledamo nove ribosomske proteine ​​in podcenjujemo vsebino parazitskih molekularnih strojev. Primer majhnih molekul kaže, kako lahko spregledamo najbolj domiselne inovacije v parazitskih molekularnih strukturah, ki jim lahko dajo novo biološko aktivnost.
Skupaj ti rezultati izboljšujejo naše razumevanje razlik med molekularnimi strukturami organizmov, omejenih na gostitelja, in njihovimi ustrezniki v prostoživečih organizmih. Pokazali smo, da imajo molekularni stroji, za katere smo dolgo mislili, da so reducirani, degenerirani in podvrženi različnim izčrpavajočim mutacijam, namesto tega niz sistematično spregledanih nenavadnih strukturnih značilnosti.
Po drugi strani pa ne-obsežni fragmenti rRNA in spojeni fragmenti, ki smo jih našli v ribosomih E. cuniculi, kažejo, da lahko redukcija genoma spremeni celo tiste dele osnovnega molekularnega mehanizma, ki so ohranjeni v treh domenah življenja – po skoraj 3,5 milijarde let neodvisne evolucije vrst.
Fragmenti rRNA brez izboklin in spojeni fragmenti v ribosomih E. cuniculi so še posebej zanimivi glede na prejšnje študije molekul RNA v endosimbiotskih bakterijah. Na primer, pri endosimbiontu listne uši Buchnera aphidicola se je pokazalo, da imajo molekule rRNA in tRNA temperaturno občutljive strukture zaradi pristranskosti sestave A+T in visokega deleža nekanoničnih baznih parov20,50. Te spremembe v RNA, pa tudi spremembe v beljakovinskih molekulah, naj bi bile odgovorne za prekomerno odvisnost endosimbiontov od partnerjev in nezmožnost endosimbiontov za prenos toplote21,23. Čeprav ima rRNA parazitskih mikrosporidij strukturno različne spremembe, narava teh sprememb kaže, da sta lahko zmanjšana toplotna stabilnost in večja odvisnost od beljakovin šaperonov skupni značilnosti molekul RNA v organizmih z reduciranimi genomi.
Po drugi strani pa naše strukture kažejo, da so parazitske mikrosporidije razvile edinstveno sposobnost odpornosti na široko ohranjene rRNA in beljakovinske fragmente, ter razvile sposobnost uporabe obilnih in lahko dostopnih majhnih metabolitov kot strukturnih posnemovalcev degeneriranih rRNA in beljakovinskih fragmentov. Degradacija molekularne strukture. To mnenje podpira dejstvo, da se majhne molekule, ki kompenzirajo izgubo beljakovinskih fragmentov v rRNA in ribosomih E. cuniculi, vežejo na ostanke, specifične za mikrosporidije, v beljakovinah uL15 in eL30. To kaže, da je vezava majhnih molekul na ribosome lahko produkt pozitivne selekcije, pri kateri so bile mutacije, specifične za mikrosporidije, v ribosomskih beljakovinah izbrane zaradi njihove sposobnosti povečanja afinitete ribosomov za majhne molekule, kar lahko vodi do učinkovitejših ribosomskih organizmov. Odkritje razkriva pametno inovacijo v molekularni strukturi mikrobnih parazitov in nam daje boljše razumevanje, kako molekularne strukture parazitov ohranjajo svojo funkcijo kljub redukcijski evoluciji.
Trenutno identifikacija teh majhnih molekul ostaja nejasna. Ni jasno, zakaj se videz teh majhnih molekul v ribosomski strukturi razlikuje med vrstami mikrosporidij. Zlasti ni jasno, zakaj opazimo vezavo nukleotidov v ribosomih E. cuniculi in P. locustae, ne pa tudi v ribosomih V. necatrix, kljub prisotnosti ostanka F170 v proteinih eL20 in K172 V. necatrix. To delecijo lahko povzroči ostanek 43 uL6 (ki se nahaja poleg žepa za vezavo nukleotidov), ki je tirozin v V. necatrix in ne treonin v E. cuniculi in P. locustae. Obsežna aromatska stranska veriga Tyr43 lahko moti vezavo nukleotidov zaradi sterične prekrivanja. Druga možnost je, da je navidezna delecija nukleotidov posledica nizke ločljivosti krio-EM slikanja, kar ovira modeliranje ribosomskih fragmentov V. necatrix.
Po drugi strani pa naše delo nakazuje, da je proces razpadanja genoma lahko inovativna sila. Zlasti struktura ribosoma E. cuniculi nakazuje, da izguba rRNA in beljakovinskih fragmentov v ribosomu mikrosporidij ustvarja evolucijski pritisk, ki spodbuja spremembe v strukturi ribosomov. Te različice se pojavljajo daleč od aktivnega mesta ribosoma in očitno pomagajo ohranjati (ali obnavljati) optimalno sestavo ribosomov, ki bi jo sicer motila reducirana rRNA. To kaže, da se je glavna inovacija ribosoma mikrosporidij razvila v potrebo po blaženju genskega drifta.
Morda je to najbolje ponazorjeno z vezavo nukleotidov, ki je doslej pri drugih organizmih še nismo opazili. Dejstvo, da so ostanki, ki vežejo nukleotide, prisotni v tipičnih mikrosporidijah, ne pa tudi pri drugih evkariontih, kaže na to, da mesta za vezavo nukleotidov niso le ostanki, ki čakajo na izginotje, ali končno mesto, kjer se rRNA obnovi v obliko posameznih nukleotidov. Namesto tega se zdi to mesto koristna značilnost, ki bi se lahko razvila v več krogih pozitivne selekcije. Mesta za vezavo nukleotidov so lahko stranski produkt naravne selekcije: ko se ES39L razgradi, so mikrosporidije prisiljene iskati kompenzacijo za obnovitev optimalne biogeneze ribosomov v odsotnosti ES39L. Ker lahko ta nukleotid posnema molekularne stike nukleotida A3186 v ES39L, postane molekula nukleotida gradnik ribosoma, katerega vezava se dodatno izboljša z mutacijo zaporedja eL30.
Glede molekularne evolucije znotrajceličnih parazitov naša študija kaže, da sile darvinistične naravne selekcije in genskega drifta razpadanja genoma ne delujejo vzporedno, temveč nihajo. Prvič, genski drift izniči pomembne značilnosti biomolekul, zaradi česar je kompenzacija nujno potrebna. Šele ko paraziti to potrebo zadovoljijo z darvinistično naravno selekcijo, bodo imele njihove makromolekule možnost razviti svoje najbolj impresivne in inovativne lastnosti. Pomembno je, da evolucija vezavnih mest nukleotidov v ribosomu E. cuniculi kaže, da ta vzorec molekularne evolucije od izgube do pridobitve ne le amortizira škodljive mutacije, temveč včasih parazitskim makromolekulam podeli povsem nove funkcije.
Ta ideja je skladna s teorijo gibljivega ravnovesja Sewella Wrighta, ki pravi, da strog sistem naravne selekcije omejuje sposobnost organizmov za inovacije51,52,53. Če pa genski drift moti naravno selekcijo, lahko ti drifi povzročijo spremembe, ki same po sebi niso prilagodljive (ali celo škodljive), ampak vodijo do nadaljnjih sprememb, ki zagotavljajo večjo sposobnost preživetja ali novo biološko aktivnost. Naš okvir podpira to idejo z ilustracijo, da je ista vrsta mutacije, ki zmanjša gubo in funkcijo biomolekule, glavni sprožilec njenega izboljšanja. V skladu z evolucijskim modelom, v katerem vsi pridobijo, naša študija kaže, da je razpad genoma, ki ga tradicionalno obravnavamo kot degenerativni proces, tudi glavno gonilo inovacij, ki včasih in morda celo pogosto omogoča makromolekulam, da pridobijo nove parazitske aktivnosti. Te dejavnosti lahko uporabijo.