Dankie dat u Nature.com besoek het. Die blaaierweergawe wat u gebruik, het beperkte CSS-ondersteuning. Vir die beste ervaring beveel ons aan dat u 'n opgedateerde blaaier gebruik (of Verenigbaarheidsmodus in Internet Explorer deaktiveer). Intussen, om voortgesette ondersteuning te verseker, sal ons die webwerf sonder style en JavaScript weergee.
Die evolusie van mikrobiese parasiete behels 'n teenwerking tussen natuurlike seleksie, wat veroorsaak dat parasiete verbeter, en genetiese drywing, wat veroorsaak dat parasiete gene verloor en skadelike mutasies ophoop. Hier, om te verstaan ​​hoe hierdie teenwerking op die skaal van 'n enkele makromolekule plaasvind, beskryf ons die krio-EM-struktuur van die ribosoom van Encephalitozoon cuniculi, 'n eukariotiese organisme met een van die kleinste genome in die natuur. Die uiterste vermindering van rRNA in E. cuniculi-ribosome gaan gepaard met ongekende strukturele veranderinge, soos die evolusie van voorheen onbekende saamgesmelte rRNA-skakelaars en rRNA sonder uitstulpings. Daarbenewens het die E. cuniculi-ribosoom die verlies van rRNA-fragmente en proteïene oorleef deur die vermoë te ontwikkel om klein molekules as strukturele nabootsers van gedegradeerde rRNA-fragmente en proteïene te gebruik. Oor die algemeen toon ons dat molekulêre strukture wat lank gedink is om gereduseer, gedegenereer en onderhewig aan aftakelende mutasies te wees, 'n aantal kompenserende meganismes het wat hulle aktief hou ten spyte van uiterste molekulêre sametrekkings.
Omdat die meeste groepe mikrobiese parasiete unieke molekulêre gereedskap het om hul gashere te benut, moet ons dikwels verskillende terapeutiese middels vir verskillende groepe parasiete ontwikkel1,2. Nuwe bewyse dui egter daarop dat sommige aspekte van parasiet-evolusie konvergent en grootliks voorspelbaar is, wat dui op 'n potensiële basis vir breë terapeutiese intervensies in mikrobiese parasiete3,4,5,6,7,8,9.
Vorige werk het 'n algemene evolusionêre tendens in mikrobiese parasiete geïdentifiseer, genaamd genoomreduksie of genoomverval10,11,12,13. Huidige navorsing toon dat wanneer mikroörganismes hul vrylewende leefstyl prysgee en intrasellulêre parasiete (of endo-simbionte) word, hul genome stadige maar verstommende metamorfoses oor miljoene jare9,11 ondergaan. In 'n proses bekend as genoomverval, versamel mikrobiese parasiete skadelike mutasies wat baie voorheen belangrike gene in pseudogene verander, wat lei tot geleidelike geenverlies en mutasionele ineenstorting14,15. Hierdie ineenstorting kan tot 95% van die gene in die oudste intrasellulêre organismes vernietig in vergelyking met nou verwante vrylewende spesies. Dus is die evolusie van intrasellulêre parasiete 'n toutrek tussen twee opponerende kragte: Darwinistiese natuurlike seleksie, wat lei tot die verbetering van parasiete, en die ineenstorting van die genoom, wat parasiete in die vergetelheid werp. Hoe die parasiet daarin geslaag het om uit hierdie toutrek te kom en die aktiwiteit van sy molekulêre struktuur te behou, bly onduidelik.
Alhoewel die meganisme van genoomverval nie ten volle verstaan ​​word nie, blyk dit hoofsaaklik te voorkom as gevolg van gereelde genetiese drywing. Omdat parasiete in klein, ongeslagtelike en geneties beperkte populasies leef, kan hulle nie skadelike mutasies wat soms tydens DNS-replikasie voorkom, effektief uitskakel nie. Dit lei tot onomkeerbare ophoping van skadelike mutasies en vermindering van die parasietgenoom. Gevolglik verloor die parasiet nie net gene wat nie meer nodig is vir sy oorlewing in die intrasellulêre omgewing nie. Dit is die onvermoë van parasietpopulasies om sporadiese skadelike mutasies effektief uit te skakel wat veroorsaak dat hierdie mutasies dwarsdeur die genoom ophoop, insluitend hul belangrikste gene.
Baie van ons huidige begrip van genoomreduksie is uitsluitlik gebaseer op vergelykings van genoomvolgordes, met minder aandag aan veranderinge in werklike molekules wat huishoudingsfunksies verrig en as potensiële geneesmiddelteikens dien. Vergelykende studies het getoon dat die las van skadelike intrasellulêre mikrobiese mutasies proteïene en nukleïensure blyk te predisponeer om verkeerd te vou en te aggregeer, wat hulle meer chaperone-afhanklik en hipersensitief vir hitte maak19,20,21,22,23. Daarbenewens het verskeie parasiete – onafhanklike evolusie soms met soveel as 2,5 miljard jaar geskei – 'n soortgelyke verlies aan kwaliteitsbeheersentrums in hul proteïensintese5,6 en DNS-herstelmeganismes24 ervaar. Min is egter bekend oor die impak van intrasellulêre leefstyl op alle ander eienskappe van sellulêre makromolekules, insluitend molekulêre aanpassing by 'n toenemende las van skadelike mutasies.
In hierdie werk, om die evolusie van proteïene en nukleïensure van intrasellulêre mikroörganismes beter te verstaan, het ons die struktuur van ribosome van die intrasellulêre parasiet Encephalitozoon cuniculi bepaal. E. cuniculi is 'n swamagtige organisme wat behoort aan 'n groep parasitiese mikrosporidia wat buitengewoon klein eukariotiese genome het en daarom as modelorganismes gebruik word om genoomverval te bestudeer25,26,27,28,29,30. Onlangs is die krio-EM ribosoomstruktuur bepaal vir matig gereduseerde genome van Microsporidia, Paranosema locustae en Vairimorpha necatrix31,32 (~3.2 Mb genoom). Hierdie strukture dui daarop dat 'n mate van verlies aan rRNA-amplifikasie vergoed word deur die ontwikkeling van nuwe kontakte tussen naburige ribosomale proteïene of die verkryging van nuwe msL131,32 ribosomale proteïene. Spesies Encephalitosoön (genoom ~2.5 miljoen bp), saam met hul naaste verwant Ordospora, demonstreer die uiteindelike graad van genoomreduksie in eukariote – hulle het minder as 2000 proteïenkoderende gene, en daar word verwag dat hul ribosome nie net sonder rRNA-uitbreidingsfragmente is (rRNA-fragmente wat eukariotiese ribosome van bakteriese ribosome onderskei nie), maar ook vier ribosomale proteïene het as gevolg van hul gebrek aan homoloë in die E. cuniculi-genoom26,27,28. Daarom het ons tot die gevolgtrekking gekom dat die E. cuniculi-ribosoom voorheen onbekende strategieë vir molekulêre aanpassing aan genoomverval kan openbaar.
Ons krio-EM-struktuur verteenwoordig die kleinste eukariotiese sitoplasmiese ribosoom wat gekarakteriseer is en bied insig in hoe die uiteindelike graad van genoomreduksie die struktuur, samestelling en evolusie van die molekulêre masjinerie wat integraal tot die sel is, beïnvloed. Ons het gevind dat die E. cuniculi-ribosoom baie van die wyd gekonserveerde beginsels van RNA-vouing en ribosoomsamestelling skend, en 'n nuwe, voorheen onbekende ribosomale proteïen ontdek. Heel onverwags toon ons dat mikrosporidia-ribosome die vermoë ontwikkel het om klein molekules te bind, en veronderstel dat afkortings in rRNA en proteïene evolusionêre innovasies veroorsaak wat uiteindelik nuttige eienskappe aan die ribosoom kan verleen.
Om ons begrip van die evolusie van proteïene en nukleïensure in intrasellulêre organismes te verbeter, het ons besluit om E. cuniculi-spore uit kulture van besmette soogdierselle te isoleer om hul ribosome te suiwer en die struktuur van hierdie ribosome te bepaal. Dit is moeilik om 'n groot aantal parasitiese mikrosporidia te verkry omdat mikrosporidia nie in 'n voedingsmedium gekweek kan word nie. In plaas daarvan groei en reproduseer hulle slegs binne die gasheersel. Om E. cuniculi-biomassa vir ribosoomsuiwering te verkry, het ons dus die soogdierniersellyn RK13 met E. cuniculi-spore besmet en hierdie besmette selle vir 'n paar weke gekweek om E. cuniculi toe te laat om te groei en te vermeerder. Deur 'n besmette selmonolaag van ongeveer 'n halwe vierkante meter te gebruik, kon ons ongeveer 300 mg Microsporidia-spore suiwer en dit gebruik om ribosome te isoleer. Ons het toe die gesuiwerde spore met glaskrale ontwrig en die ru-ribosome geïsoleer deur stapsgewyse poliëtileenglikol-fraksionering van die lisate te gebruik. Dit het ons toegelaat om ongeveer 300 µg rou E. cuniculi-ribosome vir strukturele analise te verkry.
Ons het toe krio-EM-beelde versamel met behulp van die gevolglike ribosoommonsters en hierdie beelde verwerk met behulp van maskers wat ooreenstem met die groot ribosomale subeenheid, klein subeenheidkop en klein subeenheid. Tydens hierdie proses het ons beelde van ongeveer 108 000 ribosomale deeltjies versamel en krio-EM-beelde met 'n resolusie van 2.7 Å bereken (Aanvullende Figure 1-3). Ons het toe krio-EM-beelde gebruik om rRNA, ribosomale proteïen en winterslaapfaktor Mdf1 wat met E. cuniculi-ribosome geassosieer word, te modelleer (Fig. 1a, b).
a Struktuur van die E. cuniculi-ribosoom in kompleks met die winterslaapfaktor Mdf1 (pdb id 7QEP). b Kaart van winterslaapfaktor Mdf1 geassosieer met die E. cuniculi-ribosoom. c Sekondêre struktuurkaart wat herwonne rRNA in Mikrosporidiese spesies vergelyk met bekende ribosomale strukture. Die panele toon die ligging van die versterkte rRNA-fragmente (ES) en ribosoom-aktiewe plekke, insluitend die dekoderingsplek (DC), die sarsinisienlus (SRL) en die peptidieltransferasesentrum (PTC). d Die elektrondigtheid wat ooreenstem met die peptidieltransferasesentrum van die E. cuniculi-ribosoom dui daarop dat hierdie katalitiese plek dieselfde struktuur het in die E. cuniculi-parasiet en sy gashere, insluitend H. sapiens. e, f Die ooreenstemmende elektrondigtheid van die dekoderingsentrum (e) en die skematiese struktuur van die dekoderingsentrum (f) dui daarop dat E. cuniculi residue U1491 in plaas van A1491 (E. coli-nommering) in baie ander eukariote het. Hierdie verandering dui daarop dat E. cuniculi sensitief mag wees vir antibiotika wat hierdie aktiewe plek teiken.
In teenstelling met die voorheen gevestigde strukture van V. necatrix en P. locustae ribosome (beide strukture verteenwoordig dieselfde mikrosporidia-familie Nosematidae en is baie soortgelyk aan mekaar), ondergaan 31,32 E. cuniculi ribosome talle prosesse van rRNA en proteïenfragmentasie. Verdere denaturasie (Aanvullende Figure 4-6). In rRNA het die opvallendste veranderinge die volledige verlies van die versterkte 25S rRNA-fragment ES12L en gedeeltelike degenerasie van h39-, h41- en H18-helikse ingesluit (Fig. 1c, Aanvullende Fig. 4). Onder ribosomale proteïene het die opvallendste veranderinge die volledige verlies van die eS30-proteïen en verkorting van die eL8-, eL13-, eL18-, eL22-, eL29-, eL40-, uS3-, uS9-, uS14-, uS17- en eS7-proteïene ingesluit (Aanvullende Figure 4, 5).
Dus word die uiterste vermindering van die genome van Encephalotozoon/Ordospora-spesies weerspieël in hul ribosoomstruktuur: E. cuniculi-ribosome ervaar die mees dramatiese verlies aan proteïeninhoud in eukariotiese sitoplasmiese ribosome wat onderhewig is aan strukturele karakterisering, en hulle het nie eers daardie rRNA- en proteïenfragmente wat wyd behoue ​​bly nie net in eukariote nie, maar ook in die drie domeine van die lewe. Die struktuur van die E. cuniculi-ribosoom bied die eerste molekulêre model vir hierdie veranderinge en onthul evolusionêre gebeure wat oor die hoof gesien is deur beide vergelykende genomika en studies van intrasellulêre biomolekulêre struktuur (Aanvullende Fig. 7). Hieronder beskryf ons elk van hierdie gebeure saam met hul waarskynlike evolusionêre oorsprong en hul potensiële impak op ribosoomfunksie.
Ons het toe gevind dat, benewens groot rRNA-afkortings, E. cuniculi-ribosome rRNA-variasies by een van hul aktiewe plekke het. Alhoewel die peptidieltransferase-sentrum van die E. cuniculi-ribosoom dieselfde struktuur het as ander eukariotiese ribosome (Fig. 1d), verskil die dekoderingsentrum as gevolg van volgordevariasie by nukleotied 1491 (E. coli-nommering, Fig. 1e, f). Hierdie waarneming is belangrik omdat die dekoderingsplek van eukariotiese ribosome tipies residue G1408 en A1491 bevat in vergelyking met bakteriese-tipe residue A1408 en G1491. Hierdie variasie lê ten grondslag aan die verskillende sensitiwiteit van bakteriese en eukariotiese ribosome vir die aminoglikosiedfamilie van ribosomale antibiotika en ander klein molekules wat die dekoderingsplek teiken. By die dekoderingsplek van die E. cuniculi-ribosoom is residu A1491 vervang met U1491, wat moontlik 'n unieke bindingskoppelvlak skep vir klein molekules wat hierdie aktiewe plek teiken. Dieselfde A14901-variant is ook teenwoordig in ander mikrosporidia soos P. locustae en V. necatrix, wat daarop dui dat dit wydverspreid is onder mikrosporidia-spesies (Fig. 1f).
Omdat ons E. cuniculi-ribosoommonsters uit metabolies onaktiewe spore geïsoleer is, het ons die krio-EM-kaart van E. cuniculi getoets vir voorheen beskryfde ribosoombinding onder stres- of hongersnoodtoestande. Winterslaapfaktore 31,32,36,37, 38. Ons het die voorheen gevestigde struktuur van die winterslaapribosoom gekoppel aan die krio-EM-kaart van die E. cuniculi-ribosoom. Vir die koppeling is S. cerevisiae-ribosome in kompleks met winterslaapfaktor Stm138, sprinkaanribosome in kompleks met Lso232-faktor, en V. necatrix-ribosome in kompleks met Mdf1- en Mdf231-faktore gebruik. Terselfdertyd het ons die krio-EM-digtheid gevind wat ooreenstem met die rusfaktor Mdf1. Soortgelyk aan Mdf1 wat aan die V. necatrix-ribosoom bind, bind Mdf1 ook aan die E. cuniculi-ribosoom, waar dit die E-plek van die ribosoom blokkeer, wat moontlik help om ribosome beskikbaar te stel wanneer parasietspore metabolies onaktief word na liggaamsinaktivering (Figuur 2).
Mdf1 blokkeer die E-plek van die ribosoom, wat blykbaar help om die ribosoom te inaktiveer wanneer parasietspore metabolies onaktief word. In die struktuur van die E. cuniculi-ribosoom het ons gevind dat Mdf1 'n voorheen onbekende kontak vorm met die L1-ribosoomstam, die deel van die ribosoom wat die vrystelling van gedeasileerde tRNA van die ribosoom tydens proteïensintese fasiliteer. Hierdie kontakte dui daarop dat Mdf1 van die ribosoom dissosieer deur dieselfde meganisme as gedeasileerde tRNA te gebruik, wat 'n moontlike verduideliking bied vir hoe die ribosoom Mdf1 verwyder om proteïensintese te heraktiveer.
Ons struktuur het egter 'n onbekende kontak tussen Mdf1 en die L1-ribosoombeen (die deel van die ribosoom wat help om gedeasileerde tRNA van die ribosoom vry te stel tydens proteïensintese) aan die lig gebring. In die besonder gebruik Mdf1 dieselfde kontakte as die elmboogsegment van die gedeasileerde tRNA-molekule (Fig. 2). Hierdie voorheen onbekende molekulêre modellering het getoon dat Mdf1 van die ribosoom dissosieer deur dieselfde meganisme as gedeasileerde tRNA te gebruik, wat verklaar hoe die ribosoom hierdie winterslaapfaktor verwyder om proteïensintese te heraktiveer.
Toe ons die rRNA-model konstrueer het, het ons gevind dat die E. cuniculi-ribosoom abnormaal gevoude rRNA-fragmente het, wat ons saamgesmelte rRNA genoem het (Fig. 3). In ribosome wat die drie domeine van lewe omspan, vou rRNA in strukture waarin die meeste rRNA-basisse óf basispaar en met mekaar vou óf met ribosomale proteïene interaksie het38,39,40. In E. cuniculi-ribosome blyk dit egter dat rRNA's hierdie voubeginsel skend deur sommige van hul helikse in ongevoude rRNA-streke te omskep.
Struktuur van die H18 25S rRNA-heliks in S. cerevisiae, V. necatrix en E. cuniculi. Tipies, in ribosome wat die drie lewensdomeine omspan, kronkel hierdie skakel in 'n RNA-heliks wat 24 tot 34 residue bevat. In Microsporidia, daarenteen, word hierdie rRNA-skakel geleidelik gereduseer tot twee enkelstrengige uridienryke skakels wat slegs 12 residue bevat. Die meeste van hierdie residue word aan oplosmiddels blootgestel. Die figuur toon dat parasitiese mikrosporidia die algemene beginsels van rRNA-vouing blyk te skend, waar rRNA-basisse gewoonlik aan ander basisse gekoppel is of betrokke is by rRNA-proteïen-interaksies. In mikrosporidia neem sommige rRNA-fragmente 'n ongunstige vou aan, waarin die voormalige rRNA-heliks 'n enkelstrengige fragment word wat amper in 'n reguit lyn verleng is. Die teenwoordigheid van hierdie ongewone streke laat mikrosporidia rRNA toe om verafgeleë rRNA-fragmente te bind met behulp van 'n minimale aantal RNA-basisse.
Die mees treffende voorbeeld van hierdie evolusionêre oorgang kan waargeneem word in die H18 25S rRNA-heliks (Fig. 3). In spesies van E. coli tot mense bevat die basisse van hierdie rRNA-heliks 24-32 nukleotiede, wat 'n effens onreëlmatige heliks vorm. In voorheen geïdentifiseerde ribosomale strukture van V. necatrix en P. locustae,31,32 is die basisse van die H18-heliks gedeeltelik ontrol, maar nukleotiedbasisparing word bewaar. In E. cuniculi word hierdie rRNA-fragment egter die kortste skakelaars 228UUUUGU232 en 301UUUUUUUUUU307. Anders as tipiese rRNA-fragmente, rol hierdie uridienryke skakelaars nie op of maak hulle nie uitgebreide kontak met ribosomale proteïene nie. In plaas daarvan neem hulle oplosmiddel-oop en volledig ontvoude strukture aan waarin die rRNA-stringe amper reguit verleng is. Hierdie uitgerekte konformasie verduidelik hoe E. cuniculi slegs 12 RNA-basisse gebruik om die 33 Å-gaping tussen die H16- en H18-rRNA-helikse te vul, terwyl ander spesies ten minste twee keer soveel rRNA-basisse benodig om die gaping te vul.
Dus kan ons demonstreer dat, deur energiek ongunstige vouing, parasitiese mikrosporidia 'n strategie ontwikkel het om selfs daardie rRNA-segmente wat breedweg behoue ​​bly oor spesies in die drie domeine van die lewe, saam te trek. Blykbaar, deur mutasies te akkumuleer wat rRNA-helikse in kort poli-U-skakels omskep, kan E. cuniculi ongewone rRNA-fragmente vorm wat so min nukleotiede as moontlik bevat vir die ligasie van distale rRNA-fragmente. Dit help verduidelik hoe mikrosporidia 'n dramatiese vermindering in hul basiese molekulêre struktuur bereik het sonder om hul strukturele en funksionele integriteit te verloor.
Nog 'n ongewone kenmerk van E. cuniculi rRNA is die voorkoms van rRNA sonder verdikkings (Fig. 4). Uitstulpings is nukleotiede sonder basispare wat uit die RNA-heliks draai in plaas daarvan om daarin weg te kruip. Die meeste rRNA-uitsteeksels tree op as molekulêre kleefmiddels, wat help om aangrensende ribosomale proteïene of ander rRNA-fragmente te bind. Sommige van die uitstulpings tree op as skarniere, wat die rRNA-heliks toelaat om optimaal te buig en te vou vir produktiewe proteïensintese 41.
a 'n rRNA-uitsteeksel (S. cerevisiae-nommering) is afwesig van die E. cuniculi-ribosoomstruktuur, maar teenwoordig in die meeste ander eukariote b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens, en E. cuniculi interne ribosome. parasiete kort baie van die antieke, hoogs gekonserveerde rRNA-bultjies. Hierdie verdikkings stabiliseer die ribosoomstruktuur; daarom dui hul afwesigheid in mikrosporidia op 'n verminderde stabiliteit van rRNA-vouing in mikrosporidia-parasiete. Vergelyking met P-stingels (L7/L12-stingels in bakterieë) toon dat die verlies van rRNA-bultjies soms saamval met die verskyning van nuwe knoppe langs die verlore knoppe. Die H42-heliks in die 23S/28S rRNA het 'n antieke bult (U1206 in Saccharomyces cerevisiae) wat na raming ten minste 3,5 miljard jaar oud is as gevolg van sy beskerming in drie domeine van die lewe. In mikrosporidia word hierdie bult uitgeskakel. 'n Nuwe bult het egter langs die verlore bult verskyn (A1306 in E. cuniculi).
Opvallend is dat ons gevind het dat E. cuniculi-ribosome die meeste van die rRNA-bultjies wat in ander spesies voorkom, kortkom, insluitend meer as 30 bultjies wat in ander eukariote behoue ​​gebly het (Fig. 4a). Hierdie verlies elimineer baie kontakte tussen ribosomale subeenhede en aangrensende rRNA-heliks, wat soms groot hol ruimtes binne die ribosoom skep, wat die E. cuniculi-ribosoom meer poreus maak in vergelyking met meer tradisionele ribosome (Fig. 4b). Dit is opmerklik dat ons gevind het dat die meeste van hierdie bultjies ook verlore gegaan het in die voorheen geïdentifiseerde V. necatrix- en P. locustae-ribosoomstrukture, wat deur vorige strukturele ontledings oor die hoof gesien is31,32.
Soms gaan die verlies van rRNA-bultjies gepaard met die ontwikkeling van nuwe bultjies langs die verlore bultjie. Byvoorbeeld, die ribosomale P-stam bevat 'n U1208-bultjie (in Saccharomyces cerevisiae) wat van E. coli tot mense oorleef het en dus na raming 3,5 miljard jaar oud is. Tydens proteïensintese help hierdie bultjie die P-stam om tussen oop en geslote konformasies te beweeg sodat die ribosoom translasiefaktore kan werf en na die aktiewe plek kan aflewer. In E. cuniculi-ribosome is hierdie verdikking afwesig; 'n nuwe verdikking (G883) wat slegs in drie basispare geleë is, kan egter bydra tot die herstel van die optimale buigsaamheid van die P-stam (Fig. 4c).
Ons data oor rRNA sonder uitstulpings dui daarop dat rRNA-minimalisering nie beperk is tot die verlies van rRNA-elemente op die oppervlak van die ribosoom nie, maar ook die ribosoomkern kan betrek, wat 'n parasiet-spesifieke molekulêre defek skep wat nie in vrylewende selle beskryf is nie. Lewende spesies word waargeneem.
Nadat ons kanonieke ribosomale proteïene en rRNA gemodelleer het, het ons gevind dat konvensionele ribosomale komponente nie die drie dele van die krio-EM-beeld kan verklaar nie. Twee van hierdie fragmente is klein molekules in grootte (Fig. 5, Aanvullende Fig. 8). Die eerste segment is tussen die ribosomale proteïene uL15 en eL18 in 'n posisie wat gewoonlik deur die C-terminus van eL18 beset word, wat in E. cuniculi verkort is. Alhoewel ons nie die identiteit van hierdie molekule kan bepaal nie, word die grootte en vorm van hierdie digtheidseiland goed verklaar deur die teenwoordigheid van spermidienmolekules. Die binding daarvan aan die ribosoom word gestabiliseer deur mikrosporidia-spesifieke mutasies in die uL15-proteïene (Asp51 en Arg56), wat die affiniteit van die ribosoom vir hierdie klein molekule blyk te verhoog, aangesien dit uL15 toelaat om die klein molekule in 'n ribosomale struktuur toe te draai. Aanvullende Figuur 2). 8, bykomende data 1, 2).
Krio-EM-beelding wat die teenwoordigheid van nukleotiede buite die ribose wat aan die E. cuniculi-ribosoom gebind is, toon. In die E. cuniculi-ribosoom beklee hierdie nukleotied dieselfde plek as die 25S rRNA A3186-nukleotied (Saccharomyces cerevisiae-nommering) in die meeste ander eukariotiese ribosome. b In die ribosomale struktuur van E. cuniculi is hierdie nukleotied tussen die ribosomale proteïene uL9 en eL20 geleë, waardeur die kontak tussen die twee proteïene gestabiliseer word. cd eL20-volgordebewaringsanalise onder mikrosporidia-spesies. Die filogenetiese boom van Microsporidia-spesies (c) en veelvuldige volgordebelyning van die eL20-proteïen (d) toon dat nukleotiedbindende residue F170 en K172 in die meeste tipiese Microsporidia behoue ​​bly, met die uitsondering van S. lophii, met die uitsondering van vroeë vertakkings-Microsporidia, wat die ES39L rRNA-uitbreiding behou het. e Hierdie figuur toon dat nukleotiedbindende residue F170 en K172 slegs teenwoordig is in eL20 van die hoogs gereduseerde mikrosporidia-genoom, maar nie in ander eukariote nie. Oor die algemeen dui hierdie data daarop dat Mikrosporidiese ribosome 'n nukleotiedbindingsplek ontwikkel het wat blykbaar AMP-molekules bind en dit gebruik om proteïen-proteïen-interaksies in die ribosomale struktuur te stabiliseer. Die hoë bewaring van hierdie bindingsplek in Mikrosporidia en die afwesigheid daarvan in ander eukariote dui daarop dat hierdie plek 'n selektiewe oorlewingsvoordeel vir Mikrosporidia kan bied. Dus blyk die nukleotiedbindende sak in die mikrosporidia-ribosoom nie 'n gedegenereerde kenmerk of eindvorm van rRNA-afbraak te wees soos voorheen beskryf nie, maar eerder 'n nuttige evolusionêre innovasie wat die mikrosporidia-ribosoom toelaat om klein molekules direk te bind en dit as molekulêre boustene vir ribosome te gebruik. Hierdie ontdekking maak die mikrosporidia-ribosoom die enigste ribosoom wat bekend is om 'n enkele nukleotied as sy strukturele boublok te gebruik. f Hipotetiese evolusionêre pad afgelei van nukleotiedbinding.
Die tweede lae molekulêre gewigdigtheid is geleë by die koppelvlak tussen ribosomale proteïene uL9 en eL30 (Fig. 5a). Hierdie koppelvlak is voorheen beskryf in die struktuur van die Saccharomyces cerevisiae ribosoom as 'n bindingsplek vir die 25S nukleotied van rRNA A3186 (deel van die ES39L rRNA-uitbreiding)38. Daar is getoon dat in gedegenereerde P. locustae ES39L ribosome, hierdie koppelvlak 'n onbekende enkele nukleotied 31 bind, en daar word aanvaar dat hierdie nukleotied 'n gereduseerde finale vorm van rRNA is, waarin die lengte van rRNA ~130-230 basisse is. ES39L word gereduseer tot 'n enkele nukleotied 32.43. Ons krio-EM-beelde ondersteun die idee dat digtheid deur nukleotiede verklaar kan word. Die hoër resolusie van ons struktuur het egter getoon dat hierdie nukleotied 'n ekstraribosomale molekule is, moontlik AMP (Fig. 5a, b).
Ons het toe gevra of die nukleotiedbindingsplek in die E. cuniculi-ribosoom verskyn het of dat dit voorheen bestaan ​​het. Aangesien nukleotiedbinding hoofsaaklik gemedieer word deur die Phe170- en Lys172-residue in die eL30-ribosomale proteïen, het ons die bewaring van hierdie residue in 4396 verteenwoordigende eukariote beoordeel. Soos in die geval van uL15 hierbo, het ons gevind dat die Phe170- en Lys172-residue slegs hoogs behoue ​​gebly het in tipiese Microsporidia, maar afwesig is in ander eukariote, insluitend atipiese Microsporidia Mitosporidium en Amphiamblys, waarin die ES39L rRNA-fragment nie gereduseer is nie 44, 45, 46 (Fig. 5c). -e).
Saamgevat ondersteun hierdie data die idee dat E. cuniculi en moontlik ander kanonieke mikrosporidia die vermoë ontwikkel het om groot getalle klein metaboliete doeltreffend in die ribosoomstruktuur vas te vang om te kompenseer vir die afname in rRNA- en proteïenvlakke. Deur dit te doen, het hulle 'n unieke vermoë ontwikkel om nukleotiede buite die ribosoom te bind, wat toon dat parasitiese molekulêre strukture kompenseer deur oorvloedige klein metaboliete vas te vang en dit as strukturele nabootsers van gedegradeerde RNA- en proteïenfragmente te gebruik.
Die derde ongesimuleerde deel van ons krio-EM-kaart, gevind in die groot ribosomale subeenheid. Die relatief hoë resolusie (2.6 Å) van ons kaart dui daarop dat hierdie digtheid behoort aan proteïene met unieke kombinasies van groot sykettingresidue, wat ons toegelaat het om hierdie digtheid te identifiseer as 'n voorheen onbekende ribosomale proteïen wat ons geïdentifiseer het as. Dit is msL2 (Microsporidia-spesifieke proteïen L2) genoem (metodes, figuur 6). Ons homologie-soektog het getoon dat msL2 behoue ​​bly in die Microsporidia-klade van die genus Encephaliter en Orosporidium, maar afwesig is in ander spesies, insluitend ander Microsporidia. In die ribosomale struktuur beslaan msL2 'n gaping wat gevorm word deur die verlies van die uitgebreide ES31L rRNA. In hierdie leemte help msL2 om rRNA-vouing te stabiliseer en kan dit vergoed vir die verlies van ES31L (Figuur 6).
a Elektrondigtheid en model van die Microsporidia-spesifieke ribosomale proteïen msL2 wat in E. cuniculi-ribosome gevind word. b Die meeste eukariotiese ribosome, insluitend die 80S-ribosoom van Saccharomyces cerevisiae, het ES19L rRNA-amplifikasie wat verlore gaan in die meeste Microsporidiaanse spesies. Die voorheen gevestigde struktuur van die V. necatrix microsporidia-ribosoom dui daarop dat die verlies van ES19L in hierdie parasiete gekompenseer word deur die evolusie van die nuwe msL1-ribosomale proteïen. In hierdie studie het ons gevind dat die E. cuniculi-ribosoom ook 'n addisionele ribosomale RNA-nabootsingsproteïen ontwikkel het as 'n skynbare kompensasie vir die verlies van ES19L. MsL2 (tans geannoteer as die hipotetiese ECU06_1135-proteïen) en msL1 het egter verskillende strukturele en evolusionêre oorsprong. c Hierdie ontdekking van die generering van evolusionêr onverwante msL1- en msL2-ribosomale proteïene dui daarop dat as ribosome skadelike mutasies in hul rRNA ophoop, hulle ongekende vlakke van samestellingsdiversiteit selfs in 'n klein subgroep van nou verwante spesies kan bereik. Hierdie ontdekking kan help om die oorsprong en evolusie van die mitochondriale ribosoom te verduidelik, wat bekend is vir sy hoogs gereduseerde rRNA en abnormale veranderlikheid in proteïensamestelling oor spesies heen.
Ons het toe die msL2-proteïen vergelyk met die voorheen beskryfde msL1-proteïen, die enigste bekende mikrosporidia-spesifieke ribosomale proteïen wat in die V. necatrix-ribosoom gevind word. Ons wou toets of msL1 en msL2 evolusionêr verwant is. Ons analise het getoon dat msL1 en msL2 dieselfde holte in die ribosomale struktuur beset, maar verskillende primêre en tersiêre strukture het, wat dui op hul onafhanklike evolusionêre oorsprong (Fig. 6). Dus lewer ons ontdekking van msL2 bewyse dat groepe kompakte eukariotiese spesies onafhanklik struktureel verskillende ribosomale proteïene kan ontwikkel om te kompenseer vir die verlies van rRNA-fragmente. Hierdie bevinding is opmerklik omdat die meeste sitoplasmiese eukariotiese ribosome 'n onveranderlike proteïen bevat, insluitend dieselfde familie van 81 ribosomale proteïene. Die verskyning van msL1 en msL2 in verskeie klades van mikrosporidia in reaksie op die verlies van uitgebreide rRNA-segmente dui daarop dat die agteruitgang van die parasiet se molekulêre argitektuur veroorsaak dat parasiete kompenserende mutasies soek, wat uiteindelik kan lei tot hul verkryging in verskillende parasietpopulasies.
Laastens, toe ons model voltooi was, het ons die samestelling van die E. cuniculi-ribosoom vergelyk met dié wat uit die genoomvolgorde voorspel is. Daar is voorheen gedink dat verskeie ribosomale proteïene, insluitend eL14, eL38, eL41 en eS30, van die E. cuniculi-genoom afwesig is as gevolg van die skynbare afwesigheid van hul homoloë van die E. cuniculi-genoom. Die verlies van baie ribosomale proteïene word ook voorspel in die meeste ander hoogs gereduseerde intrasellulêre parasiete en endo-simbionte. Byvoorbeeld, hoewel die meeste vrylewende bakterieë dieselfde familie van 54 ribosomale proteïene bevat, het slegs 11 van hierdie proteïenfamilies waarneembare homoloë in elke geanaliseerde genoom van gasheer-beperkte bakterieë. Ter ondersteuning van hierdie idee is 'n verlies van ribosomale proteïene eksperimenteel waargeneem in V. necatrix en P. locustae mikrosporidia, wat die eL38 en eL4131,32 proteïene kortkom.
Ons strukture toon egter dat slegs eL38, eL41 en eS30 eintlik verlore gaan in die E. cuniculi-ribosoom. Die eL14-proteïen is behoue ​​gebly en ons struktuur het getoon waarom hierdie proteïen nie in die homologiesoektog gevind kon word nie (Fig. 7). In E. cuniculi-ribosome gaan die meeste van die eL14-bindingsplek verlore as gevolg van die afbraak van die rRNA-geamplifiseerde ES39L. In die afwesigheid van ES39L het eL14 die meeste van sy sekondêre struktuur verloor, en slegs 18% van die eL14-volgorde was identies in E. cuniculi en S. cerevisiae. Hierdie swak volgordebewaring is merkwaardig omdat selfs Saccharomyces cerevisiae en Homo sapiens – organismes wat 1,5 miljard jaar uitmekaar ontwikkel het – meer as 51% van dieselfde residue in eL14 deel. Hierdie anomale verlies aan bewaring verklaar waarom E. cuniculi eL14 tans geannoteer word as die vermeende M970_061160-proteïen en nie as die eL1427 ribosomale proteïen nie.
en Die Microsporidia-ribosoom het die ES39L rRNA-uitbreiding verloor, wat die eL14 ribosomale proteïenbindingsplek gedeeltelik uitgeskakel het. In die afwesigheid van ES39L ondergaan die eL14-mikrospoorproteïen 'n verlies aan sekondêre struktuur, waarin die voormalige rRNA-bindende α-heliks in 'n minimale lengte-lus degenereer. b Veelvuldige volgorde-belyning toon dat die eL14-proteïen hoogs gekonserveer is in eukariotiese spesies (57% volgorde-identiteit tussen gis- en menslike homoloë), maar swak gekonserveer en divergent is in mikrosporidia (waarin nie meer as 24% van die residue identies is aan die eL14-homoloog nie). van S. cerevisiae of H. sapiens). Hierdie swak volgorde-bewaring en sekondêre struktuur-variasie verklaar waarom die eL14-homoloog nog nooit in E. cuniculi gevind is nie en waarom daar gedink word dat hierdie proteïen verlore gegaan het in E. cuniculi. In teenstelling hiermee is E. cuniculi eL14 voorheen geannoteer as 'n vermeende M970_061160-proteïen. Hierdie waarneming dui daarop dat die genoomdiversiteit van mikrosporidia tans oorskat word: sommige gene wat tans as verlore in mikrosporidia beskou word, word in werklikheid bewaar, alhoewel in hoogs gedifferensieerde vorme; in plaas daarvan word gedink dat sommige kodeer vir mikrosporidia-gene vir wurmspesifieke proteïene (bv. die hipotetiese proteïen M970_061160) kodeer eintlik vir die baie diverse proteïene wat in ander eukariote voorkom.
Hierdie bevinding dui daarop dat rRNA-denaturasie kan lei tot 'n dramatiese verlies aan volgordebewaring in aangrensende ribosomale proteïene, wat hierdie proteïene onopspoorbaar maak vir homologie-soektogte. Dus kan ons die werklike graad van molekulêre afbraak in klein genoomorganismes oorskat, aangesien sommige proteïene wat vermoedelik verlore gegaan het, eintlik voortduur, al is dit in hoogs veranderde vorme.
Hoe kan parasiete die funksie van hul molekulêre masjiene behou onder toestande van uiterste genoomreduksie? Ons studie beantwoord hierdie vraag deur die komplekse molekulêre struktuur (ribosoom) van E. cuniculi, 'n organisme met een van die kleinste eukariotiese genome, te beskryf.
Dit is al vir byna twee dekades bekend dat proteïen- en RNA-molekules in mikrobiese parasiete dikwels verskil van hul homoloë molekules in vrylewende spesies omdat hulle nie kwaliteitsbeheersentrums het nie, tot 50% van hul grootte in vrylewende mikrobes verminder word, ens. . baie aftakelende mutasies wat vouing en funksie belemmer. Byvoorbeeld, daar word verwag dat die ribosome van klein genoomorganismes, insluitend baie intrasellulêre parasiete en endosimbionte, verskeie ribosomale proteïene en tot een derde van rRNA-nukleotiede sal kortkom in vergelyking met vrylewende spesies 27, 29, 30, 49. Die manier waarop hierdie molekules in parasiete funksioneer, bly egter grootliks 'n raaisel, wat hoofsaaklik deur vergelykende genomika bestudeer word.
Ons studie toon dat die struktuur van makromolekules baie aspekte van evolusie kan openbaar wat moeilik is om uit tradisionele vergelykende genomiese studies van intrasellulêre parasiete en ander gasheer-beperkte organismes te onttrek (Aanvullende Fig. 7). Byvoorbeeld, die voorbeeld van die eL14-proteïen toon dat ons die werklike graad van afbraak van die molekulêre apparaat in parasitiese spesies kan oorskat. Daar word nou geglo dat enkefalitiese parasiete honderde mikrosporidia-spesifieke gene het. Ons resultate toon egter dat sommige van hierdie skynbaar spesifieke gene eintlik net baie verskillende variante van gene is wat algemeen voorkom in ander eukariote. Boonop toon die voorbeeld van die msL2-proteïen hoe ons nuwe ribosomale proteïene oor die hoof sien en die inhoud van parasitiese molekulêre masjiene onderskat. Die voorbeeld van klein molekules toon hoe ons die mees vernuftige innovasies in parasitiese molekulêre strukture kan oor die hoof sien wat hulle nuwe biologiese aktiwiteit kan gee.
Saamgevat verbeter hierdie resultate ons begrip van die verskille tussen die molekulêre strukture van gasheer-beperkte organismes en hul eweknieë in vrylewende organismes. Ons toon dat molekulêre masjiene, wat lank gedink is as gereduseer, degenererend en onderhewig aan verskeie aftakelende mutasies, eerder 'n stel sistematies oor die hoof gesiene ongewone strukturele kenmerke het.
Aan die ander kant dui die nie-lywige rRNA-fragmente en saamgesmelte fragmente wat ons in die ribosome van E. cuniculi gevind het, daarop dat genoomreduksie selfs daardie dele van die basiese molekulêre masjinerie kan verander wat in die drie domeine van die lewe bewaar gebly het – na byna 3,5 miljard jaar van onafhanklike evolusie van spesies.
Die bultvrye en saamgesmelte rRNA-fragmente in E. cuniculi-ribosome is van besondere belang in die lig van vorige studies van RNA-molekules in endosimbiotiese bakterieë. Byvoorbeeld, in die plantluis-endosimbiont Buchnera aphidicola, is getoon dat rRNA- en tRNA-molekules temperatuursensitiewe strukture het as gevolg van A+T-samestellingsvooroordeel en 'n hoë proporsie nie-kanonieke basispare20,50. Hierdie veranderinge in RNA, sowel as veranderinge in proteïenmolekules, word nou beskou as verantwoordelik vir die oormatige afhanklikheid van endo-simbionte van vennote en die onvermoë van endo-simbionte om hitte oor te dra21, 23. Alhoewel parasitiese mikrosporidia-rRNA struktureel duidelike veranderinge het, dui die aard van hierdie veranderinge daarop dat verminderde termiese stabiliteit en hoër afhanklikheid van chaperoneproteïene algemene kenmerke van RNA-molekules in organismes met verminderde genome kan wees.
Aan die ander kant toon ons strukture dat parasiet-mikrosporidia 'n unieke vermoë ontwikkel het om breedweg gekonserveerde rRNA- en proteïenfragmente te weerstaan, en die vermoë ontwikkel het om oorvloedige en geredelik beskikbare klein metaboliete as strukturele nabootsers van gedegenereerde rRNA- en proteïenfragmente te gebruik. Molekulêre struktuurdegradasie. Hierdie mening word ondersteun deur die feit dat klein molekules wat vergoed vir die verlies van proteïenfragmente in die rRNA en ribosome van E. cuniculi bind aan mikrosporidia-spesifieke residue in die uL15- en eL30-proteïene. Dit dui daarop dat die binding van klein molekules aan ribosome 'n produk van positiewe seleksie kan wees, waarin Mikrosporidia-spesifieke mutasies in ribosomale proteïene geselekteer is vir hul vermoë om die affiniteit van ribosome vir klein molekules te verhoog, wat kan lei tot meer doeltreffende ribosomale organismes. Die ontdekking onthul 'n slim innovasie in die molekulêre struktuur van mikrobiese parasiete en gee ons 'n beter begrip van hoe parasietmolekulêre strukture hul funksie handhaaf ten spyte van reduktiewe evolusie.
Tans bly die identifikasie van hierdie klein molekules onduidelik. Dit is nie duidelik waarom die voorkoms van hierdie klein molekules in die ribosomale struktuur tussen mikrosporidia-spesies verskil nie. In die besonder is dit nie duidelik waarom nukleotiedbinding waargeneem word in die ribosome van E. cuniculi en P. locustae, en nie in die ribosome van V. necatrix nie, ten spyte van die teenwoordigheid van die F170-residu in die eL20- en K172-proteïene van V. necatrix. Hierdie delesie kan veroorsaak word deur residu 43 uL6 (geleë langs die nukleotiedbindingssakkie), wat tirosien in V. necatrix is ​​en nie treonien in E. cuniculi en P. locustae nie. Die lywige aromatiese syketting van Tyr43 kan inmeng met nukleotiedbinding as gevolg van steriese oorvleueling. Alternatiewelik kan die skynbare nukleotieddelesie te wyte wees aan die lae resolusie van krio-EM-beelding, wat die modellering van V. necatrix ribosomale fragmente belemmer.
Aan die ander kant dui ons werk daarop dat die proses van genoomverval 'n vindingryke krag kan wees. In die besonder dui die struktuur van die E. cuniculi-ribosoom daarop dat die verlies van rRNA- en proteïenfragmente in die mikrosporidia-ribosoom evolusionêre druk skep wat veranderinge in ribosoomstruktuur bevorder. Hierdie variante kom ver van die aktiewe plek van die ribosoom voor en blyk te help om optimale ribosoomsamestelling te handhaaf (of te herstel) wat andersins deur verminderde rRNA ontwrig sou word. Dit dui daarop dat 'n belangrike innovasie van die mikrosporidia-ribosoom blykbaar ontwikkel het in 'n behoefte om geendrift te buffer.
Miskien word dit die beste geïllustreer deur nukleotiedbinding, wat nog nooit tot dusver in ander organismes waargeneem is nie. Die feit dat nukleotiedbindingsresidue in tipiese mikrosporidia teenwoordig is, maar nie in ander eukariote nie, dui daarop dat nukleotiedbindingsplekke nie net oorblyfsels is wat wag om te verdwyn nie, of die finale plek vir rRNA om herstel te word na die vorm van individuele nukleotiede nie. In plaas daarvan lyk hierdie plek na 'n nuttige kenmerk wat oor verskeie rondes van positiewe seleksie kon ontwikkel het. Nukleotiedbindingsplekke kan 'n neweproduk van natuurlike seleksie wees: sodra ES39L afgebreek is, word mikrosporidia gedwing om kompensasie te soek om optimale ribosoombiogenese te herstel in die afwesigheid van ES39L. Aangesien hierdie nukleotied die molekulêre kontakte van die A3186-nukleotied in ES39L kan naboots, word die nukleotiedmolekule 'n boublok van die ribosoom, waarvan die binding verder verbeter word deur mutasie van die eL30-volgorde.
Met betrekking tot die molekulêre evolusie van intrasellulêre parasiete, toon ons studie dat die kragte van Darwinistiese natuurlike seleksie en genetiese drywing van genoomverval nie parallel werk nie, maar ossilleer. Eerstens elimineer genetiese drywing belangrike kenmerke van biomolekules, wat kompensasie broodnodig maak. Slegs wanneer parasiete hierdie behoefte deur Darwinistiese natuurlike seleksie bevredig, sal hul makromolekules die kans hê om hul mees indrukwekkende en innoverende eienskappe te ontwikkel. Belangrik is dat die evolusie van nukleotiedbindingsplekke in die E. cuniculi-ribosoom daarop dui dat hierdie verlies-tot-win-patroon van molekulêre evolusie nie net skadelike mutasies amortiseer nie, maar soms heeltemal nuwe funksies aan parasitiese makromolekules verleen.
Hierdie idee stem ooreen met Sewell Wright se bewegende ewewigsteorie, wat verklaar dat 'n streng stelsel van natuurlike seleksie die vermoë van organismes om te innoveer beperk51,52,53. As genetiese drywing egter natuurlike seleksie ontwrig, kan hierdie drywings veranderinge teweegbring wat nie op sigself aanpasbaar (of selfs nadelig) is nie, maar lei tot verdere veranderinge wat hoër fiksheid of nuwe biologiese aktiwiteit bied. Ons raamwerk ondersteun hierdie idee deur te illustreer dat dieselfde tipe mutasie wat die vou en funksie van 'n biomolekule verminder, die hoofrede vir die verbetering daarvan blyk te wees. In lyn met die wen-wen evolusionêre model, toon ons studie dat genoomverval, tradisioneel beskou as 'n degeneratiewe proses, ook 'n belangrike dryfveer van innovasie is, wat soms en miskien selfs dikwels makromolekules toelaat om nuwe parasitiese aktiwiteite te verkry. kan hulle gebruik.