Благодарим ви, че посетихте Nature.com. Версията на браузъра, която използвате, има ограничена поддръжка на CSS. За най-добро изживяване ви препоръчваме да използвате актуализиран браузър (или да деактивирате режима на съвместимост в Internet Explorer). Междувременно, за да осигурим непрекъсната поддръжка, ще рендираме сайта без стилове и JavaScript.
Еволюцията на микробните паразити включва противодействие между естествения подбор, който кара паразитите да се усъвършенстват, и генетичния дрейф, който кара паразитите да губят гени и да натрупват вредни мутации. Тук, за да разберем как това противодействие се случва в мащаба на една макромолекула, ние описваме крио-ЕМ структурата на рибозомата на Encephalitozoon cuniculi, еукариотен организъм с един от най-малките геноми в природата. Екстремното намаляване на рРНК в рибозомите на E. cuniculi е съпроводено с безпрецедентни структурни промени, като еволюцията на неизвестни досега слети рРНК линкери и рРНК без издатини. В допълнение, рибозомата на E. cuniculi оцелява след загубата на рРНК фрагменти и протеини, като развива способността да използва малки молекули като структурни имитации на деградирани рРНК фрагменти и протеини. Като цяло, ние показваме, че молекулярните структури, за които дълго време се е смятало, че са редуцирани, дегенериращи и подложени на инвалидизиращи мутации, имат редица компенсаторни механизми, които ги поддържат активни въпреки екстремните молекулярни контракции.
Тъй като повечето групи микробни паразити имат уникални молекулярни инструменти за експлоатация на своите гостоприемници, често се налага да разработваме различни терапевтични средства за различните групи паразити1,2. Нови доказателства обаче сочат, че някои аспекти на еволюцията на паразитите са конвергентни и до голяма степен предвидими, което показва потенциална основа за широки терапевтични интервенции при микробните паразити3,4,5,6,7,8,9.
Предишни изследвания са идентифицирали обща еволюционна тенденция при микробните паразити, наречена редукция на генома или разпад на генома10,11,12,13. Настоящите изследвания показват, че когато микроорганизмите се откажат от свободноживеещия си начин на живот и станат вътреклетъчни паразити (или ендосимбионти), техните геноми претърпяват бавни, но удивителни метаморфози в продължение на милиони години9,11. В процес, известен като разпад на генома, микробните паразити натрупват вредни мутации, които превръщат много преди това важни гени в псевдогени, което води до постепенна загуба на гени и мутационен колапс14,15. Този колапс може да унищожи до 95% от гените в най-старите вътреклетъчни организми в сравнение с тясно свързани свободноживеещи видове. По този начин еволюцията на вътреклетъчните паразити е борба между две противоположни сили: дарвинисткият естествен подбор, водещ до усъвършенстване на паразитите, и колапсът на генома, хвърлящ паразитите в забрава. Как паразитът е успял да излезе от тази борба и да запази активността на своята молекулярна структура, остава неясно.
Въпреки че механизмът на разпадане на генома не е напълно изяснен, изглежда, че това се случва главно поради чест генетичен дрейф. Тъй като паразитите живеят в малки, безполови и генетично ограничени популации, те не могат ефективно да елиминират вредните мутации, които понякога възникват по време на репликацията на ДНК. Това води до необратимо натрупване на вредни мутации и намаляване на генома на паразита. В резултат на това паразитът не само губи гени, които вече не са необходими за оцеляването му във вътреклетъчната среда. Именно неспособността на паразитните популации ефективно да елиминират спорадичните вредни мутации кара тези мутации да се натрупват в целия геном, включително най-важните им гени.
Голяма част от настоящото ни разбиране за редукцията на генома се основава единствено на сравнения на геномните последователности, с по-малко внимание към промените в действителните молекули, които изпълняват поддържащи функции и служат като потенциални лекарствени мишени. Сравнителните проучвания показват, че тежестта на вредните вътреклетъчни микробни мутации изглежда предразполага протеините и нуклеиновите киселини към неправилно сгъване и агрегиране, което ги прави по-зависими от шаперони и свръхчувствителни към топлина19,20,21,22,23. Освен това, различни паразити – независима еволюция, понякога разделена от до 2,5 милиарда години – са претърпели подобна загуба на центрове за контрол на качеството в техния протеинов синтез5,6 и механизми за възстановяване на ДНК24. Въпреки това, малко се знае за влиянието на вътреклетъчния начин на живот върху всички други свойства на клетъчните макромолекули, включително молекулярната адаптация към нарастващото натоварване от вредни мутации.
В тази работа, за да разберем по-добре еволюцията на протеините и нуклеиновите киселини на вътреклетъчните микроорганизми, определихме структурата на рибозомите на вътреклетъчния паразит Encephalitozoon cuniculi. E. cuniculi е гъбоподобен организъм, принадлежащ към група паразитни микроспоридии, които имат необичайно малки еукариотни геноми и следователно се използват като моделни организми за изследване на разпадането на генома25,26,27,28,29,30. Наскоро беше определена крио-ЕМ рибозомна структура за умерено редуцирани геноми на Microsporidia, Paranosema locustae и Vairimorpha necatrix31,32 (геном ~3.2 Mb). Тези структури предполагат, че известна загуба на рРНК амплификация се компенсира от развитието на нови контакти между съседни рибозомни протеини или от придобиването на нови рибозомни протеини msL131,32. Видът Encephalitozoon (геном ~2,5 милиона bp), заедно с най-близкия си роднина Ordospora, демонстрират максимална степен на редукция на генома при еукариотите – те имат по-малко от 2000 гена, кодиращи протеини, и се очаква техните рибозоми не само да са лишени от фрагменти за разширяване на рРНК (фрагменти на рРНК, които разграничават еукариотните рибозоми от бактериалните рибозоми), но и да имат четири рибозомни протеина поради липсата им на хомолози в генома на E. cuniculi26,27,28. Следователно, стигнахме до заключението, че рибозомата на E. cuniculi може да разкрие неизвестни досега стратегии за молекулярна адаптация към разпадането на генома.
Нашата крио-ЕМ структура представлява най-малката еукариотна цитоплазмена рибозома, която може да бъде характеризирана, и предоставя представа за това как крайната степен на редукция на генома влияе върху структурата, сглобяването и еволюцията на молекулярния механизъм, който е неразделна част от клетката. Установихме, че рибозомата на E. cuniculi нарушава много от широко запазените принципи на сгъване на РНК и сглобяване на рибозоми и открихме нов, неизвестен досега рибозомен протеин. Съвсем неочаквано показваме, че рибозомите на микроспоридиите са еволюирали способността да свързват малки молекули и предполагаме, че съкращенията в рРНК и протеините предизвикват еволюционни иновации, които в крайна сметка могат да придадат полезни качества на рибозомата.
За да подобрим разбирането си за еволюцията на протеините и нуклеиновите киселини във вътреклетъчните организми, решихме да изолираме спори на E. cuniculi от култури от заразени клетки на бозайници, за да пречистим техните рибозоми и да определим структурата на тези рибозоми. Трудно е да се получи голям брой паразитни микроспоридии, тъй като микроспоридии не могат да се култивират в хранителна среда. Вместо това, те растат и се размножават само вътре в клетката гостоприемник. Следователно, за да получим биомаса от E. cuniculi за пречистване на рибозоми, заразихме клетъчната линия RK13 от бъбреци на бозайници със спори на E. cuniculi и култивирахме тези заразени клетки в продължение на няколко седмици, за да позволим на E. cuniculi да расте и да се размножава. Използвайки монослой от заразени клетки с площ около половин квадратен метър, успяхме да пречистим около 300 mg спори на Microsporidia и да ги използваме за изолиране на рибозоми. След това разрушихме пречистените спори със стъклени перли и изолирахме суровите рибозоми, използвайки поетапно фракциониране на лизатите с полиетиленгликол. Това ни позволи да получим приблизително 300 µg сурови рибозоми на E. cuniculi за структурен анализ.
След това събрахме крио-ЕМ изображения, използвайки получените рибозомни проби, и обработихме тези изображения, използвайки маски, съответстващи на голямата рибозомна субединица, главата на малката субединица и малката субединица. По време на този процес събрахме изображения на около 108 000 рибозомни частици и изчислихме крио-ЕМ изображения с резолюция 2,7 Å (допълнителни фигури 1-3). След това използвахме крио-ЕМ изображения, за да моделираме рРНК, рибозомния протеин и хибернационния фактор Mdf1, свързани с рибозомите на E. cuniculi (фиг. 1a, b).
a Структура на рибозомата на E. cuniculi в комплекс с хибернационния фактор Mdf1 (pdb id 7QEP). b Карта на хибернационния фактор Mdf1, свързан с рибозомата на E. cuniculi. c Карта на вторичната структура, сравняваща възстановената рРНК в микроспоридийски видове с известни рибозомни структури. Панелите показват местоположението на амплифицираните рРНК фрагменти (ES) и активните места на рибозомата, включително декодиращия сайт (DC), саркинициновата бримка (SRL) и пептидилтрансферазния център (PTC). d Електронната плътност, съответстваща на пептидилтрансферазния център на рибозомата на E. cuniculi, предполага, че този каталитичен сайт има същата структура в паразита E. cuniculi и неговите гостоприемници, включително H. sapiens. e, f Съответната електронна плътност на декодиращия център (e) и схематичната структура на декодиращия център (f) показват, че E. cuniculi има остатъци U1491 вместо A1491 (номериране на E. coli) в много други еукариоти. Тази промяна предполага, че E. cuniculi може да е чувствителен към антибиотици, насочени към този активен център.
За разлика от установените по-рано структури на рибозомите на V. necatrix и P. locustae (и двете структури представляват едно и също семейство микроспоридии Nosematidae и са много сходни помежду си), 31,32 рибозомите на E. cuniculi претърпяват множество процеси на фрагментация на рРНК и протеини. По-нататъшна денатурация (допълнителни фигури 4-6). В рРНК най-поразителните промени включват пълна загуба на амплифицирания 25S рРНК фрагмент ES12L и частична дегенерация на спиралите h39, h41 и H18 (фиг. 1в, допълнителна фигура 4). Сред рибозомните протеини най-поразителните промени включват пълна загуба на протеина eS30 и скъсяване на протеините eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 и eS7 (допълнителни фигури 4, 5).
По този начин, екстремното намаляване на геномите на видовете Encephalotozoon/Ordospora се отразява в структурата на тяхната рибозома: рибозомите на E. cuniculi претърпяват най-драматичната загуба на протеиново съдържание в еукариотните цитоплазмени рибозоми, подлежащи на структурна характеристика, и те дори нямат онези рРНК и протеинови фрагменти, които са широко запазени не само в еукариотите, но и в трите области на живота. Структурата на рибозомата на E. cuniculi предоставя първия молекулярен модел за тези промени и разкрива еволюционни събития, които са били пренебрегвани както от сравнителната геномика, така и от изследванията на вътреклетъчната биомолекулна структура (Допълнителна фигура 7). По-долу описваме всяко от тези събития, заедно с вероятния им еволюционен произход и потенциалното им въздействие върху функцията на рибозомата.
След това открихме, че освен големи рРНК скъсявания, рибозомите на E. cuniculi имат рРНК вариации в един от активните си центрове. Въпреки че пептидилтрансферазният център на рибозомата на E. cuniculi има същата структура като другите еукариотни рибозоми (фиг. 1d), декодиращият център се различава поради вариация в последователността при нуклеотид 1491 (номериране на E. coli, фиг. 1e, f). Това наблюдение е важно, защото декодиращият център на еукариотните рибозоми обикновено съдържа остатъци G1408 и A1491 в сравнение с остатъци от бактериален тип A1408 и G1491. Тази вариация е в основата на различната чувствителност на бактериалните и еукариотните рибозоми към семейството аминогликозиди на рибозомните антибиотици и други малки молекули, които са насочени към декодиращия център. В декодиращия център на рибозомата на E. cuniculi, остатъкът A1491 е заменен с U1491, което потенциално създава уникален свързващ интерфейс за малки молекули, насочени към този активен център. Същият вариант A14901 присъства и в други микроспоридии, като P. locustae и V. necatrix, което предполага, че е широко разпространен сред видовете микроспоридии (фиг. 1f).
Тъй като нашите проби от рибозоми на E. cuniculi бяха изолирани от метаболитно неактивни спори, тествахме крио-ЕМ картата на E. cuniculi за описано по-рано свързване на рибозоми при условия на стрес или гладуване. Фактори на хибернация 31, 32, 36, 37, 38. Съпоставихме предварително установената структура на хиберниращата рибозома с крио-ЕМ картата на рибозомата на E. cuniculi. За докинг бяха използвани рибозоми на S. cerevisiae в комплекс с фактор на хибернация Stm138, рибозоми на скакалци в комплекс с фактор Lso232 и рибозоми на V. necatrix в комплекс с фактори Mdf1 и Mdf231. В същото време открихме крио-ЕМ плътността, съответстваща на фактора на покой Mdf1. Подобно на свързването на Mdf1 с рибозомата на V. necatrix, Mdf1 се свързва и с рибозомата на E. cuniculi, където блокира Е-мястото на рибозомата, което вероятно помага да се осигурят рибозомите, когато спорите на паразита станат метаболитно неактивни при инактивиране на тялото (Фигура 2).
Mdf1 блокира E-мястото на рибозомата, което изглежда помага за инактивирането на рибозомата, когато спорите на паразита станат метаболитно неактивни. В структурата на рибозомата на E. cuniculi открихме, че Mdf1 образува неизвестен досега контакт със стъблото на рибозомата L1, частта от рибозомата, която улеснява освобождаването на деацилирана тРНК от рибозомата по време на протеиновия синтез. Тези контакти предполагат, че Mdf1 се дисоциира от рибозомата, използвайки същия механизъм като деацетилираната тРНК, което предоставя възможно обяснение за това как рибозомата премахва Mdf1, за да реактивира протеиновия синтез.
Нашата структура обаче разкри неизвестен контакт между Mdf1 и рибозомния крак L1 (частта от рибозомата, която помага за освобождаването на деацилирана тРНК от рибозомата по време на протеиновия синтез). По-специално, Mdf1 използва същите контакти като лакътния сегмент на деацилираната тРНК молекула (фиг. 2). Това неизвестно досега молекулярно моделиране показа, че Mdf1 се дисоциира от рибозомата, използвайки същия механизъм като деацетилираната тРНК, което обяснява как рибозомата премахва този фактор на хибернация, за да реактивира протеиновия синтез.
При конструирането на рРНК модела открихме, че рибозомата на E. cuniculi има анормално сгънати рРНК фрагменти, които нарекохме слята рРНК (фиг. 3). В рибозомите, които обхващат трите области на живота, рРНК се сгъва в структури, в които повечето рРНК бази или се сдвояват и сгъват помежду си, или взаимодействат с рибозомни протеини38,39,40. Въпреки това, в рибозомите на E. cuniculi, рРНК изглежда нарушават този принцип на сгъване, като превръщат някои от своите спирали в разгънати рРНК региони.
Структура на H18 25S рРНК спиралата в S. cerevisiae, V. necatrix и E. cuniculi. Обикновено в рибозомите, обхващащи трите жизнени домена, този линкер се навива в РНК спирала, която съдържа от 24 до 34 остатъка. За разлика от това, при микроспоридиите този рРНК линкер постепенно се редуцира до два едноверижни, богати на уридин, линкера, съдържащи само 12 остатъка. Повечето от тези остатъци са изложени на разтворители. Фигурата показва, че паразитните микроспоридии изглежда нарушават общите принципи на сгъване на рРНК, където рРНК базите обикновено са свързани с други бази или участват във взаимодействията рРНК-протеин. В микроспоридиите някои рРНК фрагменти приемат неблагоприятно сгъване, при което бившата рРНК спирала се превръща в едноверижен фрагмент, удължен почти по права линия. Наличието на тези необичайни региони позволява на рРНК на микроспоридиите да се свързва с отдалечени рРНК фрагменти, използвайки минимален брой РНК бази.
Най-поразителният пример за този еволюционен преход може да се наблюдава в H18 25S рРНК спиралата (фиг. 3). При видове от E. coli до хора, базите на тази рРНК спирала съдържат 24-32 нуклеотида, образувайки леко неправилна спирала. В предварително идентифицирани рибозомни структури от V. necatrix и P. locustae,31,32 базите на H18 спиралата са частично развити, но сдвояването на нуклеотидните бази е запазено. Въпреки това, в E. cuniculi този рРНК фрагмент се превръща в най-късите линкери 228UUUGU232 и 301UUUUUUUUUU307. За разлика от типичните рРНК фрагменти, тези богати на уридин линкери не се навиват и не осъществяват обширен контакт с рибозомните протеини. Вместо това, те приемат отворени за разтворител и напълно разгънати структури, в които рРНК веригите са удължени почти право. Тази разтегната конформация обяснява как E. cuniculi използва само 12 РНК бази, за да запълни празнината от 33 Å между спиралите на рРНК H16 и H18, докато други видове се нуждаят от поне два пъти повече рРНК бази, за да запълнят празнината.
По този начин можем да демонстрираме, че чрез енергийно неблагоприятно сгъване, паразитните микроспоридии са разработили стратегия за свиване дори на онези рРНК сегменти, които остават широко запазени между видовете в трите области на живота. Очевидно, чрез натрупване на мутации, които трансформират рРНК спиралите в къси поли-U линкери, E. cuniculi може да образува необичайни рРНК фрагменти, съдържащи възможно най-малко нуклеотиди за лигиране на дистални рРНК фрагменти. Това помага да се обясни как микроспоридиите са постигнали драматично намаляване на основната си молекулярна структура, без да губят своята структурна и функционална цялост.
Друга необичайна характеристика на рРНК на E. cuniculi е появата на рРНК без удебелявания (фиг. 4). Издатините са нуклеотиди без базови двойки, които се извиват извън РНК спиралата, вместо да се крият в нея. Повечето рРНК издатини действат като молекулярни адхезиви, помагайки за свързването на съседни рибозомни протеини или други рРНК фрагменти. Някои от издатините действат като панти, позволявайки на рРНК спиралата да се огъва и сгъва оптимално за продуктивен протеинов синтез 41.
a В структурата на рибозомата на E. cuniculi липсва рРНК издатина (номериране на S. cerevisiae), но присъства в повечето други еукариоти b Вътрешни рибозоми на E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens и E. cuniculi. Паразитите нямат много от древните, силно запазени рРНК издатини. Тези удебелявания стабилизират структурата на рибозомата; следователно, тяхното отсъствие в микроспоридиите показва намалена стабилност на сгъване на рРНК при микроспоридиите. Сравнението с P стъблата (L7/L12 стъбла при бактериите) показва, че загубата на рРНК издатини понякога съвпада с появата на нови издатини до загубените издатини. H42 спиралата в 23S/28S рРНК има древна издатина (U1206 в Saccharomyces cerevisiae), чиято възраст се оценява на поне 3,5 милиарда години, поради защитата ѝ в три области на живота. При микроспоридиите тази издатина е елиминирана. Въпреки това, до изгубената издатина се появи нова издатина (A1306 в E. cuniculi).
Поразително е, че открихме, че рибозомите на E. cuniculi нямат повечето от рРНК издутините, открити в други видове, включително повече от 30 издутини, запазени в други еукариоти (фиг. 4а). Тази загуба елиминира много контакти между рибозомните субединици и съседните рРНК спирали, понякога създавайки големи кухини в рибозомата, което прави рибозомата на E. cuniculi по-пореста в сравнение с по-традиционните рибозоми (фиг. 4б). Забележително е, че открихме, че повечето от тези издутини са загубени и в предварително идентифицираните рибозомни структури на V. necatrix и P. locustae, които са били пренебрегнати от предишни структурни анализи31,32.
Понякога загубата на рРНК издатини е съпроводена с развитието на нови издатини до загубената издатина. Например, рибозомният P-ствол съдържа издатина U1208 (в Saccharomyces cerevisiae), която е оцеляла от E. coli до хората и следователно се оценява на 3,5 милиарда години. По време на протеиновия синтез, тази издатина помага на P-стъблото да се движи между отворени и затворени конформации, така че рибозомата да може да набира транслационни фактори и да ги доставя до активния център. В рибозомите на E. cuniculi това удебеляване липсва; ново удебеляване (G883), разположено само в три базови двойки, обаче може да допринесе за възстановяването на оптималната гъвкавост на P-стъблото (фиг. 4в).
Нашите данни за рРНК без издатини показват, че минимизирането на рРНК не се ограничава до загубата на рРНК елементи на повърхността на рибозомата, но може да включва и ядрото на рибозомата, създавайки специфичен за паразита молекулярен дефект, който не е описан в свободноживеещи клетки. Наблюдават се и други живи видове.
След моделиране на канонични рибозомни протеини и рРНК, открихме, че конвенционалните рибозомни компоненти не могат да обяснят трите части на крио-ЕМ изображението. Два от тези фрагменти са малки молекули по размер (фиг. 5, допълнителна фигура 8). Първият сегмент е разположен между рибозомните протеини uL15 и eL18 в позиция, обикновено заета от C-края на eL18, който е скъсен при E. cuniculi. Въпреки че не можем да определим идентичността на тази молекула, размерът и формата на този остров на плътност се обясняват добре с наличието на спермидинови молекули. Свързването му с рибозомата се стабилизира от специфични за микроспоридията мутации в протеините uL15 (Asp51 и Arg56), които изглежда увеличават афинитета на рибозомата към тази малка молекула, тъй като позволяват на uL15 да обвие малката молекула в рибозомна структура. Допълнителна фигура 2). 8, допълнителни данни 1, 2).
Крио-ЕМ изображения, показващи наличието на нуклеотиди извън рибозата, свързана с рибозомата на E. cuniculi. В рибозомата на E. cuniculi този нуклеотид заема същото място като 25S rRNA A3186 нуклеотида (номериране на Saccharomyces cerevisiae) в повечето други еукариотни рибозоми. b В рибозомната структура на E. cuniculi този нуклеотид е разположен между рибозомните протеини uL9 и eL20, като по този начин стабилизира контакта между двата протеина. cd Анализ на консервативността на последователността на eL20 сред видовете микроспоридии. Филогенетичното дърво на видовете микроспоридии (c) и множественото подравняване на последователностите на протеина eL20 (d) показват, че нуклеотидно-свързващите остатъци F170 и K172 са консервирани в повечето типични микроспоридии, с изключение на S. lophii, с изключение на ранно разклоняващите се микроспоридии, които са запазили разширението на ES39L rRNA. e Тази фигура показва, че нуклеотидно-свързващите остатъци F170 и K172 присъстват само в eL20 на силно редуцирания геном на микроспоридията, но не и в други еукариоти. Като цяло, тези данни предполагат, че микроспоридиевите рибозоми са развили място за свързване на нуклеотиди, което изглежда свързва АМФ молекулите и ги използва за стабилизиране на протеин-протеиновите взаимодействия в рибозомната структура. Високата консервативност на това място за свързване в микроспоридията и отсъствието му в други еукариоти предполага, че това място може да осигури селективно предимство за оцеляване на микроспоридията. По този начин, джобът за свързване на нуклеотиди в микроспоридиевата рибозома не изглежда да е дегенеративна характеристика или крайна форма на разграждане на рРНК, както е описано по-рано, а по-скоро полезна еволюционна иновация, която позволява на микроспоридиевата рибозома директно да се свързва с малки молекули, използвайки ги като молекулярни градивни елементи за рибозоми. Това откритие прави микроспоридиевата рибозома единствената известна рибозома, която използва един нуклеотид като свой структурен градивен елемент. f Хипотетичен еволюционен път, произлизащ от свързването на нуклеотиди.
Втората нискомолекулна плътност е разположена на границата между рибозомните протеини uL9 и eL30 (фиг. 5а). Този интерфейс е описан по-рано в структурата на рибозомата Saccharomyces cerevisiae като място за свързване на 25S нуклеотида на rRNA A3186 (част от разширението на ES39L rRNA)38. Беше показано, че в дегенерираните ES39L рибозоми на P. locustae, този интерфейс се свързва с неизвестен единичен нуклеотид 31 и се приема, че този нуклеотид е редуцирана крайна форма на rRNA, в която дължината на rRNA е ~130-230 бази. ES39L е редуциран до единичен нуклеотид 32.43. Нашите крио-ЕМ изображения подкрепят идеята, че плътността може да се обясни с нуклеотиди. По-високата резолюция на нашата структура обаче показа, че този нуклеотид е екстрарибозомна молекула, вероятно AMP (фиг. 5а, b).
След това попитахме дали мястото на свързване на нуклеотидите се появява в рибозомата на E. cuniculi или е съществувало преди това. Тъй като свързването на нуклеотидите се осъществява главно от остатъците Phe170 и Lys172 в рибозомния протеин eL30, ние оценихме консервацията на тези остатъци в 4396 представителни еукариоти. Както в случая с uL15 по-горе, открихме, че остатъците Phe170 и Lys172 са силно консервирани само в типичните микроспоридии, но липсват в други еукариоти, включително атипичните микроспоридии Mitosporidium и Amphiamblys, в които ES39L rRNA фрагментът не е редуциран 44, 45, 46 (фиг. 5в).-д).
Взети заедно, тези данни подкрепят идеята, че E. cuniculi и евентуално други канонични микроспоридии са еволюирали способността ефективно да улавят голям брой малки метаболити в структурата на рибозомата, за да компенсират спада в нивата на рРНК и протеини. По този начин те са развили уникална способност да свързват нуклеотиди извън рибозомата, което показва, че паразитните молекулярни структури компенсират чрез улавяне на изобилни малки метаболити и използването им като структурни имитации на разградени РНК и протеинови фрагменти.
Третата несимулирана част от нашата крио-ЕМ карта, открита в голямата рибозомна субединица. Сравнително високата резолюция (2,6 Å) на нашата карта предполага, че тази плътност принадлежи на протеини с уникални комбинации от големи остатъци от странични вериги, което ни позволи да идентифицираме тази плътност като неизвестен досега рибозомен протеин, който идентифицирахме като... Той беше наречен msL2 (Microsporidia-specific protein L2) (методи, фигура 6). Нашето търсене на хомология показа, че msL2 е консервиран в клада Microsporidia от рода Encephaliter и Orosporidium, но липсва в други видове, включително други Microsporidia. В рибозомната структура msL2 заема празнина, образувана от загубата на разширената ES31L рРНК. В тази празнина msL2 помага за стабилизиране на сгъването на рРНК и може да компенсира загубата на ES31L (Фигура 6).
a Електронна плътност и модел на специфичния за микроспоридии рибозомен протеин msL2, открит в рибозомите на E. cuniculi. b Повечето еукариотни рибозоми, включително 80S рибозомата на Saccharomyces cerevisiae, имат загубена амплификация на ES19L рРНК при повечето видове микроспоридии. Установената по-рано структура на рибозомата на V. necatrix микроспоридии предполага, че загубата на ES19L при тези паразити се компенсира от еволюцията на новия рибозомен протеин msL1. В това проучване открихме, че рибозомата на E. cuniculi също е развила допълнителен рибозомен РНК мимикиран протеин като очевидна компенсация за загубата на ES19L. msL2 (понастоящем анотиран като хипотетичния протеин ECU06_1135) и msL1 обаче имат различен структурен и еволюционен произход. Това откритие за генерирането на еволюционно несвързани рибозомни протеини msL1 и msL2 предполага, че ако рибозомите натрупат вредни мутации в своята рРНК, те могат да постигнат безпрецедентни нива на композиционно разнообразие дори в малка подгрупа от тясно свързани видове. Това откритие би могло да помогне за изясняване на произхода и еволюцията на митохондриалната рибозома, която е известна със силно редуцираната си рРНК и анормална вариабилност в протеиновия състав между видовете.
След това сравнихме протеина msL2 с описания по-рано протеин msL1, единственият известен специфичен за микроспоридии рибозомен протеин, открит в рибозомата на V. necatrix. Искахме да проверим дали msL1 и msL2 са еволюционно свързани. Нашият анализ показа, че msL1 и msL2 заемат една и съща кухина в рибозомната структура, но имат различни първични и третични структури, което показва техния независим еволюционен произход (фиг. 6). По този начин, нашето откритие на msL2 предоставя доказателства, че групи от компактни еукариотни видове могат независимо да еволюират структурно различни рибозомни протеини, за да компенсират загубата на рРНК фрагменти. Това откритие е забележително с това, че повечето цитоплазмени еукариотни рибозоми съдържат инвариантен протеин, включително същото семейство от 81 рибозомни протеина. Появата на msL1 и msL2 в различни кладове микроспоридии в отговор на загубата на удължени рРНК сегменти предполага, че разграждането на молекулярната архитектура на паразита кара паразитите да търсят компенсаторни мутации, което в крайна сметка може да доведе до придобиването им в различни паразитни популации.
Накрая, когато нашият модел беше завършен, сравнихме състава на рибозомата на E. cuniculi с този, предсказан от геномната последователност. Няколко рибозомни протеина, включително eL14, eL38, eL41 и eS30, преди се смяташе, че липсват в генома на E. cuniculi поради очевидното отсъствие на техните хомолози от генома на E. cuniculi. Загуба на много рибозомни протеини се предвижда и при повечето други силно редуцирани вътреклетъчни паразити и ендосимбионти. Например, въпреки че повечето свободноживеещи бактерии съдържат едно и също семейство от 54 рибозомни протеина, само 11 от тези протеинови семейства имат откриваеми хомолози във всеки анализиран геном на бактерии, ограничени от гостоприемника. В подкрепа на това схващане, експериментално е наблюдавана загуба на рибозомни протеини при микроспоридиите на V. necatrix и P. locustae, на които липсват протеините eL38 и eL4131,32.
Нашите структури обаче показват, че само eL38, eL41 и eS30 всъщност са загубени в рибозомата на E. cuniculi. Протеинът eL14 е запазен и нашата структура показва защо този протеин не може да бъде намерен при търсенето на хомология (фиг. 7). В рибозомите на E. cuniculi по-голямата част от мястото на свързване на eL14 е загубено поради разграждане на амплифицирания с rRNA ES39L. При липса на ES39L, eL14 губи по-голямата част от вторичната си структура и само 18% от последователността на eL14 е идентична в E. cuniculi и S. cerevisiae. Това лошо запазване на последователността е забележително, защото дори Saccharomyces cerevisiae и Homo sapiens – организми, еволюирали с разлика от 1,5 милиарда години – споделят повече от 51% от едни и същи остатъци в eL14. Тази аномална загуба на консервация обяснява защо E. cuniculi eL14 в момента е анотиран като предполагаемия протеин M970_061160, а не като рибозомния протеин eL1427.
и Рибозомата на Microsporidia губи ES39L rRNA удължението, което частично елиминира мястото на свързване на рибозомния протеин eL14. При липса на ES39L, микроспорният протеин eL14 претърпява загуба на вторична структура, при която предишната rRNA-свързваща α-спирала дегенерира в бримка с минимална дължина. b Множественото подравняване на последователности показва, че протеинът eL14 е силно консервиран в еукариотните видове (57% идентичност на последователността между дрождеви и човешки хомолози), но слабо консервиран и дивергентен в микроспоридиите (в които не повече от 24% от остатъците са идентични с eL14 хомолога). от S. cerevisiae или H. sapiens). Тази лоша консервация на последователността и вариабилност на вторичната структура обясняват защо eL14 хомологът никога не е бил открит в E. cuniculi и защо се смята, че този протеин е загубен в E. cuniculi. За разлика от това, eL14 на E. cuniculi е бил предварително анотиран като предполагаем протеин M970_061160. Това наблюдение предполага, че геномното разнообразие на микроспоридиите в момента е надценено: някои гени, за които понастоящем се смята, че са загубени в микроспоридиите, всъщност са запазени, макар и в силно диференцирани форми; вместо това се смята, че някои кодират гени на микроспоридиите за специфични за червеите протеини (напр. хипотетичният протеин M970_061160 всъщност кодира много разнообразните протеини, открити в други еукариоти).
Това откритие предполага, че денатурацията на рРНК може да доведе до драматична загуба на консервативност на последователността в съседни рибозомни протеини, което прави тези протеини неоткриваеми за хомологични търсения. По този начин е възможно да надценяваме действителната степен на молекулярно разграждане в организми с малък геном, тъй като някои протеини, за които се смята, че са загубени, всъщност се запазват, макар и в силно променени форми.
Как могат паразитите да запазят функцията на своите молекулярни машини при условия на екстремно намаляване на генома? Нашето изследване отговаря на този въпрос, като описва сложната молекулярна структура (рибозома) на E. cuniculi, организъм с един от най-малките еукариотни геноми.
От почти две десетилетия е известно, че протеиновите и РНК молекулите в микробните паразити често се различават от техните хомоложни молекули в свободноживеещите видове, защото им липсват центрове за контрол на качеството, намалени са до 50% от размера си в свободноживеещите микроби и др., много инвалидизиращи мутации, които нарушават сгъването и функцията. Например, се очаква рибозомите на организмите с малък геном, включително много вътреклетъчни паразити и ендосимбионти, да нямат няколко рибозомни протеина и до една трета от рРНК нуклеотидите в сравнение със свободноживеещите видове 27, 29, 30, 49. Начинът, по който тези молекули функционират в паразитите, обаче остава до голяма степен загадка, изучавана главно чрез сравнителна геномика.
Нашето проучване показва, че структурата на макромолекулите може да разкрие много аспекти на еволюцията, които са трудни за извличане от традиционните сравнителни геномни изследвания на вътреклетъчни паразити и други организми, ограничени от гостоприемника (Допълнителна фигура 7). Например, примерът с протеина eL14 показва, че можем да надценим действителната степен на разграждане на молекулярния апарат при паразитните видове. Смята се, че енцефалитните паразити имат стотици специфични за микроспоридии гени. Нашите резултати обаче показват, че някои от тези привидно специфични гени всъщност са просто много различни варианти на гени, които са често срещани при други еукариоти. Освен това, примерът с протеина msL2 показва как пренебрегваме нови рибозомни протеини и подценяваме съдържанието на паразитни молекулярни машини. Примерът с малки молекули показва как можем да пренебрегнем най-гениалните иновации в паразитните молекулярни структури, които могат да им придадат нова биологична активност.
Взети заедно, тези резултати подобряват разбирането ни за разликите между молекулярните структури на организмите с ограничен приемник и техните аналози в свободно живеещите организми. Показваме, че молекулярните машини, за които дълго време се смяташе, че са редуцирани, дегенериращи и подложени на различни инвалидизиращи мутации, вместо това имат набор от систематично пренебрегвани необичайни структурни характеристики.
От друга страна, не-обемистите рРНК фрагменти и слетите фрагменти, които открихме в рибозомите на E. cuniculi, предполагат, че редукцията на генома може да промени дори онези части от основния молекулярен механизъм, които са запазени в трите области на живота – след почти 3,5 милиарда години независима еволюция на видовете.
Свободните от издутини и слети рРНК фрагменти в рибозомите на E. cuniculi са от особен интерес в светлината на предишни изследвания на РНК молекули в ендосимбиотични бактерии. Например, при ендосимбионта на листната въшка Buchnera aphidicola е доказано, че рРНК и тРНК молекулите имат температурно-чувствителни структури поради отклонение в състава A+T и висок дял на неканонични базови двойки20,50. Смята се, че тези промени в РНК, както и промените в протеиновите молекули, са отговорни за свръхзависимостта на ендосимбионтите от партньорите и неспособността на ендосимбионтите да пренасят топлина21,23. Въпреки че рРНК на паразитните микроспоридии има структурно различни промени, естеството на тези промени предполага, че намалената термична стабилност и по-високата зависимост от шаперонови протеини може да са общи характеристики на РНК молекулите в организми с редуцирани геноми.
От друга страна, нашите структури показват, че паразитните микроспоридии са еволюирали уникална способност да се съпротивляват на широко консервирани рРНК и протеинови фрагменти, развивайки способността да използват изобилни и леснодостъпни малки метаболити като структурни имитации на дегенерирани рРНК и протеинови фрагменти. Деградация на молекулярната структура. . Това мнение се подкрепя от факта, че малките молекули, които компенсират загубата на протеинови фрагменти в рРНК и рибозомите на E. cuniculi, се свързват със специфични за микроспоридията остатъци в протеините uL15 и eL30. Това предполага, че свързването на малки молекули с рибозомите може да е продукт на положителна селекция, при която специфични за микроспоридията мутации в рибозомните протеини са били селектирани поради способността им да увеличават афинитета на рибозомите към малки молекули, което може да доведе до по-ефективни рибозомни организми. Откритието разкрива интелигентна иновация в молекулярната структура на микробните паразити и ни дава по-добро разбиране за това как паразитните молекулярни структури поддържат функцията си въпреки редуктивната еволюция.
В момента идентифицирането на тези малки молекули остава неясно. Не е ясно защо появата на тези малки молекули в рибозомната структура се различава между видовете микроспоридии. По-специално, не е ясно защо се наблюдава свързване на нуклеотиди в рибозомите на E. cuniculi и P. locustae, а не в рибозомите на V. necatrix, въпреки наличието на остатъка F170 в протеините eL20 и K172 на V. necatrix. Тази делеция може да бъде причинена от остатък 43 uL6 (разположен в съседство с джоба за свързване на нуклеотиди), който е тирозин във V. necatrix, а не треонин в E. cuniculi и P. locustae. Обемистата ароматна странична верига на Tyr43 може да повлияе на свързването на нуклеотиди поради стерично припокриване. Алтернативно, видимата делеция на нуклеотиди може да се дължи на ниската резолюция на крио-ЕМ изображенията, което възпрепятства моделирането на рибозомните фрагменти на V. necatrix.
От друга страна, нашата работа предполага, че процесът на разпад на генома може да бъде изобретателна сила. По-специално, структурата на рибозомата на E. cuniculi предполага, че загубата на рРНК и протеинови фрагменти в микроспоридийната рибозома създава еволюционен натиск, който насърчава промени в структурата на рибозомата. Тези варианти се срещат далеч от активния център на рибозомата и изглежда помагат за поддържането (или възстановяването) на оптималния рибозомен състав, който иначе би бил нарушен от редуцираната рРНК. Това предполага, че основна иновация на микроспоридийната рибозома изглежда се е развила в необходимостта от буфериране на генния дрейф.
Може би това е най-добре илюстрирано от свързването на нуклеотиди, което досега не е наблюдавано при други организми. Фактът, че остатъци, свързващи нуклеотиди, присъстват в типичните микроспоридии, но не и в други еукариоти, предполага, че местата за свързване на нуклеотиди не са просто реликви, чакащи да изчезнат, или крайното място за възстановяване на рРНК под формата на отделни нуклеотиди. Вместо това, това място изглежда като полезна характеристика, която би могла да еволюира в продължение на няколко кръга на положителна селекция. Местата за свързване на нуклеотиди може да са страничен продукт на естествения подбор: след като ES39L се разгради, микроспоридиите са принудени да търсят компенсация, за да възстановят оптималната биогенеза на рибозомите при липса на ES39L. Тъй като този нуклеотид може да имитира молекулярните контакти на нуклеотида A3186 в ES39L, нуклеотидната молекула се превръща в градивен елемент на рибозомата, чието свързване се подобрява допълнително чрез мутация на последователността eL30.
По отношение на молекулярната еволюция на вътреклетъчните паразити, нашето проучване показва, че силите на дарвиновия естествен подбор и генетичния дрейф на разпадането на генома не действат паралелно, а осцилират. Първо, генетичният дрейф елиминира важни характеристики на биомолекулите, което прави компенсацията крайно необходима. Само когато паразитите задоволят тази нужда чрез дарвинов естествен подбор, техните макромолекули ще имат шанс да развият най-впечатляващите и иновативни черти. Важно е, че еволюцията на местата за свързване на нуклеотиди в рибозомата на E. cuniculi предполага, че този модел на молекулярна еволюция „загуба-печалба“ не само амортизира вредните мутации, но понякога придава изцяло нови функции на паразитните макромолекули.
Тази идея е в съответствие с теорията за подвижното равновесие на Сюъл Райт, която гласи, че строгата система на естествен подбор ограничава способността на организмите да внедряват иновации51,52,53. Ако обаче генетичният дрейф наруши естествения подбор, тези дрейфове могат да доведат до промени, които сами по себе си не са адаптивни (или дори вредни), но водят до допълнителни промени, които осигуряват по-висока пригодност или нова биологична активност. Нашата рамка подкрепя тази идея, като илюстрира, че същият тип мутация, която намалява гънката и функцията на биомолекулата, изглежда е основният спусък за нейното подобрение. В съответствие с еволюционния модел, от който всички печелят, нашето проучване показва, че разпадът на генома, традиционно разглеждан като дегенеративен процес, също е основен двигател на иновациите, понякога и може би дори често позволява на макромолекулите да придобият нови паразитни дейности. Те могат да ги използват.