Vă mulțumim că ați vizitat Nature.com. Versiunea browserului pe care o utilizați are suport limitat pentru CSS. Pentru o experiență optimă, vă recomandăm să utilizați un browser actualizat (sau să dezactivați Modul de compatibilitate în Internet Explorer). Între timp, pentru a asigura asistență continuă, vom reda site-ul fără stiluri și JavaScript.
Evoluția paraziților microbieni implică o contracarare între selecția naturală, care determină paraziții să se îmbunătățească, și driftul genetic, care determină paraziții să piardă gene și să acumuleze mutații dăunătoare. Aici, pentru a înțelege cum se produce această contracarare la scara unei singure macromolecule, descriem structura crio-EM a ribozomului de Encephalitozoon cuniculi, un organism eucariot cu unul dintre cele mai mici genomuri din natură. Reducerea extremă a ARNr în ribozomii de E. cuniculi este însoțită de modificări structurale fără precedent, cum ar fi evoluția linkerilor ARNr condensați necunoscuți anterior și a ARNr fără protuberanțe. În plus, ribozomul de E. cuniculi a supraviețuit pierderii fragmentelor și proteinelor ARNr dezvoltând capacitatea de a utiliza molecule mici ca imitații structurale ale fragmentelor și proteinelor ARNr degradate. Per total, arătăm că structurile moleculare considerate de mult timp a fi reduse, degenerate și supuse mutațiilor debilitante au o serie de mecanisme compensatorii care le mențin active în ciuda contracțiilor moleculare extreme.
Deoarece majoritatea grupurilor de paraziți microbieni au instrumente moleculare unice pentru a-și exploata gazdele, adesea trebuie să dezvoltăm terapii diferite pentru diferite grupe de paraziți1,2. Cu toate acestea, noi dovezi sugerează că unele aspecte ale evoluției paraziților sunt convergente și în mare măsură previzibile, indicând o bază potențială pentru intervenții terapeutice ample împotriva paraziților microbieni3,4,5,6,7,8,9.
Studii anterioare au identificat o tendință evolutivă comună la paraziții microbieni numită reducerea genomului sau degradarea genomului10,11,12,13. Cercetările actuale arată că, atunci când microorganismele renunță la stilul lor de viață liber și devin paraziți intracelulari (sau endosimbioți), genomurile lor suferă metamorfoze lente, dar uimitoare, de-a lungul a milioane de ani9,11. Într-un proces cunoscut sub numele de degradare a genomului, paraziții microbieni acumulează mutații dăunătoare care transformă multe gene anterior importante în pseudogene, ducând la pierderea treptată a genelor și la colapsul mutațional14,15. Acest colaps poate distruge până la 95% din genele celor mai vechi organisme intracelulare, comparativ cu speciile strâns înrudite, cu viață liberă. Astfel, evoluția paraziților intracelulari este un conflict între două forțe opuse: selecția naturală darwiniană, care duce la îmbunătățirea paraziților, și colapsul genomului, care aruncă paraziții în uitare. Modul în care parazitul a reușit să iasă din acest conflict și să-și păstreze activitatea structurii sale moleculare rămâne neclar.
Deși mecanismul decăderii genomului nu este pe deplin înțeles, se pare că se produce în principal din cauza derivei genetice frecvente. Deoarece paraziții trăiesc în populații mici, asexuate și limitate genetic, aceștia nu pot elimina eficient mutațiile dăunătoare care apar uneori în timpul replicării ADN-ului. Acest lucru duce la acumularea ireversibilă de mutații dăunătoare și la reducerea genomului parazitului. Drept urmare, parazitul nu numai că pierde gene care nu mai sunt necesare pentru supraviețuirea sa în mediul intracelular. Incapacitatea populațiilor de paraziți de a elimina eficient mutațiile dăunătoare sporadice este cea care determină acumularea acestor mutații în întregul genom, inclusiv în cele mai importante gene ale acestora.
O mare parte din înțelegerea noastră actuală a reducerii genomului se bazează exclusiv pe comparații ale secvențelor genomului, acordând mai puțină atenție modificărilor moleculelor reale care îndeplinesc funcții de întreținere și servesc drept potențiale ținte medicamentoase. Studiile comparative au arătat că povara mutațiilor microbiene intracelulare dăunătoare pare să predispună proteinele și acizii nucleici la pliere greșită și agregare, făcându-le mai dependenți de chaperone și hipersensibili la căldură19,20,21,22,23. În plus, diverși paraziți - cu evoluție independentă uneori separată de până la 2,5 miliarde de ani - au experimentat o pierdere similară a centrelor de control al calității în sinteza proteinelor5,6 și mecanismele de reparare a ADN-ului24. Cu toate acestea, se cunosc puține lucruri despre impactul stilului de viață intracelular asupra tuturor celorlalte proprietăți ale macromoleculelor celulare, inclusiv adaptarea moleculară la o povară tot mai mare de mutații dăunătoare.
În această lucrare, pentru a înțelege mai bine evoluția proteinelor și acizilor nucleici ai microorganismelor intracelulare, am determinat structura ribozomilor parazitului intracelular Encephalitozoon cuniculi. E. cuniculi este un organism asemănător unei fungi, aparținând unui grup de microsporidii parazitare care au genomuri eucariote neobișnuit de mici și, prin urmare, sunt utilizate ca organisme model pentru a studia degradarea genomului25,26,27,28,29,30. Recent, structura ribozomilor cryo-EM a fost determinată pentru genomuri moderat reduse de Microsporidii, Paranosema locustae și Vairimorpha necatrix31,32 (genom de ~3,2 Mb). Aceste structuri sugerează că o oarecare pierdere a amplificării ARNr este compensată prin dezvoltarea de noi contacte între proteinele ribozomale vecine sau prin achiziționarea de noi proteine ​​ribozomale msL131,32. Specia Encephalitozoon (genom ~2,5 milioane pb), împreună cu cea mai apropiată rudă a sa, Ordospora, demonstrează gradul suprem de reducere a genomului la eucariote - au mai puțin de 2000 de gene care codifică proteine ​​și este de așteptat ca ribozomii lor nu numai să fie lipsiți de fragmente de expansiune ARNr (fragmente de ARNr care disting ribozomii eucarioți de ribozomii bacterieni), dar să aibă și patru proteine ​​ribozomale din cauza lipsei de omologi în genomul E. cuniculi26,27,28. Prin urmare, am concluzionat că ribozomul E. cuniculi poate dezvălui strategii necunoscute anterior pentru adaptarea moleculară la degradarea genomului.
Structura noastră crio-EM reprezintă cel mai mic ribozom citoplasmatic eucariot caracterizat și oferă o perspectivă asupra modului în care gradul final de reducere a genomului afectează structura, asamblarea și evoluția aparatului molecular care este parte integrantă a celulei. Am descoperit că ribozomul E. cuniculi încalcă multe dintre principiile larg conservate ale plierii ARN-ului și ale asamblării ribozomilor și am descoperit o nouă proteină ribozomală, necunoscută anterior. În mod destul de neașteptat, demonstrăm că ribozomii microsporidiilor au evoluat capacitatea de a lega molecule mici și emitem ipoteza că trunchierile din ARNr și proteine ​​declanșează inovații evolutive care pot conferi în cele din urmă calități utile ribozomului.
Pentru a ne îmbunătăți înțelegerea evoluției proteinelor și acizilor nucleici în organismele intracelulare, am decis să izolăm sporii de E. cuniculi din culturi de celule de mamifere infectate pentru a le purifica ribozomii și a determina structura acestor ribozomi. Este dificil să se obțină un număr mare de microsporidii parazitare deoarece microsporidiile nu pot fi cultivate într-un mediu nutritiv. În schimb, acestea cresc și se reproduc doar în interiorul celulei gazdă. Prin urmare, pentru a obține biomasă de E. cuniculi pentru purificarea ribozomilor, am infectat linia celulară de rinichi de mamifer RK13 cu spori de E. cuniculi și am cultivat aceste celule infectate timp de câteva săptămâni pentru a permite E. cuniculi să crească și să se multiplice. Folosind un monostrat de celule infectate de aproximativ jumătate de metru pătrat, am reușit să purificăm aproximativ 300 mg de spori de Microsporidia și să-i folosim pentru a izola ribozomii. Apoi am dislocat sporii purificați cu bile de sticlă și am izolat ribozomii brute folosind fracționarea treptată a lizatelor cu polietilen glicol. Acest lucru ne-a permis să obținem aproximativ 300 µg de ribozomi E. cuniculi brute pentru analiza structurală.
Apoi am colectat imagini crio-EM folosind probele de ribozomi rezultate și am procesat aceste imagini folosind măști corespunzătoare subunității ribozomale mari, capului subunității mici și subunității mici. În timpul acestui proces, am colectat imagini a aproximativ 108.000 de particule ribozomale și am calculat imagini crio-EM cu o rezoluție de 2,7 Å (Figurile suplimentare 1-3). Am folosit apoi imagini crio-EM pentru a modela ARNr, proteina ribozomală și factorul de hibernare Mdf1 asociat cu ribozomii E. cuniculi (Fig. 1a, b).
a Structura ribozomului E. cuniculi în complex cu factorul de hibernare Mdf1 (pdb id 7QEP). b Harta factorului de hibernare Mdf1 asociat cu ribozomul E. cuniculi. c Harta structurii secundare care compară ARNr recuperat la speciile de microsporidiene cu structurile ribozomale cunoscute. Panourile arată locația fragmentelor de ARNr amplificate (ES) și a situsurilor active ale ribozomilor, inclusiv situsul de decodificare (DC), bucla de sarcinicină (SRL) și centrul peptidil transferazei (PTC). d Densitatea electronică corespunzătoare centrului peptidil transferazei al ribozomului E. cuniculi sugerează că acest situs catalitic are aceeași structură în parazitul E. cuniculi și gazdele sale, inclusiv H. sapiens. e, f Densitatea electronică corespunzătoare a centrului de decodificare (e) și structura schematică a centrului de decodificare (f) indică faptul că E. cuniculi are reziduuri U1491 în loc de A1491 (numerotarea E. coli) la multe alte eucariote. Această modificare sugerează că E. cuniculi ar putea fi sensibilă la antibioticele care vizează acest situs activ.
Spre deosebire de structurile stabilite anterior ale ribozomilor de V. necatrix și P. locustae (ambele structuri reprezintă aceeași familie de microsporidii Nosematidae și sunt foarte asemănătoare între ele),31,32 ribozomii de E. cuniculi trec prin numeroase procese de fragmentare a ARNr și a proteinelor. Denaturare ulterioară (Figurile suplimentare 4-6). În ARNr, cele mai izbitoare modificări au inclus pierderea completă a fragmentului ARNr 25S amplificat ES12L și degenerarea parțială a helicelor h39, h41 și H18 (Fig. 1c, Fig. suplimentară 4). Printre proteinele ribozomale, cele mai izbitoare modificări au inclus pierderea completă a proteinei eS30 și scurtarea proteinelor eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 și eS7 (Figurile suplimentare 4, 5).
Astfel, reducerea extremă a genomurilor speciilor de Encephalotozoon/Ordospora se reflectă în structura ribozomilor lor: ribozomii de E. cuniculi prezintă cea mai dramatică pierdere a conținutului de proteine ​​în ribozomii citoplasmatici eucarioți supuși caracterizării structurale și nici măcar nu au acele fragmente de ARNr și proteine ​​care sunt conservate pe scară largă nu numai în eucariote, ci și în cele trei domenii ale vieții. Structura ribozomului de E. cuniculi oferă primul model molecular pentru aceste schimbări și dezvăluie evenimente evolutive care au fost trecute cu vederea atât de genomica comparativă, cât și de studiile structurii biomoleculare intracelulare (Figura suplimentară 7). Mai jos, descriem fiecare dintre aceste evenimente, împreună cu probabilele lor origini evolutive și impactul lor potențial asupra funcției ribozomilor.
Am descoperit apoi că, pe lângă trunchierile mari de ARNr, ribozomii din E. cuniculi prezintă variații ale ARNr la unul dintre situsurile lor active. Deși centrul peptidil transferazei din ribozomul din E. cuniculi are aceeași structură ca și alți ribozomi eucarioți (Fig. 1d), centrul de decodificare diferă datorită variației secvenței la nucleotidul 1491 (numerotarea E. coli, Fig. 1e, f). Această observație este importantă deoarece situsul de decodificare al ribozomilor eucarioți conține de obicei reziduurile G1408 și A1491 în comparație cu reziduurile de tip bacterian A1408 și G1491. Această variație stă la baza sensibilității diferite a ribozomilor bacterieni și eucarioți la familia aminoglicozidelor de antibiotice ribozomale și la alte molecule mici care vizează situsul de decodificare. La situsul de decodificare al ribozomului din E. cuniculi, reziduul A1491 a fost înlocuit cu U1491, creând potențial o interfață de legare unică pentru moleculele mici care vizează acest situs activ. Aceeași variantă A14901 este prezentă și în alte microsporidii, cum ar fi P. locustae și V. necatrix, ceea ce sugerează că este răspândită printre speciile de microsporidii (Fig. 1f).
Deoarece probele noastre de ribozomi de E. cuniculi au fost izolate din spori inactivi metabolic, am testat harta crio-EM a E. cuniculi pentru legarea ribozomilor descrisă anterior în condiții de stres sau înfometare. Factorii de hibernare 31,32,36,37, 38. Am corelat structura stabilită anterior a ribozomului hibernant cu harta crio-EM a ribozomului de E. cuniculi. Pentru andocare, s-au utilizat ribozomi de S. cerevisiae în complex cu factorul de hibernare Stm138, ribozomi de locust în complex cu factorul Lso232 și ribozomi de V. necatrix în complex cu factorii Mdf1 și Mdf231. În același timp, am găsit densitatea crio-EM corespunzătoare factorului de repaus Mdf1. Similar legării Mdf1 de ribozomul V. necatrix, Mdf1 se leagă și de ribozomul E. cuniculi, unde blochează situsul E al ribozomului, contribuind posibil la disponibilizarea ribozomilor atunci când sporii parazitari devin inactivi metabolic la inactivarea organismului (Figura 2).
Mdf1 blochează situsul E al ribozomului, ceea ce pare să ajute la inactivarea ribozomului atunci când sporii parazitari devin inactivi metabolic. În structura ribozomului E. cuniculi, am descoperit că Mdf1 formează un contact necunoscut anterior cu tulpina ribozomului L1, partea ribozomului care facilitează eliberarea ARNt deacilat din ribozom în timpul sintezei proteinelor. Aceste contacte sugerează că Mdf1 se disociază de ribozom folosind același mecanism ca și ARNt deacetilat, oferind o posibilă explicație pentru modul în care ribozomul elimină Mdf1 pentru a reactiva sinteza proteinelor.
Cu toate acestea, structura noastră a relevat un contact necunoscut între Mdf1 și piciorul ribozomului L1 (partea ribozomului care ajută la eliberarea ARNt deacilat din ribozom în timpul sintezei proteinelor). În special, Mdf1 folosește aceleași contacte ca și segmentul cotului moleculei de ARNt deacilat (Fig. 2). Această modelare moleculară necunoscută anterior a arătat că Mdf1 se disociază de ribozom folosind același mecanism ca și ARNt deacetilat, ceea ce explică modul în care ribozomul elimină acest factor de hibernare pentru a reactiva sinteza proteinelor.
La construirea modelului de ARNr, am descoperit că ribozomul E. cuniculi are fragmente de ARNr pliate anormal, pe care le-am numit ARNr condensat (Fig. 3). În ribozomii care acoperă cele trei domenii ale vieții, ARNr se pliază în structuri în care majoritatea bazelor ARNr fie se împerechează și se pliază între ele, fie interacționează cu proteinele ribozomale38,39,40. Cu toate acestea, în ribozomii E. cuniculi, ARNr par să încalce acest principiu de pliere prin convertirea unora dintre helixurile lor în regiuni ARNr nepliate.
Structura helixului ARNr H18 25S la S. cerevisiae, V. necatrix și E. cuniculi. De obicei, în ribozomii care acoperă cele trei domenii biologice, acest linker se încolăcește într-o helix de ARN care conține 24 până la 34 de reziduuri. În schimb, în ​​Microsporidii, acest linker ARNr este redus treptat la doi linkeri bogați în uridină, monocatenari, care conțin doar 12 reziduuri. Majoritatea acestor reziduuri sunt expuse la solvenți. Figura arată că microsporidiile parazitare par să încalce principiile generale ale plierii ARNr, unde bazele ARNr sunt de obicei cuplate cu alte baze sau implicate în interacțiuni ARNr-proteină. În microsporidii, unele fragmente de ARNr adoptă o pliere nefavorabilă, în care fosta helix de ARNr devine un fragment monocatenar alungit aproape în linie dreaptă. Prezența acestor regiuni neobișnuite permite ARNr-ului microsporidiilor să se lege de fragmente de ARNr distante folosind un număr minim de baze ARN.
Cel mai frapant exemplu al acestei tranziții evolutive poate fi observat în helixul ARNr H18 25S (Fig. 3). La speciile de la E. coli la om, bazele acestui helix ARNr conțin 24-32 de nucleotide, formând un helix ușor neregulat. În structurile ribozomale identificate anterior de la V. necatrix și P. locustae,31,32 bazele helixului H18 sunt parțial neînfășurate, dar împerecherea bazelor nucleotidelor este păstrată. Cu toate acestea, în E. cuniculi, acest fragment de ARNr devine cel mai scurt linker 228UUUGU232 și 301UUUUUUUUUU307. Spre deosebire de fragmentele tipice de ARNr, acești linkeri bogați în uridină nu se înfășoară și nu fac contact extins cu proteinele ribozomale. În schimb, adoptă structuri deschise la solvent și complet neînfășurate, în care lanțurile de ARNr sunt extinse aproape drept. Această conformație alungită explică modul în care E. cuniculi folosește doar 12 baze ARN pentru a umple golul de 33 Å dintre helixurile ARNr H16 și H18, în timp ce alte specii necesită cel puțin de două ori mai multe baze ARNr pentru a umple golul.
Astfel, putem demonstra că, printr-o pliere energetic nefavorabilă, microsporidiile parazitare au dezvoltat o strategie de a contracta chiar și acele segmente de ARNr care rămân larg conservate între specii în cele trei domenii ale vieții. Se pare că, prin acumularea de mutații care transformă helixurile ARNr în linkeri poli-U scurți, E. cuniculi poate forma fragmente neobișnuite de ARNr care conțin cât mai puține nucleotide posibil pentru ligarea fragmentelor distale de ARNr. Acest lucru ajută la explicarea modului în care microsporidiile au realizat o reducere dramatică a structurii lor moleculare de bază fără a-și pierde integritatea structurală și funcțională.
O altă caracteristică neobișnuită a ARNr-ului E. cuniculi este aspectul ARNr-ului fără îngroșări (Fig. 4). Protuberanțele sunt nucleotide fără perechi de baze care se răsucesc în afara helixului ARN-ului în loc să se ascundă în acesta. Majoritatea proeminențelor ARNr acționează ca adezivi moleculari, ajutând la legarea proteinelor ribozomale adiacente sau a altor fragmente de ARNr. Unele dintre protuberanțe acționează ca balamale, permițând helixului ARNr să se flexeze și să se plieze optim pentru o sinteză proteică productivă 41.
a O proeminență ARNr (numerotare S. cerevisiae) lipsește din structura ribozomilor din E. cuniculi, dar este prezentă la majoritatea celorlalte eucariote b Ribozomii interni ai E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens și E. cuniculi. Paraziților le lipsesc multe dintre protuberanțele ARNr antice, extrem de conservate. Aceste îngroșări stabilizează structura ribozomilor; prin urmare, absența lor în microsporidii indică o stabilitate redusă a plierii ARNr la paraziții microsporidii. Comparația cu tulpinile P (tulpinile L7/L12 la bacterii) arată că pierderea protuberanțelor ARNr coincide uneori cu apariția unor noi protuberanțe lângă protuberanțele pierdute. Helixul H42 din ARNr 23S/28S are o protuberanță antică (U1206 în Saccharomyces cerevisiae) estimată a avea cel puțin 3,5 miliarde de ani datorită protecției sale în trei domenii ale vieții. În microsporidii, această protuberanță este eliminată. Totuși, o nouă umflătură a apărut lângă umflătură pierdută (A1306 în E. cuniculi).
Surprinzător, am descoperit că ribozomii de E. cuniculi nu prezintă majoritatea protuberanțelor de ARNr întâlnite la alte specii, inclusiv peste 30 de protuberanțe conservate la alte eucariote (Fig. 4a). Această pierdere elimină multe contacte dintre subunitățile ribozomale și helixurile ARNr adiacente, creând uneori goluri mari în interiorul ribozomului, făcând ribozomul de E. cuniculi mai poros în comparație cu ribozomii mai tradiționali (Fig. 4b). În mod notabil, am constatat că majoritatea acestor protuberanțe s-au pierdut și în structurile ribozomale de V. necatrix și P. locustae identificate anterior, care au fost trecute cu vederea de analizele structurale anterioare31,32.
Uneori, pierderea protuberanțelor ARNr este însoțită de dezvoltarea unor noi protuberanțe lângă protuberanța pierdută. De exemplu, tulpina P ribozomală conține o protuberanță U1208 (la Saccharomyces cerevisiae) care a supraviețuit de la E. coli la om și, prin urmare, se estimează că are o vechime de 3,5 miliarde de ani. În timpul sintezei proteinelor, această protuberanță ajută tulpina P să se miște între conformațiile deschise și închise, astfel încât ribozomul să poată recruta factori de translație și să îi livreze la situsul activ. În ribozomii E. cuniculi, această îngroșare este absentă; cu toate acestea, o nouă îngroșare (G883) localizată doar în trei perechi de baze poate contribui la restabilirea flexibilității optime a tulpinii P (Fig. 4c).
Datele noastre despre ARNr fără protuberanțe sugerează că minimizarea ARNr nu se limitează la pierderea elementelor ARNr de pe suprafața ribozomului, ci poate implica și nucleul ribozomului, creând un defect molecular specific parazitului care nu a fost descris în celulele libere. Se observă specii vii.
După modelarea proteinelor ribozomale canonice și a ARNr, am constatat că componentele ribozomale convenționale nu pot explica cele trei părți ale imaginii crio-EM. Două dintre aceste fragmente au molecule mici (Fig. 5, Fig. suplimentară 8). Primul segment este intercalat între proteinele ribozomale uL15 și eL18, într-o poziție ocupată de obicei de capătul C-terminal al eL18, care este scurtat în E. cuniculi. Deși nu putem determina identitatea acestei molecule, dimensiunea și forma acestei insule de densitate sunt bine explicate prin prezența moleculelor de spermidină. Legarea sa la ribozom este stabilizată prin mutații specifice microsporidiilor în proteinele uL15 (Asp51 și Arg56), care par să crească afinitatea ribozomului pentru această moleculă mică, deoarece permit uL15 să înfășoare molecula mică într-o structură ribozomală. Figura suplimentară 2). 8, date suplimentare 1, 2).
Imagistică crio-EM care arată prezența nucleotidelor în afara ribozei legate de ribozomul E. cuniculi. În ribozomul E. cuniculi, acest nucleotid ocupă același loc ca nucleotidul ARNr 25S A3186 (numerotare Saccharomyces cerevisiae) în majoritatea celorlalți ribozomi eucarioți. b În structura ribozomală a E. cuniculi, acest nucleotid este situat între proteinele ribozomale uL9 și eL20, stabilizând astfel contactul dintre cele două proteine. cd Analiza conservării secvenței eL20 între speciile de microsporidii. Arborele filogenetic al speciilor de Microsporidii (c) și alinierea secvențelor multiple ale proteinei eL20 (d) arată că reziduurile de legare a nucleotidelor F170 și K172 sunt conservate în majoritatea Microsporidiilor tipice, cu excepția S. lophii, cu excepția Microsporidiilor cu ramificare timpurie, care au păstrat extensia ARNr ES39L. e Această figură arată că reziduurile de legare a nucleotidelor F170 și K172 sunt prezente doar în eL20 din genomul microsporidiei extrem de redus, dar nu și în alte eucariote. Per total, aceste date sugerează că ribozomii microsporidieni au dezvoltat un situs de legare a nucleotidelor care pare să se lege de moleculele de AMP și să le utilizeze pentru a stabiliza interacțiunile proteină-proteină în structura ribozomală. Conservarea ridicată a acestui situs de legare în Microsporidia și absența sa în alte eucariote sugerează că acest situs poate oferi un avantaj selectiv de supraviețuire pentru Microsporidia. Astfel, buzunarul de legare a nucleotidelor din ribozomul microsporidiei nu pare a fi o caracteristică degenerată sau o formă finală de degradare a ARNr așa cum s-a descris anterior, ci mai degrabă o inovație evolutivă utilă care permite ribozomului microsporidiei să se lege direct de molecule mici, folosindu-le ca elemente constitutive moleculare pentru ribozomi. Această descoperire face ca ribozomul microsporidiei să fie singurul ribozom cunoscut care utilizează un singur nucleotid ca element constitutiv structural. f Cale evolutivă ipotetică derivată din legarea nucleotidelor.
A doua densitate moleculară mică este localizată la interfața dintre proteinele ribozomale uL9 și eL30 (Fig. 5a). Această interfață a fost descrisă anterior în structura ribozomului Saccharomyces cerevisiae ca situs de legare pentru nucleotida 25S a ARNr A3186 (parte a extensiei ARNr ES39L)38. S-a demonstrat că în ribozomii ES39L degenerați de P. locustae, această interfață leagă un singur nucleotid necunoscut 31 și se presupune că acest nucleotid este o formă finală redusă de ARNr, în care lungimea ARNr este de ~130-230 baze. ES39L este redus la un singur nucleotid 32,43. Imaginile noastre crio-EM susțin ideea că densitatea poate fi explicată prin nucleotide. Cu toate acestea, rezoluția mai mare a structurii noastre a arătat că acest nucleotid este o moleculă extraribozomală, posibil AMP (Fig. 5a, b).
Apoi ne-am întrebat dacă situsul de legare a nucleotidelor a apărut în ribozomul E. cuniculi sau dacă a existat anterior. Deoarece legarea nucleotidelor este mediată în principal de reziduurile Phe170 și Lys172 din proteina ribozomală eL30, am evaluat conservarea acestor reziduuri în 4396 de eucariote reprezentative. Ca și în cazul uL15 de mai sus, am constatat că reziduurile Phe170 și Lys172 sunt extrem de conservate doar în Microsporidia tipică, dar absente în alte eucariote, inclusiv Microsporidia atipică Mitosporidium și Amphiamblys, în care fragmentul de ARNr ES39L nu este redus 44, 45, 46 (Fig. 5c). -e).
Luate împreună, aceste date susțin ideea că E. cuniculi și, posibil, alte microsporidii canonice au dezvoltat capacitatea de a capta eficient un număr mare de metaboliți mici în structura ribozomilor pentru a compensa declinul nivelurilor de ARNr și proteine. Procedând astfel, au dezvoltat o capacitate unică de a lega nucleotidele în afara ribozomului, demonstrând că structurile moleculare parazitare compensează prin captarea abundenților de metaboliți mici și utilizarea lor ca imitații structurale ale fragmentelor de ARN și proteine ​​degradate.
A treia parte nesimulată a hărții noastre crio-EM, găsită în subunitatea mare de ribozomi. Rezoluția relativ mare (2,6 Å) a hărții noastre sugerează că această densitate aparține proteinelor cu combinații unice de reziduuri de lanț lateral mare, ceea ce ne-a permis să identificăm această densitate ca o proteină ribozomală necunoscută anterior, pe care am identificat-o ca fiind denumită msL2 (proteina L2 specifică microsporidiilor) (metode, figura 6). Căutarea noastră de omologie a arătat că msL2 este conservată în clada Microsporidia din genurile Encephaliter și Orosporidium, dar absentă la alte specii, inclusiv la alte Microsporidia. În structura ribozomală, msL2 ocupă un gol format prin pierderea ARNr ES31L extins. În acest gol, msL2 ajută la stabilizarea plierii ARNr și poate compensa pierderea ES31L (Figura 6).
a Densitatea electronică și modelul proteinei ribozomale msL2 specifice Microsporidiilor, găsită în ribozomii E. cuniculi. b Majoritatea ribozomilor eucarioți, inclusiv ribozomul 80S al Saccharomyces cerevisiae, prezintă o pierdere a amplificarii ARNr ES19L la majoritatea speciilor de microsporidiene. Structura stabilită anterior a ribozomului microsporidiilor V. necatrix sugerează că pierderea ES19L la acești paraziți este compensată de evoluția noii proteine ​​ribozomale msL1. În acest studiu, am descoperit că ribozomul E. cuniculi a dezvoltat și o proteină suplimentară care mimează ARN ribozomal, ca o compensare aparentă pentru pierderea ES19L. Cu toate acestea, msL2 (adnotată în prezent ca proteina ipotetică ECU06_1135) și msL1 au origini structurale și evolutive diferite. c Această descoperire a generării de proteine ​​ribozomale msL1 și msL2, fără legătură evolutivă, sugerează că, dacă ribozomii acumulează mutații dăunătoare în ARNr-ul lor, aceștia pot atinge niveluri fără precedent de diversitate compozițională chiar și într-un subset mic de specii strâns înrudite. Această descoperire ar putea ajuta la clarificarea originii și evoluției ribozomului mitocondrial, care este cunoscut pentru ARNr-ul său foarte redus și variabilitatea anormală a compoziției proteinelor între specii.
Apoi, am comparat proteina msL2 cu proteina msL1 descrisă anterior, singura proteină ribozomală specifică microsporidiilor cunoscută, găsită în ribozomul V. necatrix. Am vrut să testăm dacă msL1 și msL2 sunt înrudite evolutiv. Analiza noastră a arătat că msL1 și msL2 ocupă aceeași cavitate în structura ribozomală, dar au structuri primare și terțiare diferite, ceea ce indică originea lor evolutivă independentă (Fig. 6). Astfel, descoperirea msL2 oferă dovezi că grupuri de specii eucariote compacte pot evolua independent proteine ​​ribozomale distincte din punct de vedere structural pentru a compensa pierderea fragmentelor de ARNr. Această constatare este notabilă prin faptul că majoritatea ribozomilor eucariote citoplasmatice conțin o proteină invariabilă, inclusiv aceeași familie de 81 de proteine ​​ribozomale. Apariția msL1 și msL2 în diferite clade de microsporidii ca răspuns la pierderea segmentelor extinse de ARNr sugerează că degradarea arhitecturii moleculare a parazitului determină paraziții să caute mutații compensatorii, ceea ce poate duce în cele din urmă la achiziționarea lor în diferite structuri ale populațiilor de paraziți.
În cele din urmă, când modelul nostru a fost finalizat, am comparat compoziția ribozomului E. cuniculi cu cea prezisă din secvența genomului. Anterior, se credea că mai multe proteine ​​ribozomale, inclusiv eL14, eL38, eL41 și eS30, lipseau din genomul E. cuniculi din cauza absenței aparente a omologilor lor din genomul E. cuniculi. Pierderea multor proteine ​​ribozomale este prezisă și la majoritatea celorlalți paraziți intracelulari și endosimbionți cu conținut ridicat de proteine ​​reduse. De exemplu, deși majoritatea bacteriilor cu viață liberă conțin aceeași familie de 54 de proteine ​​ribozomale, doar 11 dintre aceste familii de proteine ​​au omologi detectabili în fiecare genom analizat al bacteriilor cu restricții la gazdă. În sprijinul acestei noțiuni, s-a observat experimental o pierdere a proteinelor ribozomale la microsporidiile V. necatrix și P. locustae, cărora le lipsesc proteinele eL38 și eL4131,32.
Cu toate acestea, structurile noastre arată că doar eL38, eL41 și eS30 sunt de fapt pierdute în ribozomul E. cuniculi. Proteina eL14 a fost conservată, iar structura noastră a arătat de ce această proteină nu a putut fi găsită în căutarea omologiei (Fig. 7). În ribozomii E. cuniculi, cea mai mare parte a situsului de legare eL14 este pierdută din cauza degradării ES39L amplificat cu ARNr. În absența ES39L, eL14 și-a pierdut cea mai mare parte a structurii secundare și doar 18% din secvența eL14 a fost identică în E. cuniculi și S. cerevisiae. Această conservare deficitară a secvenței este remarcabilă deoarece chiar și Saccharomyces cerevisiae și Homo sapiens - organisme care au evoluat la o diferență de 1,5 miliarde de ani - au în comun mai mult de 51% din aceleași reziduuri în eL14. Această pierdere anormală a conservării explică de ce E. cuniculi eL14 este adnotată în prezent ca putativa proteină M970_061160 și nu ca proteina ribozomală eL1427.
Și ribozomul Microsporidiei a pierdut extensia ARNr ES39L, ceea ce a eliminat parțial situsul de legare a proteinei ribozomale eL14. În absența ES39L, proteina microspor eL14 suferă o pierdere a structurii secundare, în care fosta α-helix de legare a ARNr degenerează într-o buclă de lungime minimă. b Alinierea secvențelor multiple arată că proteina eL14 este foarte conservată la speciile eucariote (identitate de secvență de 57% între omologii de drojdie și cei umani), dar slab conservată și divergentă în microsporidii (în care nu mai mult de 24% din reziduuri sunt identice cu omologul eL14). de la S. cerevisiae sau H. sapiens). Această conservare slabă a secvenței și variabilitatea structurii secundare explică de ce omologul eL14 nu a fost niciodată găsit în E. cuniculi și de ce se crede că această proteină s-a pierdut în E. cuniculi. În schimb, eL14 din E. cuniculi a fost adnotată anterior ca o presupusă proteină M970_061160. Această observație sugerează că diversitatea genomului microsporidiilor este în prezent supraestimată: unele gene despre care se crede în prezent că se pierd în microsporidii sunt de fapt conservate, deși în forme foarte diferențiate; în schimb, se crede că unele codifică gene microsporidii pentru proteine ​​specifice viermilor (de exemplu, proteina ipotetică M970_061160) codifică de fapt proteinele foarte diverse găsite în alte eucariote.
Această constatare sugerează că denaturarea ARNr poate duce la o pierdere dramatică a conservării secvenței în proteinele ribozomale adiacente, făcând aceste proteine ​​nedetectabile pentru căutările de omologie. Prin urmare, este posibil să supraestimăm gradul real de degradare moleculară în organismele cu genom mic, deoarece unele proteine ​​despre care se crede că s-au pierdut persistă, deși în forme foarte alterate.
Cum pot paraziții să își păstreze funcția mașinilor moleculare în condiții de reducere extremă a genomului? Studiul nostru răspunde la această întrebare prin descrierea structurii moleculare complexe (ribozomilor) a E. cuniculi, un organism cu unul dintre cele mai mici genomuri eucariote.
Se știe de aproape două decenii că moleculele de proteine ​​și ARN din paraziții microbieni diferă adesea de moleculele lor omoloage din speciile libere, deoarece acestora le lipsesc centrele de control al calității, sunt reduse la 50% din dimensiunea lor la microbii liberi etc., suferă de numeroase mutații debilitante care afectează plierea și funcția. De exemplu, ribozomii organismelor cu genom mic, inclusiv mulți paraziți intracelulari și endosimbioți, se așteaptă să lipsească de mai multe proteine ​​ribozomale și până la o treime din nucleotidele ARNr, comparativ cu speciile libere 27, 29, 30, 49. Cu toate acestea, modul în care aceste molecule funcționează la paraziți rămâne în mare parte un mister, studiat în principal prin genomică comparativă.
Studiul nostru arată că structura macromoleculelor poate dezvălui multe aspecte ale evoluției care sunt dificil de extras din studiile genomice comparative tradiționale ale paraziților intracelulari și ale altor organisme cu restricții la gazdă (Fig. suplimentară 7). De exemplu, exemplul proteinei eL14 arată că putem supraestima gradul real de degradare a aparatului molecular la speciile parazitare. Se crede acum că paraziții encefalitici au sute de gene specifice microsporidiilor. Cu toate acestea, rezultatele noastre arată că unele dintre aceste gene aparent specifice sunt de fapt doar variante foarte diferite ale unor gene comune la alte eucariote. Mai mult, exemplul proteinei msL2 arată cum trecem cu vederea noile proteine ​​ribozomale și subestimăm conținutul mașinilor moleculare parazitare. Exemplul moleculelor mici arată cum putem trece cu vederea cele mai ingenioase inovații în structurile moleculare parazitare care le pot conferi o nouă activitate biologică.
Luate împreună, aceste rezultate ne îmbunătățesc înțelegerea diferențelor dintre structurile moleculare ale organismelor cu restricții la gazdă și omologii lor din organismele cu viață liberă. Demonstrăm că mașinile moleculare, considerate mult timp a fi reduse, degenerate și supuse diverselor mutații debilitante, au în schimb un set de caracteristici structurale neobișnuite, sistematic trecute cu vederea.
Pe de altă parte, fragmentele de ARNr non-voluminoase și fragmentele condensate pe care le-am găsit în ribozomii E. cuniculi sugerează că reducerea genomului poate schimba chiar și acele părți ale mecanismului molecular de bază care sunt conservate în cele trei domenii ale vieții – după aproape 3,5 miliarde de ani de evoluție independentă a speciilor.
Fragmentele de ARNr fuzionate și fără umflături din ribozomii E. cuniculi prezintă un interes deosebit în lumina studiilor anterioare asupra moleculelor de ARN din bacteriile endosimbiotice. De exemplu, la endosimbiontul afid Buchnera aphidicola, s-a demonstrat că moleculele de ARNr și ARNt au structuri sensibile la temperatură datorită erorii de compoziție A+T și a unei proporții mari de perechi de baze non-canonice20,50. Se consideră acum că aceste modificări ale ARN-ului, precum și modificările moleculelor de proteine, sunt responsabile pentru supradependența endosimbionților de parteneri și pentru incapacitatea endosimbionților de a transfera căldură21, 23. Deși ARNr-ul microsporidiilor parazitare prezintă modificări structurale distincte, natura acestor modificări sugerează că stabilitatea termică redusă și dependența mai mare de proteinele chaperone pot fi caracteristici comune ale moleculelor de ARN din organismele cu genomuri reduse.
Pe de altă parte, structurile noastre arată că microsporidiile parazitare au dezvoltat o capacitate unică de a rezista la fragmente de ARNr și proteine ​​conservate pe scară largă, dezvoltând capacitatea de a utiliza metaboliți mici abundenți și ușor disponibili ca imitații structurale ale fragmentelor de ARNr și proteine ​​degenerate. Degradarea structurii moleculare. Această opinie este susținută de faptul că moleculele mici care compensează pierderea fragmentelor de proteine ​​din ARNr și ribozomii E. cuniculi se leagă de reziduuri specifice microsporidiilor din proteinele uL15 și eL30. Acest lucru sugerează că legarea moleculelor mici la ribozomi poate fi un produs al selecției pozitive, în care mutațiile specifice microsporidiilor din proteinele ribozomale au fost selectate pentru capacitatea lor de a crește afinitatea ribozomilor pentru moleculele mici, ceea ce poate duce la organisme ribozomale mai eficiente. Descoperirea dezvăluie o inovație inteligentă în structura moleculară a paraziților microbieni și ne oferă o mai bună înțelegere a modului în care structurile moleculare ale paraziților își mențin funcția în ciuda evoluției reductive.
În prezent, identificarea acestor molecule mici rămâne neclară. Nu este clar de ce aspectul acestor molecule mici în structura ribozomală diferă între speciile de microsporidii. În special, nu este clar de ce legarea nucleotidelor se observă în ribozomii de E. cuniculi și P. locustae și nu în ribozomii de V. necatrix, în ciuda prezenței reziduului F170 în proteinele eL20 și K172 de V. necatrix. Această deleție poate fi cauzată de reziduul 43 uL6 (situat adiacent buzunarului de legare a nucleotidelor), care este tirozină în V. necatrix și nu treonină în E. cuniculi și P. locustae. Lanțul lateral aromatic voluminos al Tyr43 poate interfera cu legarea nucleotidelor din cauza suprapunerii sterice. Alternativ, deleția aparentă a nucleotidelor se poate datora rezoluției scăzute a imagisticii crio-EM, care împiedică modelarea fragmentelor ribozomale de V. necatrix.
Pe de altă parte, studiul nostru sugerează că procesul de degradare a genomului ar putea fi o forță inventivă. În special, structura ribozomului E. cuniculi sugerează că pierderea ARNr și a fragmentelor de proteine ​​din ribozomul microsporidiei creează o presiune evolutivă care promovează modificări ale structurii ribozomilor. Aceste variante apar departe de situsul activ al ribozomului și par să ajute la menținerea (sau restabilirea) asamblării optime a ribozomilor, care altfel ar fi perturbată de ARNr redus. Acest lucru sugerează că o inovație majoră a ribozomului microsporidiei pare să fi evoluat într-o nevoie de a tampona driftul genetic.
Poate că acest lucru este cel mai bine ilustrat de legarea nucleotidelor, care nu a fost observată până acum la alte organisme. Faptul că reziduurile de legare a nucleotidelor sunt prezente în microsporidiile tipice, dar nu și în alte eucariote, sugerează că situsurile de legare a nucleotidelor nu sunt doar relicte care așteaptă să dispară sau situsul final pentru ca ARNr să fie restaurat la forma de nucleotide individuale. În schimb, acest situs pare a fi o caracteristică utilă care ar fi putut evolua de-a lungul mai multor runde de selecție pozitivă. Situsurile de legare a nucleotidelor pot fi un produs secundar al selecției naturale: odată ce ES39L este degradat, microsporidiile sunt forțate să caute compensații pentru a restabili biogeneza optimă a ribozomilor în absența ES39L. Deoarece acest nucleotid poate imita contactele moleculare ale nucleotidului A3186 din ES39L, molecula de nucleotidă devine un element constitutiv al ribozomului, a cărui legare este îmbunătățită în continuare prin mutația secvenței eL30.
În ceea ce privește evoluția moleculară a paraziților intracelulari, studiul nostru arată că forțele selecției naturale darwiniste și ale derivei genetice a decăderii genomului nu operează în paralel, ci oscilează. În primul rând, deriva genetică elimină caracteristici importante ale biomoleculelor, ceea ce face ca compensarea să fie extrem de necesară. Numai atunci când paraziții își satisfac această nevoie prin selecția naturală darwinistă, macromoleculele lor vor avea șansa de a-și dezvolta cele mai impresionante și inovatoare trăsături. Este important de menționat că evoluția situsurilor de legare a nucleotidelor din ribozomul E. cuniculi sugerează că acest model de evoluție moleculară de tip pierdere-câștig nu numai că amortizează mutațiile dăunătoare, dar uneori conferă funcții complet noi macromoleculelor parazitare.
Această idee este în concordanță cu teoria echilibrului mobil a lui Sewell Wright, care afirmă că un sistem strict de selecție naturală limitează capacitatea organismelor de a inova51,52,53. Cu toate acestea, dacă deriva genetică perturbă selecția naturală, aceste derive pot produce modificări care nu sunt în sine adaptive (sau chiar dăunătoare), ci duc la modificări suplimentare care oferă o fitness mai mare sau o nouă activitate biologică. Cadrul nostru susține această idee ilustrând faptul că același tip de mutație care reduce plierea și funcția unei biomolecule pare a fi principalul declanșator al îmbunătățirii acesteia. În conformitate cu modelul evolutiv câștig-câștig, studiul nostru arată că decăderea genomului, privită în mod tradițional ca un proces degenerativ, este, de asemenea, un factor major al inovării, permițând uneori și poate chiar adesea macromoleculelor să dobândească noi activități parazitare care le pot utiliza.