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माइक्रोबियल परजीवियों के विकास में प्राकृतिक चयन, जो परजीवियों में सुधार का कारण बनता है, और आनुवंशिक बहाव, जो परजीवियों को जीन खोने और हानिकारक उत्परिवर्तनों को जमा करने का कारण बनता है, के बीच एक प्रतिकार शामिल है। यहाँ, यह समझने के लिए कि यह प्रतिकार एकल मैक्रोमोलेक्यूल के पैमाने पर कैसे होता है, हम प्रकृति में सबसे छोटे जीनोम वाले यूकेरियोटिक जीव, एन्सेफेलिटोज़ून क्यूनिकुली के राइबोसोम की क्रायो-ईएम संरचना का वर्णन करते हैं। ई. क्यूनिकुली राइबोसोम में rRNA की अत्यधिक कमी अभूतपूर्व संरचनात्मक परिवर्तनों के साथ होती है, जैसे कि पहले से अज्ञात फ्यूज्ड rRNA लिंकर्स और बिना उभार वाले rRNA का विकास। इसके अलावा, ई. क्यूनिकुली राइबोसोम ने छोटे अणुओं को खराब हो चुके rRNA टुकड़ों और प्रोटीन की संरचनात्मक नकल के रूप में उपयोग करने की क्षमता विकसित करके rRNA टुकड़ों और प्रोटीन के नुकसान से बच निकला। कुल मिलाकर, हम दिखाते हैं कि आणविक संरचनाओं को लंबे समय से कम, पतित और दुर्बल करने वाले उत्परिवर्तनों के अधीन माना जाता है, जिनमें कई प्रतिपूरक तंत्र होते हैं जो उन्हें अत्यधिक आणविक संकुचन के बावजूद सक्रिय रखते हैं।
चूँकि माइक्रोबियल परजीवियों के अधिकांश समूहों में अपने मेज़बानों का शोषण करने के लिए अद्वितीय आणविक उपकरण होते हैं, इसलिए हमें अक्सर परजीवियों के विभिन्न समूहों के लिए अलग-अलग उपचार विकसित करने पड़ते हैं1,2। हालाँकि, नए साक्ष्य बताते हैं कि परजीवी विकास के कुछ पहलू अभिसारी और काफी हद तक पूर्वानुमानित हैं, जो माइक्रोबियल परजीवियों में व्यापक चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए संभावित आधार का संकेत देते हैं3,4,5,6,7,8,9।
पिछले शोध में सूक्ष्मजीव परजीवियों में जीनोम कमी या जीनोम क्षय10,11,12,13 नामक एक सामान्य विकासवादी प्रवृत्ति की पहचान की गई है। वर्तमान शोध से पता चलता है कि जब सूक्ष्मजीव अपनी मुक्त-जीवित जीवनशैली को त्याग देते हैं और अंतःकोशिकीय परजीवी (या एंडोसिम्बियन्ट) बन जाते हैं, तो उनके जीनोम लाखों वर्षों में धीमे लेकिन आश्चर्यजनक रूप से रूपांतरित होते हैं9,11। जीनोम क्षय के रूप में जानी जाने वाली प्रक्रिया में, सूक्ष्मजीव परजीवी हानिकारक उत्परिवर्तन जमा करते हैं जो कई पहले से महत्वपूर्ण जीन को छद्म जीन में बदल देते हैं, जिससे धीरे-धीरे जीन की हानि और उत्परिवर्तन पतन14,15 होता है। यह पतन निकट से संबंधित मुक्त-जीवित प्रजातियों की तुलना में सबसे पुराने अंतःकोशिकीय जीवों में 95% तक जीन को नष्ट कर सकता है। इस प्रकार, अंतःकोशिकीय परजीवियों का विकास दो विरोधी ताकतों के बीच रस्साकशी है: डार्विनियन प्राकृतिक चयन, जो परजीवियों के सुधार की ओर ले जाता है, और जीनोम का पतन, जो परजीवियों को विस्मृति में डाल देता है। परजीवी इस रस्साकशी से कैसे उभर पाया और अपनी आणविक संरचना की गतिविधि को कैसे बनाए रखा, यह अभी भी स्पष्ट नहीं है।
हालाँकि जीनोम क्षय का तंत्र पूरी तरह से समझा नहीं गया है, लेकिन ऐसा लगता है कि यह मुख्य रूप से बार-बार होने वाले आनुवंशिक बहाव के कारण होता है। चूँकि परजीवी छोटी, अलैंगिक और आनुवंशिक रूप से सीमित आबादी में रहते हैं, इसलिए वे कभी-कभी डीएनए प्रतिकृति के दौरान होने वाले हानिकारक उत्परिवर्तनों को प्रभावी ढंग से समाप्त नहीं कर सकते हैं। इससे हानिकारक उत्परिवर्तनों का अपरिवर्तनीय संचय होता है और परजीवी जीनोम में कमी आती है। नतीजतन, परजीवी न केवल उन जीनों को खो देता है जो अब अंतःकोशिकीय वातावरण में उसके जीवित रहने के लिए आवश्यक नहीं हैं। यह परजीवी आबादी की छिटपुट हानिकारक उत्परिवर्तनों को प्रभावी ढंग से समाप्त करने में असमर्थता है जो इन उत्परिवर्तनों को पूरे जीनोम में जमा होने का कारण बनती है, जिसमें उनके सबसे महत्वपूर्ण जीन भी शामिल हैं।
जीनोम में कमी के बारे में हमारी वर्तमान समझ का अधिकांश हिस्सा जीनोम अनुक्रमों की तुलना पर आधारित है, जिसमें वास्तविक अणुओं में होने वाले परिवर्तनों पर कम ध्यान दिया गया है जो हाउसकीपिंग कार्य करते हैं और संभावित दवा लक्ष्य के रूप में काम करते हैं। तुलनात्मक अध्ययनों से पता चला है कि हानिकारक इंट्रासेल्युलर माइक्रोबियल उत्परिवर्तन का बोझ प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड को गलत तरीके से मोड़ने और एकत्र करने के लिए प्रेरित करता है, जिससे वे अधिक चैपरोन पर निर्भर होते हैं और गर्मी के प्रति अतिसंवेदनशील होते हैं19,20,21,22,23। इसके अलावा, विभिन्न परजीवियों - कभी-कभी 2.5 बिलियन वर्षों तक अलग-अलग स्वतंत्र विकास - ने अपने प्रोटीन संश्लेषण5,6 और डीएनए मरम्मत तंत्र24 में गुणवत्ता नियंत्रण केंद्रों के समान नुकसान का अनुभव किया। हालाँकि, सेलुलर मैक्रोमोलेक्यूल्स के अन्य सभी गुणों पर इंट्रासेल्युलर जीवनशैली के प्रभाव के बारे में बहुत कम जानकारी है, जिसमें हानिकारक उत्परिवर्तन के बढ़ते बोझ के लिए आणविक अनुकूलन शामिल है।
इस कार्य में, अंतःकोशिकीय सूक्ष्मजीवों के प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड के विकास को बेहतर ढंग से समझने के लिए, हमने अंतःकोशिकीय परजीवी एन्सेफेलिटोजून क्यूनिकुली के राइबोसोम की संरचना निर्धारित की। ई. क्यूनिकुली एक कवक जैसा जीव है जो परजीवी माइक्रोस्पोरिडिया के समूह से संबंधित है जिसमें असामान्य रूप से छोटे यूकेरियोटिक जीनोम होते हैं और इसलिए जीनोम क्षय25,26,27,28,29,30 का अध्ययन करने के लिए मॉडल जीवों के रूप में उपयोग किया जाता है। हाल ही में, माइक्रोस्पोरिडिया, पैरानोसेमा लोक्स्टे और वैरीमोर्फा नेकाट्रिक्स31,32 (~3.2 एमबी जीनोम) के मध्यम रूप से कम जीनोम के लिए क्रायो-ईएम राइबोसोम संरचना निर्धारित की गई थी। ये संरचनाएं बताती हैं कि rRNA प्रवर्धन के कुछ नुकसान की भरपाई पड़ोसी राइबोसोमल प्रोटीन के बीच नए संपर्कों के विकास या नए msL131,32 राइबोसोमल प्रोटीन के अधिग्रहण से होती है। प्रजाति एन्सेफेलिटोज़ून (जीनोम ~2.5 मिलियन बीपी), अपने सबसे करीबी रिश्तेदार ऑर्डोस्पोरा के साथ, यूकेरियोट्स में जीनोम कमी की अंतिम डिग्री प्रदर्शित करते हैं - उनके पास 2000 से कम प्रोटीन-कोडिंग जीन हैं, और यह उम्मीद की जाती है कि उनके राइबोसोम न केवल आरआरएनए विस्तार टुकड़ों से रहित हैं (आरआरएनए टुकड़े जो यूकेरियोटिक राइबोसोम को बैक्टीरियल राइबोसोम से अलग करते हैं) ई. क्यूनिकुली जीनोम26,27,28 में होमोलॉग्स की कमी के कारण चार राइबोसोमल प्रोटीन भी हैं। इसलिए, हमने निष्कर्ष निकाला कि ई. क्यूनिकुली राइबोसोम जीनोम क्षय के लिए आणविक अनुकूलन के लिए पहले से अज्ञात रणनीतियों को प्रकट कर सकता है।
हमारी क्रायो-ईएम संरचना सबसे छोटे यूकेरियोटिक साइटोप्लाज्मिक राइबोसोम का प्रतिनिधित्व करती है और इस बात की जानकारी देती है कि जीनोम में कमी की अंतिम डिग्री कोशिका के अभिन्न अंग आणविक मशीनरी की संरचना, संयोजन और विकास को कैसे प्रभावित करती है। हमने पाया कि ई. क्यूनिकुली राइबोसोम आरएनए फोल्डिंग और राइबोसोम असेंबली के कई व्यापक रूप से संरक्षित सिद्धांतों का उल्लंघन करता है, और एक नए, पहले अज्ञात राइबोसोमल प्रोटीन की खोज की। काफी अप्रत्याशित रूप से, हम दिखाते हैं कि माइक्रोस्पोरिडिया राइबोसोम ने छोटे अणुओं को बांधने की क्षमता विकसित की है, और परिकल्पना की है कि आरआरएनए और प्रोटीन में कटौती विकासवादी नवाचारों को ट्रिगर करती है जो अंततः राइबोसोम पर उपयोगी गुण प्रदान कर सकती है।
अंतरकोशिकीय जीवों में प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड के विकास की हमारी समझ को बेहतर बनाने के लिए, हमने संक्रमित स्तनधारी कोशिकाओं की संस्कृतियों से ई. क्यूनिकुली बीजाणुओं को अलग करने का फैसला किया ताकि उनके राइबोसोम को शुद्ध किया जा सके और इन राइबोसोम की संरचना का निर्धारण किया जा सके। बड़ी संख्या में परजीवी माइक्रोस्पोरिडिया प्राप्त करना मुश्किल है क्योंकि माइक्रोस्पोरिडिया को पोषक माध्यम में संवर्धित नहीं किया जा सकता है। इसके बजाय, वे केवल मेजबान कोशिका के अंदर ही बढ़ते और प्रजनन करते हैं। इसलिए, राइबोसोम शुद्धिकरण के लिए ई. क्यूनिकुली बायोमास प्राप्त करने के लिए, हमने स्तनधारी किडनी सेल लाइन RK13 को ई. क्यूनिकुली बीजाणुओं से संक्रमित किया और इन संक्रमित कोशिकाओं को कई हफ्तों तक संवर्धित किया ताकि ई. क्यूनिकुली को बढ़ने और गुणा करने का मौका मिले। लगभग आधे वर्ग मीटर के संक्रमित सेल मोनोलेयर का उपयोग करके, हम लगभग 300 मिलीग्राम माइक्रोस्पोरिडिया बीजाणुओं को शुद्ध करने और राइबोसोम को अलग करने के लिए उनका उपयोग करने में सक्षम थे। फिर हमने कांच के मोतियों से शुद्ध बीजाणुओं को विघटित किया और लाइसेट्स के चरणबद्ध पॉलीइथाइलीन ग्लाइकॉल अंशांकन का उपयोग करके कच्चे राइबोसोम को अलग किया। इससे हमें संरचनात्मक विश्लेषण के लिए लगभग 300 µg कच्चे ई. क्यूनिकुली राइबोसोम प्राप्त करने की अनुमति मिली।
फिर हमने परिणामी राइबोसोम नमूनों का उपयोग करके क्रायो-ईएम छवियाँ एकत्र कीं और बड़ी राइबोसोमल सबयूनिट, छोटी सबयूनिट हेड और छोटी सबयूनिट के अनुरूप मास्क का उपयोग करके इन छवियों को संसाधित किया। इस प्रक्रिया के दौरान, हमने लगभग 108,000 राइबोसोमल कणों की छवियाँ एकत्र कीं और 2.7 Å (पूरक चित्र 1-3) के रिज़ॉल्यूशन के साथ क्रायो-ईएम छवियों की गणना की। फिर हमने ई. क्यूनिकुली राइबोसोम (चित्र 1 ए, बी) से जुड़े आरआरएनए, राइबोसोमल प्रोटीन और हाइबरनेशन फैक्टर एमडीएफ1 को मॉडल करने के लिए क्रायोईएम छवियों का उपयोग किया।
ए. हाइबरनेशन फैक्टर एमडीएफ1 (पीडीबी आईडी 7क्यूईपी) के साथ जटिल रूप में ई. क्यूनिकुली राइबोसोम की संरचना। बी. ई. क्यूनिकुली राइबोसोम से जुड़े हाइबरनेशन फैक्टर एमडीएफ1 का मानचित्र। सी. माइक्रोस्पोरिडियन प्रजातियों में पुनर्प्राप्त आरआरएनए की तुलना ज्ञात राइबोसोमल संरचनाओं से करने वाला द्वितीयक संरचना मानचित्र। पैनल प्रवर्धित आरआरएनए टुकड़ों (ईएस) और राइबोसोम सक्रिय साइटों के स्थान को दिखाते हैं, जिसमें डिकोडिंग साइट (डीसी), सारसिनिसिन लूप (एसआरएल) और पेप्टाइडाइल ट्रांसफ़ेरेज़ सेंटर (पीटीसी) शामिल हैं। डी. ई. क्यूनिकुली राइबोसोम के पेप्टाइडाइल ट्रांसफ़ेरेज़ सेंटर के अनुरूप इलेक्ट्रॉन घनत्व से पता चलता है कि इस उत्प्रेरक साइट की संरचना ई. क्यूनिकुली परजीवी और उसके मेजबानों, जिसमें एच. सेपियंस भी शामिल है, में समान है। ई, एफ डिकोडिंग सेंटर (ई) के संगत इलेक्ट्रॉन घनत्व और डिकोडिंग सेंटर (एफ) की योजनाबद्ध संरचना से संकेत मिलता है कि ई. क्यूनिकुली में कई अन्य यूकेरियोट्स में ए1491 (ई. कोली नंबरिंग) के बजाय अवशेष यू1491 है। यह परिवर्तन बताता है कि ई. क्यूनिकुली इस सक्रिय साइट को लक्षित करने वाले एंटीबायोटिक दवाओं के प्रति संवेदनशील हो सकता है।
वी. नेकाट्रिक्स और पी. लोकस्टे राइबोसोम की पहले से स्थापित संरचनाओं के विपरीत (दोनों संरचनाएं एक ही माइक्रोस्पोरिडिया परिवार नोसेमेटिडे का प्रतिनिधित्व करती हैं और एक दूसरे से बहुत मिलती-जुलती हैं), 31,32 ई. क्यूनिकुली राइबोसोम आरआरएनए और प्रोटीन विखंडन की कई प्रक्रियाओं से गुजरते हैं। आगे विकृतीकरण (पूरक चित्र 4-6)। आरआरएनए में, सबसे खास बदलावों में प्रवर्धित 25एस आरआरएनए खंड ईएस12एल का पूर्ण नुकसान और एच39, एच41 और एच18 हेलिक्स का आंशिक अध:पतन शामिल था (चित्र 1सी, पूरक चित्र 4)। राइबोसोमल प्रोटीनों में, सबसे महत्वपूर्ण परिवर्तनों में eS30 प्रोटीन की पूर्ण क्षति और eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17, और eS7 प्रोटीनों का छोटा होना शामिल था (पूरक चित्र 4, 5)।
इस प्रकार, एन्सेफेलोटोज़ून/ऑर्डोस्पोरा प्रजातियों के जीनोम की अत्यधिक कमी उनके राइबोसोम संरचना में परिलक्षित होती है: संरचनात्मक लक्षण वर्णन के अधीन यूकेरियोटिक साइटोप्लाज्मिक राइबोसोम में ई. क्यूनिकुली राइबोसोम प्रोटीन सामग्री की सबसे नाटकीय कमी का अनुभव करते हैं, और उनमें वे rRNA और प्रोटीन अंश भी नहीं होते हैं जो न केवल यूकेरियोट्स में बल्कि जीवन के तीन डोमेन में भी व्यापक रूप से संरक्षित हैं। ई. क्यूनिकुली राइबोसोम की संरचना इन परिवर्तनों के लिए पहला आणविक मॉडल प्रदान करती है और विकासवादी घटनाओं को प्रकट करती है जिन्हें तुलनात्मक जीनोमिक्स और इंट्रासेल्युलर बायोमोलिकुलर संरचना (पूरक चित्र 7) के अध्ययनों द्वारा अनदेखा किया गया है। नीचे, हम इनमें से प्रत्येक घटना का वर्णन उनके संभावित विकासवादी मूल और राइबोसोम फ़ंक्शन पर उनके संभावित प्रभाव के साथ करते हैं।
फिर हमने पाया कि, बड़े rRNA कटौतियों के अलावा, E. cuniculi राइबोसोम में उनके एक सक्रिय स्थल पर rRNA भिन्नताएँ होती हैं। हालाँकि E. cuniculi राइबोसोम के पेप्टाइडाइल ट्रांसफ़ेज़ केंद्र की संरचना अन्य यूकेरियोटिक राइबोसोम (चित्र 1d) जैसी ही है, लेकिन न्यूक्लियोटाइड 1491 (E. coli नंबरिंग, चित्र 1e, f) पर अनुक्रम भिन्नता के कारण डिकोडिंग केंद्र भिन्न होता है। यह अवलोकन महत्वपूर्ण है क्योंकि यूकेरियोटिक राइबोसोम के डिकोडिंग स्थल में आमतौर पर बैक्टीरिया-प्रकार के अवशेषों A1408 और G1491 की तुलना में अवशेष G1408 और A1491 होते हैं। यह भिन्नता राइबोसोमल एंटीबायोटिक्स और अन्य छोटे अणुओं के एमिनोग्लाइकोसाइड परिवार के लिए बैक्टीरिया और यूकेरियोटिक राइबोसोम की अलग-अलग संवेदनशीलता को रेखांकित करती है जो डिकोडिंग साइट को लक्षित करते हैं। ई. क्यूनिकुली राइबोसोम के डिकोडिंग साइट पर, अवशेष A1491 को U1491 से बदल दिया गया, जिससे संभावित रूप से इस सक्रिय साइट को लक्षित करने वाले छोटे अणुओं के लिए एक अद्वितीय बंधन इंटरफ़ेस का निर्माण हुआ। वही A14901 वैरिएंट अन्य माइक्रोस्पोरिडिया जैसे कि P. locustae और V. necatrix में भी मौजूद है, जो यह दर्शाता है कि यह माइक्रोस्पोरिडिया प्रजातियों में व्यापक रूप से फैला हुआ है (चित्र 1f)।
चूँकि हमारे ई. क्यूनिकुली राइबोसोम नमूने चयापचय रूप से निष्क्रिय बीजाणुओं से अलग किए गए थे, इसलिए हमने तनाव या भुखमरी की स्थिति में पहले से वर्णित राइबोसोम बंधन के लिए ई. क्यूनिकुली के क्रायो-ईएम मानचित्र का परीक्षण किया। हाइबरनेशन कारक 31,32,36,37, 38. हमने हाइबरनेटिंग राइबोसोम की पहले से स्थापित संरचना को ई. क्यूनिकुली राइबोसोम के क्रायो-ईएम मानचित्र से मिलाया। डॉकिंग के लिए, एस. सेरेविसिया राइबोसोम का उपयोग हाइबरनेशन कारक Stm138 के साथ कॉम्प्लेक्स में, लोकस्ट राइबोसोम का उपयोग Lso232 कारक के साथ कॉम्प्लेक्स में, और वी. नेकैट्रिक्स राइबोसोम का उपयोग Mdf1 और Mdf231 कारकों के साथ कॉम्प्लेक्स में किया गया। उसी समय, हमने रेस्ट फैक्टर Mdf1 के अनुरूप क्रायो-ईएम घनत्व पाया। एमडीएफ1 के वी. नेकाट्रिक्स राइबोसोम से बंधने के समान, एमडीएफ1 ई. क्यूनिकुली राइबोसोम से भी बंधता है, जहां यह राइबोसोम के ई साइट को अवरुद्ध करता है, संभवतः तब राइबोसोम को उपलब्ध कराने में मदद करता है जब परजीवी बीजाणु शरीर की निष्क्रियता पर चयापचय रूप से निष्क्रिय हो जाते हैं (चित्र 2)।
Mdf1 राइबोसोम के E साइट को ब्लॉक करता है, जो परजीवी बीजाणुओं के चयापचय रूप से निष्क्रिय हो जाने पर राइबोसोम को निष्क्रिय करने में मदद करता है। E. cuniculi राइबोसोम की संरचना में, हमने पाया कि Mdf1 L1 राइबोसोम स्टेम के साथ पहले से अज्ञात संपर्क बनाता है, राइबोसोम का वह हिस्सा जो प्रोटीन संश्लेषण के दौरान राइबोसोम से डीएसाइलेटेड tRNA को छोड़ने में मदद करता है। ये संपर्क बताते हैं कि Mdf1 डीएसाइलेटेड tRNA के समान तंत्र का उपयोग करके राइबोसोम से अलग हो जाता है, जो इस बात का संभावित स्पष्टीकरण प्रदान करता है कि कैसे राइबोसोम प्रोटीन संश्लेषण को पुनः सक्रिय करने के लिए Mdf1 को हटाता है।
हालाँकि, हमारी संरचना ने Mdf1 और L1 राइबोसोम लेग (राइबोसोम का वह हिस्सा जो प्रोटीन संश्लेषण के दौरान राइबोसोम से डीएसाइलेटेड tRNA को छोड़ने में मदद करता है) के बीच एक अज्ञात संपर्क का खुलासा किया। विशेष रूप से, Mdf1 डीएसाइलेटेड tRNA अणु (चित्र 2) के कोहनी खंड के समान संपर्कों का उपयोग करता है। इस पहले से अज्ञात आणविक मॉडलिंग ने दिखाया कि Mdf1 डीएसाइलेटेड tRNA के समान तंत्र का उपयोग करके राइबोसोम से अलग हो जाता है, जो बताता है कि राइबोसोम प्रोटीन संश्लेषण को फिर से सक्रिय करने के लिए इस हाइबरनेशन कारक को कैसे हटाता है।
आरआरएनए मॉडल का निर्माण करते समय, हमने पाया कि ई. क्यूनिकुली राइबोसोम में असामान्य रूप से मुड़े हुए आरआरएनए टुकड़े हैं, जिन्हें हमने फ्यूज्ड आरआरएनए (चित्र 3) कहा है। जीवन के तीन डोमेन में फैले राइबोसोम में, आरआरएनए ऐसी संरचनाओं में मुड़ता है जिसमें अधिकांश आरआरएनए बेस या तो बेस पेयर बनाते हैं और एक दूसरे के साथ फोल्ड करते हैं या राइबोसोमल प्रोटीन38,39,40 के साथ इंटरैक्ट करते हैं। हालाँकि, ई. क्यूनिकुली राइबोसोम में, आरआरएनए अपने कुछ हेलिक्स को अनफोल्डेड आरआरएनए क्षेत्रों में परिवर्तित करके इस फोल्डिंग सिद्धांत का उल्लंघन करते प्रतीत होते हैं।
एस. सेरेविसिया, वी. नेकाट्रिक्स और ई. क्यूनिकुली में H18 25S rRNA हेलिक्स की संरचना। आम तौर पर, तीन जीवन डोमेन में फैले राइबोसोम में, यह लिंकर एक RNA हेलिक्स में कुंडलित होता है जिसमें 24 से 34 अवशेष होते हैं। इसके विपरीत, माइक्रोस्पोरिडिया में, यह rRNA लिंकर धीरे-धीरे दो एकल-स्ट्रैंडेड यूरिडीन-समृद्ध लिंकर्स में सिमट जाता है जिसमें केवल 12 अवशेष होते हैं। इनमें से अधिकांश अवशेष सॉल्वैंट्स के संपर्क में आते हैं। चित्र दर्शाता है कि परजीवी माइक्रोस्पोरिडिया rRNA फोल्डिंग के सामान्य सिद्धांतों का उल्लंघन करते प्रतीत होते हैं, जहाँ rRNA बेस आमतौर पर अन्य बेस से युग्मित होते हैं या rRNA-प्रोटीन इंटरैक्शन में शामिल होते हैं। माइक्रोस्पोरिडिया में, कुछ rRNA टुकड़े एक प्रतिकूल फोल्ड लेते हैं, जिसमें पूर्व rRNA हेलिक्स एक एकल-स्ट्रैंडेड टुकड़ा बन जाता है जो लगभग एक सीधी रेखा में लम्बा होता है। इन असामान्य क्षेत्रों की उपस्थिति माइक्रोस्पोरिडिया rRNA को न्यूनतम संख्या में RNA बेस का उपयोग करके दूरस्थ rRNA टुकड़ों को बांधने की अनुमति देती है।
इस विकासवादी संक्रमण का सबसे उल्लेखनीय उदाहरण H18 25S rRNA हेलिक्स (चित्र 3) में देखा जा सकता है। ई. कोली से लेकर मनुष्यों तक की प्रजातियों में, इस rRNA हेलिक्स के बेस में 24-32 न्यूक्लियोटाइड होते हैं, जो थोड़ा अनियमित हेलिक्स बनाते हैं। वी. नेकाट्रिक्स और पी. लोकस्टे,31,32 से पहले से पहचाने गए राइबोसोमल संरचनाओं में H18 हेलिक्स के बेस आंशिक रूप से अनकॉइल होते हैं, लेकिन न्यूक्लियोटाइड बेस पेयरिंग संरक्षित होती है। हालाँकि, ई. क्यूनिकुली में यह rRNA खंड सबसे छोटा लिंकर 228UUUGU232 और 301UUUUUUUU307 बन जाता है। सामान्य rRNA टुकड़ों के विपरीत, ये यूरिडीन-समृद्ध लिंकर कॉइल नहीं बनाते हैं या राइबोसोमल प्रोटीन के साथ व्यापक संपर्क नहीं बनाते हैं। इसके बजाय, वे विलायक-खुले और पूरी तरह से अनफ़ोल्डेड संरचनाओं को अपनाते हैं जिसमें rRNA स्ट्रैंड लगभग सीधे विस्तारित होते हैं। यह फैला हुआ स्वरूप यह स्पष्ट करता है कि कैसे E. क्यूनिकुली H16 और H18 rRNA हेलिक्स के बीच 33 Å के अंतर को भरने के लिए केवल 12 RNA बेस का उपयोग करता है, जबकि अन्य प्रजातियों को अंतर को भरने के लिए कम से कम दोगुने rRNA बेस की आवश्यकता होती है।
इस प्रकार, हम यह प्रदर्शित कर सकते हैं कि, ऊर्जा के प्रतिकूल तह के माध्यम से, परजीवी माइक्रोस्पोरिडिया ने उन rRNA खंडों को भी संकुचित करने की रणनीति विकसित की है जो जीवन के तीन डोमेन में प्रजातियों में व्यापक रूप से संरक्षित रहते हैं। जाहिर है, rRNA हेलिक्स को छोटे पॉली-यू लिंकर्स में बदलने वाले उत्परिवर्तनों को जमा करके, ई. क्यूनिकुली असामान्य rRNA टुकड़े बना सकते हैं जिनमें डिस्टल rRNA टुकड़ों के बंधन के लिए यथासंभव कम न्यूक्लियोटाइड होते हैं। यह समझाने में मदद करता है कि माइक्रोस्पोरिडिया ने अपनी संरचनात्मक और कार्यात्मक अखंडता को खोए बिना अपनी मूल आणविक संरचना में नाटकीय कमी कैसे हासिल की।
ई. क्यूनिकुली आरआरएनए की एक और असामान्य विशेषता यह है कि इसमें मोटाई के बिना आरआरएनए दिखाई देता है (चित्र 4)। उभार ऐसे न्यूक्लियोटाइड होते हैं जिनमें बेस पेयर नहीं होते हैं जो आरएनए हेलिक्स में छिपने के बजाय उससे बाहर निकल जाते हैं। अधिकांश आरआरएनए उभार आणविक चिपकने वाले के रूप में कार्य करते हैं, जो आसन्न राइबोसोमल प्रोटीन या अन्य आरआरएनए टुकड़ों को बांधने में मदद करते हैं। कुछ उभार टिका के रूप में कार्य करते हैं, जिससे आरआरएनए हेलिक्स को उत्पादक प्रोटीन संश्लेषण के लिए बेहतर तरीके से फ्लेक्स और फोल्ड करने की अनुमति मिलती है 41 .
क. ई. क्यूनिकुली राइबोसोम संरचना में एक आरआरएनए उभार (एस. सेरेविसी नंबरिंग) अनुपस्थित है, लेकिन अधिकांश अन्य यूकेरियोट्स में मौजूद है ख. ई. कोलाई, एस. सेरेविसी, एच. सेपियन्स और ई. क्यूनिकुली आंतरिक राइबोसोम में। परजीवियों में कई प्राचीन, अत्यधिक संरक्षित आरआरएनए उभारों का अभाव होता है। ये गाढ़ेपन राइबोसोम संरचना को स्थिर करते हैं; इसलिए, माइक्रोस्पोरिडिया में उनकी अनुपस्थिति माइक्रोस्पोरिडिया परजीवियों में आरआरएनए तह की कम स्थिरता का संकेत देती है। पी तने (बैक्टीरिया में L7/L12 तने) के साथ तुलना से पता चलता है कि आरआरएनए धक्कों का नुकसान कभी-कभी खोए हुए धक्कों के बगल में नए धक्कों की उपस्थिति के साथ मेल खाता है। 23S/28S rRNA में H42 हेलिक्स में एक प्राचीन उभार है (सैक्रोमाइसीज सेरेविसी में U1206) माइक्रोस्पोरिडिया में यह उभार समाप्त हो जाता है। हालांकि, खोए हुए उभार के बगल में एक नया उभार दिखाई देता है (ई. क्यूनिकुली में A1306)।
आश्चर्यजनक रूप से, हमने पाया कि ई. क्यूनिकुली राइबोसोम में अन्य प्रजातियों में पाए जाने वाले अधिकांश आरआरएनए उभारों की कमी है, जिसमें अन्य यूकेरियोट्स में संरक्षित 30 से अधिक उभार शामिल हैं (चित्र 4ए)। यह नुकसान राइबोसोमल सबयूनिट्स और आसन्न आरआरएनए हेलिक्स के बीच कई संपर्कों को समाप्त कर देता है, कभी-कभी राइबोसोम के भीतर बड़े खोखले रिक्त स्थान बनाते हैं, जिससे ई. क्यूनिकुली राइबोसोम अधिक पारंपरिक राइबोसोम की तुलना में अधिक छिद्रपूर्ण हो जाता है (चित्र 4बी)। उल्लेखनीय रूप से, हमने पाया कि इनमें से अधिकांश उभार पहले से पहचाने गए वी. नेकाट्रिक्स और पी. लोकस्टे राइबोसोम संरचनाओं में भी खो गए थे, जिन्हें पिछले संरचनात्मक विश्लेषणों31,32 द्वारा अनदेखा किया गया था।
कभी-कभी rRNA उभारों के नष्ट होने के साथ ही खोए हुए उभार के बगल में नए उभारों का विकास भी होता है। उदाहरण के लिए, राइबोसोमल P-स्टेम में एक U1208 उभार (सैकरोमाइसिस सेरेविसिया में) होता है जो E. कोली से मनुष्यों में जीवित रहा और इसलिए अनुमान है कि यह 3.5 बिलियन वर्ष पुराना है। प्रोटीन संश्लेषण के दौरान, यह उभार P स्टेम को खुले और बंद स्वरूपों के बीच जाने में मदद करता है ताकि राइबोसोम अनुवाद कारकों को भर्ती कर सके और उन्हें सक्रिय साइट पर पहुंचा सके। E. क्यूनिकुली राइबोसोम में, यह गाढ़ापन अनुपस्थित है; हालाँकि, केवल तीन बेस पेयर में स्थित एक नया गाढ़ापन (G883) P स्टेम (चित्र 4c) के इष्टतम लचीलेपन की बहाली में योगदान दे सकता है।
उभार रहित rRNA पर हमारे डेटा से पता चलता है कि rRNA न्यूनीकरण राइबोसोम की सतह पर rRNA तत्वों के नुकसान तक सीमित नहीं है, बल्कि इसमें राइबोसोम नाभिक भी शामिल हो सकता है, जिससे परजीवी-विशिष्ट आणविक दोष पैदा होता है जिसका वर्णन मुक्त-जीवित कोशिकाओं में नहीं किया गया है। जीवित प्रजातियों में देखा जाता है।
विहित राइबोसोमल प्रोटीन और rRNA मॉडलिंग के बाद, हमने पाया कि पारंपरिक राइबोसोमल घटक क्रायो-ईएम छवि के तीन भागों की व्याख्या नहीं कर सकते हैं। इनमें से दो टुकड़े आकार में छोटे अणु हैं (चित्र 5, अनुपूरक चित्र 8)। पहला खंड राइबोसोमल प्रोटीन uL15 और eL18 के बीच एक ऐसी स्थिति में सैंडविच किया गया है जो आमतौर पर eL18 के C-टर्मिनस द्वारा कब्जा कर लिया जाता है, जिसे E. cuniculi में छोटा किया जाता है। हालाँकि हम इस अणु की पहचान निर्धारित नहीं कर सकते हैं, लेकिन इस घनत्व द्वीप के आकार और आकृति को स्पर्मिडाइन अणुओं की उपस्थिति से अच्छी तरह से समझाया गया है। राइबोसोम से इसका बंधन uL15 प्रोटीन (Asp51 और Arg56) में माइक्रोस्पोरिडिया-विशिष्ट उत्परिवर्तन द्वारा स्थिर किया जाता है, जो इस छोटे अणु के लिए राइबोसोम की आत्मीयता को बढ़ाता है, क्योंकि वे uL15 को छोटे अणु को राइबोसोमल संरचना में लपेटने की अनुमति देते हैं। अनुपूरक चित्र 2)। 8, अतिरिक्त डेटा 1, 2)।
क्रायो-ईएम इमेजिंग ई. क्यूनिकुली राइबोसोम से बंधे राइबोज के बाहर न्यूक्लियोटाइड की उपस्थिति को दर्शाती है। ई. क्यूनिकुली राइबोसोम में, यह न्यूक्लियोटाइड अधिकांश अन्य यूकेरियोटिक राइबोसोम में 25S rRNA A3186 न्यूक्लियोटाइड (सैकरोमाइसिस सेरेविसिया नंबरिंग) के समान स्थान पर है। बी ई. क्यूनिकुली की राइबोसोमल संरचना में, यह न्यूक्लियोटाइड राइबोसोमल प्रोटीन uL9 और eL20 के बीच स्थित है, जिससे दो प्रोटीन के बीच संपर्क स्थिर होता है। माइक्रोस्पोरिडिया प्रजातियों के बीच cd eL20 अनुक्रम संरक्षण विश्लेषण। माइक्रोस्पोरिडिया प्रजातियों का फ़ायलोजेनेटिक वृक्ष (c) और eL20 प्रोटीन (d) का बहु अनुक्रम संरेखण दर्शाता है कि न्यूक्लियोटाइड-बाइंडिंग अवशेष F170 और K172 अधिकांश विशिष्ट माइक्रोस्पोरिडिया में संरक्षित हैं, S. lophii के अपवाद के साथ, प्रारंभिक शाखा वाले माइक्रोस्पोरिडिया के अपवाद के साथ, जिसमें ES39L rRNA विस्तार बरकरार रहा। e यह आंकड़ा दर्शाता है कि न्यूक्लियोटाइड-बाइंडिंग अवशेष F170 और K172 केवल अत्यधिक कम किए गए माइक्रोस्पोरिडिया जीनोम के eL20 में मौजूद हैं, लेकिन अन्य यूकेरियोट्स में नहीं हैं। कुल मिलाकर, ये डेटा सुझाव देते हैं कि माइक्रोस्पोरिडियन राइबोसोम ने एक न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग साइट विकसित की है इस प्रकार, माइक्रोस्पोरिडिया राइबोसोम में न्यूक्लियोटाइड-बाइंडिंग पॉकेट पहले वर्णित के अनुसार आरआरएनए गिरावट का एक पतित विशेषता या अंतिम रूप प्रतीत नहीं होता है, बल्कि यह एक उपयोगी विकासवादी नवाचार है जो माइक्रोस्पोरिडिया राइबोसोम को छोटे अणुओं को सीधे बांधने की अनुमति देता है, उन्हें आणविक बिल्डिंग ब्लॉक के रूप में उपयोग करता है। राइबोसोम के लिए बिल्डिंग ब्लॉक। यह खोज माइक्रोस्पोरिडिया राइबोसोम को एकमात्र ऐसा राइबोसोम बनाती है जो अपने संरचनात्मक बिल्डिंग ब्लॉक के रूप में एकल न्यूक्लियोटाइड का उपयोग करता है। f न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग से व्युत्पन्न काल्पनिक विकासवादी मार्ग।
दूसरा कम आणविक भार घनत्व राइबोसोमल प्रोटीन uL9 और eL30 (चित्र 5a) के बीच इंटरफेस पर स्थित है। इस इंटरफेस को पहले सैकरोमाइस सेरेविसिया राइबोसोम की संरचना में rRNA A3186 (ES39L rRNA एक्सटेंशन का हिस्सा)38 के 25S न्यूक्लियोटाइड के लिए एक बाइंडिंग साइट के रूप में वर्णित किया गया था। यह दिखाया गया था कि पतित P. locustae ES39L राइबोसोम में, यह इंटरफ़ेस एक अज्ञात एकल न्यूक्लियोटाइड 31 को बांधता है, और यह माना जाता है कि यह न्यूक्लियोटाइड rRNA का एक कम अंतिम रूप है, जिसमें rRNA की लंबाई ~130-230 बेस होती है। ES39L एक एकल न्यूक्लियोटाइड 32.43 में कम हो जाता है। हमारी क्रायो-ईएम छवियां इस विचार का समर्थन करती हैं कि घनत्व को न्यूक्लियोटाइड द्वारा समझाया जा सकता है। हालाँकि, हमारी संरचना के उच्च रिज़ॉल्यूशन से पता चला कि यह न्यूक्लियोटाइड एक एक्स्ट्रारिबोसोमल अणु है, संभवतः एएमपी (चित्र 5 ए, बी)।
फिर हमने पूछा कि क्या न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग साइट ई. क्यूनिकुली राइबोसोम में दिखाई दी थी या यह पहले से मौजूद थी। चूंकि न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग मुख्य रूप से ईएल30 राइबोसोमल प्रोटीन में फे170 और लाइस172 अवशेषों द्वारा मध्यस्थ होती है, इसलिए हमने 4396 प्रतिनिधि यूकेरियोट्स में इन अवशेषों के संरक्षण का आकलन किया। जैसा कि ऊपर uL15 के मामले में, हमने पाया कि फे170 और लाइस172 अवशेष केवल विशिष्ट माइक्रोस्पोरिडिया में अत्यधिक संरक्षित हैं, लेकिन अन्य यूकेरियोट्स में अनुपस्थित हैं, जिनमें असामान्य माइक्रोस्पोरिडिया मिटोस्पोरिडियम और एम्फीएम्बलीस शामिल हैं, जिसमें ES39L rRNA खंड कम नहीं होता है 44, 45, 46 (चित्र 5c)। -ई)।
कुल मिलाकर, ये डेटा इस विचार का समर्थन करते हैं कि ई. क्यूनिकुली और संभवतः अन्य विहित माइक्रोस्पोरिडिया ने राइबोसोम संरचना में बड़ी संख्या में छोटे मेटाबोलाइट्स को कुशलतापूर्वक पकड़ने की क्षमता विकसित की है ताकि आरआरएनए और प्रोटीन के स्तर में गिरावट की भरपाई की जा सके। ऐसा करने में, उन्होंने राइबोसोम के बाहर न्यूक्लियोटाइड्स को बांधने की एक अनूठी क्षमता विकसित की है, जो दर्शाता है कि परजीवी आणविक संरचनाएं प्रचुर मात्रा में छोटे मेटाबोलाइट्स को पकड़कर और उन्हें खराब हो चुके आरएनए और प्रोटीन टुकड़ों की संरचनात्मक नकल के रूप में उपयोग करके क्षतिपूर्ति करती हैं।
हमारे क्रायो-ईएम मानचित्र का तीसरा अनसिम्युलेटेड हिस्सा, बड़े राइबोसोमल सबयूनिट में मिला। हमारे मानचित्र का अपेक्षाकृत उच्च रिज़ॉल्यूशन (2.6 Å) बताता है कि यह घनत्व बड़े साइड चेन अवशेषों के अनूठे संयोजनों वाले प्रोटीनों का है, जिससे हम इस घनत्व को पहले से अज्ञात राइबोसोमल प्रोटीन के रूप में पहचान पाए, जिसे हमने msL2 (माइक्रोस्पोरिडिया- विशिष्ट प्रोटीन L2) नाम दिया (विधियाँ, चित्र 6)। हमारी होमोलॉजी खोज से पता चला कि msL2 जीनस एन्सेफलाइटर और ओरोस्पोरिडियम के माइक्रोस्पोरिडिया क्लैड में संरक्षित है, लेकिन अन्य माइक्रोस्पोरिडिया सहित अन्य प्रजातियों में अनुपस्थित है। राइबोसोमल संरचना में, msL2 विस्तारित ES31L rRNA के नुकसान से बने अंतर को घेरता है
ए. ई. क्यूनिकुली राइबोसोम में पाए जाने वाले माइक्रोस्पोरिडिया-विशिष्ट राइबोसोमल प्रोटीन msL2 का इलेक्ट्रॉन घनत्व और मॉडल। बी. अधिकांश यूकेरियोटिक राइबोसोम, जिसमें सैकरोमाइसिस सेरेविसिया का 80S राइबोसोम शामिल है, में अधिकांश माइक्रोस्पोरिडियन प्रजातियों में ES19L rRNA प्रवर्धन खो गया है। वी. नेकाट्रिक्स माइक्रोस्पोरिडिया राइबोसोम की पहले से स्थापित संरचना से पता चलता है कि इन परजीवियों में ES19L की कमी की भरपाई नए msL1 राइबोसोमल प्रोटीन के विकास से होती है। इस अध्ययन में, हमने पाया कि ई. क्यूनिकुली राइबोसोम ने ES19L की कमी की स्पष्ट भरपाई के रूप में एक अतिरिक्त राइबोसोमल RNA मिमिक प्रोटीन भी विकसित किया। हालाँकि, msL2 (वर्तमान में काल्पनिक ECU06_1135 प्रोटीन के रूप में एनोटेट) और msL1 की संरचनात्मक और विकासवादी उत्पत्ति अलग-अलग है। c विकासात्मक रूप से असंबंधित msL1 और msL2 राइबोसोमल प्रोटीन की पीढ़ी की यह खोज बताती है कि यदि राइबोसोम अपने rRNA में हानिकारक उत्परिवर्तन जमा करते हैं, तो वे निकट से संबंधित प्रजातियों के एक छोटे उपसमूह में भी अभूतपूर्व स्तर की संरचनागत विविधता प्राप्त कर सकते हैं। यह खोज माइटोकॉन्ड्रियल राइबोसोम की उत्पत्ति और विकास को स्पष्ट करने में मदद कर सकती है, जो अपने अत्यधिक कम rRNA और प्रजातियों में प्रोटीन संरचना में असामान्य परिवर्तनशीलता के लिए जाना जाता है।
फिर हमने msL2 प्रोटीन की तुलना पहले वर्णित msL1 प्रोटीन से की, जो कि V. नेकाट्रिक्स राइबोसोम में पाया जाने वाला एकमात्र ज्ञात माइक्रोस्पोरिडिया-विशिष्ट राइबोसोमल प्रोटीन है। हम यह जांचना चाहते थे कि msL1 और msL2 विकासात्मक रूप से संबंधित हैं या नहीं। हमारे विश्लेषण से पता चला कि msL1 और msL2 राइबोसोमल संरचना में एक ही गुहा में रहते हैं, लेकिन उनकी प्राथमिक और तृतीयक संरचनाएँ अलग-अलग हैं, जो उनके स्वतंत्र विकासवादी मूल (चित्र 6) को इंगित करता है। इस प्रकार, msL2 की हमारी खोज इस बात का सबूत देती है कि कॉम्पैक्ट यूकेरियोटिक प्रजातियों के समूह rRNA टुकड़ों के नुकसान की भरपाई के लिए संरचनात्मक रूप से अलग राइबोसोमल प्रोटीन को स्वतंत्र रूप से विकसित कर सकते हैं। यह खोज इस मायने में उल्लेखनीय है कि अधिकांश साइटोप्लाज्मिक यूकेरियोटिक राइबोसोम में एक अपरिवर्तनीय प्रोटीन होता है, जिसमें 81 राइबोसोमल प्रोटीन का एक ही परिवार शामिल है। विस्तारित rRNA खंडों की क्षति के जवाब में माइक्रोस्पोरिडिया के विभिन्न समूहों में msL1 और msL2 की उपस्थिति से पता चलता है कि परजीवी की आणविक संरचना के क्षरण के कारण परजीवी प्रतिपूरक उत्परिवर्तन की तलाश करते हैं, जो अंततः विभिन्न परजीवी आबादी में उनके अधिग्रहण का कारण बन सकता है।
अंत में, जब हमारा मॉडल पूरा हो गया, तो हमने ई. क्यूनिकुली राइबोसोम की संरचना की तुलना जीनोम अनुक्रम से की। कई राइबोसोमल प्रोटीन, जिनमें eL14, eL38, eL41 और eS30 शामिल हैं, पहले ई. क्यूनिकुली जीनोम से उनके समरूपों की स्पष्ट अनुपस्थिति के कारण गायब माने जाते थे। अधिकांश अन्य अत्यधिक कम इंट्रासेल्युलर परजीवियों और एंडोसिम्बियन्ट्स में कई राइबोसोमल प्रोटीन के नुकसान की भी भविष्यवाणी की गई है। उदाहरण के लिए, हालाँकि अधिकांश मुक्त-जीवित बैक्टीरिया में 54 राइबोसोमल प्रोटीन का एक ही परिवार होता है, लेकिन इनमें से केवल 11 प्रोटीन परिवारों में मेजबान-प्रतिबंधित बैक्टीरिया के प्रत्येक विश्लेषण किए गए जीनोम में पता लगाने योग्य समरूप हैं। इस धारणा के समर्थन में, वी. नेकाट्रिक्स और पी. लोकस्टे माइक्रोस्पोरिडिया में राइबोसोमल प्रोटीन का नुकसान प्रयोगात्मक रूप से देखा गया है, जिसमें eL38 और eL4131,32 प्रोटीन की कमी होती है।
हालांकि, हमारी संरचनाएं दर्शाती हैं कि ई. क्यूनिकुली राइबोसोम में केवल eL38, eL41 और eS30 ही वास्तव में खो जाते हैं। eL14 प्रोटीन संरक्षित था और हमारी संरचना ने दिखाया कि होमोलॉजी खोज में यह प्रोटीन क्यों नहीं पाया जा सका (चित्र 7)। ई. क्यूनिकुली राइबोसोम में, अधिकांश eL14 बाइंडिंग साइट rRNA-प्रवर्धित ES39L के क्षरण के कारण खो जाती है। ES39L की अनुपस्थिति में, eL14 ने अपनी अधिकांश द्वितीयक संरचना खो दी, और केवल 18% eL14 अनुक्रम E. क्यूनिकुली और S. सेरेविसिया में समान था। यह खराब अनुक्रम संरक्षण उल्लेखनीय है क्योंकि सैकरोमाइस सेरेविसिया और होमो सेपियंस - जीव जो 1.5 बिलियन वर्ष के अंतराल पर विकसित हुए - eL14 में समान अवशेषों का 51% से अधिक हिस्सा साझा करते हैं। संरक्षण की यह असामान्य क्षति बताती है कि क्यों ई. क्यूनिकुली eL14 को वर्तमान में कथित M970_061160 प्रोटीन के रूप में चिह्नित किया गया है, न कि eL1427 राइबोसोमल प्रोटीन के रूप में।
तथा माइक्रोस्पोरिडिया राइबोसोम ने ES39L rRNA विस्तार खो दिया, जिसने eL14 राइबोसोमल प्रोटीन बंधन स्थल को आंशिक रूप से समाप्त कर दिया। ES39L की अनुपस्थिति में, eL14 माइक्रोस्पोर प्रोटीन द्वितीयक संरचना की क्षति से गुजरता है, जिसमें पूर्व rRNA-बंधन α-हेलिक्स एक न्यूनतम लंबाई के लूप में पतित हो जाता है। b बहु अनुक्रम संरेखण से पता चलता है कि eL14 प्रोटीन यूकेरियोटिक प्रजातियों में अत्यधिक संरक्षित है (यीस्ट और मानव समरूपों के बीच 57% अनुक्रम पहचान), लेकिन माइक्रोस्पोरिडिया में खराब रूप से संरक्षित और भिन्न है (जिसमें 24% से अधिक अवशेष eL14 समरूप के समान नहीं हैं)। एस. सेरेविसिया या एच. सेपियन्स से)। यह खराब अनुक्रम संरक्षण और द्वितीयक संरचना परिवर्तनशीलता बताती है इसके विपरीत, ई. क्यूनिकुली ईएल14 को पहले एक संभावित एम970_061160 प्रोटीन के रूप में एनोटेट किया गया था। यह अवलोकन बताता है कि माइक्रोस्पोरिडिया जीनोम विविधता को वर्तमान में अधिक आंका गया है: कुछ जीन जिन्हें वर्तमान में माइक्रोस्पोरिडिया में खोया हुआ माना जाता है, वास्तव में संरक्षित हैं, यद्यपि अत्यधिक विभेदित रूपों में; इसके बजाय, कुछ को कृमि-विशिष्ट प्रोटीन (जैसे, काल्पनिक प्रोटीन M970_061160) के लिए माइक्रोस्पोरिडिया जीन के लिए कोड माना जाता है, वास्तव में अन्य यूकेरियोट्स में पाए जाने वाले बहुत ही विविध प्रोटीन के लिए कोड करते हैं।
यह खोज बताती है कि rRNA विकृतीकरण से आसन्न राइबोसोमल प्रोटीन में अनुक्रम संरक्षण का नाटकीय नुकसान हो सकता है, जिससे ये प्रोटीन होमोलॉजी खोजों के लिए पता लगाने योग्य नहीं रह जाते। इस प्रकार, हम छोटे जीनोम जीवों में आणविक क्षरण की वास्तविक डिग्री का अधिक अनुमान लगा सकते हैं, क्योंकि कुछ प्रोटीन जिन्हें खोया हुआ माना जाता है, वास्तव में बने रहते हैं, यद्यपि अत्यधिक परिवर्तित रूपों में।
परजीवी जीनोम में अत्यधिक कमी की स्थिति में अपनी आणविक मशीनों के कार्य को कैसे बनाए रख सकते हैं? हमारा अध्ययन ई. क्यूनिकुली की जटिल आणविक संरचना (राइबोसोम) का वर्णन करके इस प्रश्न का उत्तर देता है, जो सबसे छोटे यूकेरियोटिक जीनोम वाले जीवों में से एक है।
यह लगभग दो दशकों से ज्ञात है कि माइक्रोबियल परजीवियों में प्रोटीन और आरएनए अणु अक्सर मुक्त रहने वाली प्रजातियों में उनके समजातीय अणुओं से भिन्न होते हैं क्योंकि उनमें गुणवत्ता नियंत्रण केंद्र नहीं होते हैं, मुक्त रहने वाले सूक्ष्मजीवों में उनके आकार का 50% तक कम हो जाता है, आदि। कई दुर्बल करने वाले उत्परिवर्तन जो तह और कार्य को बाधित करते हैं। उदाहरण के लिए, कई इंट्रासेल्युलर परजीवियों और एंडोसिम्बियन्ट्स सहित छोटे जीनोम जीवों के राइबोसोम में मुक्त रहने वाली प्रजातियों की तुलना में कई राइबोसोमल प्रोटीन और एक तिहाई आरआरएनए न्यूक्लियोटाइड की कमी होने की उम्मीद है 27, 29, 30, 49। हालांकि, परजीवी में इन अणुओं के कार्य करने का तरीका काफी हद तक एक रहस्य बना हुआ है, जिसका अध्ययन मुख्य रूप से तुलनात्मक जीनोमिक्स के माध्यम से किया जाता है।
हमारा अध्ययन दर्शाता है कि मैक्रोमॉलीक्यूल्स की संरचना विकास के कई पहलुओं को प्रकट कर सकती है, जिन्हें इंट्रासेल्युलर परजीवियों और अन्य मेजबान-प्रतिबंधित जीवों (पूरक चित्र 7) के पारंपरिक तुलनात्मक जीनोमिक अध्ययनों से निकालना मुश्किल है। उदाहरण के लिए, eL14 प्रोटीन का उदाहरण दिखाता है कि हम परजीवी प्रजातियों में आणविक तंत्र के क्षरण की वास्तविक डिग्री को बढ़ा-चढ़ाकर बता सकते हैं। माना जाता है कि एन्सेफेलिटिक परजीवियों में अब सैकड़ों माइक्रोस्पोरिडिया-विशिष्ट जीन होते हैं। हालाँकि, हमारे परिणाम दिखाते हैं कि इनमें से कुछ विशिष्ट जीन वास्तव में जीन के बहुत अलग रूप हैं जो अन्य यूकेरियोट्स में आम हैं। इसके अलावा, msL2 प्रोटीन का उदाहरण दिखाता है कि हम नए राइबोसोमल प्रोटीन को कैसे अनदेखा करते हैं और परजीवी आणविक मशीनों की सामग्री को कम आंकते हैं। छोटे अणुओं का उदाहरण दिखाता है कि हम परजीवी आणविक संरचनाओं में सबसे सरल नवाचारों को कैसे अनदेखा कर सकते हैं जो उन्हें नई जैविक गतिविधि दे सकते हैं।
कुल मिलाकर, ये परिणाम मेजबान-प्रतिबंधित जीवों और मुक्त-जीवित जीवों में उनके समकक्षों की आणविक संरचनाओं के बीच अंतर की हमारी समझ को बेहतर बनाते हैं। हम दिखाते हैं कि आणविक मशीनें, जिन्हें लंबे समय से कमज़ोर, पतित और विभिन्न दुर्बल करने वाले उत्परिवर्तनों के अधीन माना जाता था, इसके बजाय व्यवस्थित रूप से अनदेखी की गई असामान्य संरचनात्मक विशेषताओं का एक सेट है।
दूसरी ओर, गैर-भारी आरआरएनए टुकड़े और जुड़े हुए टुकड़े जो हमें ई. क्यूनिकुली के राइबोसोम में मिले, यह सुझाव देते हैं कि जीनोम में कमी बुनियादी आणविक मशीनरी के उन हिस्सों को भी बदल सकती है जो जीवन के तीन डोमेन में संरक्षित हैं - लगभग 3.5 अरब वर्षों के बाद। प्रजातियों का स्वतंत्र विकास।
एंडोसिम्बायोटिक बैक्टीरिया में आरएनए अणुओं के पिछले अध्ययनों के आलोक में ई. क्यूनिकुली राइबोसोम में उभार-रहित और जुड़े हुए आरआरएनए टुकड़े विशेष रुचि के हैं। उदाहरण के लिए, एफिड एंडोसिम्बियन्ट बुचनरा एफिडिकोला में, आरआरएनए और टीआरएनए अणुओं में ए+टी संरचना पूर्वाग्रह और गैर-कैनोनिकल बेस जोड़े के उच्च अनुपात के कारण तापमान-संवेदनशील संरचनाएं पाई गई हैं20,50। आरएनए में ये परिवर्तन, साथ ही प्रोटीन अणुओं में परिवर्तन, अब भागीदारों पर एंडोसिम्बियन्ट्स की अत्यधिक निर्भरता और एंडोसिम्बियन्ट्स की गर्मी को स्थानांतरित करने में असमर्थता के लिए जिम्मेदार माने जाते हैं 21, 23। हालांकि परजीवी माइक्रोस्पोरिडिया आरआरएनए में संरचनात्मक रूप से अलग-अलग परिवर्तन होते हैं
दूसरी ओर, हमारी संरचनाएँ दर्शाती हैं कि परजीवी माइक्रोस्पोरिडिया ने व्यापक रूप से संरक्षित rRNA और प्रोटीन अंशों का प्रतिरोध करने की एक अनूठी क्षमता विकसित की है, जो पतित rRNA और प्रोटीन अंशों की संरचनात्मक नकल के रूप में प्रचुर मात्रा में और आसानी से उपलब्ध छोटे मेटाबोलाइट्स का उपयोग करने की क्षमता विकसित करता है। आणविक संरचना क्षरण। यह राय इस तथ्य से समर्थित है कि छोटे अणु जो ई. क्यूनिकुली के rRNA और राइबोसोम में प्रोटीन अंशों के नुकसान की भरपाई करते हैं, वे uL15 और eL30 प्रोटीन में माइक्रोस्पोरिडिया-विशिष्ट अवशेषों से बंधते हैं। इससे पता चलता है कि राइबोसोम से छोटे अणुओं का बंधन सकारात्मक चयन का एक उत्पाद हो सकता है, जिसमें राइबोसोमल प्रोटीन में माइक्रोस्पोरिडिया-विशिष्ट उत्परिवर्तन को छोटे अणुओं के लिए राइबोसोम की आत्मीयता बढ़ाने की उनकी क्षमता के लिए चुना गया है, जिससे अधिक कुशल राइबोसोमल जीव बन सकते हैं। यह खोज माइक्रोबियल परजीवियों की आणविक संरचना में एक स्मार्ट नवाचार को प्रकट करती है और हमें इस बात की बेहतर समझ देती है कि परजीवी आणविक संरचनाएँ रिडक्टिव इवोल्यूशन के बावजूद अपने कार्य को कैसे बनाए रखती हैं।
वर्तमान में, इन छोटे अणुओं की पहचान अस्पष्ट बनी हुई है। यह स्पष्ट नहीं है कि माइक्रोस्पोरिडिया प्रजातियों के बीच राइबोसोमल संरचना में इन छोटे अणुओं की उपस्थिति अलग-अलग क्यों है। विशेष रूप से, यह स्पष्ट नहीं है कि वी. नेकाट्रिक्स के ईएल20 और के172 प्रोटीन में F170 अवशेष की उपस्थिति के बावजूद, ई. क्यूनिकुली और पी. लोकस्टे के राइबोसोम में न्यूक्लियोटाइड बंधन क्यों देखा जाता है, और वी. नेकाट्रिक्स के राइबोसोम में क्यों नहीं। यह विलोपन अवशेष 43 uL6 (न्यूक्लियोटाइड बंधन पॉकेट के बगल में स्थित) के कारण हो सकता है, जो वी. नेकाट्रिक्स में टायरोसिन है और ई. क्यूनिकुली और पी. लोकस्टे में थ्रेओनीन नहीं है। Tyr43 की भारी सुगंधित साइड चेन स्टेरिक ओवरलैप के कारण न्यूक्लियोटाइड बंधन में बाधा डाल सकती है। वैकल्पिक रूप से, स्पष्ट न्यूक्लियोटाइड विलोपन क्रायो-ईएम इमेजिंग के कम रिज़ॉल्यूशन के कारण हो सकता है, जो वी. नेकाट्रिक्स राइबोसोमल टुकड़ों के मॉडलिंग में बाधा डालता है।
दूसरी ओर, हमारा काम बताता है कि जीनोम क्षय की प्रक्रिया एक आविष्कारशील शक्ति हो सकती है। विशेष रूप से, ई. क्यूनिकुली राइबोसोम की संरचना से पता चलता है कि माइक्रोस्पोरिडिया राइबोसोम में आरआरएनए और प्रोटीन के टुकड़ों का नुकसान विकासवादी दबाव बनाता है जो राइबोसोम संरचना में परिवर्तन को बढ़ावा देता है। ये वेरिएंट राइबोसोम की सक्रिय साइट से बहुत दूर होते हैं और इष्टतम राइबोसोम असेंबली को बनाए रखने (या बहाल करने) में मदद करते हैं जो अन्यथा कम आरआरएनए द्वारा बाधित हो जाएगा। इससे पता चलता है कि माइक्रोस्पोरिडिया राइबोसोम का एक बड़ा नवाचार जीन बहाव को बफर करने की आवश्यकता में विकसित हुआ है।
शायद यह न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग द्वारा सबसे अच्छी तरह से दर्शाया गया है, जिसे अब तक अन्य जीवों में कभी नहीं देखा गया है। तथ्य यह है कि न्यूक्लियोटाइड-बाइंडिंग अवशेष विशिष्ट माइक्रोस्पोरिडिया में मौजूद हैं, लेकिन अन्य यूकेरियोट्स में नहीं, यह सुझाव देता है कि न्यूक्लियोटाइड-बाइंडिंग साइटें केवल गायब होने की प्रतीक्षा कर रहे अवशेष नहीं हैं, या rRNA को व्यक्तिगत न्यूक्लियोटाइड के रूप में बहाल करने के लिए अंतिम साइट नहीं हैं। इसके बजाय, यह साइट एक उपयोगी विशेषता की तरह लगती है जो सकारात्मक चयन के कई दौर में विकसित हो सकती है। न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग साइटें प्राकृतिक चयन का एक उप-उत्पाद हो सकती हैं: एक बार ES39L का क्षरण हो जाने के बाद, माइक्रोस्पोरिडिया को ES39L की अनुपस्थिति में इष्टतम राइबोसोम बायोजेनेसिस को बहाल करने के लिए क्षतिपूर्ति की तलाश करने के लिए मजबूर होना पड़ता है। चूंकि यह न्यूक्लियोटाइड ES39L में A3186 न्यूक्लियोटाइड के आणविक संपर्कों की नकल कर सकता है, इसलिए न्यूक्लियोटाइड अणु राइबोसोम का एक निर्माण खंड बन जाता है, जिसके बंधन को eL30 अनुक्रम के उत्परिवर्तन द्वारा और बेहतर बनाया जाता है।
अंतरकोशिकीय परजीवियों के आणविक विकास के संबंध में, हमारा अध्ययन दर्शाता है कि डार्विनियन प्राकृतिक चयन और जीनोम क्षय के आनुवंशिक बहाव की ताकतें समानांतर रूप से काम नहीं करती हैं, बल्कि दोलन करती हैं। सबसे पहले, आनुवंशिक बहाव जैव अणुओं की महत्वपूर्ण विशेषताओं को समाप्त कर देता है, जिससे क्षतिपूर्ति की सख्त आवश्यकता होती है। केवल जब परजीवी डार्विनियन प्राकृतिक चयन के माध्यम से इस आवश्यकता को पूरा करते हैं, तो उनके मैक्रोमोलेक्यूल्स को अपने सबसे प्रभावशाली और अभिनव लक्षण विकसित करने का मौका मिलेगा। महत्वपूर्ण रूप से, ई. क्यूनिकुली राइबोसोम में न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग साइटों का विकास बताता है कि आणविक विकास का यह नुकसान-से-लाभ पैटर्न न केवल हानिकारक उत्परिवर्तनों को समाप्त करता है, बल्कि कभी-कभी परजीवी मैक्रोमोलेक्यूल्स को पूरी तरह से नए कार्य प्रदान करता है।
यह विचार सेवेल राइट के मूविंग इक्विलिब्रियम सिद्धांत के अनुरूप है, जो बताता है कि प्राकृतिक चयन की एक सख्त प्रणाली जीवों की नवाचार करने की क्षमता को सीमित करती है51,52,53। हालांकि, अगर आनुवंशिक बहाव प्राकृतिक चयन को बाधित करता है, तो ये बहाव ऐसे बदलाव पैदा कर सकते हैं जो अपने आप में अनुकूली (या हानिकारक भी) नहीं हैं, लेकिन आगे ऐसे बदलावों को जन्म देते हैं जो उच्च फिटनेस या नई जैविक गतिविधि प्रदान करते हैं। हमारा ढांचा इस विचार का समर्थन यह दर्शाकर करता है कि एक ही प्रकार का उत्परिवर्तन जो बायोमॉलीक्यूल के फोल्ड और फ़ंक्शन को कम करता है, उसके सुधार के लिए मुख्य ट्रिगर प्रतीत होता है। जीत-जीत विकासवादी मॉडल के अनुरूप, हमारा अध्ययन दिखाता है कि जीनोम क्षय, जिसे पारंपरिक रूप से एक अपक्षयी प्रक्रिया के रूप में देखा जाता है, नवाचार का एक प्रमुख चालक भी है, जो कभी-कभी और शायद अक्सर मैक्रोमोलेक्यूल्स को नई परजीवी गतिविधियों को प्राप्त करने की अनुमति देता है।