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सूक्ष्मजीवी परजीवियों के विकास में प्राकृतिक चयन और आनुवंशिक बहाव के बीच परस्पर क्रिया होती है। प्राकृतिक चयन के कारण परजीवियों में सुधार होता है, जबकि आनुवंशिक बहाव के कारण परजीवी अपने जीन खो देते हैं और हानिकारक उत्परिवर्तन जमा कर लेते हैं। यहाँ, यह समझने के लिए कि एक वृहद अणु के स्तर पर यह परस्पर क्रिया कैसे होती है, हम एन्सेफैलिटोज़ून क्यूनिकुली के राइबोसोम की क्रायो-ईएम संरचना का वर्णन करते हैं। एन्सेफैलिटोज़ून क्यूनिकुली एक यूकेरियोटिक जीव है जिसका जीनोम प्रकृति में सबसे छोटा है। ई. क्यूनिकुली राइबोसोम में आरआरएनए की अत्यधिक कमी के साथ अभूतपूर्व संरचनात्मक परिवर्तन भी होते हैं, जैसे कि पहले अज्ञात संलयनित आरआरएनए लिंकर और उभार रहित आरआरएनए का विकास। इसके अलावा, ई. क्यूनिकुली राइबोसोम ने आरआरएनए खंडों और प्रोटीनों के नुकसान के बावजूद छोटे अणुओं को विघटित आरआरएनए खंडों और प्रोटीनों के संरचनात्मक अनुकरण के रूप में उपयोग करने की क्षमता विकसित करके जीवित रहने में सफलता प्राप्त की। कुल मिलाकर, हम यह दर्शाते हैं कि जिन आणविक संरचनाओं को लंबे समय से संकुचित, पतित और दुर्बल करने वाले उत्परिवर्तनों के अधीन माना जाता था, उनमें कई क्षतिपूर्ति तंत्र होते हैं जो उन्हें अत्यधिक आणविक संकुचन के बावजूद सक्रिय रखते हैं।
क्योंकि सूक्ष्मजीव परजीवियों के अधिकांश समूहों में अपने मेजबानों का शोषण करने के लिए अद्वितीय आणविक उपकरण होते हैं, इसलिए हमें अक्सर परजीवियों के विभिन्न समूहों के लिए अलग-अलग उपचार विकसित करने पड़ते हैं1,2। हालाँकि, नए साक्ष्य बताते हैं कि परजीवी विकास के कुछ पहलू अभिसारी और काफी हद तक पूर्वानुमानित हैं, जो सूक्ष्मजीव परजीवियों में व्यापक चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए एक संभावित आधार का संकेत देते हैं3,4,5,6,7,8,9।
पिछले अध्ययनों में सूक्ष्मजीवी परजीवियों में एक सामान्य विकासवादी प्रवृत्ति की पहचान की गई है जिसे जीनोम न्यूनीकरण या जीनोम क्षय कहा जाता है10,11,12,13। वर्तमान शोध से पता चलता है कि जब सूक्ष्मजीव अपने मुक्त-जीवित जीवन शैली को त्यागकर अंतःकोशिकीय परजीवी (या अंतःसहजीवी) बन जाते हैं, तो उनके जीनोम लाखों वर्षों में धीमी लेकिन अद्भुत रूपांतरित होते हैं9,11। जीनोम क्षय के रूप में जानी जाने वाली इस प्रक्रिया में, सूक्ष्मजीवी परजीवी हानिकारक उत्परिवर्तनों को संचित करते हैं जो कई पूर्व महत्वपूर्ण जीनों को छद्म जीनों में बदल देते हैं, जिससे धीरे-धीरे जीन का क्षय और उत्परिवर्तनीय पतन होता है14,15। यह पतन निकट संबंधी मुक्त-जीवित प्रजातियों की तुलना में सबसे पुराने अंतःकोशिकीय जीवों में 95% तक जीनों को नष्ट कर सकता है। इस प्रकार, अंतःकोशिकीय परजीवियों का विकास दो विरोधी शक्तियों के बीच एक रस्साकशी है: डार्विनवादी प्राकृतिक चयन, जो परजीवियों के सुधार की ओर ले जाता है, और जीनोम का पतन, जो परजीवियों को विस्मृति में धकेल देता है। यह अभी भी स्पष्ट नहीं है कि परजीवी इस रस्साकशी से कैसे उभरने में कामयाब रहा और अपनी आणविक संरचना की सक्रियता को कैसे बनाए रखा।
हालांकि जीनोम क्षय की प्रक्रिया पूरी तरह से समझ में नहीं आई है, लेकिन ऐसा प्रतीत होता है कि यह मुख्य रूप से बार-बार होने वाले आनुवंशिक बहाव के कारण होती है। परजीवी छोटे, अलैंगिक और आनुवंशिक रूप से सीमित समूहों में रहते हैं, इसलिए वे डीएनए प्रतिकृति के दौरान होने वाले हानिकारक उत्परिवर्तनों को प्रभावी ढंग से समाप्त नहीं कर पाते हैं। इससे हानिकारक उत्परिवर्तनों का अपरिवर्तनीय संचय होता है और परजीवी जीनोम का आकार घट जाता है। परिणामस्वरूप, परजीवी न केवल उन जीनों को खो देता है जो अंतःकोशिकीय वातावरण में उसके अस्तित्व के लिए आवश्यक नहीं रह जाते हैं, बल्कि परजीवी समूहों की छिटपुट हानिकारक उत्परिवर्तनों को प्रभावी ढंग से समाप्त करने में असमर्थता के कारण ही ये उत्परिवर्तन उनके सबसे महत्वपूर्ण जीनों सहित पूरे जीनोम में जमा हो जाते हैं।
जीनोम में कमी के बारे में हमारी वर्तमान समझ का अधिकांश भाग केवल जीनोम अनुक्रमों की तुलना पर आधारित है, जिसमें उन वास्तविक अणुओं में होने वाले परिवर्तनों पर कम ध्यान दिया गया है जो सफाई कार्य करते हैं और संभावित दवा लक्ष्य के रूप में कार्य करते हैं। तुलनात्मक अध्ययनों से पता चला है कि हानिकारक अंतःकोशिकीय सूक्ष्मजीव उत्परिवर्तनों का बोझ प्रोटीन और न्यूक्लिक अम्लों को गलत तरीके से मुड़ने और एकत्रित होने के लिए प्रेरित करता है, जिससे वे अधिक चैपरोन पर निर्भर और गर्मी के प्रति अति संवेदनशील हो जाते हैं19,20,21,22,23। इसके अलावा, विभिन्न परजीवियों—जिनका स्वतंत्र विकास कभी-कभी 2.5 अरब वर्षों तक अलग रहा है—ने अपने प्रोटीन संश्लेषण5,6 और डीएनए मरम्मत तंत्र24 में गुणवत्ता नियंत्रण केंद्रों के समान नुकसान का अनुभव किया है। हालांकि, हानिकारक उत्परिवर्तनों के बढ़ते बोझ के लिए आणविक अनुकूलन सहित, कोशिकीय वृहद अणुओं के अन्य सभी गुणों पर अंतःकोशिकीय जीवनशैली के प्रभाव के बारे में बहुत कम जानकारी है।
इस अध्ययन में, अंतःकोशिकीय सूक्ष्मजीवों के प्रोटीन और न्यूक्लिक अम्लों के विकास को बेहतर ढंग से समझने के लिए, हमने अंतःकोशिकीय परजीवी एन्सेफैलिटोज़ून क्यूनिकुली के राइबोसोम की संरचना का निर्धारण किया। ई. क्यूनिकुली एक कवक-समान जीव है जो परजीवी माइक्रोस्पोरिडिया के एक समूह से संबंधित है, जिनके जीनोम असामान्य रूप से छोटे यूकेरियोटिक होते हैं और इसलिए जीनोम क्षय25,26,27,28,29,30 के अध्ययन के लिए मॉडल जीवों के रूप में उपयोग किए जाते हैं। हाल ही में, माइक्रोस्पोरिडिया, पैरानोसेमा लोकुस्टे और वैरीमोर्फा नेकाट्रिक्स31,32 (~3.2 एमबी जीनोम) के मध्यम रूप से कम किए गए जीनोम के लिए क्रायो-ईएम राइबोसोम संरचना का निर्धारण किया गया था। ये संरचनाएं बताती हैं कि आरआरएनए प्रवर्धन के कुछ नुकसान की भरपाई पड़ोसी राइबोसोमल प्रोटीन के बीच नए संपर्कों के विकास या नए एमएसएल131,32 राइबोसोमल प्रोटीन के अधिग्रहण से होती है। एन्सेफैलिटोज़ून प्रजाति (जीनोम ~2.5 मिलियन बीपी), अपने निकटतम संबंधी ऑर्डोस्पोरा के साथ, यूकेरियोट्स में जीनोम कमी की चरम सीमा को प्रदर्शित करती है - इनमें 2000 से कम प्रोटीन-कोडिंग जीन हैं, और यह अनुमान लगाया जाता है कि इनके राइबोसोम न केवल rRNA विस्तार खंडों (rRNA खंड जो यूकेरियोटिक राइबोसोम को जीवाणु राइबोसोम से अलग करते हैं) से रहित हैं, बल्कि E. cuniculi जीनोम26,27,28 में समरूपों की कमी के कारण इनमें चार राइबोसोमल प्रोटीन भी हैं। इसलिए, हमने निष्कर्ष निकाला कि E. cuniculi राइबोसोम जीनोम क्षय के लिए आणविक अनुकूलन की पूर्व अज्ञात रणनीतियों को प्रकट कर सकता है।
हमारी क्रायो-ईएम संरचना अब तक के सबसे छोटे यूकेरियोटिक साइटोप्लाज्मिक राइबोसोम का प्रतिनिधित्व करती है और यह समझने में मदद करती है कि जीनोम में कमी की अंतिम सीमा कोशिका के अभिन्न अंग आणविक तंत्र की संरचना, संयोजन और विकास को कैसे प्रभावित करती है। हमने पाया कि ई. क्यूनिकुली राइबोसोम आरएनए फोल्डिंग और राइबोसोम संयोजन के कई व्यापक रूप से संरक्षित सिद्धांतों का उल्लंघन करता है, और हमने एक नए, पहले से अज्ञात राइबोसोमल प्रोटीन की खोज की। अप्रत्याशित रूप से, हमने दिखाया कि माइक्रोस्पोरिडिया राइबोसोम ने छोटे अणुओं को बांधने की क्षमता विकसित कर ली है, और हमारा अनुमान है कि आरआरएनए और प्रोटीन में कमी से विकासवादी नवाचार उत्पन्न होते हैं जो अंततः राइबोसोम को उपयोगी गुण प्रदान कर सकते हैं।
अंतःकोशिकीय जीवों में प्रोटीन और न्यूक्लिक अम्लों के विकास की हमारी समझ को बेहतर बनाने के लिए, हमने संक्रमित स्तनधारी कोशिकाओं के संवर्धनों से ई. क्यूनिकुली बीजाणुओं को पृथक करने का निर्णय लिया ताकि उनके राइबोसोमों को शुद्ध किया जा सके और इन राइबोसोमों की संरचना का निर्धारण किया जा सके। बड़ी संख्या में परजीवी माइक्रोस्पोरिडिया प्राप्त करना कठिन है क्योंकि माइक्रोस्पोरिडिया को पोषक माध्यम में संवर्धित नहीं किया जा सकता है। इसके बजाय, वे केवल मेजबान कोशिका के अंदर ही बढ़ते और प्रजनन करते हैं। इसलिए, राइबोसोम शुद्धिकरण के लिए ई. क्यूनिकुली बायोमास प्राप्त करने के लिए, हमने स्तनधारी गुर्दे की कोशिका रेखा RK13 को ई. क्यूनिकुली बीजाणुओं से संक्रमित किया और इन संक्रमित कोशिकाओं को कई हफ्तों तक संवर्धित किया ताकि ई. क्यूनिकुली बढ़ सकें और गुणन कर सकें। लगभग आधे वर्ग मीटर की संक्रमित कोशिका मोनोलेयर का उपयोग करके, हम लगभग 300 मिलीग्राम माइक्रोस्पोरिडिया बीजाणुओं को शुद्ध करने और उनका उपयोग राइबोसोमों को पृथक करने में सक्षम थे। इसके बाद हमने शुद्ध किए गए बीजाणुओं को कांच के मोतियों से तोड़कर, लाइसैट्स के चरणबद्ध पॉलीइथिलीन ग्लाइकॉल पृथक्करण द्वारा कच्चे राइबोसोम को पृथक किया। इससे हमें संरचनात्मक विश्लेषण के लिए लगभग 300 µg कच्चे E. cuniculi राइबोसोम प्राप्त हुए।
इसके बाद हमने प्राप्त राइबोसोम नमूनों का उपयोग करके क्रायो-ईएम छवियां एकत्र कीं और इन छवियों को बड़े राइबोसोमल सबयूनिट, छोटे सबयूनिट के शीर्ष और छोटे सबयूनिट के अनुरूप मास्क का उपयोग करके संसाधित किया। इस प्रक्रिया के दौरान, हमने लगभग 108,000 राइबोसोमल कणों की छवियां एकत्र कीं और 2.7 Å के रिज़ॉल्यूशन के साथ क्रायो-ईएम छवियों की गणना की (पूरक चित्र 1-3)। फिर हमने क्रायो-ईएम छवियों का उपयोग करके E. cuniculi राइबोसोम से जुड़े rRNA, राइबोसोमल प्रोटीन और हाइबरनेशन फैक्टर Mdf1 का मॉडल तैयार किया (चित्र 1a, b)।
a) हाइबरनेशन कारक Mdf1 (pdb id 7QEP) के साथ कॉम्प्लेक्स में E. cuniculi राइबोसोम की संरचना। b) E. cuniculi राइबोसोम से जुड़े हाइबरनेशन कारक Mdf1 का मानचित्र। c) ज्ञात राइबोसोमल संरचनाओं के साथ माइक्रोस्पोरिडियन प्रजातियों में प्राप्त rRNA की तुलना करने वाला द्वितीयक संरचना मानचित्र। पैनल प्रवर्धित rRNA खंडों (ES) और राइबोसोम सक्रिय स्थलों की स्थिति दर्शाते हैं, जिनमें डिकोडिंग साइट (DC), सार्किनिसिन लूप (SRL) और पेप्टिडिल ट्रांसफ़रेज़ केंद्र (PTC) शामिल हैं। d) E. cuniculi राइबोसोम के पेप्टिडिल ट्रांसफ़रेज़ केंद्र के अनुरूप इलेक्ट्रॉन घनत्व से पता चलता है कि इस उत्प्रेरक स्थल की संरचना E. cuniculi परजीवी और इसके मेजबानों, जिनमें H. sapiens भी शामिल है, में समान है। डिकोडिंग केंद्र (e) की संबंधित इलेक्ट्रॉन घनत्व और डिकोडिंग केंद्र (f) की योजनाबद्ध संरचना से पता चलता है कि E. cuniculi में कई अन्य यूकेरियोट्स की तुलना में A1491 (E. coli क्रमांकन) के स्थान पर U1491 अवशेष मौजूद हैं। यह परिवर्तन दर्शाता है कि E. cuniculi इस सक्रिय स्थल को लक्षित करने वाले एंटीबायोटिक दवाओं के प्रति संवेदनशील हो सकता है।
वी. नेकाट्रिक्स और पी. लोकुस्टे राइबोसोम की पूर्व-स्थापित संरचनाओं के विपरीत (दोनों संरचनाएं एक ही माइक्रोस्पोरिडिया परिवार नोसेमाटिडी का प्रतिनिधित्व करती हैं और एक दूसरे से बहुत मिलती-जुलती हैं), 31,32 ई. क्यूनिकुली राइबोसोम आरआरएनए और प्रोटीन विखंडन की कई प्रक्रियाओं से गुजरते हैं। आगे विकृतीकरण (पूरक चित्र 4-6)। आरआरएनए में, सबसे उल्लेखनीय परिवर्तनों में प्रवर्धित 25एस आरआरएनए खंड ईएस12एल का पूर्ण नुकसान और एच39, एच41 और एच18 हेलिक्स का आंशिक क्षरण शामिल था (चित्र 1सी, पूरक चित्र 4)। राइबोसोमल प्रोटीन में, सबसे उल्लेखनीय परिवर्तनों में ईएस30 प्रोटीन का पूर्ण नुकसान और ईएल8, ईएल13, ईएल18, ईएल22, ईएल29, ईएल40, यूएस3, यूएस9, यूएस14, यूएस17 और ईएस7 प्रोटीन का छोटा होना शामिल था (पूरक चित्र 4, 5)।
इस प्रकार, एन्सेफलोटोज़ून/ऑर्डोस्पोरा प्रजातियों के जीनोम में अत्यधिक कमी उनके राइबोसोम संरचना में परिलक्षित होती है: संरचनात्मक लक्षण वर्णन के अधीन यूकेरियोटिक साइटोप्लाज्मिक राइबोसोम में से ई. क्यूनिकुली राइबोसोम में प्रोटीन सामग्री का सबसे नाटकीय नुकसान देखा गया है, और उनमें वे आरआरएनए और प्रोटीन खंड भी नहीं हैं जो न केवल यूकेरियोट्स में, बल्कि जीवन के तीनों डोमेन में व्यापक रूप से संरक्षित हैं। ई. क्यूनिकुली राइबोसोम की संरचना इन परिवर्तनों के लिए पहला आणविक मॉडल प्रदान करती है और उन विकासवादी घटनाओं को प्रकट करती है जिन्हें तुलनात्मक जीनोमिक्स और अंतःकोशिकीय जैवआणविक संरचना के अध्ययनों द्वारा अनदेखा किया गया है (पूरक चित्र 7)। नीचे, हम इनमें से प्रत्येक घटना का वर्णन उनके संभावित विकासवादी मूल और राइबोसोम कार्य पर उनके संभावित प्रभाव के साथ करते हैं।
इसके बाद हमने पाया कि बड़े rRNA ट्रंकेशन के अलावा, E. cuniculi राइबोसोम के एक सक्रिय स्थल पर rRNA में भिन्नता पाई जाती है। यद्यपि E. cuniculi राइबोसोम के पेप्टिडिल ट्रांसफ़रेज़ केंद्र की संरचना अन्य यूकेरियोटिक राइबोसोम के समान है (चित्र 1d), लेकिन न्यूक्लियोटाइड 1491 पर अनुक्रम भिन्नता के कारण डिकोडिंग केंद्र भिन्न होता है (E. coli क्रमांकन, चित्र 1e, f)। यह अवलोकन महत्वपूर्ण है क्योंकि यूकेरियोटिक राइबोसोम के डिकोडिंग स्थल में आमतौर पर G1408 और A1491 अवशेष होते हैं, जबकि जीवाणु-प्रकार के राइबोसोम में A1408 और G1491 अवशेष होते हैं। यह भिन्नता राइबोसोमल एंटीबायोटिक्स के एमिनोग्लाइकोसाइड परिवार और डिकोडिंग स्थल को लक्षित करने वाले अन्य छोटे अणुओं के प्रति जीवाणु और यूकेरियोटिक राइबोसोम की अलग-अलग संवेदनशीलता का आधार है। ई. क्यूनिकुली राइबोसोम के डिकोडिंग स्थल पर, अवशेष A1491 को U1491 से प्रतिस्थापित किया गया, जिससे संभवतः इस सक्रिय स्थल को लक्षित करने वाले छोटे अणुओं के लिए एक अद्वितीय बंधन इंटरफ़ेस का निर्माण हुआ। यही A14901 वेरिएंट अन्य माइक्रोस्पोरिडिया जैसे पी. लोकुस्टे और वी. नेकाट्रिक्स में भी मौजूद है, जो दर्शाता है कि यह माइक्रोस्पोरिडिया प्रजातियों में व्यापक रूप से फैला हुआ है (चित्र 1f)।
क्योंकि हमारे E. cuniculi राइबोसोम के नमूने चयापचय रूप से निष्क्रिय बीजाणुओं से पृथक किए गए थे, इसलिए हमने तनाव या भुखमरी की स्थितियों में पहले से वर्णित राइबोसोम बंधन के लिए E. cuniculi के क्रायो-ईएम मानचित्र का परीक्षण किया। शीतनिद्रा कारक 31,32,36,37, 38। हमने शीतनिद्रा में राइबोसोम की पहले से स्थापित संरचना का मिलान E. cuniculi राइबोसोम के क्रायो-ईएम मानचित्र से किया। डॉकिंग के लिए, शीतनिद्रा कारक Stm138 के साथ S. cerevisiae राइबोसोम, Lso232 कारक के साथ टिड्डी राइबोसोम और Mdf1 और Mdf231 कारकों के साथ V. necatrix राइबोसोम का उपयोग किया गया। साथ ही, हमने शेष कारक Mdf1 के अनुरूप क्रायो-ईएम घनत्व पाया। वी. नेकाट्रिक्स राइबोसोम से एमडीएफ1 के बंधन के समान, एमडीएफ1 ई. क्यूनिकुली राइबोसोम से भी बंधता है, जहां यह राइबोसोम के ई साइट को अवरुद्ध करता है, संभवतः शरीर के निष्क्रिय होने पर परजीवी बीजाणुओं के चयापचय रूप से निष्क्रिय होने पर राइबोसोम को उपलब्ध कराने में मदद करता है (चित्र 2)।
Mdf1 राइबोसोम के E साइट को अवरुद्ध करता है, जो परजीवी बीजाणुओं के चयापचय रूप से निष्क्रिय होने पर राइबोसोम को निष्क्रिय करने में सहायक प्रतीत होता है। E. cuniculi राइबोसोम की संरचना में, हमने पाया कि Mdf1 राइबोसोम स्टेम के L1 भाग के साथ एक अज्ञात संपर्क बनाता है, जो प्रोटीन संश्लेषण के दौरान राइबोसोम से डीएसाइलेटेड tRNA के निकलने में सहायक होता है। ये संपर्क दर्शाते हैं कि Mdf1 उसी क्रियाविधि का उपयोग करके राइबोसोम से अलग होता है जिस क्रियाविधि से डीएसाइलेटेड tRNA अलग होता है, जिससे यह समझने में सहायक हो सकता है कि राइबोसोम प्रोटीन संश्लेषण को पुनः सक्रिय करने के लिए Mdf1 को कैसे हटाता है।
हालांकि, हमारी संरचना ने Mdf1 और L1 राइबोसोम लेग (राइबोसोम का वह भाग जो प्रोटीन संश्लेषण के दौरान डीएसाइलेटेड tRNA को राइबोसोम से मुक्त करने में मदद करता है) के बीच एक अज्ञात संपर्क का खुलासा किया। विशेष रूप से, Mdf1 उन्हीं संपर्कों का उपयोग करता है जिनका उपयोग डीएसाइलेटेड tRNA अणु का एल्बो सेगमेंट करता है (चित्र 2)। इस पूर्व अज्ञात आणविक मॉडलिंग ने दिखाया कि Mdf1, डीएसाइलेटेड tRNA के समान तंत्र का उपयोग करके राइबोसोम से अलग हो जाता है, जो यह स्पष्ट करता है कि राइबोसोम प्रोटीन संश्लेषण को पुनः सक्रिय करने के लिए इस निष्क्रियता कारक को कैसे हटाता है।
rRNA मॉडल का निर्माण करते समय, हमने पाया कि E. cuniculi राइबोसोम में असामान्य रूप से मुड़े हुए rRNA खंड हैं, जिन्हें हमने फ्यूज्ड rRNA कहा (चित्र 3)। जीवन के तीनों डोमेन में फैले राइबोसोम में, rRNA ऐसी संरचनाओं में मुड़ता है जिनमें अधिकांश rRNA बेस या तो एक दूसरे के साथ बेस पेयर बनाकर मुड़ते हैं या राइबोसोमल प्रोटीन के साथ परस्पर क्रिया करते हैं38,39,40। हालांकि, E. cuniculi राइबोसोम में, rRNA अपने कुछ हेलिक्स को अनफोल्डेड rRNA क्षेत्रों में परिवर्तित करके इस फोल्डिंग सिद्धांत का उल्लंघन करते प्रतीत होते हैं।
एस. सेरेविसी, वी. नेकाट्रिक्स और ई. क्यूनिकुली में H18 25S rRNA हेलिक्स की संरचना। सामान्यतः, जीवन के तीनों डोमेन में फैले राइबोसोम में, यह लिंकर कुंडलित होकर एक RNA हेलिक्स बनाता है जिसमें 24 से 34 अवशेष होते हैं। इसके विपरीत, माइक्रोस्पोरिडिया में, यह rRNA लिंकर धीरे-धीरे दो एकल-स्ट्रैंडेड यूरिडीन-समृद्ध लिंकरों में सिमट जाता है जिनमें केवल 12 अवशेष होते हैं। इनमें से अधिकांश अवशेष विलायकों के संपर्क में रहते हैं। चित्र दर्शाता है कि परजीवी माइक्रोस्पोरिडिया rRNA तह के सामान्य सिद्धांतों का उल्लंघन करते प्रतीत होते हैं, जहाँ rRNA बेस आमतौर पर अन्य बेस से जुड़े होते हैं या rRNA-प्रोटीन अंतःक्रियाओं में शामिल होते हैं। माइक्रोस्पोरिडिया में, कुछ rRNA खंड एक प्रतिकूल तह बनाते हैं, जिसमें पूर्व rRNA हेलिक्स एक एकल-स्ट्रैंडेड खंड बन जाता है जो लगभग एक सीधी रेखा में लंबा हो जाता है। इन असामान्य क्षेत्रों की उपस्थिति माइक्रोस्पोरिडिया rRNA को न्यूनतम संख्या में RNA बेस का उपयोग करके दूरस्थ rRNA खंडों से जुड़ने की अनुमति देती है।
इस विकासवादी परिवर्तन का सबसे उल्लेखनीय उदाहरण H18 25S rRNA हेलिक्स (चित्र 3) में देखा जा सकता है। ई. कोलाई से लेकर मनुष्यों तक की प्रजातियों में, इस rRNA हेलिक्स के बेस में 24-32 न्यूक्लियोटाइड होते हैं, जो एक थोड़ी अनियमित हेलिक्स बनाते हैं। V. necatrix और P. locustae से पहले से पहचानी गई राइबोसोमल संरचनाओं में,31,32 H18 हेलिक्स के बेस आंशिक रूप से अनकॉइल्ड होते हैं, लेकिन न्यूक्लियोटाइड बेस पेयरिंग संरक्षित रहती है। हालांकि, ई. क्यूनिकुली में यह rRNA खंड सबसे छोटे लिंकर 228UUUGU232 और 301UUUUUUUUU307 बन जाते हैं। विशिष्ट rRNA खंडों के विपरीत, ये यूरिडीन-समृद्ध लिंकर कुंडलित नहीं होते हैं या राइबोसोमल प्रोटीन के साथ व्यापक संपर्क नहीं बनाते हैं। इसके बजाय, वे विलायक-खुली और पूरी तरह से अनफोल्डेड संरचनाएं अपनाते हैं जिनमें rRNA स्ट्रैंड लगभग सीधे फैले होते हैं। यह विस्तारित संरचना बताती है कि कैसे ई. क्यूनिकुली एच16 और एच18 आरआरएनए हेलिक्स के बीच 33 Å के अंतर को भरने के लिए केवल 12 आरएनए बेस का उपयोग करता है, जबकि अन्य प्रजातियों को इस अंतर को भरने के लिए कम से कम दोगुने आरआरएनए बेस की आवश्यकता होती है।
इस प्रकार, हम यह प्रदर्शित कर सकते हैं कि ऊर्जा की दृष्टि से प्रतिकूल तह बनने की प्रक्रिया के माध्यम से, परजीवी माइक्रोस्पोरिडिया ने उन rRNA खंडों को भी संकुचित करने की रणनीति विकसित की है जो जीवन के तीनों डोमेन में प्रजातियों के बीच व्यापक रूप से संरक्षित रहते हैं। स्पष्ट रूप से, rRNA हेलिक्स को छोटे पॉली-यू लिंकर में बदलने वाले उत्परिवर्तनों को संचित करके, E. cuniculi दूरस्थ rRNA खंडों के लिगेशन के लिए यथासंभव कम न्यूक्लियोटाइड वाले असामान्य rRNA खंड बना सकता है। यह समझने में सहायक है कि माइक्रोस्पोरिडिया ने अपनी संरचनात्मक और कार्यात्मक अखंडता को खोए बिना अपनी मूल आणविक संरचना में नाटकीय कमी कैसे प्राप्त की।
ई. क्यूनिकुली आरआरएनए की एक और असामान्य विशेषता बिना मोटाई वाले आरआरएनए की उपस्थिति है (चित्र 4)। उभार बिना बेस पेयर वाले न्यूक्लियोटाइड होते हैं जो आरएनए हेलिक्स में छिपने के बजाय उससे बाहर की ओर मुड़ जाते हैं। अधिकांश आरआरएनए उभार आणविक चिपकने वाले पदार्थ के रूप में कार्य करते हैं, जो आसन्न राइबोसोमल प्रोटीन या अन्य आरआरएनए खंडों को बांधने में मदद करते हैं। कुछ उभार कब्जों की तरह कार्य करते हैं, जिससे आरआरएनए हेलिक्स उत्पादक प्रोटीन संश्लेषण के लिए इष्टतम रूप से लचीला और मुड़ सकता है।
a) ई. क्यूनिकुली राइबोसोम संरचना में एक rRNA उभार (एस. सेरेविसी क्रमांकन) अनुपस्थित है, लेकिन अधिकांश अन्य यूकेरियोट्स में मौजूद है। b) ई. कोलाई, एस. सेरेविसी, एच. सैपियंस और ई. क्यूनिकुली के आंतरिक राइबोसोम। परजीवियों में कई प्राचीन, अत्यधिक संरक्षित rRNA उभारों की कमी होती है। ये मोटाई राइबोसोम संरचना को स्थिर करती हैं; इसलिए, माइक्रोस्पोरिडिया में इनकी अनुपस्थिति माइक्रोस्पोरिडिया परजीवियों में rRNA तह की कम स्थिरता को दर्शाती है। P स्टेम (बैक्टीरिया में L7/L12 स्टेम) के साथ तुलना से पता चलता है कि rRNA उभारों का लुप्त होना कभी-कभी लुप्त उभारों के बगल में नए उभारों के प्रकट होने के साथ मेल खाता है। 23S/28S rRNA में H42 हेलिक्स में एक प्राचीन उभार (सैकरोमाइसिस सेरेविसी में U1206) है, जिसकी आयु जीवन के तीन डोमेन में इसके संरक्षण के कारण कम से कम 3.5 अरब वर्ष होने का अनुमान है। माइक्रोस्पोरिडिया में, यह उभार गायब हो जाता है। हालाँकि, गायब हुए उभार के बगल में एक नया उभार दिखाई देता है (ई. क्यूनिकुली में A1306)।
आश्चर्यजनक रूप से, हमने पाया कि ई. क्यूनिकुली राइबोसोम में अन्य प्रजातियों में पाए जाने वाले अधिकांश आरआरएनए उभार अनुपस्थित होते हैं, जिनमें अन्य यूकेरियोट्स में संरक्षित 30 से अधिक उभार भी शामिल हैं (चित्र 4ए)। इस कमी के कारण राइबोसोमल उपइकाइयों और आसन्न आरआरएनए हेलिक्स के बीच कई संपर्क समाप्त हो जाते हैं, जिससे कभी-कभी राइबोसोम के भीतर बड़े खोखले स्थान बन जाते हैं, जो ई. क्यूनिकुली राइबोसोम को अधिक पारंपरिक राइबोसोम की तुलना में अधिक छिद्रपूर्ण बनाते हैं (चित्र 4बी)। विशेष रूप से, हमने पाया कि इनमें से अधिकांश उभार पहले से पहचाने गए वी. नेकाट्रिक्स और पी. लोकुस्टे राइबोसोम संरचनाओं में भी अनुपस्थित थे, जिन्हें पिछले संरचनात्मक विश्लेषणों31,32 में अनदेखा किया गया था।
कभी-कभी rRNA उभारों के लुप्त होने के साथ-साथ लुप्त उभार के बगल में नए उभारों का विकास भी हो जाता है। उदाहरण के लिए, राइबोसोमल P-स्टेम में U1208 उभार (सैकरोमाइसिस सेरेविसी में) होता है जो ई. कोलाई से मनुष्यों तक जीवित रहा है और इसलिए इसकी आयु लगभग 3.5 अरब वर्ष मानी जाती है। प्रोटीन संश्लेषण के दौरान, यह उभार P-स्टेम को खुली और बंद अवस्थाओं के बीच गति करने में मदद करता है ताकि राइबोसोम अनुवाद कारकों को सक्रिय स्थल तक पहुंचा सके। ई. क्यूनिकुली राइबोसोम में, यह उभार अनुपस्थित होता है; हालांकि, केवल तीन बेस पेयर में स्थित एक नया उभार (G883) P-स्टेम की इष्टतम लचीलेपन की बहाली में योगदान कर सकता है (चित्र 4c)।
बिना उभार वाले rRNA पर हमारे डेटा से पता चलता है कि rRNA का न्यूनतमकरण केवल राइबोसोम की सतह पर rRNA तत्वों के नुकसान तक ही सीमित नहीं है, बल्कि इसमें राइबोसोम का केंद्रक भी शामिल हो सकता है, जिससे एक परजीवी-विशिष्ट आणविक दोष उत्पन्न होता है जिसका वर्णन मुक्त-जीवित कोशिकाओं में नहीं किया गया है। जीवित प्रजातियों में यह देखा गया है।
मानक राइबोसोमल प्रोटीन और rRNA का मॉडलिंग करने के बाद, हमने पाया कि पारंपरिक राइबोसोमल घटक क्रायो-ईएम छवि के तीन भागों की व्याख्या नहीं कर सकते। इनमें से दो खंड आकार में छोटे अणु हैं (चित्र 5, पूरक चित्र 8)। पहला खंड राइबोसोमल प्रोटीन uL15 और eL18 के बीच उस स्थान पर स्थित है जहाँ आमतौर पर eL18 का C-टर्मिनस होता है, जो E. cuniculi में छोटा होता है। हालाँकि हम इस अणु की पहचान निर्धारित नहीं कर सकते, लेकिन इस घनत्व द्वीप का आकार और आकृति स्पर्मिडाइन अणुओं की उपस्थिति से अच्छी तरह से समझाई जा सकती है। राइबोसोम से इसका बंधन uL15 प्रोटीन (Asp51 और Arg56) में माइक्रोस्पोरिडिया-विशिष्ट उत्परिवर्तन द्वारा स्थिर होता है, जो इस छोटे अणु के लिए राइबोसोम की आत्मीयता को बढ़ाते प्रतीत होते हैं, क्योंकि वे uL15 को छोटे अणु को राइबोसोमल संरचना में लपेटने की अनुमति देते हैं। (पूरक चित्र 2)। 8, अतिरिक्त डेटा 1, 2)।
क्रायो-ईएम इमेजिंग से ई. क्यूनिकुली राइबोसोम से बंधे राइबोज के बाहर न्यूक्लियोटाइड की उपस्थिति दिखाई देती है। ई. क्यूनिकुली राइबोसोम में, यह न्यूक्लियोटाइड अधिकांश अन्य यूकेरियोटिक राइबोसोम में 25S rRNA A3186 न्यूक्लियोटाइड (सैकरोमाइसिस सेरेविसी क्रमांकन) के समान स्थान पर स्थित है। b ई. क्यूनिकुली की राइबोसोमल संरचना में, यह न्यूक्लियोटाइड राइबोसोमल प्रोटीन uL9 और eL20 के बीच स्थित है, जिससे दोनों प्रोटीनों के बीच संपर्क स्थिर होता है। cd माइक्रोस्पोरिडिया प्रजातियों के बीच eL20 अनुक्रम संरक्षण विश्लेषण। माइक्रोस्पोरिडिया प्रजातियों का फाइलोजेनेटिक वृक्ष (c) और eL20 प्रोटीन का मल्टीपल सीक्वेंस एलाइनमेंट (d) दर्शाते हैं कि न्यूक्लियोटाइड-बाइंडिंग अवशेष F170 और K172 अधिकांश विशिष्ट माइक्रोस्पोरिडिया में संरक्षित हैं, सिवाय S. lophii के, जो प्रारंभिक शाखाओं वाले माइक्रोस्पोरिडिया को छोड़कर, जिसमें ES39L rRNA एक्सटेंशन बरकरार है। e यह चित्र दर्शाता है कि न्यूक्लियोटाइड-बाइंडिंग अवशेष F170 और K172 केवल अत्यधिक कम किए गए माइक्रोस्पोरिडिया जीनोम के eL20 में मौजूद हैं, अन्य यूकेरियोट्स में नहीं। कुल मिलाकर, ये आंकड़े बताते हैं कि माइक्रोस्पोरिडियन राइबोसोम ने एक न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग साइट विकसित की है जो AMP अणुओं को बांधती है और राइबोसोमल संरचना में प्रोटीन-प्रोटीन अंतःक्रियाओं को स्थिर करने के लिए उनका उपयोग करती है। माइक्रोस्पोरिडिया में इस बाइंडिंग साइट का उच्च संरक्षण और अन्य यूकेरियोट्स में इसकी अनुपस्थिति से पता चलता है कि यह साइट माइक्रोस्पोरिडिया के लिए एक चयनात्मक अस्तित्व लाभ प्रदान कर सकती है। इस प्रकार, माइक्रोस्पोरिडिया राइबोसोम में न्यूक्लियोटाइड-बाइंडिंग पॉकेट, जैसा कि पहले वर्णित किया गया था, rRNA के क्षरण का एक विकृत लक्षण या अंतिम रूप नहीं प्रतीत होता है, बल्कि एक उपयोगी विकासवादी नवाचार है जो माइक्रोस्पोरिडिया राइबोसोम को छोटे अणुओं को सीधे बांधने और उन्हें राइबोसोम के आणविक निर्माण खंडों के रूप में उपयोग करने की अनुमति देता है। इस खोज से माइक्रोस्पोरिडिया राइबोसोम एकमात्र ऐसा राइबोसोम बन जाता है जो अपने संरचनात्मक निर्माण खंड के रूप में एक एकल न्यूक्लियोटाइड का उपयोग करता है। (f न्यूक्लियोटाइड बंधन से व्युत्पन्न काल्पनिक विकासवादी मार्ग)
दूसरा कम आणविक भार घनत्व राइबोसोमल प्रोटीन uL9 और eL30 के बीच के इंटरफ़ेस पर स्थित है (चित्र 5a)। इस इंटरफ़ेस को पहले सैकरोमाइसिस सेरेविसी राइबोसोम की संरचना में rRNA A3186 (ES39L rRNA एक्सटेंशन का भाग) के 25S न्यूक्लियोटाइड के लिए एक बंधन स्थल के रूप में वर्णित किया गया था।38 यह दिखाया गया कि पतित P. locustae ES39L राइबोसोम में, यह इंटरफ़ेस एक अज्ञात एकल न्यूक्लियोटाइड को बांधता है।31 यह माना जाता है कि यह न्यूक्लियोटाइड rRNA का एक कम किया हुआ अंतिम रूप है, जिसमें rRNA की लंबाई लगभग 130-230 बेस होती है। ES39L एक एकल न्यूक्लियोटाइड में कम हो जाता है।32.43 हमारी क्रायो-ईएम छवियां इस विचार का समर्थन करती हैं कि घनत्व को न्यूक्लियोटाइड द्वारा समझाया जा सकता है। हालांकि, हमारी संरचना के उच्च संकल्प ने दिखाया कि यह न्यूक्लियोटाइड एक एक्स्ट्रा राइबोसोमल अणु है, संभवतः एएमपी (चित्र 5ए, बी)।
इसके बाद हमने पूछा कि क्या न्यूक्लियोटाइड बंधन स्थल ई. क्यूनिकुली राइबोसोम में प्रकट हुआ या यह पहले से मौजूद था। चूंकि न्यूक्लियोटाइड बंधन मुख्य रूप से ईएल30 राइबोसोमल प्रोटीन में Phe170 और Lys172 अवशेषों द्वारा मध्यस्थ होता है, इसलिए हमने 4396 प्रतिनिधि यूकेरियोट्स में इन अवशेषों के संरक्षण का आकलन किया। जैसा कि ऊपर uL15 के मामले में था, हमने पाया कि Phe170 और Lys172 अवशेष केवल विशिष्ट माइक्रोस्पोरिडिया में ही अत्यधिक संरक्षित हैं, लेकिन अन्य यूकेरियोट्स में अनुपस्थित हैं, जिनमें असामान्य माइक्रोस्पोरिडिया माइटोस्पोरिडियम और एम्फीएम्बलीस शामिल हैं, जिनमें ES39L rRNA खंड कम नहीं होता है 44, 45, 46 (चित्र 5c-e)।
कुल मिलाकर, ये आंकड़े इस विचार का समर्थन करते हैं कि ई. क्यूनिकुली और संभवतः अन्य प्रमुख माइक्रोस्पोरिडिया ने आरआरएनए और प्रोटीन के स्तर में गिरावट की भरपाई के लिए राइबोसोम संरचना में बड़ी संख्या में छोटे मेटाबोलाइट्स को कुशलतापूर्वक ग्रहण करने की क्षमता विकसित की है। ऐसा करने से, उन्होंने राइबोसोम के बाहर न्यूक्लियोटाइड्स को बांधने की एक अनूठी क्षमता विकसित की है, जो दर्शाती है कि परजीवी आणविक संरचनाएं प्रचुर मात्रा में छोटे मेटाबोलाइट्स को ग्रहण करके और उन्हें विघटित आरएनए और प्रोटीन खंडों के संरचनात्मक अनुकरण के रूप में उपयोग करके क्षतिपूर्ति करती हैं।
हमारे क्रायो-ईएम मानचित्र का तीसरा अप्रतिबिम्बित भाग, जो बड़े राइबोसोमल सबयूनिट में पाया गया। हमारे मानचित्र का अपेक्षाकृत उच्च रिज़ॉल्यूशन (2.6 Å) यह दर्शाता है कि यह घनत्व बड़े साइड चेन अवशेषों के अद्वितीय संयोजनों वाले प्रोटीनों से संबंधित है, जिससे हमें इस घनत्व को एक पूर्व अज्ञात राइबोसोमल प्रोटीन के रूप में पहचानने में मदद मिली, जिसे हमने msL2 (माइक्रोस्पोरिडिया-विशिष्ट प्रोटीन L2) नाम दिया (विधियाँ, चित्र 6)। हमारी समरूपता खोज से पता चला कि msL2, एन्सेफेलिटर और ओरोस्पोरिडियम जीनस के माइक्रोस्पोरिडिया क्लेड में संरक्षित है, लेकिन अन्य प्रजातियों में अनुपस्थित है, जिनमें अन्य माइक्रोस्पोरिडिया भी शामिल हैं। राइबोसोमल संरचना में, msL2 विस्तारित ES31L rRNA के लुप्त होने से बने अंतराल को भरता है। इस रिक्त स्थान में, msL2 rRNA फोल्डिंग को स्थिर करने में मदद करता है और ES31L के लुप्त होने की भरपाई कर सकता है (चित्र 6)।
a) E. cuniculi राइबोसोम में पाए जाने वाले माइक्रोस्पोरिडिया-विशिष्ट राइबोसोमल प्रोटीन msL2 का इलेक्ट्रॉन घनत्व और मॉडल। b) अधिकांश यूकेरियोटिक राइबोसोम, जिनमें Saccharomyces cerevisiae का 80S राइबोसोम भी शामिल है, में अधिकांश माइक्रोस्पोरिडियन प्रजातियों में ES19L rRNA प्रवर्धन लुप्त हो गया है। V. necatrix माइक्रोस्पोरिडिया राइबोसोम की पूर्व-स्थापित संरचना से पता चलता है कि इन परजीवियों में ES19L की हानि की भरपाई नए msL1 राइबोसोमल प्रोटीन के विकास द्वारा की जाती है। इस अध्ययन में, हमने पाया कि E. cuniculi राइबोसोम ने भी ES19L की हानि की स्पष्ट क्षतिपूर्ति के रूप में एक अतिरिक्त राइबोसोमल RNA मिमिक प्रोटीन विकसित किया है। हालांकि, msL2 (वर्तमान में काल्पनिक ECU06_1135 प्रोटीन के रूप में एनोटेट किया गया) और msL1 की संरचनात्मक और विकासवादी उत्पत्ति भिन्न-भिन्न है। विकासवादी दृष्टि से असंबंधित msL1 और msL2 राइबोसोमल प्रोटीनों की उत्पत्ति की यह खोज बताती है कि यदि राइबोसोम अपने rRNA में हानिकारक उत्परिवर्तन जमा कर लेते हैं, तो वे निकट संबंधी प्रजातियों के एक छोटे से उपसमूह में भी संरचनात्मक विविधता के अभूतपूर्व स्तर तक पहुँच सकते हैं। यह खोज माइटोकॉन्ड्रियल राइबोसोम की उत्पत्ति और विकास को स्पष्ट करने में सहायक हो सकती है, जो अपने अत्यधिक कम rRNA और विभिन्न प्रजातियों में प्रोटीन संरचना की असामान्य परिवर्तनशीलता के लिए जाना जाता है।
इसके बाद हमने msL2 प्रोटीन की तुलना पहले वर्णित msL1 प्रोटीन से की, जो V. necatrix राइबोसोम में पाया जाने वाला एकमात्र ज्ञात माइक्रोस्पोरिडिया-विशिष्ट राइबोसोमल प्रोटीन है। हम यह परीक्षण करना चाहते थे कि क्या msL1 और msL2 विकासवादी रूप से संबंधित हैं। हमारे विश्लेषण से पता चला कि msL1 और msL2 राइबोसोमल संरचना में एक ही गुहा में स्थित हैं, लेकिन उनकी प्राथमिक और तृतीयक संरचनाएं भिन्न हैं, जो उनके स्वतंत्र विकासवादी उद्भव को इंगित करती हैं (चित्र 6)। इस प्रकार, msL2 की हमारी खोज इस बात का प्रमाण प्रदान करती है कि सघन यूकेरियोटिक प्रजातियों के समूह rRNA खंडों के नुकसान की भरपाई के लिए संरचनात्मक रूप से भिन्न राइबोसोमल प्रोटीन को स्वतंत्र रूप से विकसित कर सकते हैं। यह निष्कर्ष उल्लेखनीय है क्योंकि अधिकांश साइटोप्लाज्मिक यूकेरियोटिक राइबोसोम में एक अपरिवर्तनीय प्रोटीन होता है, जिसमें 81 राइबोसोमल प्रोटीन का एक ही परिवार शामिल है। विस्तारित rRNA खंडों के लुप्त होने के परिणामस्वरूप माइक्रोस्पोरिडिया के विभिन्न समूहों में msL1 और msL2 की उपस्थिति से पता चलता है कि परजीवी की आणविक संरचना के क्षरण के कारण परजीवी क्षतिपूर्ति उत्परिवर्तन की तलाश करते हैं, जिससे अंततः विभिन्न परजीवी आबादी में उनकी संरचनाओं का अधिग्रहण हो सकता है।
अंत में, जब हमारा मॉडल पूरा हो गया, तो हमने ई. क्यूनिकुली राइबोसोम की संरचना की तुलना जीनोम अनुक्रम से अनुमानित संरचना से की। कई राइबोसोमल प्रोटीन, जिनमें eL14, eL38, eL41 और eS30 शामिल हैं, पहले ई. क्यूनिकुली जीनोम में अनुपस्थित माने जाते थे, क्योंकि ई. क्यूनिकुली जीनोम में उनके समरूप प्रोटीन स्पष्ट रूप से अनुपस्थित थे। अधिकांश अन्य अत्यधिक कम हुए अंतःकोशिकीय परजीवियों और अंतःसहजीवी जीवों में भी कई राइबोसोमल प्रोटीनों की कमी का अनुमान लगाया गया है। उदाहरण के लिए, यद्यपि अधिकांश मुक्त-जीवित जीवाणुओं में 54 राइबोसोमल प्रोटीनों का एक ही परिवार होता है, लेकिन मेजबान-प्रतिबंधित जीवाणुओं के प्रत्येक विश्लेषित जीनोम में इनमें से केवल 11 प्रोटीन परिवारों के ही समरूप प्रोटीन पाए जाते हैं। इस धारणा के समर्थन में, वी. नेकाट्रिक्स और पी. लोकुस्टे माइक्रोस्पोरिडिया में राइबोसोमल प्रोटीनों की कमी प्रयोगात्मक रूप से देखी गई है, जिनमें eL38 और eL4131,32 प्रोटीन अनुपस्थित होते हैं।
हालांकि, हमारी संरचनाओं से पता चलता है कि E. cuniculi राइबोसोम में वास्तव में केवल eL38, eL41 और eS30 ही लुप्त हो जाते हैं। eL14 प्रोटीन संरक्षित था और हमारी संरचना ने दिखाया कि समरूपता खोज में यह प्रोटीन क्यों नहीं पाया जा सका (चित्र 7)। E. cuniculi राइबोसोम में, rRNA-प्रवर्धित ES39L के क्षरण के कारण eL14 बंधन स्थल का अधिकांश भाग लुप्त हो जाता है। ES39L की अनुपस्थिति में, eL14 ने अपनी अधिकांश द्वितीयक संरचना खो दी, और E. cuniculi और S. cerevisiae में eL14 अनुक्रम का केवल 18% भाग ही समान था। अनुक्रम का यह कम संरक्षण उल्लेखनीय है क्योंकि Saccharomyces cerevisiae और Homo sapiens—जो जीव 1.5 अरब वर्षों के अंतराल पर विकसित हुए—भी eL14 में 51% से अधिक समान अवशेष साझा करते हैं। संरक्षण की यह असामान्य हानि इस बात की व्याख्या करती है कि E. cuniculi eL14 को वर्तमान में संभावित M970_061160 प्रोटीन के रूप में एनोटेट किया गया है, न कि eL1427 राइबोसोमल प्रोटीन के रूप में।
माइक्रोस्पोरिडिया राइबोसोम ने ES39L rRNA एक्सटेंशन खो दिया, जिससे eL14 राइबोसोमल प्रोटीन बाइंडिंग साइट आंशिक रूप से समाप्त हो गई। ES39L की अनुपस्थिति में, eL14 माइक्रोस्पोर प्रोटीन की द्वितीयक संरचना में परिवर्तन होता है, जिसमें पूर्व rRNA-बाइंडिंग α-हेलिक्स न्यूनतम लंबाई के लूप में परिवर्तित हो जाता है। b बहु अनुक्रम संरेखण दर्शाता है कि eL14 प्रोटीन यूकेरियोटिक प्रजातियों में अत्यधिक संरक्षित है (यीस्ट और मानव समरूपों के बीच 57% अनुक्रम समानता), लेकिन माइक्रोस्पोरिडिया में कम संरक्षित और भिन्न है (जिसमें 24% से अधिक अवशेष eL14 समरूप के समान नहीं हैं)। (S. cerevisiae या H. sapiens से)। यह कम अनुक्रम संरक्षण और द्वितीयक संरचना परिवर्तनशीलता बताती है कि eL14 समरूप E. cuniculi में कभी क्यों नहीं पाया गया और क्यों माना जाता है कि यह प्रोटीन E. cuniculi में लुप्त हो गया है। इसके विपरीत, E. cuniculi eL14 को पहले एक संभावित M970_061160 प्रोटीन के रूप में एनोटेट किया गया था। यह अवलोकन बताता है कि माइक्रोस्पोरिडिया जीनोम विविधता का वर्तमान में अतिरंजित अनुमान लगाया जा रहा है: कुछ जीन जिन्हें वर्तमान में माइक्रोस्पोरिडिया में लुप्त माना जाता है, वास्तव में संरक्षित हैं, हालांकि अत्यधिक विभेदित रूपों में; इसके बजाय, कुछ जीन जिन्हें कृमि-विशिष्ट प्रोटीन के लिए माइक्रोस्पोरिडिया जीन को कोड करने वाला माना जाता है (उदाहरण के लिए, काल्पनिक प्रोटीन M970_061160) वास्तव में अन्य यूकेरियोट्स में पाए जाने वाले बहुत विविध प्रोटीन को कोड करते हैं।
इस निष्कर्ष से पता चलता है कि rRNA के विसंक्रमण से आसन्न राइबोसोमल प्रोटीनों में अनुक्रम संरक्षण में भारी कमी आ सकती है, जिससे ये प्रोटीन समरूपता खोजों के लिए अप्राप्य हो जाते हैं। इस प्रकार, हम छोटे जीनोम वाले जीवों में आणविक क्षरण की वास्तविक मात्रा का अधिक अनुमान लगा सकते हैं, क्योंकि कुछ प्रोटीन जिन्हें लुप्त माना जाता है, वास्तव में मौजूद रहते हैं, हालांकि अत्यधिक परिवर्तित रूपों में।
जीनोम के अत्यधिक संकुचन की स्थिति में परजीवी अपनी आणविक मशीनरी के कार्य को कैसे बनाए रख सकते हैं? हमारा अध्ययन इस प्रश्न का उत्तर ई. क्यूनिकुली की जटिल आणविक संरचना (राइबोसोम) का वर्णन करके देता है, जो कि सबसे छोटे यूकेरियोटिक जीनोम वाले जीवों में से एक है।
लगभग दो दशकों से यह ज्ञात है कि सूक्ष्मजीवी परजीवियों में प्रोटीन और आरएनए अणु अक्सर मुक्त-जीवित प्रजातियों में उनके समरूप अणुओं से भिन्न होते हैं क्योंकि उनमें गुणवत्ता नियंत्रण केंद्रों की कमी होती है, मुक्त-जीवित सूक्ष्मजीवों में उनका आकार 50% तक कम हो जाता है, आदि। इनमें कई दुर्बल करने वाले उत्परिवर्तन होते हैं जो तह और कार्य को बाधित करते हैं। उदाहरण के लिए, कई अंतःकोशिकीय परजीवियों और अंतःसहजीवी सहित छोटे जीनोम वाले जीवों के राइबोसोम में मुक्त-जीवित प्रजातियों की तुलना में कई राइबोसोमल प्रोटीन और एक तिहाई तक आरआरएनए न्यूक्लियोटाइड की कमी होने की उम्मीद है 27, 29, 30, 49। हालांकि, परजीवी में इन अणुओं के कार्य करने का तरीका काफी हद तक एक रहस्य बना हुआ है, जिसका अध्ययन मुख्य रूप से तुलनात्मक जीनोमिक्स के माध्यम से किया जाता है।
हमारे अध्ययन से पता चलता है कि वृहद अणुओं की संरचना विकास के कई पहलुओं को उजागर कर सकती है, जिन्हें अंतःकोशिकीय परजीवियों और अन्य मेजबान-प्रतिबंधित जीवों के पारंपरिक तुलनात्मक जीनोमिक अध्ययनों से निकालना मुश्किल है (पूरक चित्र 7)। उदाहरण के लिए, eL14 प्रोटीन का उदाहरण दर्शाता है कि हम परजीवी प्रजातियों में आणविक तंत्र के वास्तविक क्षरण की मात्रा को अधिक आंक सकते हैं। अब यह माना जाता है कि एन्सेफेलिटिक परजीवियों में सैकड़ों माइक्रोस्पोरिडिया-विशिष्ट जीन होते हैं। हालांकि, हमारे परिणाम दर्शाते हैं कि इनमें से कुछ विशिष्ट प्रतीत होने वाले जीन वास्तव में अन्य यूकेरियोट्स में पाए जाने वाले जीनों के बहुत भिन्न रूप हैं। इसके अलावा, msL2 प्रोटीन का उदाहरण दर्शाता है कि हम कैसे नए राइबोसोमल प्रोटीनों को अनदेखा कर देते हैं और परजीवी आणविक मशीनों की सामग्री को कम आंकते हैं। छोटे अणुओं का उदाहरण दर्शाता है कि हम कैसे परजीवी आणविक संरचनाओं में सबसे अद्भुत नवाचारों को अनदेखा कर सकते हैं जो उन्हें नई जैविक गतिविधि प्रदान कर सकते हैं।
कुल मिलाकर, ये परिणाम मेजबान-प्रतिबंधित जीवों और मुक्त-जीवित जीवों में उनके समकक्षों की आणविक संरचनाओं के बीच अंतर की हमारी समझ को बेहतर बनाते हैं। हम दिखाते हैं कि आणविक मशीनें, जिन्हें लंबे समय से संकुचित, पतित और विभिन्न दुर्बलकारी उत्परिवर्तनों के अधीन माना जाता था, वास्तव में व्यवस्थित रूप से अनदेखी की गई असामान्य संरचनात्मक विशेषताओं का एक समूह रखती हैं।
दूसरी ओर, ई. क्यूनिकुली के राइबोसोम में पाए गए गैर-भारी आरआरएनए खंड और संलयन खंड यह संकेत देते हैं कि जीनोम में कमी बुनियादी आणविक तंत्र के उन हिस्सों को भी बदल सकती है जो जीवन के तीनों डोमेन में संरक्षित हैं - लगभग 3.5 अरब वर्षों के बाद प्रजातियों के स्वतंत्र विकास के बाद।
एंडोसिम्बायोटिक बैक्टीरिया में आरएनए अणुओं के पिछले अध्ययनों के आलोक में, ई. क्यूनिकुली राइबोसोम में उभार रहित और जुड़े हुए आरआरएनए खंड विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं। उदाहरण के लिए, एफिड एंडोसिम्बायोट बुचनेरा एफिडिकोला में, आरआरएनए और टीआरएनए अणुओं में ए+टी संरचना पूर्वाग्रह और गैर-मानक बेस युग्मों के उच्च अनुपात के कारण तापमान-संवेदनशील संरचनाएं पाई गई हैं।20,50 आरएनए में ये परिवर्तन, साथ ही प्रोटीन अणुओं में परिवर्तन, अब एंडोसिम्बायोट्स की साझेदारों पर अत्यधिक निर्भरता और ऊष्मा स्थानांतरण करने में उनकी अक्षमता के लिए जिम्मेदार माने जाते हैं।21, 23 यद्यपि परजीवी माइक्रोस्पोरिडिया आरआरएनए में संरचनात्मक रूप से विशिष्ट परिवर्तन होते हैं, इन परिवर्तनों की प्रकृति से पता चलता है कि कम तापीय स्थिरता और चैपरोन प्रोटीन पर अधिक निर्भरता कम जीनोम वाले जीवों में आरएनए अणुओं की सामान्य विशेषताएं हो सकती हैं।
दूसरी ओर, हमारी संरचनाएं दर्शाती हैं कि परजीवी माइक्रोस्पोरिडिया ने व्यापक रूप से संरक्षित rRNA और प्रोटीन खंडों का प्रतिरोध करने की एक अनूठी क्षमता विकसित की है, जिससे वे प्रचुर मात्रा में और आसानी से उपलब्ध छोटे मेटाबोलाइट्स का उपयोग पतित rRNA और प्रोटीन खंडों के संरचनात्मक अनुकरण के रूप में करने की क्षमता विकसित कर लेते हैं। आणविक संरचना का क्षरण। इस मत का समर्थन इस तथ्य से होता है कि E. cuniculi के rRNA और राइबोसोम में प्रोटीन खंडों की हानि की भरपाई करने वाले छोटे अणु uL15 और eL30 प्रोटीन में माइक्रोस्पोरिडिया-विशिष्ट अवशेषों से बंधते हैं। यह बताता है कि राइबोसोम से छोटे अणुओं का बंधन सकारात्मक चयन का परिणाम हो सकता है, जिसमें राइबोसोमल प्रोटीन में माइक्रोस्पोरिडिया-विशिष्ट उत्परिवर्तन को छोटे अणुओं के लिए राइबोसोम की आत्मीयता बढ़ाने की उनकी क्षमता के लिए चुना गया है, जिससे अधिक कुशल राइबोसोमल जीव बन सकते हैं। यह खोज सूक्ष्मजीव परजीवियों की आणविक संरचना में एक महत्वपूर्ण नवाचार को उजागर करती है और हमें इस बात की बेहतर समझ प्रदान करती है कि परजीवी आणविक संरचनाएं अपचायक विकास के बावजूद अपने कार्य को कैसे बनाए रखती हैं।
वर्तमान में, इन छोटे अणुओं की पहचान स्पष्ट नहीं है। यह स्पष्ट नहीं है कि राइबोसोमल संरचना में इन छोटे अणुओं की उपस्थिति विभिन्न माइक्रोस्पोरिडिया प्रजातियों में भिन्न क्यों होती है। विशेष रूप से, यह स्पष्ट नहीं है कि E. cuniculi और P. locustae के राइबोसोम में न्यूक्लियोटाइड बंधन क्यों देखा जाता है, जबकि V. necatrix के eL20 और K172 प्रोटीन में F170 अवशेष मौजूद होता है। यह विलोपन 43 uL6 अवशेष (न्यूक्लियोटाइड बंधन पॉकेट के निकट स्थित) के कारण हो सकता है, जो V. necatrix में टायरोसिन है, जबकि E. cuniculi और P. locustae में थ्रेओनिन है। Tyr43 की बड़ी एरोमैटिक साइड चेन स्टेरिक ओवरलैप के कारण न्यूक्लियोटाइड बंधन में बाधा उत्पन्न कर सकती है। वैकल्पिक रूप से, स्पष्ट न्यूक्लियोटाइड विलोपन क्रायो-ईएम इमेजिंग के कम रिज़ॉल्यूशन के कारण हो सकता है, जो वी. नेकाट्रिक्स राइबोसोमल टुकड़ों के मॉडलिंग में बाधा डालता है।
दूसरी ओर, हमारा शोध यह दर्शाता है कि जीनोम क्षय की प्रक्रिया एक रचनात्मक शक्ति हो सकती है। विशेष रूप से, ई. क्यूनिकुली राइबोसोम की संरचना से पता चलता है कि माइक्रोस्पोरिडिया राइबोसोम में rRNA और प्रोटीन खंडों की कमी से एक ऐसा विकासवादी दबाव बनता है जो राइबोसोम संरचना में परिवर्तन को बढ़ावा देता है। ये भिन्नताएं राइबोसोम के सक्रिय स्थल से काफी दूर पाई जाती हैं और ऐसा प्रतीत होता है कि ये इष्टतम राइबोसोम संयोजन को बनाए रखने (या बहाल करने) में मदद करती हैं, जो अन्यथा कम rRNA के कारण बाधित हो जाता। इससे यह संकेत मिलता है कि माइक्रोस्पोरिडिया राइबोसोम का एक प्रमुख नवाचार जीन बहाव को संतुलित करने की आवश्यकता के रूप में विकसित हुआ प्रतीत होता है।
शायद इसे न्यूक्लियोटाइड बंधन के उदाहरण से सबसे अच्छी तरह समझाया जा सकता है, जो अब तक अन्य जीवों में नहीं देखा गया है। यह तथ्य कि न्यूक्लियोटाइड-बंधन अवशेष विशिष्ट माइक्रोस्पोरिडिया में मौजूद होते हैं, लेकिन अन्य यूकेरियोट्स में नहीं, यह दर्शाता है कि न्यूक्लियोटाइड-बंधन स्थल केवल लुप्त होने की प्रतीक्षा कर रहे अवशेष नहीं हैं, या rRNA के व्यक्तिगत न्यूक्लियोटाइड के रूप में पुनर्स्थापित होने का अंतिम स्थान नहीं हैं। इसके बजाय, यह स्थल एक उपयोगी विशेषता प्रतीत होती है जो सकारात्मक चयन के कई चरणों में विकसित हुई होगी। न्यूक्लियोटाइड बंधन स्थल प्राकृतिक चयन का एक उप-उत्पाद हो सकते हैं: एक बार जब ES39L विघटित हो जाता है, तो माइक्रोस्पोरिडिया को ES39L की अनुपस्थिति में इष्टतम राइबोसोम जैवजनन को बहाल करने के लिए क्षतिपूर्ति की तलाश करनी पड़ती है। चूंकि यह न्यूक्लियोटाइड ES39L में A3186 न्यूक्लियोटाइड के आणविक संपर्कों की नकल कर सकता है, इसलिए यह न्यूक्लियोटाइड अणु राइबोसोम का एक निर्माण खंड बन जाता है, जिसका बंधन eL30 अनुक्रम के उत्परिवर्तन द्वारा और बेहतर हो जाता है।
अंतःकोशिकीय परजीवियों के आणविक विकास के संदर्भ में, हमारा अध्ययन दर्शाता है कि डार्विनवादी प्राकृतिक चयन और जीनोम क्षय के आनुवंशिक बहाव की शक्तियाँ समानांतर रूप से कार्य नहीं करतीं, बल्कि दोलन करती हैं। सर्वप्रथम, आनुवंशिक बहाव जैव-अणुओं की महत्वपूर्ण विशेषताओं को समाप्त कर देता है, जिससे क्षतिपूर्ति की अत्यधिक आवश्यकता उत्पन्न होती है। परजीवी जब डार्विनवादी प्राकृतिक चयन के माध्यम से इस आवश्यकता को पूरा करते हैं, तभी उनके वृहद अणुओं को अपने सबसे प्रभावशाली और नवीन गुणों को विकसित करने का अवसर मिलता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि ई. क्यूनिकुली राइबोसोम में न्यूक्लियोटाइड बंधन स्थलों का विकास यह दर्शाता है कि आणविक विकास का यह हानि-से-लाभ का पैटर्न न केवल हानिकारक उत्परिवर्तनों को कम करता है, बल्कि कभी-कभी परजीवी वृहद अणुओं को पूरी तरह से नए कार्य भी प्रदान करता है।
यह विचार सेवेल राइट के गतिशील संतुलन सिद्धांत के अनुरूप है, जो कहता है कि प्राकृतिक चयन की एक सख्त प्रणाली जीवों की नवाचार करने की क्षमता को सीमित करती है।51,52,53 हालांकि, यदि आनुवंशिक बहाव प्राकृतिक चयन को बाधित करता है, तो ये बहाव ऐसे परिवर्तन उत्पन्न कर सकते हैं जो स्वयं में अनुकूल नहीं होते (या हानिकारक भी हो सकते हैं) लेकिन आगे चलकर ऐसे परिवर्तनों को जन्म देते हैं जो उच्चतर उपयुक्तता या नई जैविक गतिविधि प्रदान करते हैं। हमारा ढांचा इस विचार का समर्थन करता है, यह दर्शाते हुए कि एक ही प्रकार का उत्परिवर्तन जो एक जैवअणुक के आकार और कार्य को कम करता है, उसके सुधार का मुख्य कारण प्रतीत होता है। जीत-जीत विकासवादी मॉडल के अनुरूप, हमारा अध्ययन दर्शाता है कि जीनोम क्षय, जिसे परंपरागत रूप से एक अपक्षयी प्रक्रिया के रूप में देखा जाता है, नवाचार का एक प्रमुख चालक भी है, जो कभी-कभी और शायद अक्सर वृहदअणुओं को नई परजीवी गतिविधियाँ प्राप्त करने की अनुमति देता है।