ขอบคุณที่เข้าชม Nature.com เบราว์เซอร์ที่คุณใช้อยู่มีการรองรับ CSS อย่างจำกัด เพื่อประสบการณ์การใช้งานที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์เวอร์ชันล่าสุด (หรือปิดโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer) ในระหว่างนี้ เพื่อให้มั่นใจว่าเว็บไซต์จะยังคงได้รับการสนับสนุนต่อไป เราจะแสดงผลเว็บไซต์โดยไม่มีสไตล์และ JavaScript
วิวัฒนาการของปรสิตจุลินทรีย์เกี่ยวข้องกับปฏิกิริยาตอบโต้ระหว่างการคัดเลือกโดยธรรมชาติ ซึ่งทำให้ปรสิตพัฒนาขึ้น และการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรม ซึ่งทำให้ปรสิตสูญเสียยีนและสะสมการกลายพันธุ์ที่เป็นอันตราย ในที่นี้ เพื่อให้เข้าใจว่าปฏิกิริยาตอบโต้ดังกล่าวเกิดขึ้นได้อย่างไรในระดับโมเลกุลขนาดใหญ่ เราจึงได้อธิบายโครงสร้างของไรโบโซมของ Encephalitozoon cuniculi ซึ่งเป็นสิ่งมีชีวิตยูคาริโอตที่มีจีโนมขนาดเล็กที่สุดในธรรมชาติ โดยใช้เทคนิค cryo-EM การลดปริมาณ rRNA อย่างมากในไรโบโซมของ E. cuniculi มาพร้อมกับการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างที่ไม่เคยเกิดขึ้นมาก่อน เช่น วิวัฒนาการของตัวเชื่อม rRNA ที่หลอมรวมกันซึ่งไม่เคยรู้จักมาก่อน และ rRNA ที่ไม่มีส่วนยื่น นอกจากนี้ ไรโบโซมของ E. cuniculi ยังรอดพ้นจากการสูญเสียชิ้นส่วน rRNA และโปรตีนโดยการพัฒนาความสามารถในการใช้โมเลกุลขนาดเล็กเป็นตัวเลียนแบบโครงสร้างของชิ้นส่วน rRNA และโปรตีนที่เสื่อมสภาพ โดยสรุป เราแสดงให้เห็นว่าโครงสร้างระดับโมเลกุลที่เคยเชื่อกันว่าลดขนาด เสื่อมสภาพ และเกิดการกลายพันธุ์ที่ทำให้ประสิทธิภาพลดลงนั้น มีกลไกการชดเชยหลายอย่างที่ช่วยให้โครงสร้างเหล่านั้นยังคงทำงานได้แม้จะมีการหดตัวของโมเลกุลอย่างรุนแรงก็ตาม
เนื่องจากปรสิตจุลินทรีย์ส่วนใหญ่มีเครื่องมือโมเลกุลเฉพาะตัวในการโจมตีโฮสต์ของพวกมัน เราจึงมักต้องพัฒนายารักษาที่แตกต่างกันสำหรับปรสิตแต่ละกลุ่ม1,2 อย่างไรก็ตาม หลักฐานใหม่ชี้ให้เห็นว่าวิวัฒนาการของปรสิตบางแง่มุมนั้นมีลักษณะบรรจบกันและสามารถคาดการณ์ได้เป็นส่วนใหญ่ ซึ่งบ่งชี้ถึงพื้นฐานที่เป็นไปได้สำหรับการแทรกแซงการรักษาในวงกว้างสำหรับปรสิตจุลินทรีย์3,4,5,6,7,8,9
งานวิจัยก่อนหน้านี้ได้ระบุแนวโน้มวิวัฒนาการทั่วไปในปรสิตจุลินทรีย์ที่เรียกว่าการลดขนาดจีโนมหรือการเสื่อมสภาพของจีโนม10,11,12,13 งานวิจัยปัจจุบันแสดงให้เห็นว่าเมื่อจุลินทรีย์ละทิ้งวิถีชีวิตแบบอิสระและกลายเป็นปรสิตภายในเซลล์ (หรือเอนโดซิมไบออนต์) จีโนมของพวกมันจะ undergoes การเปลี่ยนแปลงที่ช้าแต่น่าทึ่งในช่วงหลายล้านปี9,11 ในกระบวนการที่เรียกว่าการเสื่อมสภาพของจีโนม ปรสิตจุลินทรีย์จะสะสมการกลายพันธุ์ที่เป็นอันตรายซึ่งเปลี่ยนยีนที่สำคัญก่อนหน้านี้จำนวนมากให้กลายเป็นยีนเทียม นำไปสู่การสูญเสียยีนอย่างค่อยเป็นค่อยไปและการล่มสลายของการกลายพันธุ์14,15 การล่มสลายนี้สามารถทำลายยีนได้มากถึง 95% ในสิ่งมีชีวิตภายในเซลล์ที่เก่าแก่ที่สุดเมื่อเทียบกับสายพันธุ์อิสระที่ใกล้เคียงกัน ดังนั้นวิวัฒนาการของปรสิตภายในเซลล์จึงเป็นการต่อสู้ระหว่างสองแรงที่ตรงข้ามกัน: การคัดเลือกโดยธรรมชาติแบบดาร์วิน ซึ่งนำไปสู่การปรับปรุงปรสิต และการล่มสลายของจีโนม ซึ่งทำให้ปรสิตสูญหายไป ยังไม่เป็นที่แน่ชัดว่าปรสิตสามารถเอาตัวรอดจากการต่อสู้ที่ยืดเยื้อนี้และคงไว้ซึ่งการทำงานของโครงสร้างโมเลกุลได้อย่างไร
แม้ว่ากลไกการเสื่อมสภาพของจีโนมจะยังไม่เป็นที่เข้าใจอย่างถ่องแท้ แต่ดูเหมือนว่าจะเกิดขึ้นส่วนใหญ่เนื่องจากการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมที่เกิดขึ้นบ่อยครั้ง เนื่องจากปรสิตอาศัยอยู่ในประชากรขนาดเล็ก สืบพันธุ์แบบไม่อาศัยเพศ และมีข้อจำกัดทางพันธุกรรม พวกมันจึงไม่สามารถกำจัดกลายพันธุ์ที่เป็นอันตรายซึ่งบางครั้งเกิดขึ้นระหว่างการจำลองดีเอ็นเอได้อย่างมีประสิทธิภาพ ส่งผลให้เกิดการสะสมของกลายพันธุ์ที่เป็นอันตรายอย่างถาวรและลดขนาดของจีโนมปรสิต ผลที่ตามมาคือ ปรสิตไม่เพียงแต่สูญเสียยีนที่ไม่จำเป็นต่อการอยู่รอดในสภาพแวดล้อมภายในเซลล์เท่านั้น แต่ความไม่สามารถของประชากรปรสิตในการกำจัดกลายพันธุ์ที่เป็นอันตรายที่เกิดขึ้นเป็นครั้งคราวอย่างมีประสิทธิภาพ ยังทำให้กลายพันธุ์เหล่านี้สะสมอยู่ทั่วทั้งจีโนม รวมถึงยีนที่สำคัญที่สุดของพวกมันด้วย
ความเข้าใจในปัจจุบันของเราเกี่ยวกับการลดขนาดจีโนมส่วนใหญ่ขึ้นอยู่กับการเปรียบเทียบลำดับจีโนมเท่านั้น โดยให้ความสนใจน้อยลงกับการเปลี่ยนแปลงในโมเลกุลที่ทำหน้าที่พื้นฐานและเป็นเป้าหมายยาที่มีศักยภาพ การศึกษาเปรียบเทียบแสดงให้เห็นว่าภาระของการกลายพันธุ์ของจุลินทรีย์ภายในเซลล์ที่เป็นอันตรายดูเหมือนจะทำให้โปรตีนและกรดนิวคลีอิกมีแนวโน้มที่จะพับตัวผิดรูปและรวมตัวกัน ทำให้ต้องพึ่งพาชาเปอโรนมากขึ้นและไวต่อความร้อนมากขึ้น19,20,21,22,23 นอกจากนี้ ปรสิตต่างๆ ซึ่งมีการวิวัฒนาการอย่างอิสระและบางครั้งห่างกันถึง 2.5 พันล้านปี ก็ประสบกับการสูญเสียศูนย์ควบคุมคุณภาพที่คล้ายกันในกลไกการสังเคราะห์โปรตีน5,6 และการซ่อมแซมดีเอ็นเอ24 อย่างไรก็ตาม ยังมีข้อมูลน้อยมากเกี่ยวกับผลกระทบของวิถีชีวิตภายในเซลล์ต่อคุณสมบัติอื่นๆ ทั้งหมดของโมเลกุลขนาดใหญ่ในเซลล์ รวมถึงการปรับตัวของโมเลกุลต่อภาระของการกลายพันธุ์ที่เป็นอันตรายที่เพิ่มขึ้น
ในงานวิจัยนี้ เพื่อให้เข้าใจวิวัฒนาการของโปรตีนและกรดนิวคลีอิกของจุลินทรีย์ภายในเซลล์ได้ดียิ่งขึ้น เราได้กำหนดโครงสร้างของไรโบโซมของปรสิตภายในเซลล์ Encephalitozoon cuniculi E. cuniculi เป็นสิ่งมีชีวิตคล้ายเชื้อราที่อยู่ในกลุ่มไมโครสปอริเดียที่เป็นปรสิต ซึ่งมีจีโนมยูคาริโอตขนาดเล็กผิดปกติ จึงถูกใช้เป็นสิ่งมีชีวิตต้นแบบในการศึกษาการเสื่อมสภาพของจีโนม25,26,27,28,29,30 เมื่อเร็วๆ นี้ ได้มีการกำหนดโครงสร้างไรโบโซมด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบแช่แข็ง (cryo-EM) สำหรับจีโนมที่ลดลงปานกลางของไมโครสปอริเดีย, Paranosema locustae และ Vairimorpha necatrix31,32 (จีโนมประมาณ 3.2 Mb) โครงสร้างเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการสูญเสียการขยายตัวของ rRNA บางส่วนได้รับการชดเชยด้วยการพัฒนาการสัมผัสใหม่ระหว่างโปรตีนไรโบโซมที่อยู่ใกล้เคียงกัน หรือการได้รับโปรตีนไรโบโซม msL131,32 ใหม่ สายพันธุ์ Encephalitozoon (จีโนมประมาณ 2.5 ล้าน bp) พร้อมกับญาติที่ใกล้เคียงที่สุดอย่าง Ordospora แสดงให้เห็นถึงระดับสูงสุดของการลดขนาดจีโนมในยูคาริโอต – พวกมันมียีนที่เข้ารหัสโปรตีนน้อยกว่า 2000 ยีน และคาดว่าไรโบโซมของพวกมันไม่เพียงแต่ปราศจากชิ้นส่วนขยาย rRNA (ชิ้นส่วน rRNA ที่แยกแยะไรโบโซมของยูคาริโอตออกจากไรโบโซมของแบคทีเรีย) เท่านั้น แต่ยังมีโปรตีนไรโบโซมสี่ชนิดเนื่องจากขาดโฮโมล็อกในจีโนมของ E. cuniculi26,27,28 ดังนั้น เราจึงสรุปได้ว่าไรโบโซมของ E. cuniculi สามารถเปิดเผยกลยุทธ์ที่ไม่เคยรู้จักมาก่อนสำหรับการปรับตัวระดับโมเลกุลต่อการเสื่อมสภาพของจีโนม
โครงสร้างไครโอ-เอ็มบีไอของเราแสดงถึงไรโบโซมไซโตพลาสมิกของยูคาริโอตที่เล็กที่สุดเท่าที่เคยมีการศึกษามา และให้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับผลกระทบของการลดขนาดจีโนมในระดับสูงสุดต่อโครงสร้าง การประกอบ และวิวัฒนาการของกลไกโมเลกุลที่เป็นส่วนสำคัญของเซลล์ เราพบว่าไรโบโซมของ E. cuniculi ละเมิดหลักการพับ RNA และการประกอบไรโบโซมที่ได้รับการอนุรักษ์ไว้อย่างกว้างขวางหลายประการ และค้นพบโปรตีนไรโบโซมชนิดใหม่ที่ไม่เคยรู้จักมาก่อน ที่น่าประหลาดใจคือ เราแสดงให้เห็นว่าไรโบโซมของไมโครสปอริเดียได้วิวัฒนาการความสามารถในการจับกับโมเลกุลขนาดเล็ก และตั้งสมมติฐานว่าการตัดทอนใน rRNA และโปรตีนกระตุ้นนวัตกรรมทางวิวัฒนาการที่อาจมอบคุณสมบัติที่เป็นประโยชน์แก่ไรโบโซมในที่สุด
เพื่อเพิ่มความเข้าใจเกี่ยวกับการวิวัฒนาการของโปรตีนและกรดนิวคลีอิกในสิ่งมีชีวิตภายในเซลล์ เราจึงตัดสินใจแยกสปอร์ของ E. cuniculi ออกจากเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมที่ติดเชื้อ เพื่อทำให้ไรโบโซมบริสุทธิ์และกำหนดโครงสร้างของไรโบโซมเหล่านี้ การได้มาซึ่งไมโครสปอริเดียปรสิตจำนวนมากนั้นทำได้ยาก เนื่องจากไมโครสปอริเดียไม่สามารถเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อได้ แต่จะเจริญเติบโตและขยายพันธุ์ได้เฉพาะภายในเซลล์เจ้าบ้านเท่านั้น ดังนั้น เพื่อให้ได้ชีวมวลของ E. cuniculi สำหรับการทำให้ไรโบโซมบริสุทธิ์ เราจึงทำการติดเชื้อเซลล์ไตของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมสายพันธุ์ RK13 ด้วยสปอร์ของ E. cuniculi และเพาะเลี้ยงเซลล์ที่ติดเชื้อเหล่านี้เป็นเวลาหลายสัปดาห์เพื่อให้ E. cuniculi เจริญเติบโตและเพิ่มจำนวน โดยใช้เซลล์ที่ติดเชื้อเป็นชั้นเดียวขนาดประมาณครึ่งตารางเมตร เราสามารถทำให้สปอร์ของไมโครสปอริเดียบริสุทธิ์ได้ประมาณ 300 มิลลิกรัม และนำไปใช้ในการแยกไรโบโซม จากนั้นเราใช้ลูกปัดแก้วบดสปอร์ที่บริสุทธิ์แล้ว และแยกไรโบโซมดิบโดยใช้การแยกส่วนด้วยโพลีเอทิลีนไกลคอลทีละขั้นตอนจากสารละลาย ซึ่งทำให้เราได้ไรโบโซมดิบของ E. cuniculi ประมาณ 300 ไมโครกรัมสำหรับการวิเคราะห์โครงสร้าง
จากนั้นเราได้รวบรวมภาพ cryo-EM โดยใช้ตัวอย่างไรโบโซมที่ได้มา และประมวลผลภาพเหล่านี้โดยใช้มาสก์ที่สอดคล้องกับหน่วยย่อยไรโบโซมขนาดใหญ่ ส่วนหัวของหน่วยย่อยขนาดเล็ก และหน่วยย่อยขนาดเล็ก ในระหว่างกระบวนการนี้ เราได้รวบรวมภาพอนุภาคไรโบโซมประมาณ 108,000 อนุภาค และคำนวณภาพ cryo-EM ด้วยความละเอียด 2.7 Å (ภาพประกอบเพิ่มเติม 1-3) จากนั้นเราใช้ภาพ cryoEM เพื่อสร้างแบบจำลอง rRNA โปรตีนไรโบโซม และปัจจัยจำศีล Mdf1 ที่เกี่ยวข้องกับไรโบโซมของ E. cuniculi (รูปที่ 1a, b)
a โครงสร้างของไรโบโซม E. cuniculi ที่ซับซ้อนร่วมกับปัจจัยจำศีล Mdf1 (รหัส pdb 7QEP) b แผนที่ของปัจจัยจำศีล Mdf1 ที่เกี่ยวข้องกับไรโบโซม E. cuniculi c แผนที่โครงสร้างทุติยภูมิเปรียบเทียบ rRNA ที่ได้จากการค้นพบในสายพันธุ์ Microsporidian กับโครงสร้างไรโบโซมที่รู้จัก แผงแสดงตำแหน่งของชิ้นส่วน rRNA ที่ขยาย (ES) และบริเวณออกฤทธิ์ของไรโบโซม รวมถึงบริเวณถอดรหัส (DC) วงซาร์ซินิซิน (SRL) และศูนย์ถ่ายโอนเปปไทด์ (PTC) d ความหนาแน่นของอิเล็กตรอนที่สอดคล้องกับศูนย์ถ่ายโอนเปปไทด์ของไรโบโซม E. cuniculi บ่งชี้ว่าบริเวณเร่งปฏิกิริยานี้มีโครงสร้างเดียวกันในปรสิต E. cuniculi และโฮสต์ของมัน รวมถึง H. sapiens e, f ความหนาแน่นของอิเล็กตรอนที่สอดคล้องกันของศูนย์ถอดรหัส (e) และโครงสร้างแผนผังของศูนย์ถอดรหัส (f) บ่งชี้ว่า E. cuniculi มีสารตกค้าง U1491 แทนที่จะเป็น A1491 (การกำหนดหมายเลขของ E. coli) ในยูคาริโอตอื่นๆ จำนวนมาก การเปลี่ยนแปลงนี้ชี้ให้เห็นว่า E. cuniculi อาจไวต่อยาปฏิชีวนะที่มุ่งเป้าไปที่บริเวณออกฤทธิ์นี้
เมื่อเปรียบเทียบกับโครงสร้างของไรโบโซม V. necatrix และ P. locustae ที่ได้รับการกำหนดไว้ก่อนหน้านี้ (โครงสร้างทั้งสองเป็นตัวแทนของไมโครสปอริเดียตระกูล Nosematidae เดียวกันและมีความคล้ายคลึงกันมาก) 31,32 ไรโบโซม E. cuniculi ผ่านกระบวนการแตกตัวของ rRNA และโปรตีนจำนวนมาก นอกจากนี้ยังมีการเปลี่ยนแปลงโครงสร้าง (ภาพประกอบเพิ่มเติม 4-6) ในส่วนของ rRNA การเปลี่ยนแปลงที่เด่นชัดที่สุด ได้แก่ การสูญเสียชิ้นส่วน rRNA 25S ที่ขยายแล้ว ES12L อย่างสมบูรณ์ และการเสื่อมสภาพบางส่วนของเกลียว h39, h41 และ H18 (รูปที่ 1c ภาพประกอบเพิ่มเติม 4) ในบรรดาโปรตีนไรโบโซม การเปลี่ยนแปลงที่เห็นได้ชัดที่สุด ได้แก่ การสูญเสียโปรตีน eS30 อย่างสมบูรณ์ และการหดตัวของโปรตีน eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 และ eS7 (ภาพประกอบเพิ่มเติม 4, 5)
ดังนั้น การลดขนาดจีโนมอย่างมากของสปีชีส์ Encephalotozoon/Ordospora จึงสะท้อนให้เห็นในโครงสร้างของไรโบโซม: ไรโบโซมของ E. cuniculi ประสบกับการสูญเสียปริมาณโปรตีนอย่างมากที่สุดในบรรดาไรโบโซมไซโตพลาสมิกของยูคาริโอตที่ได้รับการศึกษาโครงสร้าง และพวกมันไม่มีแม้แต่ชิ้นส่วน rRNA และโปรตีนที่ได้รับการอนุรักษ์ไว้อย่างกว้างขวางไม่เพียงแต่ในยูคาริโอตเท่านั้น แต่ยังรวมถึงในสามโดเมนของสิ่งมีชีวิตด้วย โครงสร้างของไรโบโซม E. cuniculi เป็นแบบจำลองโมเลกุลแรกสำหรับความเปลี่ยนแปลงเหล่านี้ และเผยให้เห็นเหตุการณ์วิวัฒนาการที่ถูกมองข้ามไปทั้งจากการศึกษาจีโนมเปรียบเทียบและการศึกษาโครงสร้างชีวโมเลกุลภายในเซลล์ (ภาพประกอบเพิ่มเติมที่ 7) ด้านล่างนี้ เราจะอธิบายเหตุการณ์แต่ละอย่างพร้อมกับต้นกำเนิดวิวัฒนาการที่เป็นไปได้และผลกระทบที่อาจเกิดขึ้นต่อการทำงานของไรโบโซม
จากนั้นเราพบว่า นอกเหนือจากการตัดแต่ง rRNA ขนาดใหญ่แล้ว ไรโบโซมของ E. cuniculi ยังมีความแปรผันของ rRNA ที่บริเวณแอคทีฟไซต์หนึ่งด้วย แม้ว่าศูนย์กลางการถ่ายโอนเปปไทด์ของไรโบโซม E. cuniculi จะมีโครงสร้างเหมือนกับไรโบโซมยูคาริโอตอื่นๆ (รูปที่ 1d) แต่ศูนย์กลางการถอดรหัสจะแตกต่างกันเนื่องจากความแปรผันของลำดับที่นิวคลีโอไทด์ 1491 (การกำหนดหมายเลขแบบ E. coli รูปที่ 1e, f) ข้อสังเกตนี้มีความสำคัญเพราะโดยทั่วไปแล้วบริเวณการถอดรหัสของไรโบโซมยูคาริโอตจะมีสารตกค้าง G1408 และ A1491 เมื่อเทียบกับสารตกค้างแบบแบคทีเรีย A1408 และ G1491 ความแปรผันนี้เป็นสาเหตุของความไวที่แตกต่างกันของไรโบโซมแบคทีเรียและยูคาริโอตต่อยาปฏิชีวนะในกลุ่มอะมิโนไกลโคไซด์ที่ออกฤทธิ์ต่อไรโบโซมและโมเลกุลขนาดเล็กอื่นๆ ที่มุ่งเป้าไปที่บริเวณการถอดรหัส ที่บริเวณถอดรหัสของไรโบโซม E. cuniculi พบว่ากรดอะมิโน A1491 ถูกแทนที่ด้วย U1491 ซึ่งอาจสร้างส่วนเชื่อมต่อการจับที่เฉพาะเจาะจงสำหรับโมเลกุลขนาดเล็กที่มุ่งเป้าไปที่บริเวณออกฤทธิ์นี้ นอกจากนี้ ยังพบตัวแปร A14901 เดียวกันนี้ในไมโครสปอริเดียชนิดอื่นๆ เช่น P. locustae และ V. necatrix ซึ่งบ่งชี้ว่ามีการแพร่กระจายอย่างกว้างขวางในสายพันธุ์ไมโครสปอริเดีย (รูปที่ 1f)
เนื่องจากตัวอย่างไรโบโซม E. cuniculi ของเราถูกแยกได้จากสปอร์ที่ไม่มีการทำงานทางเมตาบอลิซึม เราจึงทดสอบแผนที่ cryo-EM ของ E. cuniculi สำหรับการจับไรโบโซมที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ภายใต้สภาวะความเครียดหรือการอดอาหาร ปัจจัยการจำศีล 31,32,36,37, 38 เราจับคู่โครงสร้างของไรโบโซมจำศีลที่กำหนดไว้ก่อนหน้านี้กับแผนที่ cryo-EM ของไรโบโซม E. cuniculi สำหรับการเชื่อมต่อ เราใช้ไรโบโซม S. cerevisiae ที่ซับซ้อนกับปัจจัยการจำศีล Stm138 ไรโบโซมตั๊กแตนที่ซับซ้อนกับปัจจัย Lso232 และไรโบโซม V. necatrix ที่ซับซ้อนกับปัจจัย Mdf1 และ Mdf231 ในขณะเดียวกัน เราพบความหนาแน่น cryo-EM ที่สอดคล้องกับปัจจัยพัก Mdf1 เช่นเดียวกับการที่ Mdf1 จับกับไรโบโซมของ V. necatrix นั้น Mdf1 ยังจับกับไรโบโซมของ E. cuniculi ด้วย โดยจะไปปิดกั้นตำแหน่ง E ของไรโบโซม ซึ่งอาจช่วยให้ไรโบโซมพร้อมใช้งานเมื่อสปอร์ของปรสิตหยุดการทำงานทางเมตาบอลิซึมเนื่องจากการหยุดทำงานของร่างกาย (รูปที่ 2)
Mdf1 ปิดกั้นตำแหน่ง E ของไรโบโซม ซึ่งดูเหมือนจะช่วยยับยั้งการทำงานของไรโบโซมเมื่อสปอร์ของปรสิตหยุดการทำงานทางเมตาบอลิซึม ในโครงสร้างของไรโบโซม E. cuniculi เราพบว่า Mdf1 สร้างการสัมผัสที่ไม่เคยรู้จักมาก่อนกับก้านไรโบโซม L1 ซึ่งเป็นส่วนของไรโบโซมที่ช่วยในการปลดปล่อย tRNA ที่ถูกกำจัดหมู่แอซิลออกจากไรโบโซมในระหว่างการสังเคราะห์โปรตีน การสัมผัสเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า Mdf1 แยกตัวออกจากไรโบโซมโดยใช้กลไกเดียวกับ tRNA ที่ถูกกำจัดหมู่แอซิล ซึ่งอาจเป็นคำอธิบายว่าไรโบโซมกำจัด Mdf1 ออกไปได้อย่างไรเพื่อกระตุ้นการสังเคราะห์โปรตีนอีกครั้ง
อย่างไรก็ตาม โครงสร้างของเราเผยให้เห็นการสัมผัสที่ไม่เคยรู้จักมาก่อนระหว่าง Mdf1 กับขา L1 ของไรโบโซม (ส่วนของไรโบโซมที่ช่วยปลดปล่อย tRNA ที่ถูกกำจัดหมู่แอซิลออกจากไรโบโซมในระหว่างการสังเคราะห์โปรตีน) โดยเฉพาะอย่างยิ่ง Mdf1 ใช้การสัมผัสแบบเดียวกับส่วนข้อศอกของโมเลกุล tRNA ที่ถูกกำจัดหมู่แอซิล (รูปที่ 2) การสร้างแบบจำลองโมเลกุลที่ไม่เคยรู้จักมาก่อนนี้แสดงให้เห็นว่า Mdf1 แยกตัวออกจากไรโบโซมโดยใช้กลไกเดียวกับ tRNA ที่ถูกกำจัดหมู่แอซิล ซึ่งอธิบายได้ว่าไรโบโซมกำจัดปัจจัยจำศีลนี้ออกไปได้อย่างไรเพื่อกระตุ้นการสังเคราะห์โปรตีนอีกครั้ง
เมื่อสร้างแบบจำลอง rRNA เราพบว่าไรโบโซมของ E. cuniculi มีชิ้นส่วน rRNA ที่พับผิดปกติ ซึ่งเราเรียกว่า rRNA ที่หลอมรวมกัน (รูปที่ 3) ในไรโบโซมที่ครอบคลุมสิ่งมีชีวิตทั้งสามโดเมน rRNA จะพับเป็นโครงสร้างที่เบสส่วนใหญ่ของ rRNA จะจับคู่และพับเข้าด้วยกัน หรือมีปฏิสัมพันธ์กับโปรตีนไรโบโซม38,39,40 อย่างไรก็ตาม ในไรโบโซมของ E. cuniculi ดูเหมือนว่า rRNA จะละเมิดหลักการพับนี้โดยการเปลี่ยนเกลียวบางส่วนให้กลายเป็นบริเวณ rRNA ที่ไม่พับ
โครงสร้างของเกลียว H18 25S rRNA ใน S. cerevisiae, V. necatrix และ E. cuniculi โดยทั่วไป ในไรโบโซมที่ครอบคลุมโดเมนชีวิตทั้งสาม ลิงก์เกอร์นี้จะขดตัวเป็นเกลียว RNA ที่ประกอบด้วยหน่วยย่อย 24 ถึง 34 หน่วย ในทางตรงกันข้าม ในไมโครสปอริเดีย ลิงก์เกอร์ rRNA นี้จะค่อยๆ ลดลงเหลือลิงก์เกอร์แบบสายเดี่ยวสองสายที่อุดมไปด้วยยูริดีนซึ่งมีเพียง 12 หน่วยย่อยเท่านั้น หน่วยย่อยส่วนใหญ่เหล่านี้สัมผัสกับตัวทำละลาย รูปแสดงให้เห็นว่าไมโครสปอริเดียที่เป็นปรสิตดูเหมือนจะละเมิดหลักการทั่วไปของการพับตัวของ rRNA ซึ่งโดยปกติแล้วเบสของ rRNA จะเชื่อมต่อกับเบสอื่นๆ หรือเกี่ยวข้องกับปฏิกิริยาระหว่าง rRNA กับโปรตีน ในไมโครสปอริเดีย ชิ้นส่วน rRNA บางส่วนมีการพับตัวที่ไม่เหมาะสม ซึ่งเกลียว rRNA เดิมกลายเป็นชิ้นส่วนแบบสายเดี่ยวที่ยืดออกเกือบเป็นเส้นตรง การมีอยู่ของบริเวณที่ผิดปกติเหล่านี้ทำให้ rRNA ของไมโครสปอริเดียสามารถจับกับชิ้นส่วน rRNA ที่อยู่ห่างไกลได้โดยใช้เบส RNA จำนวนน้อยที่สุด
ตัวอย่างที่โดดเด่นที่สุดของการเปลี่ยนแปลงทางวิวัฒนาการนี้สามารถสังเกตได้ในเกลียว H18 25S rRNA (รูปที่ 3) ในสปีชีส์ตั้งแต่ E. coli ไปจนถึงมนุษย์ ฐานของเกลียว rRNA นี้ประกอบด้วยนิวคลีโอไทด์ 24-32 ตัว ก่อตัวเป็นเกลียวที่ไม่สม่ำเสมอเล็กน้อย ในโครงสร้างไรโบโซมที่ระบุไว้ก่อนหน้านี้จาก V. necatrix และ P. locustae31,32 ฐานของเกลียว H18 จะคลายตัวออกบางส่วน แต่การจับคู่เบสของนิวคลีโอไทด์ยังคงอยู่ อย่างไรก็ตาม ใน E. cuniculi ชิ้นส่วน rRNA นี้กลายเป็นตัวเชื่อมที่สั้นที่สุด 228UUUGU232 และ 301UUUUUUUUU307 ซึ่งแตกต่างจากชิ้นส่วน rRNA ทั่วไป ตัวเชื่อมที่อุดมด้วยยูริดีนเหล่านี้ไม่ขดตัวหรือสัมผัสกับโปรตีนไรโบโซมอย่างกว้างขวาง แต่พวกมันกลับมีโครงสร้างที่เปิดรับตัวทำละลายและคลี่ออกอย่างสมบูรณ์ โดยที่สาย rRNA จะยืดออกเกือบเป็นเส้นตรง โครงสร้างที่ยืดออกนี้อธิบายได้ว่าทำไม E. cuniculi จึงใช้เบส RNA เพียง 12 เบสในการเติมช่องว่าง 33 Å ระหว่างเกลียว rRNA H16 และ H18 ในขณะที่สายพันธุ์อื่น ๆ ต้องการเบส rRNA อย่างน้อยสองเท่าในการเติมช่องว่างนั้น
ดังนั้น เราจึงสามารถแสดงให้เห็นว่า ไมโครสปอริเดียที่เป็นปรสิตได้พัฒนากลยุทธ์ในการหดตัวของส่วน rRNA ที่ยังคงได้รับการอนุรักษ์ไว้อย่างกว้างขวางในสายพันธุ์ต่างๆ ในสามโดเมนของสิ่งมีชีวิต ผ่านกระบวนการพับตัวที่ไม่เอื้อต่อพลังงาน เห็นได้ชัดว่า โดยการสะสมการกลายพันธุ์ที่เปลี่ยนเกลียว rRNA ให้กลายเป็นตัวเชื่อมโพลี-ยูสั้นๆ E. cuniculi สามารถสร้างชิ้นส่วน rRNA ที่ผิดปกติซึ่งมีนิวคลีโอไทด์น้อยที่สุดเท่าที่จะเป็นไปได้สำหรับการเชื่อมต่อชิ้นส่วน rRNA ที่อยู่ห่างออกไป ซึ่งช่วยอธิบายว่าไมโครสปอริเดียประสบความสำเร็จในการลดโครงสร้างโมเลกุลพื้นฐานลงอย่างมากโดยไม่สูญเสียความสมบูรณ์ของโครงสร้างและหน้าที่ได้อย่างไร
ลักษณะพิเศษอีกอย่างหนึ่งของ rRNA ของ E. cuniculi คือการปรากฏของ rRNA ที่ไม่มีส่วนที่หนาขึ้น (รูปที่ 4) ส่วนที่ยื่นออกมาคือ นิวคลีโอไทด์ที่ไม่มีคู่เบสซึ่งบิดตัวออกมาจากเกลียว RNA แทนที่จะซ่อนอยู่ภายใน ส่วนที่ยื่นออกมาของ rRNA ส่วนใหญ่ทำหน้าที่เป็นกาวโมเลกุล ช่วยในการยึดโปรตีนไรโบโซมที่อยู่ติดกันหรือชิ้นส่วน rRNA อื่นๆ ส่วนที่ยื่นออกมาบางส่วนทำหน้าที่เป็นบานพับ ทำให้เกลียว rRNA สามารถงอและพับได้อย่างเหมาะสมเพื่อการสังเคราะห์โปรตีนที่มีประสิทธิภาพ 41
a. ส่วนยื่นของ rRNA (การกำหนดหมายเลขตาม S. cerevisiae) หายไปจากโครงสร้างไรโบโซมของ E. cuniculi แต่มีอยู่ในยูคาริโอตอื่นๆ ส่วนใหญ่ b. E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens และไรโบโซมภายในของ E. cuniculi ปรสิตเหล่านี้ขาดส่วนนูนของ rRNA โบราณที่มีการอนุรักษ์ไว้อย่างสูงจำนวนมาก ส่วนที่หนาขึ้นเหล่านี้ช่วยทำให้โครงสร้างของไรโบโซมมีความเสถียร ดังนั้น การที่ไม่มีส่วนนูนเหล่านี้ในไมโครสปอริเดียจึงบ่งชี้ถึงความเสถียรที่ลดลงของการพับตัวของ rRNA ในปรสิตไมโครสปอริเดีย การเปรียบเทียบกับลำต้น P (ลำต้น L7/L12 ในแบคทีเรีย) แสดงให้เห็นว่าการสูญเสียส่วนนูนของ rRNA บางครั้งเกิดขึ้นพร้อมกับการปรากฏของส่วนนูนใหม่ถัดจากส่วนนูนที่หายไป เกลียว H42 ใน rRNA 23S/28S มีส่วนนูนโบราณ (U1206 ใน Saccharomyces cerevisiae) ซึ่งคาดว่ามีอายุอย่างน้อย 3.5 พันล้านปี เนื่องจากได้รับการปกป้องในสิ่งมีชีวิตสามโดเมน ในไมโครสปอริเดีย ส่วนนูนนี้หายไป อย่างไรก็ตาม ส่วนนูนใหม่ปรากฏขึ้นถัดจากส่วนนูนที่หายไป (A1306 ใน E. cuniculi)
ที่น่าสังเกตคือ เราพบว่าไรโบโซมของ E. cuniculi ขาดส่วนยื่นของ rRNA ส่วนใหญ่ที่พบในสปีชีส์อื่นๆ รวมถึงส่วนยื่นมากกว่า 30 ส่วนที่ได้รับการอนุรักษ์ไว้ในยูคาริโอตอื่นๆ (รูปที่ 4a) การสูญเสียนี้ทำให้การสัมผัสระหว่างหน่วยย่อยของไรโบโซมและเกลียว rRNA ที่อยู่ติดกันลดลง ซึ่งบางครั้งทำให้เกิดช่องว่างขนาดใหญ่ภายในไรโบโซม ทำให้ไรโบโซมของ E. cuniculi มีรูพรุนมากกว่าไรโบโซมแบบดั้งเดิม (รูปที่ 4b) ที่สำคัญคือ เราพบว่าส่วนยื่นเหล่านี้ส่วนใหญ่หายไปในโครงสร้างไรโบโซมของ V. necatrix และ P. locustae ที่ระบุไว้ก่อนหน้านี้ด้วย ซึ่งถูกมองข้ามไปในการวิเคราะห์โครงสร้างก่อนหน้านี้31,32
บางครั้ง การสูญเสียส่วนที่โป่งพองของ rRNA อาจเกิดขึ้นพร้อมกับการพัฒนาส่วนที่โป่งพองใหม่ขึ้นมาข้างๆ ส่วนที่โป่งพองที่หายไป ตัวอย่างเช่น ก้าน P ของไรโบโซมมีส่วนโป่งพอง U1208 (ใน Saccharomyces cerevisiae) ซึ่งคงอยู่มาตั้งแต่ E. coli จนถึงมนุษย์ และจึงคาดว่ามีอายุประมาณ 3.5 พันล้านปี ในระหว่างการสังเคราะห์โปรตีน ส่วนที่โป่งพองนี้ช่วยให้ก้าน P เคลื่อนที่ระหว่างโครงสร้างแบบเปิดและแบบปิด เพื่อให้ไรโบโซมสามารถดึงดูดปัจจัยการแปลและส่งไปยังตำแหน่งออกฤทธิ์ได้ ในไรโบโซมของ E. cuniculi ส่วนที่หนาขึ้นนี้หายไป อย่างไรก็ตาม ส่วนที่หนาขึ้นใหม่ (G883) ซึ่งอยู่ห่างจากเบสเพียงสามคู่ สามารถช่วยฟื้นฟูความยืดหยุ่นที่เหมาะสมของก้าน P ได้ (รูปที่ 4c)
ข้อมูลของเราเกี่ยวกับ rRNA ที่ไม่มีส่วนยื่นบ่งชี้ว่า การลดขนาดของ rRNA ไม่ได้จำกัดอยู่เพียงแค่การสูญเสียองค์ประกอบของ rRNA บนพื้นผิวของไรโบโซมเท่านั้น แต่ยังอาจเกี่ยวข้องกับนิวเคลียสของไรโบโซมด้วย ซึ่งก่อให้เกิดความบกพร่องทางโมเลกุลเฉพาะของปรสิตที่ยังไม่เคยมีการอธิบายไว้ในเซลล์ที่ดำรงชีวิตอิสระ
หลังจากสร้างแบบจำลองโปรตีนไรโบโซมและ rRNA แบบดั้งเดิมแล้ว เราพบว่าส่วนประกอบไรโบโซมแบบดั้งเดิมไม่สามารถอธิบายส่วนทั้งสามของภาพ cryo-EM ได้ สองส่วนนี้เป็นโมเลกุลขนาดเล็ก (รูปที่ 5, รูปประกอบเพิ่มเติมที่ 8) ส่วนแรกถูกประกบอยู่ระหว่างโปรตีนไรโบโซม uL15 และ eL18 ในตำแหน่งที่ปกติแล้วจะเป็นปลาย C-terminus ของ eL18 ซึ่งสั้นลงใน E. cuniculi แม้ว่าเราจะไม่สามารถระบุตัวตนของโมเลกุลนี้ได้ แต่ขนาดและรูปร่างของเกาะความหนาแน่นนี้สามารถอธิบายได้เป็นอย่างดีด้วยการมีอยู่ของโมเลกุลสเปอร์มิดีน การจับกับไรโบโซมนั้นมีความเสถียรมากขึ้นโดยการกลายพันธุ์เฉพาะของไมโครสปอริเดียในโปรตีน uL15 (Asp51 และ Arg56) ซึ่งดูเหมือนจะเพิ่มความสัมพันธ์ของไรโบโซมกับโมเลกุลขนาดเล็กนี้ เนื่องจากทำให้ uL15 สามารถห่อหุ้มโมเลกุลขนาดเล็กเข้าไปในโครงสร้างไรโบโซมได้ (รูปประกอบเพิ่มเติมที่ 2) 8, ข้อมูลเพิ่มเติม 1, 2)
ภาพถ่าย Cryo-EM แสดงให้เห็นการมีอยู่ของนิวคลีโอไทด์ภายนอกไรโบสที่จับกับไรโบโซมของ E. cuniculi ในไรโบโซมของ E. cuniculi นิวคลีโอไทด์นี้อยู่ในตำแหน่งเดียวกับนิวคลีโอไทด์ 25S rRNA A3186 (การกำหนดหมายเลขของ Saccharomyces cerevisiae) ในไรโบโซมยูคาริโอตอื่นๆ ส่วนใหญ่ b ในโครงสร้างไรโบโซมของ E. cuniculi นิวคลีโอไทด์นี้ตั้งอยู่ระหว่างโปรตีนไรโบโซม uL9 และ eL20 จึงช่วยรักษาเสถียรภาพการสัมผัสระหว่างโปรตีนทั้งสอง cd การวิเคราะห์การอนุรักษ์ลำดับ eL20 ในกลุ่มไมโครสปอริเดีย แผนภูมิวิวัฒนาการของสายพันธุ์ Microsporidia (c) และการจัดเรียงลำดับหลายลำดับของโปรตีน eL20 (d) แสดงให้เห็นว่าสารตกค้างที่จับกับนิวคลีโอไทด์ F170 และ K172 นั้นได้รับการอนุรักษ์ไว้ใน Microsporidia ทั่วไปส่วนใหญ่ ยกเว้น S. lophii ซึ่งเป็น Microsporidia ที่แตกแขนงในช่วงต้น ซึ่งยังคงส่วนขยาย rRNA ES39L ไว้ ภาพนี้แสดงให้เห็นว่าสารตกค้างที่จับกับนิวคลีโอไทด์ F170 และ K172 มีอยู่เฉพาะใน eL20 ของจีโนม Microsporidia ที่ลดลงอย่างมากเท่านั้น แต่ไม่พบในยูคาริโอตอื่นๆ โดยรวมแล้ว ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าไรโบโซมของ Microsporidia ได้พัฒนาตำแหน่งการจับกับนิวคลีโอไทด์ที่ดูเหมือนจะจับกับโมเลกุล AMP และใช้โมเลกุลเหล่านั้นเพื่อทำให้ปฏิกิริยาระหว่างโปรตีนกับโปรตีนในโครงสร้างไรโบโซมมีความเสถียร การอนุรักษ์ตำแหน่งการจับนี้ในไมโครสปอริเดียในระดับสูงและการไม่มีอยู่ในยูคาริโอตอื่นๆ บ่งชี้ว่าตำแหน่งนี้อาจให้ประโยชน์ในการอยู่รอดแบบเลือกสรรแก่ไมโครสปอริเดีย ดังนั้น ช่องจับนิวคลีโอไทด์ในไรโบโซมของไมโครสปอริเดียจึงไม่ปรากฏว่าเป็นลักษณะที่เสื่อมสภาพหรือรูปแบบสุดท้ายของการย่อยสลาย rRNA ดังที่เคยอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ แต่เป็นนวัตกรรมวิวัฒนาการที่มีประโยชน์ซึ่งช่วยให้ไรโบโซมของไมโครสปอริเดียสามารถจับกับโมเลกุลขนาดเล็กได้โดยตรง โดยใช้โมเลกุลเหล่านั้นเป็นหน่วยโครงสร้างระดับโมเลกุลสำหรับไรโบโซม การค้นพบนี้ทำให้ไรโบโซมของไมโครสปอริเดียเป็นไรโบโซมเพียงชนิดเดียวที่ทราบว่าใช้นิวคลีโอไทด์เดี่ยวเป็นหน่วยโครงสร้าง f เส้นทางวิวัฒนาการสมมุติฐานที่ได้มาจากการจับนิวคลีโอไทด์
ความหนาแน่นของโมเลกุลน้ำหนักต่ำลำดับที่สองตั้งอยู่ที่ส่วนต่อประสานระหว่างโปรตีนไรโบโซม uL9 และ eL30 (รูปที่ 5a) ส่วนต่อประสานนี้เคยถูกอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ในโครงสร้างของไรโบโซม Saccharomyces cerevisiae ว่าเป็นตำแหน่งการจับของนิวคลีโอไทด์ 25S ของ rRNA A3186 (ส่วนหนึ่งของส่วนขยาย rRNA ES39L)38 มีการแสดงให้เห็นว่าในไรโบโซม ES39L ของ P. locustae ที่เสื่อมสภาพ ส่วนต่อประสานนี้จะจับกับนิวคลีโอไทด์เดี่ยวที่ไม่ทราบชนิด 31 และสันนิษฐานว่านิวคลีโอไทด์นี้เป็นรูปแบบสุดท้ายที่ลดลงของ rRNA ซึ่งความยาวของ rRNA อยู่ที่ประมาณ 130-230 เบส ES39L ลดลงเหลือนิวคลีโอไทด์เดี่ยว 3243 ภาพ cryo-EM ของเราสนับสนุนแนวคิดที่ว่าความหนาแน่นสามารถอธิบายได้ด้วยนิวคลีโอไทด์ อย่างไรก็ตาม โครงสร้างที่มีความละเอียดสูงขึ้นของเราแสดงให้เห็นว่านิวคลีโอไทด์นี้เป็นโมเลกุลนอกไรโบโซม ซึ่งอาจเป็น AMP (รูปที่ 5a, b)
จากนั้นเราได้ถามว่าตำแหน่งการจับนิวคลีโอไทด์ปรากฏในไรโบโซมของ E. cuniculi หรือไม่ หรือว่ามันมีอยู่ก่อนหน้านี้แล้ว เนื่องจากการจับนิวคลีโอไทด์ส่วนใหญ่เกิดขึ้นโดยอาศัยหมู่ Phe170 และ Lys172 ในโปรตีนไรโบโซม eL30 เราจึงประเมินการอนุรักษ์หมู่เหล่านี้ในยูคาริโอตตัวแทน 4396 ตัวอย่าง เช่นเดียวกับกรณีของ uL15 ข้างต้น เราพบว่าหมู่ Phe170 และ Lys172 มีการอนุรักษ์สูงเฉพาะใน Microsporidia ทั่วไปเท่านั้น แต่ไม่มีอยู่ในยูคาริโอตอื่นๆ รวมถึง Microsporidia ที่ผิดปกติอย่าง Mitosporidium และ Amphiamblys ซึ่งชิ้นส่วน rRNA ES39L ไม่ได้รับการลดลง 44, 45, 46 (รูปที่ 5c-e)
โดยรวมแล้ว ข้อมูลเหล่านี้สนับสนุนแนวคิดที่ว่า E. cuniculi และอาจรวมถึงไมโครสปอริเดียสายพันธุ์อื่นๆ ได้วิวัฒนาการความสามารถในการดักจับสารเมตาบอไลต์ขนาดเล็กจำนวนมากในโครงสร้างของไรโบโซมอย่างมีประสิทธิภาพ เพื่อชดเชยการลดลงของระดับ rRNA และโปรตีน ในการทำเช่นนั้น พวกมันได้พัฒนาความสามารถพิเศษในการจับกับนิวคลีโอไทด์ภายนอกไรโบโซม แสดงให้เห็นว่าโครงสร้างโมเลกุลของปรสิตชดเชยโดยการดักจับสารเมตาบอไลต์ขนาดเล็กจำนวนมาก และใช้พวกมันเป็นตัวเลียนแบบโครงสร้างของ RNA และชิ้นส่วนโปรตีนที่เสื่อมสภาพ
ส่วนที่สามที่ไม่ได้จำลองขึ้นจากแผนที่ cryo-EM ของเรา พบในหน่วยย่อยไรโบโซมขนาดใหญ่ ความละเอียดค่อนข้างสูง (2.6 Å) ของแผนที่ของเราบ่งชี้ว่าความหนาแน่นนี้เป็นของโปรตีนที่มีการรวมกันของหมู่ข้างเคียงขนาดใหญ่ที่เป็นเอกลักษณ์ ซึ่งทำให้เราสามารถระบุความหนาแน่นนี้ว่าเป็นโปรตีนไรโบโซมที่ไม่เคยรู้จักมาก่อน และตั้งชื่อว่า msL2 (โปรตีนเฉพาะของไมโครสปอริเดีย L2) (วิธีการ รูปที่ 6) การค้นหาความคล้ายคลึงกันของเราแสดงให้เห็นว่า msL2 มีการอนุรักษ์ไว้ในกลุ่มไมโครสปอริเดียของสกุล Encephaliter และ Orosporidium แต่ไม่มีอยู่ในสปีชีส์อื่น ๆ รวมถึงไมโครสปอริเดียอื่น ๆ ในโครงสร้างไรโบโซม msL2 ครอบครองช่องว่างที่เกิดจากการสูญเสีย rRNA ES31L ที่ยืดออก ในช่องว่างนี้ msL2 ช่วยทำให้การพับตัวของ rRNA มีเสถียรภาพและสามารถชดเชยการสูญเสีย ES31L ได้ (รูปที่ 6)
a ความหนาแน่นของอิเล็กตรอนและแบบจำลองของโปรตีนไรโบโซม msL2 ที่จำเพาะต่อไมโครสปอริเดีย ซึ่งพบในไรโบโซมของ E. cuniculi b ไรโบโซมของยูคาริโอตส่วนใหญ่ รวมถึงไรโบโซม 80S ของ Saccharomyces cerevisiae มีการสูญเสียการขยาย rRNA ES19L ในสายพันธุ์ไมโครสปอริเดียส่วนใหญ่ โครงสร้างของไรโบโซมไมโครสปอริเดีย V. necatrix ที่ได้รับการกำหนดไว้ก่อนหน้านี้ชี้ให้เห็นว่าการสูญเสีย ES19L ในปรสิตเหล่านี้ได้รับการชดเชยโดยวิวัฒนาการของโปรตีนไรโบโซม msL1 ตัวใหม่ ในการศึกษาครั้งนี้ เราพบว่าไรโบโซมของ E. cuniculi ยังพัฒนาโปรตีนเลียนแบบ RNA ไรโบโซมเพิ่มเติมเพื่อเป็นการชดเชยการสูญเสีย ES19L อย่างเห็นได้ชัด อย่างไรก็ตาม msL2 (ปัจจุบันถูกระบุว่าเป็นโปรตีนสมมุติฐาน ECU06_1135) และ msL1 มีโครงสร้างและต้นกำเนิดทางวิวัฒนาการที่แตกต่างกัน ค. การค้นพบการสร้างโปรตีนไรโบโซม msL1 และ msL2 ที่ไม่มีความสัมพันธ์ทางวิวัฒนาการกัน แสดงให้เห็นว่า หากไรโบโซมสะสมการกลายพันธุ์ที่เป็นอันตรายใน rRNA ของพวกมัน พวกมันสามารถบรรลุระดับความหลากหลายทางองค์ประกอบที่ไม่เคยมีมาก่อนได้ แม้ในกลุ่มย่อยเล็กๆ ของสายพันธุ์ที่ใกล้เคียงกัน การค้นพบนี้อาจช่วยชี้แจงที่มาและวิวัฒนาการของไรโบโซมไมโทคอนเดรีย ซึ่งเป็นที่รู้จักกันดีว่ามี rRNA ที่ลดลงอย่างมากและความแปรปรวนที่ผิดปกติในองค์ประกอบของโปรตีนในสายพันธุ์ต่างๆ
จากนั้นเราได้เปรียบเทียบโปรตีน msL2 กับโปรตีน msL1 ที่ได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ซึ่งเป็นโปรตีนไรโบโซมเฉพาะของไมโครสปอริเดียเพียงชนิดเดียวที่พบในไรโบโซมของ V. necatrix เราต้องการทดสอบว่า msL1 และ msL2 มีความสัมพันธ์ทางวิวัฒนาการกันหรือไม่ การวิเคราะห์ของเราแสดงให้เห็นว่า msL1 และ msL2 ครอบครองช่องว่างเดียวกันในโครงสร้างไรโบโซม แต่มีโครงสร้างปฐมภูมิและตติยภูมิที่แตกต่างกัน ซึ่งบ่งชี้ถึงต้นกำเนิดทางวิวัฒนาการที่เป็นอิสระ (รูปที่ 6) ดังนั้น การค้นพบ msL2 ของเราจึงเป็นหลักฐานที่แสดงว่ากลุ่มของสิ่งมีชีวิตยูคาริโอตขนาดเล็กสามารถวิวัฒนาการโปรตีนไรโบโซมที่มีโครงสร้างแตกต่างกันได้อย่างอิสระเพื่อชดเชยการสูญเสียชิ้นส่วน rRNA การค้นพบนี้มีความสำคัญเนื่องจากไรโบโซมของสิ่งมีชีวิตยูคาริโอตส่วนใหญ่ในไซโตพลาสซึมมีโปรตีนที่ไม่เปลี่ยนแปลง รวมถึงโปรตีนไรโบโซมตระกูลเดียวกันจำนวน 81 ชนิด การปรากฏตัวของ msL1 และ msL2 ในกลุ่มย่อยต่างๆ ของไมโครสปอริเดีย อันเป็นผลมาจากการสูญเสียส่วนของ rRNA ที่ขยายออกไป บ่งชี้ว่าการเสื่อมสภาพของโครงสร้างโมเลกุลของปรสิตทำให้ปรสิตแสวงหาการกลายพันธุ์เพื่อชดเชย ซึ่งอาจนำไปสู่การได้รับโครงสร้างเหล่านี้ในประชากรปรสิตที่แตกต่างกันในที่สุด
สุดท้าย เมื่อแบบจำลองของเราเสร็จสมบูรณ์ เราได้เปรียบเทียบองค์ประกอบของไรโบโซมของ E. cuniculi กับที่คาดการณ์จากลำดับจีโนม โปรตีนไรโบโซมหลายชนิด รวมถึง eL14, eL38, eL41 และ eS30 เคยถูกคิดว่าหายไปจากจีโนมของ E. cuniculi เนื่องจากไม่พบโปรตีนที่คล้ายคลึงกันในจีโนมของ E. cuniculi การสูญเสียโปรตีนไรโบโซมหลายชนิดยังถูกคาดการณ์ไว้ในปรสิตภายในเซลล์และเอนโดซิมไบออนที่ลดจำนวนลงอย่างมากอื่นๆ ด้วย ตัวอย่างเช่น แม้ว่าแบคทีเรียที่ดำรงชีวิตอิสระส่วนใหญ่จะมีโปรตีนไรโบโซมตระกูลเดียวกัน 54 ชนิด แต่มีเพียง 11 ตระกูลของโปรตีนเหล่านี้เท่านั้นที่มีโปรตีนที่คล้ายคลึงกันที่ตรวจพบได้ในแต่ละจีโนมที่วิเคราะห์ของแบคทีเรียที่จำกัดอยู่เฉพาะในโฮสต์ เพื่อสนับสนุนแนวคิดนี้ มีการสังเกตการสูญเสียโปรตีนไรโบโซมในไมโครสปอริเดีย V. necatrix และ P. locustae โดยการทดลอง ซึ่งไมโครสปอริเดียเหล่านี้ขาดโปรตีน eL38 และ eL4131,32
อย่างไรก็ตาม โครงสร้างของเราแสดงให้เห็นว่ามีเพียง eL38, eL41 และ eS30 เท่านั้นที่หายไปในไรโบโซมของ E. cuniculi โปรตีน eL14 ยังคงอยู่ และโครงสร้างของเราแสดงให้เห็นว่าเหตุใดจึงไม่พบโปรตีนนี้ในการค้นหาความคล้ายคลึงกัน (รูปที่ 7) ในไรโบโซมของ E. cuniculi บริเวณที่ eL14 จับส่วนใหญ่หายไปเนื่องจากการย่อยสลายของ ES39L ที่ขยายด้วย rRNA ในกรณีที่ไม่มี ES39L eL14 สูญเสียโครงสร้างทุติยภูมิส่วนใหญ่ และมีเพียง 18% ของลำดับ eL14 เท่านั้นที่เหมือนกันใน E. cuniculi และ S. cerevisiae การรักษาลำดับที่ไม่ดีนี้เป็นสิ่งที่น่าทึ่ง เพราะแม้แต่ Saccharomyces cerevisiae และ Homo sapiens ซึ่งเป็นสิ่งมีชีวิตที่วิวัฒนาการห่างกัน 1.5 พันล้านปี ก็ยังมีกรดอะมิโนที่เหมือนกันมากกว่า 51% ใน eL14 การสูญเสียการอนุรักษ์ที่ผิดปกตินี้อธิบายได้ว่าทำไม E. cuniculi eL14 จึงถูกระบุว่าเป็นโปรตีน M970_061160 ที่คาดการณ์ไว้ในปัจจุบัน และไม่ใช่โปรตีนไรโบโซม eL1427
และไรโบโซมของไมโครสปอริเดียสูญเสียส่วนขยาย rRNA ES39L ซึ่งทำให้บริเวณการจับโปรตีนไรโบโซม eL14 หายไปบางส่วน ในกรณีที่ไม่มี ES39L โปรตีนไมโครสปอร์ eL14 จะสูญเสียโครงสร้างทุติยภูมิ โดยที่เกลียวอัลฟาที่เคยจับ rRNA จะเสื่อมสภาพกลายเป็นลูปที่มีความยาวน้อยที่สุด ข การจัดเรียงลำดับหลายลำดับแสดงให้เห็นว่าโปรตีน eL14 มีการอนุรักษ์สูงในสิ่งมีชีวิตยูคาริโอต (ความเหมือนของลำดับ 57% ระหว่างโฮโมล็อกของยีสต์และมนุษย์) แต่มีการอนุรักษ์ต่ำและแตกต่างกันในไมโครสปอริเดีย (ซึ่งมีกรดอะมิโนไม่เกิน 24% ที่เหมือนกับโฮโมล็อก eL14 จาก S. cerevisiae หรือ H. sapiens) การอนุรักษ์ลำดับที่ต่ำและความแปรปรวนของโครงสร้างทุติยภูมินี้อธิบายได้ว่าทำไมจึงไม่เคยพบโฮโมล็อก eL14 ใน E. cuniculi และทำไมจึงเชื่อว่าโปรตีนนี้สูญหายไปใน E. cuniculi ในทางตรงกันข้าม ก่อนหน้านี้ E. cuniculi eL14 ถูกระบุว่าเป็นโปรตีน M970_061160 ที่คาดการณ์ไว้ ข้อสังเกตนี้ชี้ให้เห็นว่าความหลากหลายของจีโนมไมโครสปอริเดียในปัจจุบันนั้นถูกประเมินสูงเกินไป: ยีนบางส่วนที่คิดว่าสูญหายไปในไมโครสปอริเดียนั้น แท้จริงแล้วยังคงอยู่ แม้ว่าจะอยู่ในรูปแบบที่แตกต่างกันอย่างมากก็ตาม และบางส่วนที่คิดว่าเข้ารหัสยีนสำหรับโปรตีนเฉพาะของหนอนไมโครสปอริเดีย (เช่น โปรตีนสมมุติฐาน M970_061160) นั้น แท้จริงแล้วเข้ารหัสโปรตีนที่หลากหลายมากที่พบในยูคาริโอตอื่นๆ
ผลการค้นพบนี้ชี้ให้เห็นว่า การเสียสภาพของ rRNA อาจนำไปสู่การสูญเสียการอนุรักษ์ลำดับอย่างมากในโปรตีนไรโบโซมที่อยู่ติดกัน ทำให้โปรตีนเหล่านี้ไม่สามารถตรวจพบได้ด้วยการค้นหาความคล้ายคลึงกัน ดังนั้น เราอาจประเมินระดับการเสื่อมสภาพของโมเลกุลในสิ่งมีชีวิตที่มีจีโนมขนาดเล็กสูงเกินไป เนื่องจากโปรตีนบางชนิดที่คิดว่าสูญหายไปแล้วนั้นยังคงอยู่ แม้ว่าจะอยู่ในรูปแบบที่เปลี่ยนแปลงไปอย่างมากก็ตาม
ปรสิตสามารถรักษาการทำงานของเครื่องจักรระดับโมเลกุลภายใต้สภาวะที่มีการลดขนาดจีโนมอย่างมากได้อย่างไร งานวิจัยของเราตอบคำถามนี้โดยการอธิบายโครงสร้างระดับโมเลกุลที่ซับซ้อน (ไรโบโซม) ของ E. cuniculi ซึ่งเป็นสิ่งมีชีวิตที่มีจีโนมยูคาริโอตขนาดเล็กที่สุดชนิดหนึ่ง
เป็นที่ทราบกันมาเกือบสองทศวรรษแล้วว่า โมเลกุลโปรตีนและอาร์เอ็นเอในปรสิตจุลินทรีย์มักแตกต่างจากโมเลกุลที่คล้ายคลึงกันในสายพันธุ์ที่ดำรงชีวิตอิสระ เนื่องจากขาดศูนย์ควบคุมคุณภาพ มีขนาดลดลงเหลือเพียง 50% ของขนาดในจุลินทรีย์ที่ดำรงชีวิตอิสระ เป็นต้น มีการกลายพันธุ์ที่ทำให้การพับตัวและการทำงานบกพร่องหลายอย่าง ตัวอย่างเช่น ไรโบโซมของสิ่งมีชีวิตที่มีจีโนมขนาดเล็ก รวมถึงปรสิตภายในเซลล์และเอนโดซิมไบออนจำนวนมาก คาดว่าจะขาดโปรตีนไรโบโซมหลายชนิดและนิวคลีโอไทด์ rRNA มากถึงหนึ่งในสามเมื่อเทียบกับสายพันธุ์ที่ดำรงชีวิตอิสระ 27, 29, 30, 49 อย่างไรก็ตาม วิธีการทำงานของโมเลกุลเหล่านี้ในปรสิตยังคงเป็นปริศนาอยู่มาก โดยส่วนใหญ่ศึกษาผ่านการเปรียบเทียบจีโนม
การศึกษาของเราแสดงให้เห็นว่าโครงสร้างของโมเลกุลขนาดใหญ่สามารถเปิดเผยแง่มุมต่างๆ ของวิวัฒนาการได้มากมาย ซึ่งยากที่จะได้มาจากการศึกษาจีโนมเปรียบเทียบแบบดั้งเดิมของปรสิตภายในเซลล์และสิ่งมีชีวิตอื่นๆ ที่จำกัดอยู่เฉพาะโฮสต์ (ภาพประกอบเพิ่มเติมที่ 7) ตัวอย่างเช่น ตัวอย่างของโปรตีน eL14 แสดงให้เห็นว่าเราอาจประเมินระดับการเสื่อมสภาพที่แท้จริงของกลไกโมเลกุลในสายพันธุ์ปรสิตสูงเกินไป ปัจจุบันเชื่อกันว่าปรสิตที่ทำให้เกิดโรคไข้สมองอักเสบมีหลายร้อยยีนที่จำเพาะต่อไมโครสปอริเดีย อย่างไรก็ตาม ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นว่ายีนที่ดูเหมือนจำเพาะเหล่านี้บางส่วนเป็นเพียงรูปแบบที่แตกต่างกันมากของยีนที่พบได้ทั่วไปในยูคาริโอตอื่นๆ ยิ่งไปกว่านั้น ตัวอย่างของโปรตีน msL2 แสดงให้เห็นว่าเรามองข้ามโปรตีนไรโบโซมใหม่ๆ และประเมินเนื้อหาของเครื่องจักรโมเลกุลของปรสิตต่ำเกินไป ตัวอย่างของโมเลกุลขนาดเล็กแสดงให้เห็นว่าเราอาจมองข้ามนวัตกรรมที่ชาญฉลาดที่สุดในโครงสร้างโมเลกุลของปรสิตซึ่งสามารถให้กิจกรรมทางชีวภาพใหม่ๆ แก่พวกมันได้
โดยรวมแล้ว ผลลัพธ์เหล่านี้ช่วยให้เราเข้าใจความแตกต่างระหว่างโครงสร้างโมเลกุลของสิ่งมีชีวิตที่จำกัดอยู่เฉพาะในโฮสต์และโครงสร้างโมเลกุลที่เทียบเคียงได้ในสิ่งมีชีวิตอิสระได้ดียิ่งขึ้น เราแสดงให้เห็นว่าเครื่องจักรโมเลกุล ซึ่งเคยคิดกันว่ามีขนาดเล็กลง เสื่อมสภาพ และเกิดการกลายพันธุ์ที่ทำให้ประสิทธิภาพลดลงนั้น แท้จริงแล้วมีลักษณะโครงสร้างที่ผิดปกติซึ่งถูกมองข้ามไปอย่างเป็นระบบ
ในทางกลับกัน ชิ้นส่วน rRNA ที่ไม่ใหญ่โตและชิ้นส่วนที่หลอมรวมกันที่เราพบในไรโบโซมของ E. cuniculi ชี้ให้เห็นว่าการลดขนาดจีโนมสามารถเปลี่ยนแปลงแม้กระทั่งส่วนต่างๆ ของกลไกโมเลกุลพื้นฐานที่ได้รับการอนุรักษ์ไว้ในสิ่งมีชีวิตทั้งสามโดเมน – หลังจากวิวัฒนาการอิสระของสายพันธุ์ต่างๆ มาเกือบ 3.5 พันล้านปี
ชิ้นส่วน rRNA ที่ปราศจากส่วนโป่งและหลอมรวมกันในไรโบโซมของ E. cuniculi เป็นสิ่งที่น่าสนใจเป็นพิเศษเมื่อพิจารณาจากการศึกษาโมเลกุล RNA ในแบคทีเรียที่อาศัยอยู่ร่วมกันแบบพึ่งพาอาศัยกันก่อนหน้านี้ ตัวอย่างเช่น ในแบคทีเรียที่อาศัยอยู่ร่วมกันแบบพึ่งพาอาศัยกันในเพลี้ยอ่อน Buchnera aphidicola พบว่าโมเลกุล rRNA และ tRNA มีโครงสร้างที่ไวต่ออุณหภูมิเนื่องจากความลำเอียงขององค์ประกอบ A+T และสัดส่วนที่สูงของคู่เบสที่ไม่เป็นไปตามแบบแผน20,50 การเปลี่ยนแปลงเหล่านี้ใน RNA เช่นเดียวกับการเปลี่ยนแปลงในโมเลกุลโปรตีน ปัจจุบันเชื่อกันว่าเป็นสาเหตุของการพึ่งพาอาศัยกันมากเกินไปของแบคทีเรียที่อาศัยอยู่ร่วมกันแบบพึ่งพาอาศัยกัน และความไม่สามารถของแบคทีเรียเหล่านั้นในการถ่ายเทความร้อน 21, 23 แม้ว่า rRNA ของไมโครสปอริเดียที่เป็นปรสิตจะมีโครงสร้างที่เปลี่ยนแปลงไปอย่างชัดเจน แต่ลักษณะของการเปลี่ยนแปลงเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าความเสถียรต่อความร้อนที่ลดลงและการพึ่งพาโปรตีนชาเปอโรนที่สูงขึ้นอาจเป็นลักษณะทั่วไปของโมเลกุล RNA ในสิ่งมีชีวิตที่มีจีโนมลดลง
ในทางกลับกัน โครงสร้างของเราแสดงให้เห็นว่าไมโครสปอริเดียที่เป็นปรสิตได้พัฒนาความสามารถเฉพาะตัวในการต้านทานชิ้นส่วน rRNA และโปรตีนที่อนุรักษ์ไว้อย่างกว้างขวาง โดยพัฒนาความสามารถในการใช้สารเมตาบอไลต์ขนาดเล็กที่มีอยู่มากมายและหาได้ง่ายเป็นตัวเลียนแบบโครงสร้างของชิ้นส่วน rRNA และโปรตีนที่เสื่อมสภาพ ความเห็นนี้ได้รับการสนับสนุนจากข้อเท็จจริงที่ว่าโมเลกุลขนาดเล็กที่ชดเชยการสูญเสียชิ้นส่วนโปรตีนใน rRNA และไรโบโซมของ E. cuniculi จะจับกับสารตกค้างเฉพาะของไมโครสปอริเดียในโปรตีน uL15 และ eL30 สิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่าการจับของโมเลกุลขนาดเล็กกับไรโบโซมอาจเป็นผลมาจากการคัดเลือกเชิงบวก ซึ่งการกลายพันธุ์เฉพาะของไมโครสปอริเดียในโปรตีนไรโบโซมได้รับการคัดเลือกเนื่องจากความสามารถในการเพิ่มความสัมพันธ์ของไรโบโซมกับโมเลกุลขนาดเล็ก ซึ่งอาจนำไปสู่สิ่งมีชีวิตที่มีไรโบโซมที่มีประสิทธิภาพมากขึ้น การค้นพบนี้เผยให้เห็นนวัตกรรมอันชาญฉลาดในโครงสร้างระดับโมเลกุลของปรสิตจุลินทรีย์ และทำให้เราเข้าใจได้ดียิ่งขึ้นว่าโครงสร้างระดับโมเลกุลของปรสิตสามารถรักษาการทำงานของตนเองได้อย่างไร แม้จะมีการวิวัฒนาการแบบลดทอนก็ตาม
ในปัจจุบัน การระบุโมเลกุลขนาดเล็กเหล่านี้ยังไม่ชัดเจน ยังไม่เป็นที่แน่ชัดว่าเหตุใดการปรากฏของโมเลกุลขนาดเล็กเหล่านี้ในโครงสร้างของไรโบโซมจึงแตกต่างกันระหว่างสายพันธุ์ไมโครสปอริเดีย โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ยังไม่เป็นที่แน่ชัดว่าเหตุใดจึงพบการจับกับนิวคลีโอไทด์ในไรโบโซมของ E. cuniculi และ P. locustae แต่ไม่พบในไรโบโซมของ V. necatrix ทั้งๆ ที่มีกรดอะมิโน F170 อยู่ในโปรตีน eL20 และ K172 ของ V. necatrix การขาดหายไปนี้อาจเกิดจากกรดอะมิโนตำแหน่งที่ 43 uL6 (ซึ่งอยู่ติดกับช่องจับนิวคลีโอไทด์) ซึ่งเป็นไทโรซีนใน V. necatrix ไม่ใช่ทรีโอนีนใน E. cuniculi และ P. locustae หมู่ข้างเคียงอะโรมาติกขนาดใหญ่ของ Tyr43 อาจรบกวนการจับกับนิวคลีโอไทด์เนื่องจากการทับซ้อนเชิงพื้นที่ อีกทางเลือกหนึ่ง การลบของนิวคลีโอไทด์ที่ปรากฏอาจเกิดจากความละเอียดต่ำของการถ่ายภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบแช่แข็ง (cryo-EM) ซึ่งขัดขวางการสร้างแบบจำลองของชิ้นส่วนไรโบโซมของ V. necatrix
ในทางกลับกัน งานวิจัยของเราชี้ให้เห็นว่ากระบวนการเสื่อมสภาพของจีโนมอาจเป็นแรงผลักดันในการสร้างสรรค์สิ่งใหม่ๆ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง โครงสร้างของไรโบโซม E. cuniculi บ่งชี้ว่าการสูญเสีย rRNA และชิ้นส่วนโปรตีนในไรโบโซมของไมโครสปอริเดียสร้างแรงกดดันทางวิวัฒนาการที่ส่งเสริมการเปลี่ยนแปลงในโครงสร้างของไรโบโซม รูปแบบต่างๆ เหล่านี้เกิดขึ้นห่างจากบริเวณออกฤทธิ์ของไรโบโซมและดูเหมือนจะช่วยรักษา (หรือฟื้นฟู) การประกอบไรโบโซมที่เหมาะสมซึ่งอาจถูกรบกวนโดย rRNA ที่ลดลง สิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่านวัตกรรมที่สำคัญของไรโบโซมไมโครสปอริเดียดูเหมือนจะวิวัฒนาการไปสู่ความต้องการในการปรับสมดุลการเปลี่ยนแปลงของยีน
บางทีอาจอธิบายเรื่องนี้ได้ดีที่สุดด้วยการจับตัวของนิวคลีโอไทด์ ซึ่งยังไม่เคยพบในสิ่งมีชีวิตอื่นมาก่อน ข้อเท็จจริงที่ว่ามีสารตกค้างที่จับกับนิวคลีโอไทด์อยู่ในไมโครสปอริเดียทั่วไป แต่ไม่มีในยูคาริโอตอื่นๆ บ่งชี้ว่าตำแหน่งที่จับกับนิวคลีโอไทด์ไม่ใช่เพียงแค่ซากที่รอการหายไป หรือตำแหน่งสุดท้ายที่ rRNA จะถูกฟื้นฟูให้กลับมาอยู่ในรูปของนิวคลีโอไทด์แต่ละตัว แต่ดูเหมือนว่าตำแหน่งนี้จะเป็นคุณลักษณะที่มีประโยชน์ซึ่งอาจวิวัฒนาการมาจากการคัดเลือกเชิงบวกหลายรอบ ตำแหน่งที่จับกับนิวคลีโอไทด์อาจเป็นผลพลอยได้จากการคัดเลือกโดยธรรมชาติ: เมื่อ ES39L เสื่อมสภาพ ไมโครสปอริเดียจะถูกบังคับให้หาทางชดเชยเพื่อฟื้นฟูการสร้างไรโบโซมให้เหมาะสมที่สุดในกรณีที่ไม่มี ES39L เนื่องจากนิวคลีโอไทด์นี้สามารถเลียนแบบการสัมผัสระดับโมเลกุลของนิวคลีโอไทด์ A3186 ใน ES39L ได้ โมเลกุลของนิวคลีโอไทด์จึงกลายเป็นส่วนประกอบสำคัญของไรโบโซม ซึ่งการจับตัวของมันจะได้รับการปรับปรุงให้ดียิ่งขึ้นโดยการกลายพันธุ์ของลำดับ eL30
ในส่วนของการวิวัฒนาการระดับโมเลกุลของปรสิตภายในเซลล์ งานวิจัยของเราแสดงให้เห็นว่าแรงผลักดันของการคัดเลือกโดยธรรมชาติแบบดาร์วินและการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมที่ทำให้จีโนมเสื่อมสภาพนั้นไม่ได้ทำงานควบคู่กันไป แต่เป็นการแกว่งไปมา ประการแรก การเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมจะกำจัดลักษณะสำคัญของโมเลกุลชีวภาพ ทำให้จำเป็นต้องมีการชดเชยอย่างมาก เฉพาะเมื่อปรสิตสามารถชดเชยความต้องการนี้ได้ผ่านการคัดเลือกโดยธรรมชาติแบบดาร์วินเท่านั้น โมเลกุลขนาดใหญ่ของพวกมันจึงจะมีโอกาสพัฒนาลักษณะที่น่าประทับใจและสร้างสรรค์ที่สุด ที่สำคัญ การวิวัฒนาการของตำแหน่งการจับนิวคลีโอไทด์ในไรโบโซมของ E. cuniculi ชี้ให้เห็นว่ารูปแบบการสูญเสียไปสู่การได้มาซึ่งการวิวัฒนาการระดับโมเลกุลนี้ ไม่เพียงแต่จะลดทอนการกลายพันธุ์ที่เป็นอันตรายเท่านั้น แต่บางครั้งยังมอบหน้าที่ใหม่ทั้งหมดให้กับโมเลกุลขนาดใหญ่ของปรสิตอีกด้วย
แนวคิดนี้สอดคล้องกับทฤษฎีสมดุลเคลื่อนที่ของ Sewell Wright ซึ่งระบุว่าระบบการคัดเลือกโดยธรรมชาติที่เข้มงวดจะจำกัดความสามารถของสิ่งมีชีวิตในการสร้างนวัตกรรม51,52,53 อย่างไรก็ตาม หากการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมขัดขวางการคัดเลือกโดยธรรมชาติ การเปลี่ยนแปลงเหล่านี้อาจก่อให้เกิดการเปลี่ยนแปลงที่ไม่ใช่การปรับตัว (หรืออาจเป็นอันตรายด้วยซ้ำ) แต่จะนำไปสู่การเปลี่ยนแปลงเพิ่มเติมที่ให้ความเหมาะสมที่สูงขึ้นหรือกิจกรรมทางชีวภาพใหม่ กรอบการทำงานของเราสนับสนุนแนวคิดนี้โดยแสดงให้เห็นว่าการกลายพันธุ์ประเภทเดียวกันที่ลดโครงสร้างและการทำงานของโมเลกุลชีวภาพดูเหมือนจะเป็นตัวกระตุ้นหลักสำหรับการปรับปรุง ในทำนองเดียวกันกับแบบจำลองวิวัฒนาการแบบ win-win การศึกษาของเราแสดงให้เห็นว่าการเสื่อมสภาพของจีโนม ซึ่งโดยทั่วไปมองว่าเป็นกระบวนการเสื่อมถอย ยังเป็นตัวขับเคลื่อนหลักของนวัตกรรม บางครั้งและอาจบ่อยครั้งที่ทำให้โมเลกุลขนาดใหญ่ได้รับกิจกรรมปรสิตใหม่ ๆ ที่สามารถนำไปใช้ได้