Gratias tibi ago quod Nature.com invisisti. Versio navigatri quam uteris limitatam sustentationem CSS habet. Pro optima experientia, commendamus ut navigatro recentiore utaris (vel Modum Compatibilitatis in Internet Explorer deactivare). Interea, ut sustentationem continuam praestemus, situm sine stylis et JavaScript reddemus.
Evolutio parasitorum microbialium contrarietatem inter selectionem naturalem, quae parasitos ad meliorationem incitat, et derivationem geneticam, quae parasitos ad gena amittenda et mutationes detrimentales accumulandas efficit, implicat. Hic, ut intelligamus quomodo haec contrarietas in scala macromoleculae singularis fiat, structuram cryo-EM ribosomi Encephalitozoon cuniculi, organismi eukaryotici cum uno ex minimis genomis in natura, describimus. Extrema reductio rRNA in ribosomatibus E. cuniculi mutationibus structuralibus inauditis comitatur, ut evolutio copularum rRNA fusarum antea ignotarum et rRNA sine tumoribus. Praeterea, ribosoma E. cuniculi iacturam fragmentorum et proteinorum rRNA supervixit per facultatem utendi moleculis parvis ut imitationes structurales fragmentorum et proteinorum rRNA degradatorum evolvendam. In summa, demonstramus structuras moleculares, quae diu putabantur reductae, degeneratae, et mutationibus debilitantibus subiectae esse, plures mechanismos compensatorios habere qui eas activas servant, contractionibus molecularibus extremis non obstantibus.
Quia pleraeque catervae parasitorum microbialium instrumenta molecularia singularia habent ad hospites suos utendos, saepe diversas curationes pro diversis parasitorum catervis excogitare debemus1,2. Nihilominus, novae probationes suggerunt nonnullos aspectus evolutionis parasitorum convergentes et plerumque praedicabiles esse, quod fundamentum potentiale indicat pro latis interventionibus therapeuticis in parasitis microbialibus3,4,5,6,7,8,9.
Opera priora communem quandam inclinationem evolutionariam in parasitis microbialibus, quae reductio genomi vel decaditio genomi appellatur, invenerunt10,11,12,13. Investigationes recentes ostendunt, cum microorganismi vitam liberam relinquunt et parasiti intracellulares (vel endosymbiontes) fiunt, genoma eorum metamorphoses lentas sed mirabiles per milliones annorum subire9,11. In processu qui decaditio genomi appellatur, parasiti microbiales mutationes detrimentosas accumulant quae multa gena antea magni momenti in pseudogena vertunt, quod ad gradatim genorum iacturam et collapsum mutationalem ducit14,15. Hic collapsus usque ad 95% genorum in vetustissimis organismis intracellularibus comparatis cum speciebus libere viventibus arcte cognatis delere potest. Itaque evolutio parasitum intracellularium est certamen inter duas vires oppositas: selectionem naturalem Darwinianam, quae ad meliorationem parasitum ducit, et collapsum genomi, qui parasitos in oblivionem proicit. Quomodo parasitus ex hoc certamine emergere et actionem structurae suae molecularis retinere potuerit, adhuc incertum est.
Quamquam ratio corruptionis genomi nondum plene intellegitur, videtur fieri praecipue propter frequentem mutationem geneticam. Quia parasiti in parvis, asexualibus, et genetice limitatis populationibus vivunt, mutationes deleterias quae interdum per replicationem DNA occurrunt efficaciter eliminare non possunt. Hoc ad accumulationem irreversibilem mutationum noxiarum et reductionem genomi parasiti ducit. Propterea, parasitus non solum genes perdit quae non amplius necessaria sunt ad supervivendum in ambitu intracellulari. Incapacitas populationum parasitarum ad mutationes deleterias sporadicas efficaciter eliminandas efficit ut hae mutationes per totum genoma accumulentur, etiam genes maximi momenti.
Magna pars intellegentiae nostrae hodiernae de reductione genomi solum in comparationibus sequentiarum genomi fundatur, minore attentione ad mutationes in moleculis actualibus quae functiones generales peragunt et ut potentialia scopi medicamentorum funguntur. Studia comparativa demonstraverunt onus mutationum microbialium intracellularium detrimentosarum proteinas et acida nucleica ad male plicanda et aggreganda praedisponere videri, ea magis a chaperonibus dependentia et hypersensibilia ad calorem reddens19,20,21,22,23. Praeterea, varii parasiti — evolutione independens interdum usque ad 2.5 miliarda annorum separata — similem iacturam centrorum moderationis qualitatis in synthesi proteinorum5,6 et mechanismis reparationis DNA24 experti sunt. Attamen, parum notum est de impactu vitae intracellularis in omnes alias proprietates macromolecularum cellularum, inter quas adaptatio molecularis ad crescentem onus mutationum detrimentosarum.
In hoc opere, ut evolutionem proteinorum et acidorum nucleicorum microorganismorum intracellularium melius intellegeremus, structuram ribosomatum parasiti intracellularis *Encephalitozoon cuniculi* determinavimus. *E. cuniculi* est organismus fungo similis, ad gregem microsporidiorum parasiticorum pertinens, quae genoma eukaryotica insolito parva habent, ideoque ut organismi exemplares ad investigandam degradationem genomi adhibentur25,26,27,28,29,30. Nuper, structura ribosomatum cryo-EM determinata est pro genomis moderate reductis Microsporidiorum, *Paranosematis locustae*, et *Vairimorphae necatrix*31,32 (genoma ~3.2 Mb). Hae structurae suggerunt aliquam iacturam amplificationis rRNA compensari evolutione novorum contactuum inter proteinas ribosomales vicinas vel acquisitione novorum proteinorum ribosomalum *msL131,32*. Species *Encephalitozoon* (genoma ~2.5 million bp), una cum proximo cognato *Ordospora*, summum gradum reductionis genomi in eukaryotis demonstrant – minus quam 2000 gena proteinorum codificantia habent, et expectatur ut ribosomata eorum non solum fragmentis expansionis rRNA (fragmentis rRNA quae ribosomata eukaryotica a ribosomatibus bacterialibus distinguunt) careant, sed etiam quattuor proteinas ribosomales habeant propter carentiam homologorum in genoma *E. cuniculi*26,27,28. Ergo, conclusimus ribosoma *E. cuniculi* posse revelare rationes antea ignotas adaptationis molecularis ad corruptionem genomi.
Structura nostra cryo-EM minimum ribosoma cytoplasmicum eukaryoticum quod descriptum est repraesentat et perspicuitatem praebet quomodo ultimus gradus reductionis genomi structuram, compositionem, et evolutionem machinationis molecularis quae cellulae integralis est afficit. Invenimus ribosoma E. cuniculi multa principia late conservata plicaturae RNA et compositionis ribosomatum violare, et novum proteinum ribosomiale antea ignotum invenimus. Inopinato modo, demonstramus ribosomata microsporidia facultatem ligandi moleculas parvas evolvisse, et hypothesim ponimus truncationes in rRNA et proteinis innovationes evolutionarias incitare quae tandem qualitates utiles ribosomati conferre possint.
Ut intellegentiam nostram evolutionis proteinorum et acidorum nucleicorum in organismis intracellularibus augeremus, decrevimus sporas *E. cuniculi* ex culturis cellularum mammalium infectarum separare, ut ribosomata earum purificaremus et structuram horum ribosomatum determinaremus. Difficile est magnum numerum microsporidiorum parasiticorum obtinere, quia microsporidia in medio nutriente coli non possunt. Potius, intra cellulam hospitis tantum crescunt et multiplicantur. Ergo, ut biomassam *E. cuniculi* ad purificationem ribosomatum obtineremus, lineam cellularum renum mammalium RK13 sporis *E. cuniculi* infecimus et has cellulas infectas per aliquot septimanas coluimus ut *E. cuniculi* crescere et multiplicari posset. Monostrato cellularum infectarum circiter dimidii metri quadrati utentes, circiter 300 mg sporarum Microsporidiorum purificare et eas ad ribosomata separanda uti potuimus. Deinde sporas purificatas globulis vitreis interrupimus et ribosomata cruda, fractionatione gradatim polyethylene glycol lysatarum utentes, separavimus. Hoc nobis permisit ut circiter 300 µg ribosomatum E. cuniculi crudorum ad analysin structuralem obtineremus.
Deinde imagines cryo-EM collegimus, exemplis ribosomatum inde ortis, et has imagines tractavimus utens larvis respondentibus subunitati ribosomiali magnae, capiti subunitatis parvae, et subunitati parvae. Per hoc processum, imagines circiter 108,000 particularum ribosomalium collegimus et imagines cryo-EM cum resolutione 2.7 Å computavimus (Figurae Supplementariae 1-3). Deinde imagines cryoEM adhibuimus ad rRNA, proteinum ribosomiale, et factorem hibernationis Mdf1 cum ribosomatibus E. cuniculi associatum simulandum (Fig. 1a, b).
a Structura ribosomi E. cuniculi in complexo cum factore hibernationis Mdf1 (pdb id 7QEP). b Tabula factoris hibernationis Mdf1 cum ribosomate E. cuniculi associati. c Tabula structurae secundariae comparans rRNA recuperatum in speciebus Microsporidianis cum structuris ribosomialibus notis. Tabulae locum fragmentorum rRNA amplificatorum (ES) et locorum activorum ribosomatum ostendunt, incluso loco decodificationis (DC), ansa sarcinicini (SRL), et centro peptidyl transferasis (PTC). d Densitas electronica correspondens centro peptidyl transferasis ribosomi E. cuniculi suggerit hunc locum catalyticum eandem structuram habere in parasito E. cuniculi et hospitibus eius, incluso H. sapiens. e, f Densitas electronica correspondens centri decodificationis (e) et structura schematica centri decodificationis (f) indicant E. cuniculi residua U1491 habere loco A1491 (numeratio E. coli) in multis aliis eukaryotis. Haec mutatio suggerit E. cuniculi fortasse sensibilem esse ad antibiotica quae hunc locum activum petunt.
Contra structuras ribosomatum *V. necatrix* et *P. locustae* antea constitutas (utraque structura eandem familiam microsporidiorum *Nosematidarum* repraesentat et inter se simillima est),31,32 ribosomata *E. cuniculi* numerosos processus fragmentationis rRNA et proteinorum subeunt. Ulterior denaturatio (Figurae Suppletoriae 4-6). In rRNA, mutationes maxime insignes incluserunt amissionem completam fragmenti amplificati 25S rRNA ES12L et degenerationem partialem helicium h39, h41, et H18 (Figura 1c, Figura Suppletoria 4). Inter proteinas ribosomales, mutationes maxime insignes incluserunt amissionem completam proteini eS30 et breviationem proteinorum eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17, et eS7 (Figurae Suppletoriae 4, 5).
Itaque, extrema reductio genomatum specierum Encephalotozoon/Ordospora in structura ribosomatum eorum reflectitur: ribosomata E. cuniculi maximam iacturam contenti proteini in ribosomatibus cytoplasmaticis eukaryoticis, quae characterizationi structurali subiecta sunt, patiuntur, nec illa fragmenta rRNA et proteinorum habent, quae non solum in eukaryotis, sed etiam in tribus vitae partibus late conservantur. Structura ribosomi E. cuniculi primum exemplar moleculare harum mutationum praebet et eventa evolutionaria revelat, quae et a genomica comparativa et a studiis structurae biomolecularis intracellularis neglecta sunt (Figura Supplementaria 7). Infra, unumquodque horum eventuum una cum probabilibus originibus evolutionariis et potentiali impactu in functionem ribosomatum describimus.
Deinde invenimus, praeter magnas truncationes rRNA, ribosomata E. cuniculi variationes rRNA in uno locorum suorum activorum habere. Quamquam centrum peptidyl transferasis ribosomi E. cuniculi eandem structuram habet quam alia ribosomata eukaryotica (Fig. 1d), centrum decodificationis differt propter variationem sequentiae apud nucleotidum 1491 (numeratio E. coli, Fig. 1e, f). Haec observatio magni momenti est quia locus decodificationis ribosomatum eukaryoticorum typice residua G1408 et A1491 continet comparatus cum residuis bacterialibus A1408 et G1491. Haec variatio subiacet diversae sensibilitati ribosomatum bacterialium et eukaryoticorum ad familiam aminoglycosidum antibioticorum ribosomalium et aliarum moleculorum parvarum quae locum decodificationis petunt. In loco decodificationis ribosomi E. cuniculi, residuum A1491 cum U1491 substitutum est, potentialiter creans interfaciem ligationis unicam pro moleculis parvis hunc locum activum petentibus. Eadem varietas A14901 etiam in aliis microsporidiis, ut *P. locustae* et *V. necatrix*, praesens est, quod indicat eam inter species microsporidiorum late diffusam esse (Fig. 1f).
Quia exempla nostra ribosomatum *E. cuniculi* ex sporis metabolice inactivis separata sunt, mappam cryo-EM *E. cuniculi* ad nexum ribosomatum sub condicionibus stressis vel inedia antea descriptum examinavimus. Factores hibernationis 31, 32, 36, 37, 38. Structuram antea constitutam ribosomatis hibernantis cum mappa cryo-EM ribosomatis *E. cuniculi* comparavimus. Ad coniunctionem, ribosomata *S. cerevisiae* in complexo cum factore hibernationis Stm138, ribosomata *locustae* in complexo cum factore Lso232, et ribosomata *V. necatrix* in complexo cum factoribus Mdf1 et Mdf231 adhibita sunt. Simul, densitatem cryo-EM factori quietis Mdf1 correspondentem invenimus. Similiter ac Mdf1 ad ribosoma V. necatrix se iungit, Mdf1 etiam ad ribosoma E. cuniculi se iungit, ubi locum E ribosomatis obstruit, fortasse adiuvans ut ribosomata praesto sint cum sporae parasitorum metabolice inactivae fiunt post inactivationem corporis (Figura 2).
Mdf1 locum E ribosomi obstruit, quod ribosoma inactivare iuvare videtur cum sporae parasitorum metabolice inactivae fiunt. In structura ribosomi E. cuniculi, invenimus Mdf1 contactum antea ignotum cum caule ribosomi L1, parte ribosomi quae liberationem tRNA deacylatae e ribosomate per synthesim proteinorum facilitat, formare. Hi contactus suggerunt Mdf1 a ribosomate dissociari eodem mechanismo quo tRNA deacetylata utens, explicationem possibilem praebentes quomodo ribosoma Mdf1 removet ad synthesim proteinorum reactivandam.
Attamen structura nostra contactum ignotum inter Mdf1 et crus ribosomatis L1 (partem ribosomatis quae adiuvat ad liberandum tRNA deacylatum e ribosomate durante synthesi proteinorum) revelavit. Praesertim, Mdf1 utitur iisdem contactibus ac segmentum cubitale moleculae tRNA deacylatae (Fig. 2). Haec modellatio molecularis antea ignota demonstravit Mdf1 a ribosomate dissociari eodem mechanismo utens quo tRNA deacetylata, quod explicat quomodo ribosoma hunc factorem hibernationis removet ad synthesim proteinorum reactivandam.
Cum exemplar rRNA construeremus, invenimus ribosoma E. cuniculi fragmenta rRNA abnormaliter complicata habere, quae rRNA fusa appellavimus (Fig. 3). In ribosomatis quae tres vitae regiones comprehendunt, rRNA in structuras plicatur in quibus pleraeque bases rRNA vel inter se copulantur et plicantur vel cum proteinis ribosomalibus interagunt 38,39,40. Attamen, in ribosomatis E. cuniculi, rRNA hoc principium plicaturae violare videntur convertendo aliquas helices suas in regiones rRNA non explicatas.
Structura helicis H18 25S rRNA in *S. cerevisiae*, *V. necatrix*, et *E. cuniculi*. Typice, in ribosomatis quae tres regiones vitae complectuntur, hic linker in helicem RNA volvitur quae 24 ad 34 residua continet. In Microsporidiis, contra, hic linker rRNA gradatim reducitur ad duos linkers uridino divites monocatenarios, tantum 12 residua continentes. Plerique horum residuorum solventibus exponuntur. Figura ostendit microsporidia parasitica principia generalia plicaturae rRNA violare videntur, ubi bases rRNA plerumque cum aliis basibus copulantur vel in interactionibus rRNA-proteini implicantur. In microsporidiis, quaedam fragmenta rRNA plicaturam non favorabilem suscipiunt, in qua prior helice rRNA fragmentum monocatenarium fere in linea recta elongatum fit. Praesentia harum regionum insolitarum permittit microsporidia rRNA fragmenta rRNA distantia ligare utens numero minimo basium RNA.
Exemplum clarissimum huius transitionis evolutionariae observari potest in helice H18 25S rRNA (Fig. 3). In speciebus ab E. coli ad homines, bases huius helicis rRNA continent 24-32 nucleotida, helicem paulo irregularem formantes. In structuris ribosomalibus antea identificatis ab V. necatrix et P. locustae,31,32 bases helicis H18 partim explicatae sunt, sed paria basium nucleotidorum servantur. Attamen, in E. cuniculi hoc fragmentum rRNA fit brevissimus copulator 228UUUGU232 et 301UUUUUUUUUU307. Dissimilia fragmentis rRNA typicis, hi copulatores uridino divites non convolvuntur nec contactum amplum cum proteinis ribosomalibus faciunt. Potius, structuras solvente apertas et plene explicatas adoptant, in quibus fila rRNA fere recte extenduntur. Haec conformatio extensa explicat quomodo E. cuniculi tantum duodecim basibus RNA utitur ad hiatum 33 Å inter helices rRNA H16 et H18 implendum, dum aliae species saltem duplo tot basibus rRNA requirunt ad hiatum implendum.
Itaque demonstrare possumus microsporidiis parasiticis, per plicaturam energetice adversam, rationem evolvisse ad contrahendos etiam ea segmenta rRNA quae late conservata manent per species in tribus vitae partibus. Videtur E. cuniculi, accumulando mutationes quae helices rRNA in breves copulas poly-U transformant, fragmenta rRNA insolita formare posse, quam paucissima nucleotida continentia ad ligationem fragmentorum rRNA distalium. Hoc adiuvat ad explicandum quomodo microsporidiis dramaticam reductionem in structura moleculari fundamentali consecuti sint sine integritate structurali et functionali amissa.
Alia insolita proprietas rRNA E. cuniculi est species rRNA sine crassitudinibus (Fig. 4). Tumores sunt nucleotida sine paribus basium quae ex helice RNA torquentur potius quam in ea latent. Pleraeque protrusiones rRNA funguntur ut glutina molecularia, adiuvantes ad ligandas proteinas ribosomales adiacentes vel alia fragmenta rRNA. Nonnullae tumores funguntur ut cardines, permittentes helici rRNA flectere et complicare optime ad synthesis proteinorum productivam. 41.
a Protrusio rRNA (numeratione S. cerevisiae) abest a structura ribosomatis E. cuniculi, sed praesens est in plurimis aliis eukaryotis. b Ribosomata interna E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens, et E. cuniculi. Parasiti multis tumoribus antiquis et valde conservatis rRNA carent. Hae crassitudines structuram ribosomatis stabilizant; ergo, absentia eorum in microsporidiis stabilitatem reductam plicaturae rRNA in parasitis microsporidiis indicat. Comparatio cum caulibus P (caulibus L7/L12 in bacteriis) ostendit amissionem tumorum rRNA interdum coincidere cum apparitione novorum tumorum iuxta tumores amissis. Helix H42 in rRNA 23S/28S tumorem antiquum (U1206 in Saccharomyces cerevisiae) habet, qui saltem 3.5 miliarda annorum aestimatur propter eius protectionem in tribus vitae partibus. In microsporidiis, hic tumor eliminatur. Nova tamen tumorem iuxta tumorem amissum apparuit (A1306 in E. cuniculi).
Mirum in modum, invenimus ribosomata *E. cuniculi* plerisque tumoribus rRNA quae in aliis speciebus inveniuntur carere, inter quos plus quam triginta tumores qui in aliis eukaryotis conservantur (Fig. 4a). Haec amissio multos contactus inter subunitates ribosomales et helices rRNA adiacentes eliminat, interdum magna inania intra ribosoma creans, ribosoma *E. cuniculi* porosius reddens comparatum cum ribosomatibus magis traditis (Fig. 4b). Notandum est quod invenimus plerosque horum tumorum etiam in structuris ribosomatum *V. necatrix* et *P. locustae* antea identificatis amissos esse, quae ab prioribus analysibus structuralibus neglectae sunt31,32.
Interdum amissio tumorum rRNA comitatur cum evolutione novorum tumorum iuxta tumorem amissum. Exempli gratia, caulis P ribosomialis continet tumorem U1208 (in Saccharomyce cerevisiae) qui ab E. coli ad homines supervixit et ideo aestimatur 3.5 miliarda annorum natum esse. Per synthesim proteinorum, hic tumor adiuvat caulem P movere inter conformationes apertas et clausas ut ribosoma factores translationis adsciscere et eos ad locum activum perferre possit. In ribosomatibus E. cuniculi, haec crassitudo abest; tamen, nova crassitudo (G883) sita tantum in tribus paribus basium ad restitutionem flexibilitatis optimae caulis P conferre potest (Fig. 4c).
Data nostra de rRNA sine tumoribus suggerunt imminutionem rRNA non solum ad iacturam elementorum rRNA in superficie ribosomatis limitari, sed etiam nucleum ribosomatis implicare posse, vitium moleculare parasito-proprium creans, quod in cellulis libere viventibus non descriptum est. Species viventes observantur.
Post exemplaria proteinorum ribosomalium canonicorum et rRNA, invenimus componentes ribosomales conventionales tres partes imaginis cryo-EM explicare non posse. Duo ex his fragmentis moleculae parvae magnitudinis sunt (Fig. 5, Fig. Supplementaria 8). Primum segmentum inter proteinas ribosomales uL15 et eL18 in loco plerumque a C-termino eL18 occupato, qui in E. cuniculi abbreviatus est, interponitur. Quamquam identitatem huius moleculae determinare non possumus, magnitudo et forma huius insulae densitatis bene explicantur praesentia molecularum spermidinae. Nexus eius ad ribosoma stabilitur mutationibus microsporidia-specificis in proteinis uL15 (Asp51 et Arg56), quae affinitatem ribosomatis pro hac molecula parva augere videntur, cum uL15 permittant moleculam parvam in structuram ribosomalem involvere. Figura Supplementaria 2). 8, data addita 1, 2).
Imago cryo-electromagnetica (Cryo-EM) praesentiam nucleotidorum extra ribosum ribosomati E. cuniculi coniunctum ostendens. In ribosomate E. cuniculi, hoc nucleotidum eundem locum occupat ac nucleotidum 25S rRNA A3186 (numeratio Saccharomyces cerevisiae) in plurimis aliis ribosomatibus eukaryoticis. b In structura ribosomiali E. cuniculi, hoc nucleotidum inter proteinas ribosomales uL9 et eL20 locatum est, ita contactum inter duas proteinas stabiliens. cd Analysis conservationis sequentiae eL20 inter species microsporidia. Arbor phylogenetica specierum Microsporidia (c) et ordinatio sequentiarum multiplex proteini eL20 (d) ostendunt residua nucleotidorum coniungentia F170 et K172 conservari in plurimis Microsporidiis typicis, excepto S. lophii, excepto Microsporidia ramosa praematura, quae extensionem rRNA ES39L retinuerunt. e Haec figura ostendit residua nucleotidorum ligantium F170 et K172 tantum in eL20 genomatis microsporidiorum valde reducti adesse, sed non in aliis eukaryotis. In universum, haec data suggerunt ribosomata microsporidia locum ligationis nucleotidorum evolvisse qui moleculas AMP ligare et eas ad interactiones proteinorum in structura ribosomali stabiliendas uti videtur. Alta conservatio huius loci ligationis in Microsporidiis et eius absentia in aliis eukaryotis suggerit hunc locum commodum superviventiae selectivae Microsporidiis praebere posse. Ita, loculus ligationis nucleotidorum in ribosomate microsporidiorum non videtur esse nota degenerata vel forma finalis degradationis rRNA ut antea descriptum est, sed potius utilis innovatio evolutionaria quae ribosomati microsporidiorum permittit moleculas parvas directe ligare, eas ut fundamenta molecularia ribosomatum utens. Haec inventio ribosoma microsporidiorum unicum ribosoma facit quod unum nucleotidum ut structuram suam utitur. f Via evolutionaria hypothetica a ligatione nucleotidorum derivata.
Secunda densitas ponderis molecularis humilis in interfacie inter proteinas ribosomales uL9 et eL30 sita est (Fig. 5a). Haec interfacies antea in structura ribosomi Saccharomyces cerevisiae ut locus ligationis pro nucleotido 25S rRNA A3186 (pars extensionis rRNA ES39L)38 descripta est. Demonstratum est in ribosomis degeneratis P. locustae ES39L, hanc interfaciem nucleotidum singulare ignotum 31 ligare, et assumitur hoc nucleotidum formam finalem reductam rRNA esse, in qua longitudo rRNA ~130-230 bases est. ES39L ad nucleotidum singulare 32.43 reducitur. Imagines nostrae cryo-EM ideam confirmant densitatem nucleotidis explicari posse. Attamen, resolutio superior structurae nostrae ostendit hoc nucleotidum moleculam extraribosomalem esse, fortasse AMP (Fig. 5a, b).
Deinde quaesivimus utrum situs ligationis nucleotidorum in ribosomate *E. cuniculi* apparuisset an antea exstitisset. Cum ligatio nucleotidorum praecipue per residua Phe170 et Lys172 in proteino ribosomiali *eL30* mediatur, conservationem horum residuorum in 4396 eukaryotis repraesentativis aestimavimus. Sicut in casu *uL15* supra, invenimus residua Phe170 et Lys172 solum in Microsporidiis typicis valde conservata esse, sed absentia in aliis eukaryotis, inter quas Microsporidia atypica *Mitosporidium* et *Amphiamblys*, in quibus fragmentum ES39L rRNA non reducitur 44, 45, 46 (Fig. 5c). -e).
Haec data simul sumpta notionem confirmant E. cuniculi et fortasse alia microsporidia canonica facultatem evolvisse ad magnum numerum metabolitarum parvarum in structura ribosomatis efficaciter capiendam, ut detrimentum rRNA et proteinorum compensent. Hoc faciendo, facultatem singularem nucleotida extra ribosoma ligandi excoluerunt, ostendens structuras moleculares parasiticas compensare per abundantes metabolitas parvas captandas et eas ut imitationes structurales fragmentorum RNA et proteinorum degradatorum utendas.
Tertia pars non simulata mappae nostrae cryo-EM, inventa in subunitate magna ribosomali. Resolutio relative alta (2.6 Å) mappae nostrae suggerit hanc densitatem pertinere ad proteinos cum combinationibus singularibus residuorum magnarum catenarum lateralium, quod nobis permisit ut hanc densitatem identificaremus ut proteinum ribosomale antea ignotum quod identificavimus ut msL2 (proteinum L2 specificum Microsporidiae) nominatum est (methodi, figura 6). Investigatio nostra homologiae ostendit msL2 conservari in clado Microsporidiae generis Encephaliter et Orosporidium, sed abesse in aliis speciebus, inter quas alia Microsporidia. In structura ribosomali, msL2 occupat hiatum formatum a iactura rRNA ES31L extensa. In hoc vacuo, msL2 adiuvat ad stabilizandum plicaturam rRNA et potest compensare iacturam ES31L (Figura 6).
a Densitas electronica et exemplar proteini ribosomialis msL2, specifici Microsporidiae, in ribosomatibus E. cuniculi reperti. b Pleraque ribosomata eukaryotica, incluso ribosomate 80S Saccharomyces cerevisiae, amplificationem ES19L rRNA amissam habent in plurimis speciebus Microsporidianis. Structura antea constituta ribosomi microsporidiae V. necatrix suggerit iacturam ES19L in his parasitis compensari evolutione novi proteini ribosomialis msL1. In hoc studio, invenimus ribosoma E. cuniculi etiam proteinum mimicum RNA ribosomialis additum evolvisse, ut compensationem apparentem pro iactura ES19L. Attamen, msL2 (nunc annotata ut proteinum hypotheticum ECU06_1135) et msL1 origines structurales et evolutionarias differentes habent. Haec inventio generationis proteinorum ribosomalium msL1 et msL2 evolutione non conexorum suggerit, si ribosomata mutationes detrimentosas in rRNA suo accumulant, gradus diversitatis compositionis inauditos etiam in parva parte specierum arcte conexarum consequi posse. Haec inventio originem et evolutionem ribosomatis mitochondrialis, quod propter rRNA valde reductum et variabilitatem abnormalem in compositione proteinorum inter species notum est, elucidare adiuvare potest.
Deinde proteinum msL2 cum proteino msL1 antea descripto comparavimus, solo proteino ribosomiali microsporidiis specifico in ribosomate V. necatrix inventum. Experiri voluimus utrum msL1 et msL2 evolutione cognatae sint. Nostra analysis demonstravit msL1 et msL2 eandem cavitatem in structura ribosomiali occupare, sed structuras primarias et tertiarias diversas habere, quod originem earum evolutionariam independentem indicat (Fig. 6). Itaque, nostra inventio msL2 testimonium praebet greges specierum eukaryoticarum compactarum proteinas ribosomiales structuraliter distinctas independenter evolvere posse ad iacturam fragmentorum rRNA compensandam. Haec inventio notabilis est eo quod pleraque ribosomata eukaryotica cytoplasmatica proteinum invariabile continent, eandem familiam 81 proteinorum ribosomialium includentem. Apparentia msL1 et msL2 in variis cladis microsporidiorum in responsione ad iacturam segmentorum rRNA extensorum suggerit degradationem architecturae molecularis parasiti parasitos mutationes compensatorias quaerere facere, quae tandem ad acquisitionem earum in diversis populationibus parasitorum ducere possunt.
Denique, cum exemplar nostrum perfectum esset, compositionem ribosomi E. cuniculi cum ea quae ex sequentia genomi praedicta erat comparavimus. Plures proteinae ribosomales, inter quas eL14, eL38, eL41, et eS30, antea putabantur abesse ex genoma E. cuniculi propter absentiam apparentem homologorum suorum ex genoma E. cuniculi. Amissio multarum proteinarum ribosomalum etiam praedicitur in plerisque aliis parasitis intracellularibus valde reductis et endosymbiontibus. Exempli gratia, quamquam pleraeque bacteriae libere viventes eandem familiam 54 proteinarum ribosomalum continent, tantum 11 harum familiarum proteinarum homologos detectabiles habent in unoquoque genoma analyzato ​​bacteriorum hospiti restrictorum. Ad hanc notionem confirmandam, amissio proteinorum ribosomalum experimentaliter observata est in microsporidiis V. necatrix et P. locustae, quae carent proteinis eL38 et eL4131,32.
Attamen, structurae nostrae ostendunt solum eL38, eL41, et eS30 re vera in ribosomate E. cuniculi amissos esse. Proteinum eL14 conservatum est et structura nostra demonstravit cur hoc proteinum in investigatione homologiae inveniri non potuit (Fig. 7). In ribosomatibus E. cuniculi, maxima pars situs ligationis eL14 amissa est propter degradationem ES39L rRNA-amplificati. Absente ES39L, eL14 maximam partem structurae suae secundariae amisit, et tantum 18% sequentiae eL14 identica erat in E. cuniculi et S. cerevisiae. Haec mala conservatio sequentiae notabilis est quia etiam Saccharomyces cerevisiae et Homo sapiens — organismi qui 1.5 miliardis annorum inter se evoluti sunt — plus quam 51% eorundem residuorum in eL14 communicant. Haec anomala conservationis iactura explicat cur E. cuniculi eL14 nunc annotatur ut proteina M970_061160 putativa et non ut proteina ribosomalis eL1427.
Et ribosoma Microsporidiae extensionem ES39L rRNA amisit, quae locum ligationis proteini ribosomalis eL14 partim eliminavit. Absente ES39L, proteinum microsporarum eL14 iacturam structurae secundariae subit, in qua prior α-helice rRNA ligante in ansam minimae longitudinis degenerat. b Aequatio sequentiarum multiplicium ostendit proteinum eL14 valde conservatum esse in speciebus eukaryoticis (57% identitas sequentiae inter homologos fermenti et humani), sed male conservatum et divergens in microsporidiis (in quibus non plus quam 24% residuorum identica sunt cum homologo eL14). ex S. cerevisiae vel H. sapiens). Haec mala conservatio sequentiae et variabilitas structurae secundariae explicat cur homologus eL14 numquam in E. cuniculi inventus sit et cur hoc proteinum putetur in E. cuniculi amissum esse. Contra, eL14 in E. cuniculi antea annotatum est ut proteinum putativum M970_061160. Haec observatio suggerit diversitatem genomatis microsporidiorum nunc superaestimari: quaedam gena quae nunc in microsporidiis amissa putantur re vera conservantur, quamvis in formis valde differentiatis; contra, quaedam putantur gena microsporidiorum pro proteinis vermium specificis codificare (exempli gratia, proteina hypothetica M970_061160 re vera proteinis valde diversis in aliis eukaryotis inventis codificat.
Haec inventio suggerit denaturationem rRNA ad dramaticam iacturam conservationis sequentiae in proteinis ribosomalibus adiacentibus ducere posse, ita ut hae proteinae inquisitionibus homologiae non detegantur. Itaque, fortasse verum gradum degradationis molecularis in organismis genomis parvis superaestimamus, cum quaedam proteinae quae amissae esse putantur re vera perdurent, quamvis in formis valde mutatis.
Quomodo parasiti functionem machinarum suarum molecularium sub condicionibus extremae reductionis genomi retinere possunt? Studium nostrum hanc quaestionem respondet describendo structuram molecularem complexam (ribosoma) E. cuniculi, organismi cum uno ex minimis genomis eukaryoticis.
Iam fere duo decennia notum est moleculas proteinorum et RNA in parasitis microbialibus saepe ab homologis moleculis in speciebus libere viventibus differre, quia centra moderationis qualitatis desunt, ad 50% magnitudinis suae in microbiis libere viventibus reducuntur, et cetera. Multae mutationes debilitantes quae plicaturam et functionem impediunt. Exempli gratia, ribosomata organismorum parvorum genomicorum, inter quos multi parasiti intracellulares et endosymbiontes, exspectantur carere pluribus proteinis ribosomalibus et usque ad tertiam partem nucleotidorum rRNA comparatis cum speciebus libere viventibus [27, 29, 30, 49]. Tamen, modus quo hae moleculae in parasito funguntur magna ex parte mysterium manet, praecipue per genomicam comparativam studiatus.
Studium nostrum demonstrat structuram macromolecularum multa evolutionis aspecta revelare posse, quae difficulter ex studiis genomicis comparativis traditis parasitorum intracellularium aliorumque organismorum hospiti restrictorum extrahi possunt (Figura Suppletoria 7). Exempli gratia, exemplum proteini eL14 demonstrat nos posse gradum degradationis apparatus molecularis in speciebus parasiticis superaestimare. Parasiti encephalitici nunc creduntur centenas genorum microsporidia-specificorum habere. Attamen, nostrae conclusiones ostendunt nonnulla ex his genis specie specificis re vera esse tantum variantes valde differentes genorum quae in aliis eukaryotis communia sunt. Praeterea, exemplum proteini msL2 demonstrat quomodo novas proteinas ribosomales neglegamus et contentum machinarum molecularium parasiticarum subaestimamus. Exemplum molecularum parvarum demonstrat quomodo innovationes ingeniosissimas in structuris molecularibus parasiticis, quae eis novam activitatem biologicam dare possunt, neglegere possimus.
Haec omnia simul sumpta, intellegentiam nostram de differentiis inter structuras moleculares organismorum hospite restrictorum et earum pares in organismis liberis viventibus augent. Demonstramus machinas moleculares, quae diu putabantur reductae, degeneratae, et variis mutationibus debilitantibus obnoxiae, potius habere seriem proprietatum structuralium insolitarum, quae systematice negleguntur.
Ex altera parte, fragmenta rRNA non magna et fragmenta cohaerentia quae in ribosomatibus E. cuniculi invenimus suggerunt reductionem genomi etiam eas partes machinationis molecularis fundamentalis, quae in tribus vitae partibus conservantur, mutare posse – post fere 3.5 miliarda annorum – evolutionis specierum independentis.
Fragmenta rRNA, et sine tumore et coniuncta et sine tumore, in ribosomatibus *E. cuniculi*, magni momenti sunt, luce studiorum priorum molecularum RNA in bacteriis endosymbioticis. Exempli gratia, in aphide endosymbiotico *Buchnera aphidicola*, moleculae rRNA et tRNA structuras temperaturae sensibiles habere demonstratae sunt propter inclinationem compositionis A+T et magnam proportionem parium basium non-canonicorum [20,50]. Hae mutationes in RNA, necnon mutationes in moleculis proteinorum, nunc putantur responsabiles esse pro nimia dependentia endosymbiontium a sociis et incapacitate endosymbiontium ad transferendum calorem [21, 23]. Quamquam rRNA microsporidia parasitica mutationes structuraliter distinctas habet, natura harum mutationum suggerit stabilitatem thermalem reductam et maiorem dependentiam a proteinis chaperonis notas communes molecularum RNA in organismis cum genomis reductis esse posse.
Ex altera parte, nostrae structurae ostendunt microsporidiis parasitorum singularem facultatem resistendi fragmentis rRNA et proteinorum late conservatis evolvisse, facultatem utendi parvis metabolitis abundantibus et facile praesto ut imitationes structurales fragmentorum rRNA et proteinorum degeneratorum evolventes. Degradatio structurae molecularis. Haec opinio confirmatur eo facto quod moleculae parvae quae iacturam fragmentorum proteinorum in rRNA et ribosomatibus E. cuniculi compensant, ad residua microsporidiis specificis in proteinis uL15 et eL30 ligant. Hoc suggerit ligationem molecularum parvarum ad ribosomata fortasse esse productum selectionis positivae, in qua mutationes microsporidiis specificae in proteinis ribosomalibus selectae sunt propter facultatem augendi affinitatem ribosomatum pro moleculis parvis, quod ad organismos ribosomales efficaciores ducere potest. Inventio innovationem ingeniosam in structura moleculari parasitorum microbialium revelat et nobis meliorem intellectum dat quomodo structurae moleculares parasitorum functionem suam servant, evolutione reductiva non obstante.
In praesenti, identificatio harum molecularum parvarum incerta manet. Non liquet cur aspectus harum molecularum parvarum in structura ribosomiali inter species microsporidiorum differat. Praesertim, non liquet cur ligatio nucleotidorum in ribosomatibus E. cuniculi et P. locustae observetur, et non in ribosomatibus V. necatrix, quamvis residuum F170 in proteinis eL20 et K172 V. necatrix adsit. Haec deletio fortasse a residuo 43 uL6 (iuxta loculum ligationis nucleotidorum situm) causatur, quod tyrosinum in V. necatrix est, non threoninum in E. cuniculi et P. locustae. Magna catena lateralis aromatica Tyr43 ligationem nucleotidorum propter superpositionem stericam impedire potest. Aliter, deletio nucleotidorum apparens fortasse ob resolutionem humilem imaginum cryo-EM oritur, quae impedit modellationem fragmentorum ribosomialium V. necatrix.
Ex altera parte, opus nostrum suggerit processum corruptionis genomi fortasse vim inventivam esse. Praesertim, structura ribosomi *E. cuniculi* suggerit iacturam fragmentorum rRNA et proteinorum in ribosomate microsporidiorum pressionem evolutionariam creare quae mutationes in structura ribosomatis promovet. Hae variationes longe a loco activo ribosomatis occurrunt et videntur adiuvare ad conservandam (vel restituendam) optimam ribosomatis congregationem quae aliter a rRNA reducto perturbaretur. Hoc suggerit innovationem magnam ribosomatis microsporidiorum in necessitatem mitigandi deviationem genorum evolutam esse.
Fortasse hoc optime illustratur per ligationem nucleotidorum, quae numquam hactenus in aliis organismis observata est. Quod residua ligationis nucleotidorum in microsporidiis typicis adsunt, sed non in aliis eukaryotis, suggerit loca ligationis nucleotidorum non esse tantum reliquias exspectantes ut evanescant, aut locum finalem ubi rRNA ad formam nucleotidorum singularium restituatur. Immo, hic locus videtur quasi proprietas utilis quae per plures vices selectionis positivae evoluta esse potuit. Loca ligationis nucleotidorum fortasse sunt productum secundarium selectionis naturalis: semel ES39L degradatum est, microsporidia coguntur compensationem petere ad biogenesin ribosomatis optimalem restituendam absente ES39L. Cum hoc nucleotidum contactus moleculares nucleotidi A3186 in ES39L imitari possit, molecula nucleotidi fit pars fundamentalis ribosomatis, cuius ligatio ulterius melioratur mutatione sequentiae eL30.
Quod ad evolutionem molecularem parasitorum intracellularium attinet, studium nostrum demonstrat vires selectionis naturalis Darwinianae et deviationem geneticam corruptionis genomi non paralleliter operari, sed oscillari. Primo, deviatio genetica proprietates importantes biomolecularum eliminat, compensationem graviter necessariam faciens. Tantum cum parasiti hanc necessitatem per selectionem naturalem Darwinianam satisfaciunt, macromoleculae eorum occasionem habebunt suas proprietates maxime impressivas et innovativas evolvendi. Magni momenti est quod evolutio locorum ligationis nucleotidorum in ribosomate E. cuniculi suggerit hunc modum evolutionis molecularis "damn-to-lucrum" non solum mutationes detrimentosas amortizare, sed interdum functiones omnino novas macromoleculis parasiticis conferre.
Haec sententia congruit cum theoria aequilibrii mobilis Sewell Wright, quae affirmat systema strictum selectionis naturalis facultatem organismorum ad innovandum limitare51,52,53. Attamen, si fluctuatio genetica selectionem naturalem perturbat, hae fluctuationes mutationes producere possunt quae per se non sunt adaptivae (vel etiam detrimentales) sed ad ulteriores mutationes ducunt quae maiorem aptitudinem vel novam activitatem biologicam praebent. Nostra structura hanc sententiam confirmat illustrando eundem genus mutationis quod plicaturam et functionem biomoleculae minuit videri esse principale impulsum ad eius emendationem. Secundum exemplar evolutionis "win-win" (utile ut omnes), nostrum studium demonstrat corruptionem genomatis, quae tradito modo ut processus degenerativus visa est, etiam esse impulsorem magnum innovationis, interdum et fortasse etiam saepe permittens macromoleculis novas activitates parasiticas acquirere. Eas uti possunt.