Tak fordi du besøger Nature.com. Den browserversion, du bruger, har begrænset CSS-understøttelse. For at få den bedste oplevelse anbefaler vi, at du bruger en opdateret browser (eller deaktiverer kompatibilitetstilstand i Internet Explorer). I mellemtiden, for at sikre fortsat support, vil vi gengive webstedet uden typografier og JavaScript.
Udviklingen af ​​mikrobielle parasitter involverer en modvirkning mellem naturlig selektion, som får parasitter til at forbedre sig, og genetisk drift, som får parasitter til at miste gener og akkumulere skadelige mutationer. For at forstå, hvordan denne modvirkning sker på skalaen af ​​et enkelt makromolekyle, beskriver vi her kryo-EM-strukturen af ​​ribosomet hos Encephalitozoon cuniculi, en eukaryot organisme med et af de mindste genomer i naturen. Den ekstreme reduktion af rRNA i E. cuniculi-ribosomer ledsages af hidtil usete strukturelle ændringer, såsom udviklingen af ​​tidligere ukendte fusionerede rRNA-linkere og rRNA uden udbulinger. Derudover overlevede E. cuniculi-ribosomet tabet af rRNA-fragmenter og proteiner ved at udvikle evnen til at bruge små molekyler som strukturelle efterligninger af nedbrudte rRNA-fragmenter og proteiner. Samlet set viser vi, at molekylære strukturer, der længe blev anset for at være reducerede, degenererede og udsatte for invaliderende mutationer, har en række kompensationsmekanismer, der holder dem aktive på trods af ekstreme molekylære sammentrækninger.
Fordi de fleste grupper af mikrobielle parasitter har unikke molekylære værktøjer til at udnytte deres værter, er vi ofte nødt til at udvikle forskellige terapeutiske midler til forskellige grupper af parasitter1,2. Nye beviser tyder dog på, at nogle aspekter af parasittens evolution er konvergente og i vid udstrækning forudsigelige, hvilket indikerer et potentielt grundlag for brede terapeutiske interventioner i mikrobielle parasitter3,4,5,6,7,8,9.
Tidligere arbejde har identificeret en fælles evolutionær tendens i mikrobielle parasitter kaldet genomreduktion eller genomforfald10,11,12,13. Nuværende forskning viser, at når mikroorganismer opgiver deres fritlevende livsstil og bliver intracellulære parasitter (eller endosymbionter), gennemgår deres genomer langsomme, men fantastiske metamorfoser over millioner af år9,11. I en proces kendt som genomforfald akkumulerer mikrobielle parasitter skadelige mutationer, der omdanner mange tidligere vigtige gener til pseudogener, hvilket fører til gradvist gentab og mutationskollaps14,15. Dette kollaps kan ødelægge op til 95% af generne i de ældste intracellulære organismer sammenlignet med nært beslægtede fritlevende arter. Således er udviklingen af ​​intracellulære parasitter en tovtrækning mellem to modsatrettede kræfter: darwinistisk naturlig selektion, der fører til forbedring af parasitter, og genomets kollaps, der kaster parasitter i glemsel. Hvordan parasitten formåede at komme ud af denne tovtrækning og bevare aktiviteten af ​​sin molekylære struktur, forbliver uklart.
Selvom mekanismen bag genomforfald ikke er fuldt ud forstået, ser det ud til primært at forekomme på grund af hyppig genetisk drift. Fordi parasitter lever i små, aseksuelle og genetisk begrænsede populationer, kan de ikke effektivt eliminere skadelige mutationer, der nogle gange opstår under DNA-replikation. Dette fører til irreversibel ophobning af skadelige mutationer og reduktion af parasittens genom. Som følge heraf mister parasitten ikke kun gener, der ikke længere er nødvendige for dens overlevelse i det intracellulære miljø. Det er parasitpopulationernes manglende evne til effektivt at eliminere sporadiske skadelige mutationer, der får disse mutationer til at ophobe sig i hele genomet, inklusive deres vigtigste gener.
Meget af vores nuværende forståelse af genomreduktion er udelukkende baseret på sammenligninger af genomsekvenser, med mindre opmærksomhed på ændringer i faktiske molekyler, der udfører husholdningsfunktioner og tjener som potentielle lægemiddelmål. Sammenlignende undersøgelser har vist, at byrden af ​​skadelige intracellulære mikrobielle mutationer ser ud til at prædisponere proteiner og nukleinsyrer til misfoldning og aggregering, hvilket gør dem mere chaperoneafhængige og overfølsomme over for varme19,20,21,22,23. Derudover oplevede forskellige parasitter - uafhængig evolution undertiden adskilt med så meget som 2,5 milliarder år - et lignende tab af kvalitetskontrolcentre i deres proteinsyntese5,6 og DNA-reparationsmekanismer24. Der vides dog kun lidt om virkningen af ​​intracellulær livsstil på alle andre egenskaber ved cellulære makromolekyler, herunder molekylær tilpasning til en stigende byrde af skadelige mutationer.
I dette arbejde bestemte vi strukturen af ​​ribosomer i den intracellulære parasit Encephalitozoon cuniculi for bedre at forstå udviklingen af ​​proteiner og nukleinsyrer i intracellulære mikroorganismer. E. cuniculi er en svampelignende organisme, der tilhører en gruppe af parasitiske mikrosporidier, der har usædvanligt små eukaryote genomer og derfor bruges som modelorganismer til at studere genomforfald25,26,27,28,29,30. For nylig blev cryo-EM ribosomstrukturen bestemt for moderat reducerede genomer af Microsporidia, Paranosema locustae og Vairimorpha necatrix31,32 (~3,2 Mb genom). Disse strukturer antyder, at et vist tab af rRNA-amplifikation kompenseres af udviklingen af ​​nye kontakter mellem tilstødende ribosomale proteiner eller erhvervelse af nye msL131,32 ribosomale proteiner. Arten Encephalitozoon (genom ~2,5 millioner bp) udviser sammen med deres nærmeste slægtning Ordospora den ultimative grad af genomreduktion i eukaryoter – de har færre end 2000 proteinkodende gener, og det forventes, at deres ribosomer ikke blot mangler rRNA-ekspansionsfragmenter (rRNA-fragmenter, der adskiller eukaryote ribosomer fra bakterielle ribosomer), men også har fire ribosomale proteiner på grund af deres mangel på homologer i E. cuniculi-genomet26,27,28. Derfor konkluderede vi, at E. cuniculi-ribosomet kan afsløre tidligere ukendte strategier for molekylær tilpasning til genomforfald.
Vores cryo-EM-struktur repræsenterer det mindste eukaryote cytoplasmatiske ribosom, der nogensinde er blevet karakteriseret, og giver indsigt i, hvordan den ultimative grad af genomreduktion påvirker strukturen, sammensætningen og udviklingen af ​​det molekylære maskineri, der er integreret i cellen. Vi fandt, at E. cuniculi-ribosomet overtræder mange af de bredt konserverede principper for RNA-foldning og ribosomsamling, og opdagede et nyt, tidligere ukendt ribosomalt protein. Helt uventet viser vi, at microsporidia-ribosomer har udviklet evnen til at binde små molekyler, og vi antager, at trunkeringer i rRNA og proteiner udløser evolutionære innovationer, der i sidste ende kan give ribosomet nyttige egenskaber.
For at forbedre vores forståelse af udviklingen af ​​proteiner og nukleinsyrer i intracellulære organismer besluttede vi at isolere E. cuniculi-sporer fra kulturer af inficerede pattedyrceller for at oprense deres ribosomer og bestemme strukturen af ​​disse ribosomer. Det er vanskeligt at opnå et stort antal parasitære mikrosporidier, fordi mikrosporidier ikke kan dyrkes i et næringsmedium. I stedet vokser og reproducerer de sig kun inde i værtscellen. For at opnå E. cuniculi-biomasse til ribosomoprensning inficerede vi derfor pattedyrsnyrecellelinjen RK13 med E. cuniculi-sporer og dyrkede disse inficerede celler i flere uger for at give E. cuniculi mulighed for at vokse og formere sig. Ved at bruge et inficeret cellemonolag på omkring en halv kvadratmeter var vi i stand til at oprense omkring 300 mg Microsporidia-sporer og bruge dem til at isolere ribosomer. Vi sprængte derefter de oprensede sporer med glasperler og isolerede de rå ribosomer ved hjælp af trinvis polyethylenglycolfraktionering af lysaterne. Dette tillod os at opnå cirka 300 µg rå E. cuniculi-ribosomer til strukturel analyse.
Vi indsamlede derefter kryo-EM-billeder ved hjælp af de resulterende ribosomprøver og behandlede disse billeder ved hjælp af masker svarende til den store ribosomale underenhed, den lille underenhedshoved og den lille underenhed. Under denne proces indsamlede vi billeder af omkring 108.000 ribosomale partikler og beregnede kryo-EM-billeder med en opløsning på 2,7 Å (Supplerende figurer 1-3). Vi brugte derefter kryoEM-billeder til at modellere rRNA, ribosomalt protein og hibernationsfaktor Mdf1 associeret med E. cuniculi-ribosomer (fig. 1a, b).
a Struktur af E. cuniculi-ribosomet i kompleks med dvalefaktoren Mdf1 (pdb-id 7QEP). b Kort over dvalefaktoren Mdf1 associeret med E. cuniculi-ribosomet. c Kort over sekundær struktur, der sammenligner genvundet rRNA i Microsporidian-arter med kendte ribosomale strukturer. Panelerne viser placeringen af ​​de amplificerede rRNA-fragmenter (ES) og ribosomaktive steder, herunder afkodningsstedet (DC), sarcinicin-løkken (SRL) og peptidyltransferasecentret (PTC). d Elektrondensiteten svarende til peptidyltransferasecentret i E. cuniculi-ribosomet antyder, at dette katalytiske sted har den samme struktur i E. cuniculi-parasitten og dens værter, herunder H. sapiens. e, f Den tilsvarende elektrontæthed af dekodningscentret (e) og den skematiske struktur af dekodningscentret (f) indikerer, at E. cuniculi har resterne U1491 i stedet for A1491 (E. coli-nummerering) i mange andre eukaryoter. Denne ændring antyder, at E. cuniculi kan være følsom over for antibiotika, der er rettet mod dette aktive sted.
I modsætning til de tidligere etablerede strukturer af V. necatrix og P. locustae ribosomer (begge strukturer repræsenterer den samme microsporidia-familie Nosematidae og ligner hinanden meget), gennemgår E. cuniculi ribosomer31,32 adskillige processer med rRNA- og proteinfragmentering. Yderligere denaturering (Supplerende figurer 4-6). I rRNA omfattede de mest slående ændringer fuldstændigt tab af det amplificerede 25S rRNA-fragment ES12L og delvis degeneration af h39-, h41- og H18-helixerne (fig. 1c, supplerende figur 4). Blandt ribosomale proteiner omfattede de mest slående ændringer fuldstændigt tab af eS30-proteinet og forkortelse af eL8-, eL13-, eL18-, eL22-, eL29-, eL40-, uS3-, uS9-, uS14-, uS17- og eS7-proteinerne (Supplerende figurer 4, 5).
Den ekstreme reduktion af genomerne hos Encephalotozoon/Ordospora-arter afspejles således i deres ribosomstruktur: E. cuniculi-ribosomer oplever det mest dramatiske tab af proteinindhold i eukaryote cytoplasmatiske ribosomer, der er genstand for strukturel karakterisering, og de har ikke engang de rRNA- og proteinfragmenter, der er bredt bevaret, ikke kun i eukaryoter, men også i livets tre domæner. Strukturen af ​​E. cuniculi-ribosomet giver den første molekylære model for disse ændringer og afslører evolutionære begivenheder, der er blevet overset af både sammenlignende genomik og studier af intracellulær biomolekylær struktur (Supplerende Fig. 7). Nedenfor beskriver vi hver af disse begivenheder sammen med deres sandsynlige evolutionære oprindelse og deres potentielle indvirkning på ribosomfunktionen.
Vi fandt derefter, at E. cuniculi-ribosomer, udover store rRNA-trunkeringer, også har rRNA-variationer på et af deres aktive steder. Selvom peptidyltransferasecentret i E. cuniculi-ribosomet har samme struktur som andre eukaryote ribosomer (fig. 1d), er afkodningscentret forskelligt på grund af sekvensvariation ved nukleotid 1491 (E. coli-nummerering, fig. 1e, f). Denne observation er vigtig, fordi afkodningsstedet for eukaryote ribosomer typisk indeholder resterne G1408 og A1491 sammenlignet med bakterietyperesterne A1408 og G1491. Denne variation ligger til grund for den forskellige følsomhed af bakterielle og eukaryote ribosomer over for aminoglykosidfamilien af ​​ribosomale antibiotika og andre små molekyler, der er målrettet mod afkodningsstedet. På afkodningsstedet for E. cuniculi-ribosomet blev rest A1491 erstattet med U1491, hvilket potentielt skabte en unik bindingsgrænseflade for små molekyler, der er målrettet mod dette aktive sted. Den samme A14901-variant findes også i andre mikrosporidier såsom P. locustae og V. necatrix, hvilket tyder på, at den er udbredt blandt mikrosporidiearter (fig. 1f).
Fordi vores E. cuniculi ribosomprøver blev isoleret fra metabolisk inaktive sporer, testede vi kryo-EM-kortet af E. cuniculi for tidligere beskrevet ribosombinding under stress- eller sultforhold. Dvalefaktorer 31, 32, 36, 37, 38. Vi matchede den tidligere etablerede struktur af det dvalelignende ribosom med kryo-EM-kortet af E. cuniculi ribosomet. Til docking blev S. cerevisiae ribosomer anvendt i kompleks med dvalefaktor Stm138, johannesbrødkernemel-ribosomer i kompleks med Lso232-faktor og V. necatrix ribosomer i kompleks med Mdf1- og Mdf231-faktorer. Samtidig fandt vi kryo-EM-densiteten svarende til hvilefaktoren Mdf1. I lighed med Mdf1's binding til V. necatrix-ribosomet, binder Mdf1 sig også til E. cuniculi-ribosomet, hvor det blokerer E-stedet på ribosomet, hvilket muligvis hjælper med at gøre ribosomer tilgængelige, når parasitsporer bliver metabolisk inaktive ved inaktivering af kroppen (figur 2).
Mdf1 blokerer E-stedet i ribosomet, hvilket ser ud til at hjælpe med at inaktivere ribosomet, når parasitsporer bliver metabolisk inaktive. I strukturen af ​​E. cuniculi-ribosomet fandt vi, at Mdf1 danner en hidtil ukendt kontakt med L1-ribosomstammen, den del af ribosomet, der letter frigivelsen af ​​deacyleret tRNA fra ribosomet under proteinsyntese. Disse kontakter antyder, at Mdf1 dissocierer fra ribosomet ved hjælp af samme mekanisme som deacetyleret tRNA, hvilket giver en mulig forklaring på, hvordan ribosomet fjerner Mdf1 for at genaktivere proteinsyntese.
Vores struktur afslørede imidlertid en ukendt kontakt mellem Mdf1 og L1-ribosombenet (den del af ribosomet, der hjælper med at frigive deacyleret tRNA fra ribosomet under proteinsyntese). Især bruger Mdf1 de samme kontakter som albuesegmentet af det deacylerede tRNA-molekyle (fig. 2). Denne tidligere ukendte molekylære modellering viste, at Mdf1 dissocierer fra ribosomet ved hjælp af den samme mekanisme som deacetyleret tRNA, hvilket forklarer, hvordan ribosomet fjerner denne dvalefaktor for at genaktivere proteinsyntese.
Da vi konstruerede rRNA-modellen, fandt vi, at E. cuniculi-ribosomet har unormalt foldede rRNA-fragmenter, som vi kaldte fusioneret rRNA (fig. 3). I ribosomer, der spænder over livets tre domæner, folder rRNA sig til strukturer, hvor de fleste rRNA-baser enten danner basepar og folder sig med hinanden eller interagerer med ribosomale proteiner38,39,40. I E. cuniculi-ribosomer synes rRNA'er imidlertid at overtræde dette foldningsprincip ved at omdanne nogle af deres helixer til udfoldede rRNA-regioner.
Struktur af H18 25S rRNA-helixen i S. cerevisiae, V. necatrix og E. cuniculi. Typisk, i ribosomer, der spænder over de tre livsdomæner, snor denne linker sig til en RNA-helix, der indeholder 24 til 34 rester. I Microsporidia reduceres denne rRNA-linker derimod gradvist til to enkeltstrengede uridinrige linkere, der kun indeholder 12 rester. De fleste af disse rester udsættes for opløsningsmidler. Figuren viser, at parasitiske mikrosporidier synes at overtræde de generelle principper for rRNA-foldning, hvor rRNA-baser normalt er koblet til andre baser eller involveret i rRNA-protein-interaktioner. I mikrosporidier antager nogle rRNA-fragmenter en ugunstig foldning, hvor den tidligere rRNA-helix bliver et enkeltstrenget fragment, der er forlænget næsten i en lige linje. Tilstedeværelsen af ​​disse usædvanlige regioner tillader mikrosporidia-rRNA at binde fjerne rRNA-fragmenter ved hjælp af et minimalt antal RNA-baser.
Det mest slående eksempel på denne evolutionære overgang kan observeres i H18 25S rRNA-helixen (fig. 3). Hos arter fra E. coli til mennesker indeholder baserne i denne rRNA-helix 24-32 nukleotider, hvilket danner en let uregelmæssig helix. I tidligere identificerede ribosomale strukturer fra V. necatrix og P. locustae,31,32 er baserne i H18-helixen delvist udrullede, men nukleotidbaseparringen er bevaret. I E. cuniculi bliver dette rRNA-fragment imidlertid de korteste linkere 228UUUUGU232 og 301UUUUUUUUUU307. I modsætning til typiske rRNA-fragmenter ruller disse uridinrige linkere sig ikke sammen eller har omfattende kontakt med ribosomale proteiner. I stedet antager de opløsningsmiddelåbne og fuldt udfoldede strukturer, hvor rRNA-strengene er forlænget næsten lige. Denne strakte konformation forklarer, hvordan E. cuniculi kun bruger 12 RNA-baser til at udfylde 33 Å-gabet mellem H16- og H18-rRNA-helixerne, mens andre arter kræver mindst dobbelt så mange rRNA-baser for at udfylde gabet.
Vi kan således demonstrere, at parasitiske mikrosporidier gennem energetisk ugunstig foldning har udviklet en strategi til at kontrahere selv de rRNA-segmenter, der forbliver bredt konserverede på tværs af arter i livets tre domæner. Tilsyneladende kan E. cuniculi, ved at akkumulere mutationer, der transformerer rRNA-helixer til korte poly-U-linkere, danne usædvanlige rRNA-fragmenter, der indeholder så få nukleotider som muligt til ligering af distale rRNA-fragmenter. Dette hjælper med at forklare, hvordan mikrosporidier opnåede en dramatisk reduktion i deres grundlæggende molekylære struktur uden at miste deres strukturelle og funktionelle integritet.
Et andet usædvanligt træk ved E. cuniculi rRNA er udseendet af rRNA uden fortykkelser (fig. 4). Udbulinger er nukleotider uden basepar, der vrider sig ud af RNA-helixen i stedet for at gemme sig i den. De fleste rRNA-fremspring fungerer som molekylære klæbemidler, der hjælper med at binde tilstødende ribosomale proteiner eller andre rRNA-fragmenter. Nogle af udbulingerne fungerer som hængsler, der gør det muligt for rRNA-helixen at bøje og folde optimalt for produktiv proteinsyntese 41.
a En rRNA-fremspring (S. cerevisiae-nummerering) er fraværende i E. cuniculi-ribosomstrukturen, men er til stede i de fleste andre eukaryoter b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens og E. cuniculi interne ribosomer. Parasitter mangler mange af de gamle, stærkt konserverede rRNA-buler. Disse fortykkelser stabiliserer ribosomstrukturen; derfor indikerer deres fravær i mikrosporidier en reduceret stabilitet af rRNA-foldning i mikrosporidieparasitter. Sammenligning med P-stængler (L7/L12-stængler i bakterier) viser, at tabet af rRNA-buler undertiden falder sammen med fremkomsten af ​​nye buler ved siden af ​​de mistede buler. H42-helixen i 23S/28S rRNA har en gammel bule (U1206 i Saccharomyces cerevisiae), der anslås at være mindst 3,5 milliarder år gammel på grund af dens beskyttelse i tre livsdomæner. I mikrosporidier er denne bule elimineret. Imidlertid opstod en ny bule ved siden af ​​den tabte bule (A1306 i E. cuniculi).
Påfaldende nok fandt vi, at E. cuniculi ribosomer mangler de fleste af de rRNA-udbulinger, der findes i andre arter, herunder mere end 30 udbulinger, der er bevaret i andre eukaryoter (fig. 4a). Dette tab eliminerer mange kontakter mellem ribosomale underenheder og tilstødende rRNA-helixer, hvilket nogle gange skaber store hulrum i ribosomet, hvilket gør E. cuniculi-ribosomet mere porøst sammenlignet med mere traditionelle ribosomer (fig. 4b). Bemærkelsesværdigt fandt vi, at de fleste af disse udbulinger også gik tabt i de tidligere identificerede V. necatrix- og P. locustae-ribosomstrukturer, som blev overset af tidligere strukturelle analyser31,32.
Nogle gange ledsages tabet af rRNA-udbulninger af udviklingen af ​​nye udbulninger ved siden af ​​den tabte udbulning. For eksempel indeholder den ribosomale P-stamme en U1208-udbulning (i Saccharomyces cerevisiae), der overlevede fra E. coli til mennesker og derfor anslås at være 3,5 milliarder år gammel. Under proteinsyntese hjælper denne udbulning P-stammen med at bevæge sig mellem åbne og lukkede konformationer, så ribosomet kan rekruttere translationsfaktorer og levere dem til det aktive sted. I E. cuniculi-ribosomer er denne fortykkelse fraværende; dog kan en ny fortykkelse (G883), der kun er placeret i tre basepar, bidrage til genoprettelsen af ​​P-stammens optimale fleksibilitet (fig. 4c).
Vores data om rRNA uden udbulinger tyder på, at rRNA-minimering ikke er begrænset til tabet af rRNA-elementer på ribosomets overflade, men også kan involvere ribosomkernen, hvilket skaber en parasitspecifik molekylær defekt, der ikke er blevet beskrevet i fritlevende celler. Ingen levende arter observeres.
Efter modellering af kanoniske ribosomale proteiner og rRNA fandt vi, at konventionelle ribosomale komponenter ikke kan forklare de tre dele af cryo-EM-billedet. To af disse fragmenter er små molekyler i størrelse (fig. 5, supplerende fig. 8). Det første segment er klemt inde mellem ribosomproteinerne uL15 og eL18 i en position, der normalt optages af C-terminalen af ​​eL18, som er forkortet i E. cuniculi. Selvom vi ikke kan bestemme identiteten af ​​dette molekyle, forklares størrelsen og formen af ​​denne densitetsø godt af tilstedeværelsen af ​​spermidinmolekyler. Dens binding til ribosomet stabiliseres af mikrosporidia-specifikke mutationer i uL15-proteinerne (Asp51 og Arg56), som synes at øge ribosomets affinitet for dette lille molekyle, da de tillader uL15 at indpakke det lille molekyle i en ribosomal struktur. Supplerende figur 2). 8, yderligere data 1, 2).
Kryo-EM-billeddannelse viser tilstedeværelsen af ​​nukleotider uden for ribosen bundet til E. cuniculi-ribosomet. I E. cuniculi-ribosomet indtager dette nukleotid samme plads som 25S rRNA A3186-nukleotidet (Saccharomyces cerevisiae-nummerering) i de fleste andre eukaryote ribosomer. b I den ribosomale struktur af E. cuniculi er dette nukleotid placeret mellem ribosomproteinerne uL9 og eL20, hvorved kontakten mellem de to proteiner stabiliseres. cd eL20-sekvensbevaringsanalyse blandt microsporidia-arter. Det fylogenetiske træ for Microsporidia-arter (c) og multipel sekvensjustering af eL20-proteinet (d) viser, at nukleotidbindende rester F170 og K172 er bevaret i de fleste typiske Microsporidier, med undtagelse af S. lophii, med undtagelse af tidligt forgrenende Microsporidier, som bevarede ES39L rRNA-udvidelsen. e Denne figur viser, at nukleotidbindende rester F170 og K172 kun er til stede i eL20 af det stærkt reducerede microsporidia-genom, men ikke i andre eukaryoter. Samlet set tyder disse data på, at Microsporidian-ribosomer har udviklet et nukleotidbindingssted, der ser ud til at binde AMP-molekyler og bruge dem til at stabilisere protein-protein-interaktioner i ribosomstrukturen. Den høje konservering af dette bindingssted i Microsporidia og dets fravær i andre eukaryoter antyder, at dette sted kan give en selektiv overlevelsesfordel for Microsporidia. Nukleotidbindingslommen i microsporidia-ribosomet ser således ikke ud til at være et degenereret træk eller en slutform for rRNA-nedbrydning som tidligere beskrevet, men snarere en nyttig evolutionær innovation, der tillader microsporidia-ribosomet at binde små molekyler direkte ved at bruge dem som molekylære byggesten til ribosomer. Denne opdagelse gør microsporidia-ribosomet til det eneste ribosom, der vides at bruge et enkelt nukleotid som sin strukturelle byggesten. f Hypotetisk evolutionær vej afledt af nukleotidbinding.
Den anden lavmolekylære densitet er placeret ved grænsefladen mellem ribosomale proteiner uL9 og eL30 (fig. 5a). Denne grænseflade blev tidligere beskrevet i strukturen af ​​Saccharomyces cerevisiae-ribosomet som et bindingssted for 25S-nukleotidet i rRNA A3186 (del af ES39L rRNA-udvidelsen)38. Det blev vist, at i degenererede P. locustae ES39L-ribosomer binder denne grænseflade et ukendt enkelt nukleotid 31, og det antages, at dette nukleotid er en reduceret endelig form af rRNA, hvor længden af ​​rRNA er ~130-230 baser. ES39L er reduceret til et enkelt nukleotid 32,43. Vores cryo-EM-billeder understøtter ideen om, at densitet kan forklares med nukleotider. Den højere opløsning af vores struktur viste imidlertid, at dette nukleotid er et ekstraribosomalt molekyle, muligvis AMP (fig. 5a, b).
Vi spurgte derefter, om nukleotidbindingsstedet forekom i E. cuniculi-ribosomet, eller om det eksisterede tidligere. Da nukleotidbinding primært medieres af Phe170- og Lys172-resterne i eL30-ribosomproteinet, vurderede vi konserveringen af ​​disse rester i 4396 repræsentative eukaryoter. Som i tilfældet med uL15 ovenfor fandt vi, at Phe170- og Lys172-resterne kun er stærkt konserverede i typiske Microsporidier, men fraværende i andre eukaryoter, herunder atypiske Microsporidier, Mitosporidium og Amphiamblys, hvor ES39L rRNA-fragmentet ikke er reduceret 44, 45, 46 (fig. 5c). -e).
Samlet set understøtter disse data ideen om, at E. cuniculi og muligvis andre kanoniske mikrosporidier har udviklet evnen til effektivt at indfange et stort antal små metabolitter i ribosomstrukturen for at kompensere for faldet i rRNA- og proteinniveauer. Dermed har de udviklet en unik evne til at binde nukleotider uden for ribosomet, hvilket viser, at parasitære molekylære strukturer kompenserer ved at indfange rigelige små metabolitter og bruge dem som strukturelle efterligninger af nedbrudt RNA og proteinfragmenter.
Den tredje usimulerede del af vores kryo-EM-kort findes i den store ribosomale underenhed. Den relativt høje opløsning (2,6 Å) af vores kort antyder, at denne tæthed tilhører proteiner med unikke kombinationer af store sidekæderester, hvilket gjorde det muligt for os at identificere denne tæthed som et tidligere ukendt ribosomalt protein, som vi identificerede som msL2 (Microsporidia-specifikt protein L2) (metoder, figur 6). Vores homologisøgning viste, at msL2 er bevaret i Microsporidia-kladen af ​​slægten Encephaliter og Orosporidium, men fraværende i andre arter, herunder andre Microsporidier. I den ribosomale struktur optager msL2 et hul dannet af tabet af det udvidede ES31L rRNA. I dette hulrum hjælper msL2 med at stabilisere rRNA-foldning og kan kompensere for tabet af ES31L (Figur 6).
a Elektrontæthed og model af det Microsporidia-specifikke ribosomale protein msL2 fundet i E. cuniculi ribosomer. b De fleste eukaryote ribosomer, inklusive 80S ribosomet fra Saccharomyces cerevisiae, har ES19L rRNA-amplifikation tabt i de fleste Microsporidian-arter. Den tidligere etablerede struktur af V. necatrix microsporidia ribosomet antyder, at tabet af ES19L i disse parasitter kompenseres af udviklingen af ​​det nye msL1 ribosomale protein. I denne undersøgelse fandt vi, at E. cuniculi ribosomet også udviklede et yderligere ribosomalt RNA-efterligningsprotein som en tilsyneladende kompensation for tabet af ES19L. Imidlertid har msL2 (i øjeblikket annoteret som det hypotetiske ECU06_1135-protein) og msL1 forskellig strukturel og evolutionær oprindelse. c Denne opdagelse af dannelsen af ​​evolutionært ubeslægtede msL1- og msL2-ribosomale proteiner antyder, at hvis ribosomer akkumulerer skadelige mutationer i deres rRNA, kan de opnå hidtil usete niveauer af sammensætningsmæssig diversitet i selv en lille delmængde af nært beslægtede arter. Denne opdagelse kan bidrage til at afklare oprindelsen og udviklingen af ​​det mitokondrielle ribosom, som er kendt for sit stærkt reducerede rRNA og unormale variation i proteinsammensætning på tværs af arter.
Vi sammenlignede derefter msL2-proteinet med det tidligere beskrevne msL1-protein, det eneste kendte microsporidia-specifikke ribosomale protein, der findes i V. necatrix-ribosomet. Vi ønskede at teste, om msL1 og msL2 er evolutionært beslægtede. Vores analyse viste, at msL1 og msL2 optager det samme hulrum i ribosomstrukturen, men har forskellige primære og tertiære strukturer, hvilket indikerer deres uafhængige evolutionære oprindelse (fig. 6). Vores opdagelse af msL2 giver således bevis for, at grupper af kompakte eukaryote arter uafhængigt kan udvikle strukturelt forskellige ribosomale proteiner for at kompensere for tabet af rRNA-fragmenter. Dette fund er bemærkelsesværdigt, idet de fleste cytoplasmatiske eukaryote ribosomer indeholder et invariant protein, herunder den samme familie af 81 ribosomale proteiner. Forekomsten af ​​msL1 og msL2 i forskellige klader af microsporidia som reaktion på tabet af udvidede rRNA-segmenter antyder, at nedbrydning af parasittens molekylære arkitektur får parasitter til at søge kompenserende mutationer, hvilket i sidste ende kan føre til deres erhvervelse i forskellige parasitpopulationer.
Da vores model var færdig, sammenlignede vi sammensætningen af ​​E. cuniculi-ribosomet med den, der blev forudsagt ud fra genomsekvensen. Adskillige ribosomale proteiner, herunder eL14, eL38, eL41 og eS30, blev tidligere anset for at mangle i E. cuniculi-genomet på grund af den tilsyneladende mangel på deres homologer fra E. cuniculi-genomet. Tab af mange ribosomale proteiner forudsiges også i de fleste andre stærkt reducerede intracellulære parasitter og endosymbionter. For eksempel, selvom de fleste fritlevende bakterier indeholder den samme familie af 54 ribosomale proteiner, har kun 11 af disse proteinfamilier detekterbare homologer i hvert analyseret genom af værtsbegrænsede bakterier. Til støtte for denne antagelse er et tab af ribosomale proteiner blevet observeret eksperimentelt i V. necatrix og P. locustae microsporidia, som mangler eL38- og eL4131,32-proteinerne.
Vores strukturer viser imidlertid, at kun eL38, eL41 og eS30 faktisk går tabt i E. cuniculi-ribosomet. eL14-proteinet var bevaret, og vores struktur viste, hvorfor dette protein ikke kunne findes i homologisøgningen (fig. 7). I E. cuniculi-ribosomer går det meste af eL14-bindingsstedet tabt på grund af nedbrydning af det rRNA-amplificerede ES39L. I fravær af ES39L mistede eL14 det meste af sin sekundære struktur, og kun 18% af eL14-sekvensen var identisk i E. cuniculi og S. cerevisiae. Denne dårlige sekvensbevarelse er bemærkelsesværdig, fordi selv Saccharomyces cerevisiae og Homo sapiens - organismer, der udviklede sig med 1,5 milliarder års mellemrum - deler mere end 51% af de samme rester i eL14. Dette anomale tab af konservering forklarer, hvorfor E. cuniculi eL14 i øjeblikket er annoteret som det formodede M970_061160-protein og ikke som det ribosomale protein eL1427.
og Microsporidia-ribosomet mistede ES39L rRNA-forlængelsen, hvilket delvist eliminerede eL14 ribosomproteinbindingsstedet. I fravær af ES39L undergår eL14-mikrosporeproteinet et tab af sekundær struktur, hvor den tidligere rRNA-bindende α-helix degenererer til en minimal længdeløkke. b Multipel sekvensjustering viser, at eL14-proteinet er stærkt konserveret i eukaryote arter (57 % sekvensidentitet mellem gær- og humane homologer), men dårligt konserveret og divergerende i mikrosporidier (hvor ikke mere end 24 % af resterne er identiske med eL14-homologen). fra S. cerevisiae eller H. sapiens). Denne dårlige sekvensbevarelse og sekundære strukturvariabilitet forklarer, hvorfor eL14-homologen aldrig er blevet fundet i E. cuniculi, og hvorfor dette protein menes at være gået tabt i E. cuniculi. I modsætning hertil blev E. cuniculi eL14 tidligere annoteret som et formodet M970_061160-protein. Denne observation tyder på, at mikrosporidiers genomdiversitet i øjeblikket overvurderes: nogle gener, der i øjeblikket menes at være tabt i mikrosporidier, er faktisk bevaret, omend i stærkt differentierede former; i stedet menes nogle at kode for mikrosporidiegener for ormespecifikke proteiner (f.eks. det hypotetiske protein M970_061160), der faktisk koder for de meget forskelligartede proteiner, der findes i andre eukaryoter.
Dette fund tyder på, at rRNA-denaturering kan føre til et dramatisk tab af sekvensbevarelse i tilstødende ribosomale proteiner, hvilket gør disse proteiner uopdagelige til homologisøgninger. Vi kan således overvurdere den faktiske grad af molekylær nedbrydning i små genomorganismer, da nogle proteiner, der menes at være tabt, faktisk fortsætter, omend i stærkt ændrede former.
Hvordan kan parasitter bevare funktionen af ​​deres molekylære maskiner under forhold med ekstrem genomreduktion? Vores undersøgelse besvarer dette spørgsmål ved at beskrive den komplekse molekylære struktur (ribosom) af E. cuniculi, en organisme med et af de mindste eukaryote genomer.
Det har været kendt i næsten to årtier, at protein- og RNA-molekyler i mikrobielle parasitter ofte afviger fra deres homologe molekyler i fritlevende arter, fordi de mangler kvalitetskontrolcentre, er reduceret til 50 % af deres størrelse i fritlevende mikrober osv. ... mange invaliderende mutationer, der forringer foldning og funktion. For eksempel forventes ribosomerne i små genomorganismer, herunder mange intracellulære parasitter og endosymbionter, at mangle adskillige ribosomale proteiner og op til en tredjedel af rRNA-nukleotiderne sammenlignet med fritlevende arter 27, 29, 30, 49. Den måde, disse molekyler fungerer på i parasitter, forbliver dog stort set et mysterium, der hovedsageligt studeres gennem sammenlignende genomik.
Vores undersøgelse viser, at makromolekylers struktur kan afsløre mange aspekter af evolutionen, som er vanskelige at udtrække fra traditionelle sammenlignende genomiske undersøgelser af intracellulære parasitter og andre værtsbegrænsede organismer (Supplerende Fig. 7). For eksempel viser eksemplet med eL14-proteinet, at vi kan overvurdere den faktiske grad af nedbrydning af det molekylære apparat hos parasitære arter. Encephalitiske parasitter menes nu at have hundredvis af mikrosporidia-specifikke gener. Vores resultater viser dog, at nogle af disse tilsyneladende specifikke gener faktisk blot er meget forskellige varianter af gener, der er almindelige i andre eukaryoter. Desuden viser eksemplet med msL2-proteinet, hvordan vi overser nye ribosomale proteiner og undervurderer indholdet af parasitære molekylære maskiner. Eksemplet med små molekyler viser, hvordan vi kan overse de mest geniale innovationer i parasitære molekylære strukturer, der kan give dem ny biologisk aktivitet.
Samlet set forbedrer disse resultater vores forståelse af forskellene mellem de molekylære strukturer hos værtsbegrænsede organismer og deres modstykker i fritlevende organismer. Vi viser, at molekylære maskiner, der længe har været anset for at være reducerede, degenererede og udsatte for forskellige invaliderende mutationer, i stedet har et sæt systematisk oversete usædvanlige strukturelle træk.
På den anden side antyder de ikke-volumenfylte rRNA-fragmenter og fusionerede fragmenter, som vi fandt i ribosomerne hos E. cuniculi, at genomreduktion kan ændre selv de dele af det grundlæggende molekylære maskineri, der er bevaret i livets tre domæner – efter næsten 3,5 milliarder år af uafhængig evolution af arter.
De udbulingsfri og fusionerede rRNA-fragmenter i E. cuniculi-ribosomer er af særlig interesse i lyset af tidligere studier af RNA-molekyler i endosymbiotiske bakterier. For eksempel har det i bladlusens endosymbiont Buchnera aphidicola vist sig, at rRNA- og tRNA-molekyler har temperaturfølsomme strukturer på grund af A+T-sammensætningsbias og en høj andel af ikke-kanoniske basepar20,50. Disse ændringer i RNA, såvel som ændringer i proteinmolekyler, menes nu at være ansvarlige for endosymbionters overafhængighed af partnere og endosymbionters manglende evne til at overføre varme21, 23. Selvom parasitisk mikrosporidia-rRNA har strukturelt forskellige ændringer, antyder arten af ​​disse ændringer, at reduceret termisk stabilitet og højere afhængighed af chaperonproteiner kan være fælles træk ved RNA-molekyler i organismer med reducerede genomer.
På den anden side viser vores strukturer, at parasit-mikrosporidier har udviklet en unik evne til at modstå bredt konserverede rRNA- og proteinfragmenter og har udviklet evnen til at bruge rigelige og let tilgængelige små metabolitter som strukturelle efterligninger af degenererede rRNA- og proteinfragmenter. Nedbrydning af molekylær struktur. Denne opfattelse understøttes af det faktum, at små molekyler, der kompenserer for tabet af proteinfragmenter i rRNA og ribosomer fra E. cuniculi, binder til mikrosporidia-specifikke rester i uL15- og eL30-proteinerne. Dette antyder, at binding af små molekyler til ribosomer kan være et produkt af positiv selektion, hvor mikrosporidia-specifikke mutationer i ribosomale proteiner er blevet udvalgt for deres evne til at øge ribosomers affinitet for små molekyler, hvilket kan føre til mere effektive ribosomale organismer. Opdagelsen afslører en smart innovation i den molekylære struktur af mikrobielle parasitter og giver os en bedre forståelse af, hvordan parasit-molekylære strukturer opretholder deres funktion på trods af reduktiv evolution.
På nuværende tidspunkt er identifikationen af ​​disse små molekyler stadig uklar. Det er ikke klart, hvorfor udseendet af disse små molekyler i ribosomstrukturen varierer mellem microsporidia-arter. Især er det ikke klart, hvorfor nukleotidbinding observeres i ribosomerne hos E. cuniculi og P. locustae, og ikke i ribosomerne hos V. necatrix, på trods af tilstedeværelsen af ​​F170-resten i eL20- og K172-proteinerne hos V. necatrix. Denne deletion kan være forårsaget af rest 43 uL6 (placeret ved siden af ​​nukleotidbindingslommen), som er tyrosin i V. necatrix og ikke threonin i E. cuniculi og P. locustae. Den store aromatiske sidekæde af Tyr43 kan interferere med nukleotidbinding på grund af sterisk overlapning. Alternativt kan den tilsyneladende nukleotiddeletion skyldes den lave opløsning af kryo-EM-billeddannelse, hvilket hindrer modelleringen af ​​V. necatrix ribosomale fragmenter.
På den anden side tyder vores arbejde på, at processen med genomforfald kan være en opfindsom kraft. Især strukturen af ​​E. cuniculi-ribosomet antyder, at tabet af rRNA og proteinfragmenter i microsporidia-ribosomet skaber et evolutionært pres, der fremmer ændringer i ribosomstrukturen. Disse varianter forekommer langt fra ribosomets aktive sted og ser ud til at hjælpe med at opretholde (eller genoprette) optimal ribosomsamling, som ellers ville blive forstyrret af reduceret rRNA. Dette antyder, at en væsentlig innovation i microsporidia-ribosomet ser ud til at have udviklet sig til et behov for at buffere gendrift.
Måske illustreres dette bedst af nukleotidbinding, som aldrig er blevet observeret i andre organismer indtil videre. Det faktum, at nukleotidbindende rester er til stede i typiske mikrosporidier, men ikke i andre eukaryoter, antyder, at nukleotidbindingssteder ikke blot er rester, der venter på at forsvinde, eller det endelige sted, hvor rRNA kan genoprettes til form af individuelle nukleotider. I stedet virker dette sted som en nyttig funktion, der kunne have udviklet sig over flere runder med positiv selektion. Nukleotidbindingssteder kan være et biprodukt af naturlig selektion: Når ES39L er nedbrudt, er mikrosporidier tvunget til at søge kompensation for at genoprette optimal ribosombiogenese i fravær af ES39L. Da dette nukleotid kan efterligne de molekylære kontakter i A3186-nukleotidet i ES39L, bliver nukleotidmolekylet en byggesten i ribosomet, hvis binding yderligere forbedres ved mutation af eL30-sekvensen.
Med hensyn til den molekylære udvikling af intracellulære parasitter viser vores undersøgelse, at kræfterne i darwinistisk naturlig selektion og genetisk drift i genomforfald ikke opererer parallelt, men oscillerer. For det første eliminerer genetisk drift vigtige egenskaber ved biomolekyler, hvilket gør kompensation hårdt nødvendig. Først når parasitter opfylder dette behov gennem darwinistisk naturlig selektion, vil deres makromolekyler have en chance for at udvikle deres mest imponerende og innovative egenskaber. Det er vigtigt at bemærke, at udviklingen af ​​nukleotidbindingssteder i E. cuniculi-ribosomet antyder, at dette "tab-for-gevinst"-mønster af molekylær evolution ikke kun amortiserer skadelige mutationer, men nogle gange giver helt nye funktioner til parasitiske makromolekyler.
Denne idé er i overensstemmelse med Sewell Wrights teori om bevægelig ligevægt, som siger, at et strengt system af naturlig selektion begrænser organismers evne til at innovere51,52,53. Men hvis genetisk drift forstyrrer den naturlige selektion, kan disse drifter producere ændringer, der ikke i sig selv er adaptive (eller endda skadelige), men som fører til yderligere ændringer, der giver højere fitness eller ny biologisk aktivitet. Vores rammeværk understøtter denne idé ved at illustrere, at den samme type mutation, der reducerer et biomolekyles foldning og funktion, synes at være den vigtigste udløser for dets forbedring. I overensstemmelse med den win-win-evolutionære model viser vores undersøgelse, at genomforfald, traditionelt set som en degenerativ proces, også er en væsentlig drivkraft for innovation, som nogle gange og måske endda ofte tillader makromolekyler at erhverve nye parasitiske aktiviteter. kan bruge dem.