Ďakujeme za návštevu stránky Nature.com. Verzia prehliadača, ktorú používate, má obmedzenú podporu CSS. Pre dosiahnutie čo najlepšieho zážitku odporúčame používať aktualizovaný prehliadač (alebo vypnúť režim kompatibility v prehliadači Internet Explorer). Medzitým budeme stránku vykresľovať bez štýlov a JavaScriptu, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu.
Evolúcia mikrobiálnych parazitov zahŕňa protipôsobenie medzi prirodzeným výberom, ktorý spôsobuje zlepšovanie parazitov, a genetickým driftom, ktorý spôsobuje, že parazity strácajú gény a hromadia škodlivé mutácie. Aby sme pochopili, ako k tomuto protipôsobeniu dochádza v mierke jednej makromolekuly, opisujeme kryo-EM štruktúru ribozómu Encephalitozoon cuniculi, eukaryotického organizmu s jedným z najmenších genómov v prírode. Extrémna redukcia rRNA v ribozómoch E. cuniculi je sprevádzaná bezprecedentnými štrukturálnymi zmenami, ako je vývoj predtým neznámych fúzovaných linkerov rRNA a rRNA bez vydutín. Okrem toho ribozóm E. cuniculi prežil stratu fragmentov a proteínov rRNA tým, že si vyvinul schopnosť používať malé molekuly ako štrukturálne napodobeniny degradovaných fragmentov a proteínov rRNA. Celkovo ukazujeme, že molekulárne štruktúry, o ktorých sa dlho predpokladalo, že sú redukované, degenerované a podliehajú oslabujúcim mutáciám, majú množstvo kompenzačných mechanizmov, ktoré ich udržiavajú aktívne napriek extrémnym molekulárnym kontrakciám.
Keďže väčšina skupín mikrobiálnych parazitov má jedinečné molekulárne nástroje na využívanie svojich hostiteľov, často musíme vyvinúť rôzne terapeutiká pre rôzne skupiny parazitov1,2. Nové dôkazy však naznačujú, že niektoré aspekty evolúcie parazitov sú konvergentné a do značnej miery predvídateľné, čo naznačuje potenciálny základ pre široké terapeutické intervencie u mikrobiálnych parazitov3,4,5,6,7,8,9.
Predchádzajúce práce identifikovali spoločný evolučný trend u mikrobiálnych parazitov nazývaný redukcia genómu alebo rozpad genómu10,11,12,13. Súčasný výskum ukazuje, že keď sa mikroorganizmy vzdajú svojho voľne žijúceho spôsobu života a stanú sa intracelulárnymi parazitmi (alebo endosymbiontmi), ich genómy prechádzajú pomalými, ale úžasnými metamorfózami počas miliónov rokov9,11. V procese známom ako rozpad genómu mikrobiálne parazity akumulujú škodlivé mutácie, ktoré premieňajú mnohé predtým dôležité gény na pseudogény, čo vedie k postupnej strate génov a mutačnému kolapsu14,15. Tento kolaps môže zničiť až 95 % génov v najstarších intracelulárnych organizmoch v porovnaní s blízko príbuznými voľne žijúcimi druhmi. Evolúcia intracelulárnych parazitov je teda preťahovaním sa medzi dvoma protichodnými silami: darwinovským prirodzeným výberom, ktorý vedie k zlepšeniu parazitov, a kolapsom genómu, ktorý uvrháva parazity do zabudnutia. Ako sa parazitovi podarilo vymaniť sa z tohto preťahovania sa a zachovať si aktivitu svojej molekulárnej štruktúry, zostáva nejasné.
Hoci mechanizmus rozpadu genómu nie je úplne objasnený, zdá sa, že k nemu dochádza hlavne v dôsledku častého genetického driftu. Keďže parazity žijú v malých, nepohlavných a geneticky obmedzených populáciách, nedokážu účinne eliminovať škodlivé mutácie, ktoré sa niekedy vyskytujú počas replikácie DNA. To vedie k nezvratnej akumulácii škodlivých mutácií a redukcii genómu parazita. V dôsledku toho parazit nielenže stráca gény, ktoré už nie sú potrebné pre jeho prežitie v intracelulárnom prostredí. Práve neschopnosť populácií parazitov účinne eliminovať sporadické škodlivé mutácie spôsobuje, že sa tieto mutácie hromadia v celom genóme vrátane ich najdôležitejších génov.
Veľká časť nášho súčasného chápania redukcie genómu je založená výlučne na porovnávaní genómových sekvencií, s menšou pozornosťou venovanou zmenám v skutočných molekulách, ktoré vykonávajú údržbárske funkcie a slúžia ako potenciálne ciele liekov. Porovnávacie štúdie ukázali, že záťaž škodlivých intracelulárnych mikrobiálnych mutácií zrejme predisponuje proteíny a nukleové kyseliny k nesprávnemu skladaniu a agregácii, čím sa stávajú viac závislými od chaperónov a precitlivenými na teplo19,20,21,22,23. Okrem toho rôzne parazity – nezávislá evolúcia, niekedy oddelená až 2,5 miliardami rokov – zaznamenali podobnú stratu centier kontroly kvality v ich syntéze bielkovín5,6 a mechanizmoch opravy DNA24. O vplyve intracelulárneho životného štýlu na všetky ostatné vlastnosti bunkových makromolekúl, vrátane molekulárnej adaptácie na rastúcu záťaž škodlivých mutácií, sa však vie len málo.
V tejto práci sme s cieľom lepšie pochopiť evolúciu proteínov a nukleových kyselín intracelulárnych mikroorganizmov určili štruktúru ribozómov intracelulárneho parazita Encephalitozoon cuniculi. E. cuniculi je organizmus podobný hube patriaci do skupiny parazitických mikrosporídií, ktoré majú nezvyčajne malé eukaryotické genómy, a preto sa používajú ako modelové organizmy na štúdium rozpadu genómu25,26,27,28,29,30. Nedávno bola kryo-EM ribozómová štruktúra určená pre mierne redukované genómy Microsporidia, Paranosema locustae a Vairimorpha necatrix31,32 (genóm s veľkosťou ~3,2 Mb). Tieto štruktúry naznačujú, že určitá strata amplifikácie rRNA je kompenzovaná vývojom nových kontaktov medzi susednými ribozomálnymi proteínmi alebo získaním nových ribozomálnych proteínov msL131,32. Druh Encephalitozoon (genóm ~2,5 milióna bp) spolu s ich najbližším príbuzným Ordospora vykazujú najvyšší stupeň redukcie genómu u eukaryotov – majú menej ako 2000 génov kódujúcich proteíny a očakáva sa, že ich ribozómy nielenže neobsahujú expanzné fragmenty rRNA (fragmenty rRNA, ktoré odlišujú eukaryotické ribozómy od bakteriálnych ribozómov), ale majú aj štyri ribozomálne proteíny kvôli nedostatku homológov v genóme E. cuniculi26,27,28. Preto sme dospeli k záveru, že ribozóm E. cuniculi môže odhaliť doteraz neznáme stratégie molekulárnej adaptácie na rozpad genómu.
Naša kryo-EM štruktúra predstavuje najmenší eukaryotický cytoplazmatický ribozóm, ktorý bol charakterizovaný, a poskytuje pohľad na to, ako konečný stupeň redukcie genómu ovplyvňuje štruktúru, zostavenie a vývoj molekulárneho aparátu, ktorý je neoddeliteľnou súčasťou bunky. Zistili sme, že ribozóm E. cuniculi porušuje mnohé zo široko konzervovaných princípov skladania RNA a zostavovania ribozómov a objavili sme nový, doteraz neznámy ribozomálny proteín. Celkom neočakávane sme ukázali, že ribozómy mikrosporídií si vyvinuli schopnosť viazať malé molekuly a predpokladáme, že skrátenia v rRNA a proteínoch spúšťajú evolučné inovácie, ktoré môžu v konečnom dôsledku preniesť užitočné vlastnosti na ribozóm.
Aby sme lepšie pochopili vývoj proteínov a nukleových kyselín v intracelulárnych organizmoch, rozhodli sme sa izolovať spóry E. cuniculi z kultúr infikovaných cicavčích buniek, aby sme purifikovali ich ribozómy a určili ich štruktúru. Získať veľké množstvo parazitických mikrosporídií je ťažké, pretože mikrosporídie sa nedajú kultivovať v živnom médiu. Namiesto toho rastú a rozmnožujú sa iba vo vnútri hostiteľskej bunky. Preto sme na získanie biomasy E. cuniculi na purifikáciu ribozómov infikovali bunkovú líniu cicavčích obličiek RK13 spórami E. cuniculi a tieto infikované bunky sme kultivovali niekoľko týždňov, aby sa E. cuniculi mohli rozrásť a množiť. Pomocou infikovanej bunkovej monovrstvy s rozlohou približne pol metra štvorcového sme dokázali purifikovať približne 300 mg spór mikrosporídií a použiť ich na izoláciu ribozómov. Purifikované spóry sme potom rozrušili sklenenými guľôčkami a surové ribozómy sme izolovali pomocou postupnej frakcionácie lyzátov polyetylénglykolom. To nám umožnilo získať približne 300 µg surových ribozómov E. cuniculi na štrukturálnu analýzu.
Následne sme z výsledných vzoriek ribozómov zozbierali kryo-EM snímky a spracovali sme ich pomocou masiek zodpovedajúcich veľkej ribozomálnej podjednotke, hlave malej podjednotky a malej podjednotke. Počas tohto procesu sme zhromaždili snímky približne 108 000 ribozomálnych častíc a vypočítali kryo-EM snímky s rozlíšením 2,7 Å (doplnkové obrázky 1-3). Kryo-EM snímky sme potom použili na modelovanie rRNA, ribozomálneho proteínu a hibernačného faktora Mdf1 spojeného s ribozómami E. cuniculi (obr. 1a, b).
a Štruktúra ribozómu E. cuniculi v komplexe s hiberačným faktorom Mdf1 (pdb id 7QEP). b Mapa hiberačného faktora Mdf1 spojeného s ribozómom E. cuniculi. c Mapa sekundárnej štruktúry porovnávajúca získanú rRNA v druhoch mikrosporídií so známymi ribozomálnymi štruktúrami. Panely zobrazujú umiestnenie amplifikovaných fragmentov rRNA (ES) a aktívnych miest ribozómu vrátane dekódovacieho miesta (DC), sarcinicínovej slučky (SRL) a centra peptidyltransferázy (PTC). d Hustota elektrónov zodpovedajúca centru peptidyltransferázy ribozómu E. cuniculi naznačuje, že toto katalytické miesto má rovnakú štruktúru v parazitovi E. cuniculi a jeho hostiteľoch vrátane H. sapiens. e, f Zodpovedajúca hustota elektrónov dekódovacieho centra (e) a schematická štruktúra dekódovacieho centra (f) naznačujú, že E. cuniculi má zvyšky U1491 namiesto A1491 (číslovanie E. coli) v mnohých iných eukaryotoch. Táto zmena naznačuje, že E. cuniculi môže byť citlivá na antibiotiká, ktoré pôsobia na toto aktívne miesto.
Na rozdiel od predtým stanovených štruktúr ribozómov V. necatrix a P. locustae (obe štruktúry predstavujú tú istú čeľaď mikrosporídií Nosematidae a sú si navzájom veľmi podobné), 31,32 ribozómy E. cuniculi prechádzajú početnými procesmi fragmentácie rRNA a proteínov. Ďalšia denaturácia (doplnkové obrázky 4-6). V rRNA medzi najvýraznejšie zmeny patrila úplná strata amplifikovaného 25S rRNA fragmentu ES12L a čiastočná degenerácia helixov h39, h41 a H18 (obr. 1c, doplnkový obrázok 4). Medzi ribozomálne proteíny patrila medzi najvýraznejšie zmeny úplná strata proteínu eS30 a skrátenie proteínov eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 a eS7 (doplnkové obrázky 4, 5).
Extrémna redukcia genómov druhov Encephalotozoon/Ordospora sa teda odráža v štruktúre ich ribozómov: Ribozómy E. cuniculi zažívajú najdramatickejšiu stratu obsahu bielkovín v eukaryotických cytoplazmatických ribozómoch, ktoré sú predmetom štrukturálnej charakterizácie, a nemajú ani tie rRNA a proteínové fragmenty, ktoré sú široko konzervované nielen v eukaryotoch, ale aj v troch doménach života. Štruktúra ribozómu E. cuniculi poskytuje prvý molekulárny model týchto zmien a odhaľuje evolučné udalosti, ktoré boli prehliadané porovnávacou genomikou aj štúdiami intracelulárnej biomolekulárnej štruktúry (doplnkový obrázok 7). Nižšie popisujeme každú z týchto udalostí spolu s ich pravdepodobným evolučným pôvodom a ich potenciálnym vplyvom na funkciu ribozómov.
Následne sme zistili, že okrem rozsiahlych skrátení rRNA majú ribozómy E. cuniculi variácie rRNA na jednom zo svojich aktívnych miest. Hoci peptidyltransferázové centrum ribozómu E. cuniculi má rovnakú štruktúru ako iné eukaryotické ribozómy (obr. 1d), dekódovacie centrum sa líši v dôsledku sekvenčnej variácie na nukleotide 1491 (číslovanie E. coli, obr. 1e, f). Toto pozorovanie je dôležité, pretože dekódovacie miesto eukaryotických ribozómov typicky obsahuje zvyšky G1408 a A1491 v porovnaní so zvyškami bakteriálneho typu A1408 a G1491. Táto variácia je základom rozdielnej citlivosti bakteriálnych a eukaryotických ribozómov na aminoglykozidovú rodinu ribozomálnych antibiotík a iné malé molekuly, ktoré cielia na dekódovacie miesto. V dekódovacom mieste ribozómu E. cuniculi bol zvyšok A1491 nahradený zvyškom U1491, čím sa potenciálne vytvorilo jedinečné väzbové rozhranie pre malé molekuly cieliace na toto aktívne miesto. Rovnaký variant A14901 je prítomný aj v iných mikrosporídiách, ako sú P. locustae a V. necatrix, čo naznačuje, že je rozšírený medzi druhmi mikrosporídií (obr. 1f).
Keďže naše vzorky ribozómov E. cuniculi boli izolované z metabolicky neaktívnych spór, testovali sme kryo-EM mapu E. cuniculi na predtým opísanú väzbu ribozómov za stresových alebo hladovacích podmienok. Hibernačné faktory 31, 32, 36, 37, 38. Predtým stanovenú štruktúru hibernujúceho ribozómu sme porovnali s kryo-EM mapou ribozómu E. cuniculi. Na dokovanie boli použité ribozómy S. cerevisiae v komplexe s hibernačným faktorom Stm138, ribozómy kobky v komplexe s faktorom Lso232 a ribozómy V. necatrix v komplexe s faktormi Mdf1 a Mdf231. Zároveň sme zistili hustotu kryo-EM zodpovedajúcu pokojovému faktoru Mdf1. Podobne ako sa Mdf1 viaže na ribozóm V. necatrix, Mdf1 sa viaže aj na ribozóm E. cuniculi, kde blokuje miesto E ribozómu, čo pravdepodobne pomáha sprístupniť ribozómy, keď sa spóry parazitov stanú metabolicky neaktívnymi po inaktivácii tela (obrázok 2).
Mdf1 blokuje miesto E ribozómu, čo zrejme pomáha inaktivovať ribozóm, keď sa spóry parazita stanú metabolicky neaktívnymi. V štruktúre ribozómu E. cuniculi sme zistili, že Mdf1 tvorí doteraz neznámy kontakt s ribozómovou stopkou L1, časťou ribozómu, ktorá uľahčuje uvoľňovanie deacylovanej tRNA z ribozómu počas syntézy bielkovín. Tieto kontakty naznačujú, že Mdf1 disociuje z ribozómu rovnakým mechanizmom ako deacetylovaná tRNA, čo poskytuje možné vysvetlenie, ako ribozóm odstraňuje Mdf1, aby reaktivoval syntézu bielkovín.
Naša štruktúra však odhalila neznámy kontakt medzi Mdf1 a ribozómovou nohou L1 (časť ribozómu, ktorá pomáha uvoľňovať deacylovanú tRNA z ribozómu počas syntézy bielkovín). Konkrétne, Mdf1 používa rovnaké kontakty ako kolenný segment deacylovanej molekuly tRNA (obr. 2). Toto doteraz neznáme molekulárne modelovanie ukázalo, že Mdf1 disociuje z ribozómu rovnakým mechanizmom ako deacetylovaná tRNA, čo vysvetľuje, ako ribozóm odstraňuje tento hibernačný faktor, aby reaktivoval syntézu bielkovín.
Pri konštrukcii modelu rRNA sme zistili, že ribozóm E. cuniculi má abnormálne zložené fragmenty rRNA, ktoré sme nazvali fúzovaná rRNA (obr. 3). V ribozómoch, ktoré zahŕňajú tri domény života, sa rRNA skladá do štruktúr, v ktorých sa väčšina báz rRNA buď páruje a skladá navzájom, alebo interaguje s ribozomálnymi proteínmi38,39,40. Avšak v ribozómoch E. cuniculi sa zdá, že rRNA porušujú tento princíp skladania tým, že premieňajú niektoré zo svojich helixov na nerozložené oblasti rRNA.
Štruktúra H18 25S rRNA helixu v S. cerevisiae, V. necatrix a E. cuniculi. V ribozómoch preklenujúcich tri životné domény sa tento linker typicky stočí do RNA helixu, ktorý obsahuje 24 až 34 zvyškov. Naproti tomu v mikrosporídiách sa tento rRNA linker postupne redukuje na dva jednovláknové linkery bohaté na uridín, ktoré obsahujú iba 12 zvyškov. Väčšina týchto zvyškov je vystavená rozpúšťadlám. Obrázok ukazuje, že parazitické mikrosporídie zrejme porušujú všeobecné princípy skladania rRNA, kde sú bázy rRNA zvyčajne spojené s inými bázami alebo sa podieľajú na interakciách rRNA-proteín. V mikrosporídiách niektoré fragmenty rRNA nadobúdajú nepriaznivý sklad, pri ktorom sa pôvodná rRNA helix stáva jednovláknovým fragmentom predĺženým takmer v priamke. Prítomnosť týchto nezvyčajných oblastí umožňuje rRNA mikrosporídií viazať vzdialené fragmenty rRNA s použitím minimálneho počtu RNA báz.
Najvýraznejší príklad tohto evolučného prechodu možno pozorovať v helixe H18 25S rRNA (obr. 3). U druhov od E. coli až po ľudí obsahujú bázy tohto helixu rRNA 24 – 32 nukleotidov, čím tvoria mierne nepravidelný helix. V predtým identifikovaných ribozomálnych štruktúrach z V. necatrix a P. locustae31,32 sú bázy helixu H18 čiastočne rozvinuté, ale párovanie nukleotidových báz je zachované. Avšak v E. cuniculi sa tento fragment rRNA stáva najkratšími linkermi 228UUUGU232 a 301UUUUUUUUUU307. Na rozdiel od typických fragmentov rRNA sa tieto linkery bohaté na uridín nezvinú ani nevytvárajú rozsiahly kontakt s ribozomálnymi proteínmi. Namiesto toho prijímajú štruktúry otvorené pre rozpúšťadlo a úplne rozvinuté, v ktorých sú vlákna rRNA predĺžené takmer rovno. Táto natiahnutá konformácia vysvetľuje, ako E. cuniculi používa iba 12 báz RNA na vyplnenie medzery 33 Å medzi helixmi rRNA H16 a H18, zatiaľ čo iné druhy potrebujú na vyplnenie medzery najmenej dvakrát toľko báz rRNA.
Môžeme teda preukázať, že prostredníctvom energeticky nepriaznivého skladania si parazitické mikrosporídie vyvinuli stratégiu na sťahovanie aj tých segmentov rRNA, ktoré zostávajú v troch oblastiach života naprieč druhmi široko konzervované. Zdá sa, že akumuláciou mutácií, ktoré transformujú helixy rRNA na krátke poly-U linkery, môže E. cuniculi tvoriť nezvyčajné fragmenty rRNA obsahujúce čo najmenej nukleotidov na ligáciu distálnych fragmentov rRNA. To pomáha vysvetliť, ako mikrosporídie dosiahli dramatickú redukciu svojej základnej molekulárnej štruktúry bez straty svojej štrukturálnej a funkčnej integrity.
Ďalším nezvyčajným znakom rRNA E. cuniculi je vzhľad rRNA bez zhrubnutí (obr. 4). Vydutiny sú nukleotidy bez bázových párov, ktoré sa vykrúcajú z RNA helixu namiesto toho, aby sa v ňom skrývali. Väčšina vydutín rRNA funguje ako molekulárne lepidlá, ktoré pomáhajú viazať susedné ribozomálne proteíny alebo iné fragmenty rRNA. Niektoré z vydutín fungujú ako pánty, čo umožňuje rRNA helixu optimálne sa ohýbať a skladať pre produktívnu syntézu bielkovín 41.
a Výbežok rRNA (číslovanie S. cerevisiae) chýba v štruktúre ribozómu E. cuniculi, ale je prítomný vo väčšine ostatných eukaryotov b Vnútorné ribozómy E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens a E. cuniculi. Parazitom chýba mnoho starých, vysoko konzervovaných vyvýšenín rRNA. Tieto zhrubnutia stabilizujú štruktúru ribozómov; preto ich absencia v mikrosporídiách naznačuje zníženú stabilitu skladania rRNA u parazitov s mikrosporídiami. Porovnanie s P stonkami (stonky L7/L12 u baktérií) ukazuje, že strata vyvýšenín rRNA sa niekedy zhoduje s objavením sa nových vyvýšenín vedľa stratených vyvýšenín. Špirálka H42 v rRNA 23S/28S má starú vyvýšeninu (U1206 u Saccharomyces cerevisiae), ktorej vek sa odhaduje na najmenej 3,5 miliardy rokov vďaka jej ochrane v troch doménach života. V mikrosporídiách je táto vyvýšenina eliminovaná. Vedľa stratenej vydutiny (A1306 u E. cuniculi) sa však objavila nová vydutina.
Prekvapivo sme zistili, že ribozómom E. cuniculi chýba väčšina rRNA vydutín nachádzajúcich sa u iných druhov, vrátane viac ako 30 vydutín konzervovaných u iných eukaryotov (obr. 4a). Táto strata eliminuje mnoho kontaktov medzi ribozomálnymi podjednotkami a susednými rRNA helixmi, čo niekedy vytvára veľké duté priestory v ribozóme, vďaka čomu je ribozóm E. cuniculi poréznejší v porovnaní s tradičnejšími ribozómami (obr. 4b). Zistili sme najmä, že väčšina týchto vydutín sa stratila aj v predtým identifikovaných ribozómových štruktúrach V. necatrix a P. locustae, ktoré boli prehliadnuté predchádzajúcimi štrukturálnymi analýzami31,32.
Niekedy je strata vydutín rRNA sprevádzaná vývojom nových vydutín vedľa strateného vydutia. Napríklad ribozomálny P-stonok obsahuje vydutie U1208 (u Saccharomyces cerevisiae), ktoré prežilo z E. coli na človeka, a preto sa odhaduje, že jeho vek je 3,5 miliardy rokov. Počas syntézy bielkovín toto vydutie pomáha P-stonke pohybovať sa medzi otvorenou a uzavretou konformáciou, aby ribozóm mohol prijímať translačné faktory a doručovať ich do aktívneho miesta. V ribozómoch E. cuniculi toto zhrubnutie chýba; nové zhrubnutie (G883) nachádzajúce sa iba v troch bázových pároch však môže prispieť k obnoveniu optimálnej flexibility P-stonky (obr. 4c).
Naše údaje o rRNA bez vydutín naznačujú, že minimalizácia rRNA nie je obmedzená len na stratu prvkov rRNA na povrchu ribozómu, ale môže zahŕňať aj jadro ribozómu, čím vzniká molekulárny defekt špecifický pre parazita, ktorý nebol popísaný vo voľne žijúcich bunkách. U žijúcich druhov sa pozoruje viacero pozorovaných žijúcich druhov.
Po modelovaní kanonických ribozomálnych proteínov a rRNA sme zistili, že konvenčné ribozomálne komponenty nedokážu vysvetliť tri časti kryo-EM obrazu. Dva z týchto fragmentov sú molekuly malej veľkosti (obr. 5, doplnkový obr. 8). Prvý segment je vložený medzi ribozomálne proteíny uL15 a eL18 v polohe, ktorú zvyčajne obsadzuje C-koniec eL18, ktorý je u E. cuniculi skrátený. Hoci nevieme určiť identitu tejto molekuly, veľkosť a tvar tohto ostrovčeka hustoty sa dobre vysvetľujú prítomnosťou molekúl spermidínu. Jeho väzba na ribozóm je stabilizovaná mutáciami špecifickými pre mikrosporídie v proteínoch uL15 (Asp51 a Arg56), ktoré zrejme zvyšujú afinitu ribozómu k tejto malej molekule, pretože umožňujú uL15 obaliť malú molekulu do ribozomálnej štruktúry. Doplnkový obrázok 2). 8, ďalšie údaje 1, 2).
Kryo-EM zobrazovanie ukazujúce prítomnosť nukleotidov mimo ribózy viazanej na ribozóm E. cuniculi. V ribozóme E. cuniculi tento nukleotid zaujíma rovnaké miesto ako nukleotid 25S rRNA A3186 (číslovanie Saccharomyces cerevisiae) vo väčšine ostatných eukaryotických ribozómov. b V ribozomálnej štruktúre E. cuniculi sa tento nukleotid nachádza medzi ribozomálnymi proteínmi uL9 a eL20, čím stabilizuje kontakt medzi týmito dvoma proteínmi. cd Analýza konzervácie sekvencie eL20 medzi druhmi mikrosporídií. Fylogenetický strom druhov mikrosporídií (c) a viacnásobné zarovnanie sekvencií proteínu eL20 (d) ukazujú, že zvyšky viažuce nukleotidy F170 a K172 sú konzervované vo väčšine typických mikrosporídií, s výnimkou S. lophii, s výnimkou skorých vetvených mikrosporídií, ktoré si zachovali predĺženie rRNA ES39L. e Tento obrázok ukazuje, že zvyšky F170 a K172 viažuce nukleotidy sú prítomné iba v eL20 vysoko redukovaného genómu mikrosporídií, ale nie v iných eukaryotoch. Celkovo tieto údaje naznačujú, že ribozómy mikrosporídií si vyvinuli väzbové miesto pre nukleotidy, ktoré sa zrejme viaže na molekuly AMP a používa ich na stabilizáciu interakcií proteín-proteín v štruktúre ribozómov. Vysoká konzervácia tohto väzbového miesta v mikrosporídiách a jeho absencia v iných eukaryotoch naznačuje, že toto miesto môže poskytnúť selektívnu výhodu prežitia pre mikrosporídie. Väzbové vrecko pre nukleotidy v ribozóme mikrosporídií sa teda nezdá byť degenerovaným znakom alebo koncovou formou degradácie rRNA, ako bolo opísané predtým, ale skôr užitočnou evolučnou inováciou, ktorá umožňuje ribozómu mikrosporídií priamo viazať malé molekuly a používať ich ako molekulárne stavebné bloky pre ribozómy. Tento objav robí z ribozómu mikrosporídií jediný ribozóm, o ktorom je známe, že používa jeden nukleotid ako svoj štrukturálny stavebný blok. f Hypotetická evolučná dráha odvodená z väzby nukleotidov.
Druhá nízka molekulová hustota sa nachádza na rozhraní medzi ribozomálnymi proteínmi uL9 a eL30 (obr. 5a). Toto rozhranie bolo predtým opísané v štruktúre ribozómu Saccharomyces cerevisiae ako väzbové miesto pre 25S nukleotid rRNA A3186 (súčasť predĺženia rRNA ES39L)38. Ukázalo sa, že v degenerovaných ribozómoch P. locustae ES39L sa toto rozhranie viaže na neznámy jediný nukleotid 31 a predpokladá sa, že tento nukleotid je redukovanou konečnou formou rRNA, v ktorej je dĺžka rRNA ~130-230 báz. ES39L je redukovaný na jediný nukleotid 32,43. Naše kryo-EM snímky podporujú myšlienku, že hustotu možno vysvetliť nukleotidmi. Vyššie rozlíšenie našej štruktúry však ukázalo, že tento nukleotid je extraribozomálna molekula, pravdepodobne AMP (obr. 5a, b).
Následne sme sa pýtali, či sa väzbové miesto nukleotidov nachádza v ribozóme E. cuniculi alebo či existovalo už predtým. Keďže väzba nukleotidov je sprostredkovaná hlavne zvyškami Phe170 a Lys172 v ribozomálnom proteíne eL30, hodnotili sme konzervovanosť týchto zvyškov v 4396 reprezentatívnych eukaryotoch. Rovnako ako v prípade uL15 vyššie sme zistili, že zvyšky Phe170 a Lys172 sú vysoko konzervované iba v typických mikrosporídiách, ale chýbajú v iných eukaryotoch vrátane atypických mikrosporídií Mitosporidium a Amphiamblys, v ktorých nie je fragment ES39L rRNA redukovaný 44, 45, 46 (Obr. 5c). -e).
Tieto údaje spoločne podporujú myšlienku, že E. cuniculi a pravdepodobne aj iné kanonické mikrosporídie si vyvinuli schopnosť efektívne zachytávať veľké množstvo malých metabolitov v štruktúre ribozómu, aby kompenzovali pokles hladín rRNA a proteínov. Pritom si vyvinuli jedinečnú schopnosť viazať nukleotidy mimo ribozómu, čo ukazuje, že parazitické molekulárne štruktúry to kompenzujú zachytávaním veľkého množstva malých metabolitov a ich použitím ako štrukturálnych napodobenín degradovaných fragmentov RNA a proteínov.
Tretia nesimulovaná časť našej kryo-EM mapy sa nachádza vo veľkej ribozomálnej podjednotke. Relatívne vysoké rozlíšenie (2,6 Å) našej mapy naznačuje, že táto hustota patrí proteínom s jedinečnými kombináciami zvyškov dlhých bočných reťazcov, čo nám umožnilo identifikovať túto hustotu ako predtým neznámy ribozomálny proteín, ktorý sme identifikovali ako. Bol pomenovaný msL2 (proteín L2 špecifický pre mikrosporídie) (metódy, obrázok 6). Naše hľadanie homológie ukázalo, že msL2 je konzervovaný v klade Microsporidia rodu Encephaliter a Orosporidium, ale chýba u iných druhov vrátane iných mikrosporídií. V ribozomálnej štruktúre msL2 zaberá medzeru vytvorenú stratou predĺženej rRNA ES31L. V tejto medzere msL2 pomáha stabilizovať skladanie rRNA a môže kompenzovať stratu ES31L (obrázok 6).
a Elektrónová hustota a model ribozomálneho proteínu msL2 špecifického pre mikrosporídie, ktorý sa nachádza v ribozómoch E. cuniculi. b Väčšina eukaryotických ribozómov, vrátane 80S ribozómu Saccharomyces cerevisiae, má u väčšiny druhov mikrosporídií stratenú amplifikáciu ES19L rRNA. Predtým stanovená štruktúra ribozómu mikrosporídií V. necatrix naznačuje, že strata ES19L u týchto parazitov je kompenzovaná vývojom nového ribozomálneho proteínu msL1. V tejto štúdii sme zistili, že ribozóm E. cuniculi tiež vyvinul ďalší proteín napodobňujúci ribozomálnu RNA ako zjavnú kompenzáciu za stratu ES19L. MsL2 (v súčasnosti označovaný ako hypotetický proteín ECU06_1135) a msL1 však majú odlišný štrukturálny a evolučný pôvod. c Tento objav tvorby evolučne nesúvisiacich ribozomálnych proteínov msL1 a msL2 naznačuje, že ak ribozómy akumulujú škodlivé mutácie vo svojej rRNA, môžu dosiahnuť bezprecedentnú úroveň kompozičnej diverzity aj v malej podskupine blízko príbuzných druhov. Tento objav by mohol pomôcť objasniť pôvod a vývoj mitochondriálneho ribozómu, ktorý je známy svojou vysoko redukovanou rRNA a abnormálnou variabilitou v zložení proteínov medzi druhmi.
Následne sme porovnali proteín msL2 s predtým opísaným proteínom msL1, jediným známym ribozomálnym proteínom špecifickým pre mikrosporídie, ktorý sa nachádza v ribozóme V. necatrix. Chceli sme otestovať, či sú msL1 a msL2 evolučne príbuzné. Naša analýza ukázala, že msL1 a msL2 zaberajú rovnakú dutinu v ribozomálnej štruktúre, ale majú odlišné primárne a terciárne štruktúry, čo naznačuje ich nezávislý evolučný pôvod (Obr. 6). Náš objav msL2 teda poskytuje dôkaz, že skupiny kompaktných eukaryotických druhov môžu nezávisle vyvinúť štrukturálne odlišné ribozomálne proteíny, aby kompenzovali stratu fragmentov rRNA. Toto zistenie je pozoruhodné v tom, že väčšina cytoplazmatických eukaryotických ribozómov obsahuje invariantný proteín vrátane rovnakej rodiny 81 ribozomálnych proteínov. Výskyt msL1 a msL2 v rôznych kladoch mikrosporídií v reakcii na stratu predĺžených segmentov rRNA naznačuje, že degradácia molekulárnej architektúry parazita spôsobuje, že parazity hľadajú kompenzačné mutácie, čo môže nakoniec viesť k ich získaniu v rôznych populáciách parazitov.
Nakoniec, keď bol náš model dokončený, porovnali sme zloženie ribozómu E. cuniculi so zložením predpovedaným zo sekvencie genómu. Predtým sa predpokladalo, že v genóme E. cuniculi chýba niekoľko ribozomálnych proteínov, vrátane eL14, eL38, eL41 a eS30, kvôli zjavnej absencii ich homológov v genóme E. cuniculi. Strata mnohých ribozomálnych proteínov sa predpokladá aj u väčšiny ostatných vysoko redukovaných intracelulárnych parazitov a endosymbiontov. Napríklad, hoci väčšina voľne žijúcich baktérií obsahuje rovnakú rodinu 54 ribozomálnych proteínov, iba 11 z týchto proteínových rodín má detekovateľné homológy v každom analyzovanom genóme baktérií obmedzeného na hostiteľa. Na podporu tejto myšlienky bola experimentálne pozorovaná strata ribozomálnych proteínov u mikrosporídií V. necatrix a P. locustae, ktorým chýbajú proteíny eL38 a eL4131,32.
Naše štruktúry však ukazujú, že v ribozóme E. cuniculi sa v skutočnosti strácajú iba eL38, eL41 a eS30. Proteín eL14 bol konzervovaný a naša štruktúra ukázala, prečo sa tento proteín nedal nájsť pri hľadaní homológie (Obr. 7). V ribozómoch E. cuniculi sa väčšina väzbového miesta eL14 stráca v dôsledku degradácie rRNA-amplifikovaného ES39L. V neprítomnosti ES39L stratil eL14 väčšinu svojej sekundárnej štruktúry a iba 18 % sekvencie eL14 bolo identických v E. cuniculi a S. cerevisiae. Táto slabá konzervácia sekvencií je pozoruhodná, pretože aj Saccharomyces cerevisiae a Homo sapiens – organizmy, ktoré sa vyvinuli s odstupom 1,5 miliardy rokov – zdieľajú viac ako 51 % rovnakých zvyškov v eL14. Táto anomálna strata ochrany vysvetľuje, prečo je E. cuniculi eL14 v súčasnosti označovaný ako predpokladaný proteín M970_061160 a nie ako ribozomálny proteín eL1427.
a Ribozóm mikrosporídií stratil predĺženie rRNA ES39L, čo čiastočne eliminovalo väzbové miesto ribozomálneho proteínu eL14. V neprítomnosti ES39L dochádza k strate sekundárnej štruktúry proteínu mikrosporídií eL14, pri ktorej sa bývalá α-helix viažuca rRNA degeneruje do slučky minimálnej dĺžky. b Viacnásobné zarovnanie sekvencií ukazuje, že proteín eL14 je vysoko konzervovaný u eukaryotických druhov (57 % sekvenčná identita medzi kvasinkovými a ľudskými homológmi), ale slabo konzervovaný a divergentný u mikrosporídií (v ktorých nie je viac ako 24 % zvyškov identických s homológom eL14). z S. cerevisiae alebo H. sapiens). Táto slabá konzervácia sekvencií a variabilita sekundárnej štruktúry vysvetľuje, prečo sa homológ eL14 nikdy nenašiel u E. cuniculi a prečo sa predpokladá, že tento proteín sa v E. cuniculi stratil. Naproti tomu eL14 z E. cuniculi bol predtým označený ako predpokladaný proteín M970_061160. Toto pozorovanie naznačuje, že diverzita genómu mikrosporídií je v súčasnosti nadhodnotená: niektoré gény, o ktorých sa v súčasnosti predpokladá, že sa v mikrosporídiách stratili, sú v skutočnosti zachované, aj keď vo vysoko diferencovaných formách; namiesto toho sa predpokladá, že niektoré kódujú gény mikrosporídií pre proteíny špecifické pre červy (napr. hypotetický proteín M970_061160) v skutočnosti kóduje veľmi rozmanité proteíny nachádzajúce sa v iných eukaryotoch.
Toto zistenie naznačuje, že denaturácia rRNA môže viesť k dramatickej strate konzervácie sekvencií v susedných ribozomálnych proteínoch, čím sa tieto proteíny stanú nedetekovateľnými pri vyhľadávaní homológie. Preto môžeme nadhodnocovať skutočný stupeň molekulárnej degradácie v organizmoch s malým genómom, pretože niektoré proteíny, o ktorých sa predpokladá, že sú stratené, v skutočnosti pretrvávajú, aj keď vo vysoko zmenených formách.
Ako si parazity dokážu zachovať funkciu svojich molekulárnych strojov v podmienkach extrémnej redukcie genómu? Naša štúdia odpovedá na túto otázku opisom komplexnej molekulárnej štruktúry (ribozómu) E. cuniculi, organizmu s jedným z najmenších eukaryotických genómov.
Už takmer dve desaťročia je známe, že molekuly proteínov a RNA v mikrobiálnych parazitoch sa často líšia od ich homológnych molekúl u voľne žijúcich druhov, pretože im chýbajú centrá kontroly kvality, u voľne žijúcich mikróbov sú zmenšené na 50 % svojej veľkosti atď., majú mnoho oslabujúcich mutácií, ktoré zhoršujú skladanie a funkciu. Napríklad sa očakáva, že ribozómy organizmov s malým genómom, vrátane mnohých intracelulárnych parazitov a endosymbiontov, budú mať v porovnaní s voľne žijúcimi druhmi nedostatok niekoľkých ribozomálnych proteínov a až tretiny nukleotidov rRNA 27, 29, 30, 49. Spôsob, akým tieto molekuly fungujú u parazitov, však zostáva do značnej miery záhadou a skúma sa najmä prostredníctvom porovnávacej genomiky.
Naša štúdia ukazuje, že štruktúra makromolekúl môže odhaliť mnoho aspektov evolúcie, ktoré je ťažké extrahovať z tradičných porovnávacích genomických štúdií intracelulárnych parazitov a iných organizmov obmedzených na hostiteľa (doplnkový obrázok 7). Napríklad príklad proteínu eL14 ukazuje, že môžeme nadhodnotiť skutočný stupeň degradácie molekulárneho aparátu u parazitických druhov. Predpokladá sa, že encefalitické parazity majú v súčasnosti stovky génov špecifických pre mikrosporídie. Naše výsledky však ukazujú, že niektoré z týchto zdanlivo špecifických génov sú v skutočnosti len veľmi odlišnými variantmi génov, ktoré sú bežné u iných eukaryotov. Okrem toho príklad proteínu msL2 ukazuje, ako prehliadame nové ribozomálne proteíny a podceňujeme obsah parazitických molekulárnych strojov. Príklad malých molekúl ukazuje, ako môžeme prehliadať najdômyselnejšie inovácie v parazitických molekulárnych štruktúrach, ktoré im môžu dať novú biologickú aktivitu.
Tieto výsledky spoločne zlepšujú naše chápanie rozdielov medzi molekulárnymi štruktúrami organizmov obmedzenými na hostiteľa a ich náprotivkami vo voľne žijúcich organizmoch. Ukazujeme, že molekulárne stroje, o ktorých sa dlho predpokladalo, že sú redukované, degenerované a podliehajú rôznym oslabujúcim mutáciám, majú namiesto toho súbor systematicky prehliadaných nezvyčajných štrukturálnych znakov.
Na druhej strane, neobjemné fragmenty rRNA a fúzované fragmenty, ktoré sme našli v ribozómoch E. cuniculi, naznačujú, že redukcia genómu môže zmeniť aj tie časti základného molekulárneho aparátu, ktoré sú zachované v troch doménach života – po takmer 3,5 miliardách rokov nezávislej evolúcie druhov.
Fragmenty rRNA bez vydutín a fúzované fragmenty v ribozómoch E. cuniculi sú obzvlášť zaujímavé vzhľadom na predchádzajúce štúdie molekúl RNA v endosymbiotických baktériách. Napríklad u endosymbionta vošky Buchnera aphidicola sa ukázalo, že molekuly rRNA a tRNA majú teplotne citlivé štruktúry v dôsledku skreslenia zloženia A+T a vysokého podielu nekanonických párov báz20,50. Tieto zmeny v RNA, ako aj zmeny v molekulách proteínov, sa teraz považujú za zodpovedné za nadmernú závislosť endosymbiontov od partnerov a neschopnosť endosymbiontov prenášať teplo21,23. Hoci rRNA parazitických mikrosporídií má štrukturálne odlišné zmeny, povaha týchto zmien naznačuje, že znížená tepelná stabilita a vyššia závislosť od chaperónových proteínov môžu byť spoločnými znakmi molekúl RNA v organizmoch s redukovanými genómami.
Na druhej strane, naše štruktúry ukazujú, že parazitárne mikrosporídie si vyvinuli jedinečnú schopnosť odolávať široko konzervovaným rRNA a proteínovým fragmentom, čím si vyvinuli schopnosť používať hojné a ľahko dostupné malé metabolity ako štrukturálne napodobeniny degenerovaných rRNA a proteínových fragmentov. Degradácia molekulárnej štruktúry. Tento názor podporuje skutočnosť, že malé molekuly, ktoré kompenzujú stratu proteínových fragmentov v rRNA a ribozómoch E. cuniculi, sa viažu na zvyšky špecifické pre mikrosporídie v proteínoch uL15 a eL30. To naznačuje, že väzba malých molekúl na ribozómy môže byť produktom pozitívneho výberu, pri ktorom boli mutácie špecifické pre mikrosporídie v ribozomálnych proteínoch vybrané pre ich schopnosť zvýšiť afinitu ribozómov k malým molekulám, čo môže viesť k efektívnejším ribozomálnym organizmom. Tento objav odhaľuje inteligentnú inováciu v molekulárnej štruktúre mikrobiálnych parazitov a poskytuje nám lepšie pochopenie toho, ako si molekulárne štruktúry parazitov zachovávajú svoju funkciu napriek reduktívnej evolúcii.
V súčasnosti zostáva identifikácia týchto malých molekúl nejasná. Nie je jasné, prečo sa vzhľad týchto malých molekúl v ribozómovej štruktúre líši medzi druhmi mikrosporídií. Najmä nie je jasné, prečo sa väzba nukleotidov pozoruje v ribozómoch E. cuniculi a P. locustae a nie v ribozómoch V. necatrix, a to aj napriek prítomnosti zvyšku F170 v proteínoch eL20 a K172 V. necatrix. Túto deléciu môže spôsobiť zvyšok 43 uL6 (nachádzajúci sa vedľa väzbového vrecka nukleotidov), ktorým je tyrozín vo V. necatrix a nie treonín v E. cuniculi a P. locustae. Objemný aromatický bočný reťazec Tyr43 môže interferovať s väzbou nukleotidov v dôsledku sterického prekrývania. Alternatívne môže byť zdanlivá delécia nukleotidov spôsobená nízkym rozlíšením kryo-EM zobrazovania, ktoré bráni modelovaniu ribozomálnych fragmentov V. necatrix.
Na druhej strane, naša práca naznačuje, že proces rozpadu genómu môže byť vynaliezavou silou. Najmä štruktúra ribozómu E. cuniculi naznačuje, že strata rRNA a proteínových fragmentov v ribozóme mikrosporídií vytvára evolučný tlak, ktorý podporuje zmeny v štruktúre ribozómov. Tieto varianty sa vyskytujú ďaleko od aktívneho miesta ribozómu a zdá sa, že pomáhajú udržiavať (alebo obnovovať) optimálnu zostavu ribozómov, ktorá by inak bola narušená redukovanou rRNA. To naznačuje, že hlavná inovácia ribozómu mikrosporídií sa zrejme vyvinula do potreby tlmiť drift génov.
Možno to najlepšie ilustruje väzba nukleotidov, ktorá doteraz nebola u iných organizmov pozorovaná. Skutočnosť, že zvyšky viažuce nukleotidy sú prítomné v typických mikrosporídiách, ale nie v iných eukaryotoch, naznačuje, že miesta viažuce nukleotidy nie sú len pozostatkami čakajúcimi na zánik alebo konečným miestom pre obnovenie rRNA do podoby jednotlivých nukleotidov. Namiesto toho sa toto miesto javí ako užitočná funkcia, ktorá sa mohla vyvinúť počas niekoľkých kôl pozitívneho výberu. Miesta viažuce nukleotidy môžu byť vedľajším produktom prirodzeného výberu: akonáhle je ES39L degradovaný, mikrosporídie sú nútené hľadať kompenzáciu na obnovenie optimálnej biogenézy ribozómov v neprítomnosti ES39L. Keďže tento nukleotid môže napodobňovať molekulárne kontakty nukleotidu A3186 v ES39L, molekula nukleotidu sa stáva stavebným blokom ribozómu, ktorého väzba sa ďalej zlepšuje mutáciou sekvencie eL30.
Pokiaľ ide o molekulárnu evolúciu intracelulárnych parazitov, naša štúdia ukazuje, že sily darwinovského prirodzeného výberu a genetického driftu rozpadu genómu nefungujú paralelne, ale oscilujú. Po prvé, genetický drift eliminuje dôležité vlastnosti biomolekúl, čo vedie k nevyhnutnej kompenzácii. Až keď parazity uspokoja túto potrebu prostredníctvom darwinovského prirodzeného výberu, budú mať ich makromolekuly šancu rozvinúť svoje najpôsobivejšie a najinovatívnejšie vlastnosti. Dôležité je, že evolúcia väzbových miest nukleotidov v ribozóme E. cuniculi naznačuje, že tento vzorec molekulárnej evolúcie so stratou za ziskom nielenže amortizuje škodlivé mutácie, ale niekedy udeľuje parazitickým makromolekulám úplne nové funkcie.
Táto myšlienka je v súlade s teóriou pohyblivej rovnováhy Sewella Wrighta, ktorá tvrdí, že prísny systém prirodzeného výberu obmedzuje schopnosť organizmov inovovať51,52,53. Ak však genetický drift naruší prirodzený výber, tieto drifty môžu spôsobiť zmeny, ktoré samy osebe nie sú adaptívne (alebo dokonca škodlivé), ale vedú k ďalším zmenám, ktoré poskytujú vyššiu zdatnosť alebo novú biologickú aktivitu. Náš rámec podporuje túto myšlienku ilustráciou, že rovnaký typ mutácie, ktorá znižuje rozsah a funkciu biomolekuly, sa javí ako hlavný spúšťač jej zlepšenia. V súlade s evolučným modelom, v ktorom sú výhodné všetky strany, naša štúdia ukazuje, že rozpad genómu, tradične vnímaný ako degeneratívny proces, je tiež hlavným hnacím motorom inovácií, ktorý niekedy a možno aj často umožňuje makromolekulám získať nové parazitické aktivity. Tieto aktivity môžu byť využívané.