Terima kasih telah mengunjungi Nature.com. Versi peramban yang Anda gunakan memiliki dukungan CSS yang terbatas. Untuk pengalaman terbaik, kami sarankan Anda menggunakan peramban yang lebih baru (atau menonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan dukungan berkelanjutan, kami akan menampilkan situs tanpa gaya dan JavaScript.
Evolusi parasit mikroba melibatkan pertentangan antara seleksi alam, yang menyebabkan parasit menjadi lebih baik, dan hanyutan genetik, yang menyebabkan parasit kehilangan gen dan mengakumulasi mutasi yang merugikan. Di sini, untuk memahami bagaimana pertentangan ini terjadi pada skala makromolekul tunggal, kami menjelaskan struktur cryo-EM ribosom Encephalitozoon cuniculi, organisme eukariotik dengan salah satu genom terkecil di alam. Pengurangan rRNA yang ekstrem pada ribosom E. cuniculi disertai dengan perubahan struktural yang belum pernah terjadi sebelumnya, seperti evolusi penghubung rRNA yang menyatu dan rRNA tanpa tonjolan yang sebelumnya tidak diketahui. Selain itu, ribosom E. cuniculi bertahan dari kehilangan fragmen rRNA dan protein dengan mengembangkan kemampuan untuk menggunakan molekul kecil sebagai peniru struktural fragmen rRNA dan protein yang terdegradasi. Secara keseluruhan, kami menunjukkan bahwa struktur molekuler yang selama ini dianggap berkurang, terdegenerasi, dan rentan terhadap mutasi yang melemahkan memiliki sejumlah mekanisme kompensasi yang membuatnya tetap aktif meskipun terjadi kontraksi molekuler yang ekstrem.
Karena sebagian besar kelompok parasit mikroba memiliki alat molekuler unik untuk mengeksploitasi inangnya, kita sering kali harus mengembangkan terapi yang berbeda untuk kelompok parasit yang berbeda1,2. Namun, bukti baru menunjukkan bahwa beberapa aspek evolusi parasit bersifat konvergen dan sebagian besar dapat diprediksi, yang mengindikasikan potensi dasar untuk intervensi terapeutik yang luas pada parasit mikroba3,4,5,6,7,8,9.
Penelitian sebelumnya telah mengidentifikasi tren evolusi umum pada parasit mikroba yang disebut pengurangan genom atau peluruhan genom10,11,12,13. Penelitian saat ini menunjukkan bahwa ketika mikroorganisme meninggalkan gaya hidup bebasnya dan menjadi parasit intraseluler (atau endosimbion), genom mereka mengalami metamorfosis yang lambat namun menakjubkan selama jutaan tahun9,11. Dalam proses yang dikenal sebagai peluruhan genom, parasit mikroba mengakumulasi mutasi berbahaya yang mengubah banyak gen yang sebelumnya penting menjadi pseudogen, yang menyebabkan hilangnya gen secara bertahap dan keruntuhan mutasi14,15. Keruntuhan ini dapat menghancurkan hingga 95% gen pada organisme intraseluler tertua dibandingkan dengan spesies bebas yang berkerabat dekat. Dengan demikian, evolusi parasit intraseluler adalah tarik-menarik antara dua kekuatan yang berlawanan: seleksi alam Darwin, yang mengarah pada peningkatan parasit, dan keruntuhan genom, yang membuat parasit punah. Bagaimana parasit berhasil keluar dari tarik-menarik ini dan mempertahankan aktivitas struktur molekulnya masih belum jelas.
Meskipun mekanisme peluruhan genom belum sepenuhnya dipahami, tampaknya hal itu terutama terjadi karena seringnya terjadi pergeseran genetik. Karena parasit hidup dalam populasi kecil, aseksual, dan terbatas secara genetik, mereka tidak dapat secara efektif menghilangkan mutasi berbahaya yang terkadang terjadi selama replikasi DNA. Hal ini menyebabkan akumulasi mutasi berbahaya yang tidak dapat dipulihkan dan pengurangan genom parasit. Akibatnya, parasit tidak hanya kehilangan gen yang tidak lagi diperlukan untuk kelangsungan hidupnya di lingkungan intraseluler. Ketidakmampuan populasi parasit untuk secara efektif menghilangkan mutasi berbahaya sporadis inilah yang menyebabkan mutasi ini terakumulasi di seluruh genom, termasuk gen-gen terpentingnya.
Sebagian besar pemahaman kita saat ini tentang pengurangan genom hanya didasarkan pada perbandingan sekuens genom, dengan sedikit perhatian pada perubahan molekul sebenarnya yang melakukan fungsi pemeliharaan dan berfungsi sebagai target obat potensial. Studi perbandingan telah menunjukkan bahwa beban mutasi mikroba intraseluler yang merugikan tampaknya membuat protein dan asam nukleat rentan terhadap kesalahan pelipatan dan agregasi, sehingga lebih bergantung pada chaperone dan sangat sensitif terhadap panas19,20,21,22,23. Selain itu, berbagai parasit—evolusi independen yang terkadang terpisah hingga 2,5 miliar tahun—mengalami kehilangan pusat kendali mutu yang serupa dalam sintesis protein5,6 dan mekanisme perbaikan DNA24. Namun, sedikit yang diketahui tentang dampak gaya hidup intraseluler pada semua sifat makromolekul seluler lainnya, termasuk adaptasi molekuler terhadap peningkatan beban mutasi yang merugikan.
Dalam penelitian ini, untuk lebih memahami evolusi protein dan asam nukleat mikroorganisme intraseluler, kami menentukan struktur ribosom parasit intraseluler Encephalitozoon cuniculi. E. cuniculi adalah organisme mirip jamur yang termasuk dalam kelompok mikrosporidia parasit yang memiliki genom eukariotik yang sangat kecil dan oleh karena itu digunakan sebagai organisme model untuk mempelajari peluruhan genom25,26,27,28,29,30. Baru-baru ini, struktur ribosom cryo-EM telah ditentukan untuk genom yang sedikit tereduksi dari Microsporidia, Paranosema locustae, dan Vairimorpha necatrix31,32 (~3,2 Mb genom). Struktur ini menunjukkan bahwa beberapa kehilangan amplifikasi rRNA dikompensasi oleh perkembangan kontak baru antara protein ribosom yang berdekatan atau akuisisi protein ribosom msL131,32 yang baru. Spesies Encephalitozoon (genom ~2,5 juta bp), bersama dengan kerabat terdekatnya Ordospora, menunjukkan tingkat pengurangan genom tertinggi pada eukariota – mereka memiliki kurang dari 2000 gen pengkode protein, dan diperkirakan bahwa ribosom mereka tidak hanya tidak memiliki fragmen ekspansi rRNA (fragmen rRNA yang membedakan ribosom eukariota dari ribosom bakteri) tetapi juga memiliki empat protein ribosom karena kurangnya homolog dalam genom E. cuniculi26,27,28. Oleh karena itu, kami menyimpulkan bahwa ribosom E. cuniculi dapat mengungkapkan strategi adaptasi molekuler terhadap peluruhan genom yang sebelumnya tidak diketahui.
Struktur cryo-EM kami mewakili ribosom sitoplasma eukariotik terkecil yang telah dikarakterisasi dan memberikan wawasan tentang bagaimana tingkat pengurangan genom tertinggi memengaruhi struktur, perakitan, dan evolusi mesin molekuler yang integral bagi sel. Kami menemukan bahwa ribosom E. cuniculi melanggar banyak prinsip yang dilestarikan secara luas tentang pelipatan RNA dan perakitan ribosom, dan menemukan protein ribosom baru yang sebelumnya tidak diketahui. Secara tak terduga, kami menunjukkan bahwa ribosom mikrosporidia telah mengembangkan kemampuan untuk mengikat molekul kecil, dan berhipotesis bahwa pemotongan pada rRNA dan protein memicu inovasi evolusioner yang pada akhirnya dapat memberikan kualitas yang berguna pada ribosom.
Untuk meningkatkan pemahaman kita tentang evolusi protein dan asam nukleat dalam organisme intraseluler, kami memutuskan untuk mengisolasi spora E. cuniculi dari kultur sel mamalia yang terinfeksi untuk memurnikan ribosomnya dan menentukan struktur ribosom tersebut. Sulit untuk mendapatkan sejumlah besar mikrosporidia parasit karena mikrosporidia tidak dapat dikultur dalam media nutrisi. Sebaliknya, mereka hanya tumbuh dan bereproduksi di dalam sel inang. Oleh karena itu, untuk mendapatkan biomassa E. cuniculi untuk pemurnian ribosom, kami menginfeksi sel ginjal mamalia RK13 dengan spora E. cuniculi dan mengkultur sel-sel yang terinfeksi ini selama beberapa minggu untuk memungkinkan E. cuniculi tumbuh dan berkembang biak. Dengan menggunakan lapisan sel yang terinfeksi seluas sekitar setengah meter persegi, kami mampu memurnikan sekitar 300 mg spora Mikrosporidia dan menggunakannya untuk mengisolasi ribosom. Kemudian kami menghancurkan spora yang telah dimurnikan dengan manik-manik kaca dan mengisolasi ribosom kasar menggunakan fraksinasi polietilen glikol bertahap dari lisat. Hal ini memungkinkan kami untuk memperoleh sekitar 300 µg ribosom E. cuniculi mentah untuk analisis struktural.
Kemudian, kami mengumpulkan citra cryo-EM menggunakan sampel ribosom yang dihasilkan dan memproses citra-citra ini menggunakan masker yang sesuai dengan subunit ribosom besar, kepala subunit kecil, dan subunit kecil. Selama proses ini, kami mengumpulkan citra sekitar 108.000 partikel ribosom dan menghitung citra cryo-EM dengan resolusi 2,7 Å (Gambar Tambahan 1-3). Selanjutnya, kami menggunakan citra cryo-EM untuk memodelkan rRNA, protein ribosom, dan faktor hibernasi Mdf1 yang terkait dengan ribosom E. cuniculi (Gambar 1a, b).
a Struktur ribosom E. cuniculi dalam kompleks dengan faktor hibernasi Mdf1 (pdb id 7QEP). b Peta faktor hibernasi Mdf1 yang berasosiasi dengan ribosom E. cuniculi. c Peta struktur sekunder yang membandingkan rRNA yang ditemukan pada spesies Microsporidia dengan struktur ribosom yang diketahui. Panel menunjukkan lokasi fragmen rRNA yang diamplifikasi (ES) dan situs aktif ribosom, termasuk situs dekoding (DC), loop sarcinicin (SRL), dan pusat peptidyl transferase (PTC). d Kepadatan elektron yang sesuai dengan pusat peptidyl transferase ribosom E. cuniculi menunjukkan bahwa situs katalitik ini memiliki struktur yang sama pada parasit E. cuniculi dan inangnya, termasuk H. sapiens. e, f Kepadatan elektron yang sesuai dari pusat dekoding (e) dan struktur skematis dari pusat dekoding (f) menunjukkan bahwa E. cuniculi memiliki residu U1491, bukan A1491 (penomoran E. coli) seperti pada banyak eukariota lainnya. Perubahan ini menunjukkan bahwa E. cuniculi mungkin sensitif terhadap antibiotik yang menargetkan situs aktif ini.
Berbeda dengan struktur ribosom V. necatrix dan P. locustae yang telah ditetapkan sebelumnya (kedua struktur tersebut mewakili famili mikrosporidia Nosematidae yang sama dan sangat mirip satu sama lain), 31,32 ribosom E. cuniculi mengalami banyak proses fragmentasi rRNA dan protein. Denaturasi lebih lanjut (Gambar Tambahan 4-6). Pada rRNA, perubahan yang paling mencolok termasuk hilangnya fragmen rRNA 25S ES12L yang diamplifikasi secara lengkap dan degenerasi parsial heliks h39, h41, dan H18 (Gambar 1c, Gambar Tambahan 4). Di antara protein ribosom, perubahan yang paling mencolok termasuk hilangnya protein eS30 secara lengkap dan pemendekan protein eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17, dan eS7 (Gambar Tambahan 4, 5).
Dengan demikian, pengurangan ekstrem genom spesies Encephalotozoon/Ordospora tercermin dalam struktur ribosomnya: ribosom E. cuniculi mengalami kehilangan kandungan protein paling dramatis di antara ribosom sitoplasma eukariotik yang menjadi subjek karakterisasi struktural, dan bahkan tidak memiliki fragmen rRNA dan protein yang banyak dikonservasi tidak hanya pada eukariota, tetapi juga pada ketiga domain kehidupan. Struktur ribosom E. cuniculi memberikan model molekuler pertama untuk perubahan ini dan mengungkapkan peristiwa evolusi yang telah diabaikan oleh genomik komparatif dan studi struktur biomolekuler intraseluler (Gambar Tambahan 7). Di bawah ini, kami menjelaskan masing-masing peristiwa ini beserta kemungkinan asal evolusinya dan potensi dampaknya pada fungsi ribosom.
Kemudian kami menemukan bahwa, selain pemotongan rRNA yang besar, ribosom E. cuniculi memiliki variasi rRNA pada salah satu situs aktifnya. Meskipun pusat peptidyl transferase ribosom E. cuniculi memiliki struktur yang sama dengan ribosom eukariotik lainnya (Gambar 1d), pusat dekoding berbeda karena variasi sekuens pada nukleotida 1491 (penomoran E. coli, Gambar 1e, f). Pengamatan ini penting karena situs dekoding ribosom eukariotik biasanya mengandung residu G1408 dan A1491 dibandingkan dengan residu tipe bakteri A1408 dan G1491. Variasi ini mendasari perbedaan sensitivitas ribosom bakteri dan eukariotik terhadap keluarga antibiotik ribosom aminoglikosida dan molekul kecil lainnya yang menargetkan situs dekoding. Pada situs dekoding ribosom E. cuniculi, residu A1491 digantikan dengan U1491, yang berpotensi menciptakan antarmuka pengikatan unik untuk molekul kecil yang menargetkan situs aktif ini. Varian A14901 yang sama juga terdapat pada mikrosporidia lain seperti P. locustae dan V. necatrix, menunjukkan bahwa varian ini tersebar luas di antara spesies mikrosporidia (Gambar 1f).
Karena sampel ribosom E. cuniculi kami diisolasi dari spora yang tidak aktif secara metabolik, kami menguji peta cryo-EM E. cuniculi untuk pengikatan ribosom yang telah dijelaskan sebelumnya dalam kondisi stres atau kelaparan. Faktor hibernasi 31,32,36,37, 38. Kami mencocokkan struktur ribosom hibernasi yang telah ditetapkan sebelumnya dengan peta cryo-EM ribosom E. cuniculi. Untuk penambatan, ribosom S. cerevisiae digunakan dalam kompleks dengan faktor hibernasi Stm138, ribosom belalang dalam kompleks dengan faktor Lso232, dan ribosom V. necatrix dalam kompleks dengan faktor Mdf1 dan Mdf231. Pada saat yang sama, kami menemukan kerapatan cryo-EM yang sesuai dengan faktor istirahat Mdf1. Mirip dengan pengikatan Mdf1 pada ribosom V. necatrix, Mdf1 juga berikatan dengan ribosom E. cuniculi, di mana ia memblokir situs E ribosom, kemungkinan membantu menyediakan ribosom ketika spora parasit menjadi tidak aktif secara metabolik setelah inaktivasi tubuh (Gambar 2).
Mdf1 memblokir situs E ribosom, yang tampaknya membantu menonaktifkan ribosom ketika spora parasit menjadi tidak aktif secara metabolik. Dalam struktur ribosom E. cuniculi, kami menemukan bahwa Mdf1 membentuk kontak yang sebelumnya tidak diketahui dengan batang ribosom L1, bagian ribosom yang memfasilitasi pelepasan tRNA yang telah dideasetilasi dari ribosom selama sintesis protein. Kontak-kontak ini menunjukkan bahwa Mdf1 berdisosiasi dari ribosom menggunakan mekanisme yang sama seperti tRNA yang telah dideasetilasi, memberikan penjelasan yang mungkin tentang bagaimana ribosom melepaskan Mdf1 untuk mengaktifkan kembali sintesis protein.
Namun, struktur yang kami peroleh mengungkapkan adanya kontak yang tidak diketahui antara Mdf1 dan kaki ribosom L1 (bagian ribosom yang membantu melepaskan tRNA yang telah dideasetilasi dari ribosom selama sintesis protein). Secara khusus, Mdf1 menggunakan kontak yang sama dengan segmen siku molekul tRNA yang telah dideasetilasi (Gambar 2). Pemodelan molekuler yang sebelumnya tidak diketahui ini menunjukkan bahwa Mdf1 berdisosiasi dari ribosom menggunakan mekanisme yang sama dengan tRNA yang telah dideasetilasi, yang menjelaskan bagaimana ribosom menghilangkan faktor hibernasi ini untuk mengaktifkan kembali sintesis protein.
Saat membangun model rRNA, kami menemukan bahwa ribosom E. cuniculi memiliki fragmen rRNA yang terlipat secara abnormal, yang kami sebut rRNA fusi (Gambar 3). Pada ribosom yang mencakup tiga domain kehidupan, rRNA terlipat menjadi struktur di mana sebagian besar basa rRNA berpasangan dan terlipat satu sama lain atau berinteraksi dengan protein ribosom38,39,40. Namun, pada ribosom E. cuniculi, rRNA tampaknya melanggar prinsip pelipatan ini dengan mengubah beberapa heliksnya menjadi daerah rRNA yang tidak terlipat.
Struktur heliks rRNA H18 25S pada S. cerevisiae, V. necatrix, dan E. cuniculi. Biasanya, pada ribosom yang mencakup tiga domain kehidupan, penghubung ini melingkar menjadi heliks RNA yang mengandung 24 hingga 34 residu. Sebaliknya, pada Microsporidia, penghubung rRNA ini secara bertahap berkurang menjadi dua penghubung kaya uridin beruntai tunggal yang hanya mengandung 12 residu. Sebagian besar residu ini terpapar pelarut. Gambar tersebut menunjukkan bahwa microsporidia parasit tampaknya melanggar prinsip umum pelipatan rRNA, di mana basa rRNA biasanya terhubung dengan basa lain atau terlibat dalam interaksi rRNA-protein. Pada microsporidia, beberapa fragmen rRNA mengambil lipatan yang tidak menguntungkan, di mana heliks rRNA sebelumnya menjadi fragmen beruntai tunggal yang memanjang hampir dalam garis lurus. Kehadiran daerah-daerah yang tidak biasa ini memungkinkan rRNA microsporidia untuk mengikat fragmen rRNA yang jauh menggunakan jumlah basa RNA yang minimal.
Contoh paling mencolok dari transisi evolusi ini dapat diamati pada heliks rRNA 25S H18 (Gambar 3). Pada spesies dari E. coli hingga manusia, basa heliks rRNA ini mengandung 24-32 nukleotida, membentuk heliks yang sedikit tidak beraturan. Pada struktur ribosom yang sebelumnya diidentifikasi dari V. necatrix dan P. locustae,31,32 basa heliks H18 sebagian tidak tergulung, tetapi pasangan basa nukleotida tetap terjaga. Namun, pada E. cuniculi fragmen rRNA ini menjadi linker terpendek 228UUUGU232 dan 301UUUUUUUUU307. Tidak seperti fragmen rRNA tipikal, linker kaya uridin ini tidak menggulung atau melakukan kontak yang luas dengan protein ribosom. Sebaliknya, mereka mengadopsi struktur terbuka pelarut dan sepenuhnya tidak terlipat di mana untai rRNA memanjang hampir lurus. Konformasi yang memanjang ini menjelaskan bagaimana E. cuniculi hanya menggunakan 12 basa RNA untuk mengisi celah 33 Å antara heliks rRNA H16 dan H18, sementara spesies lain membutuhkan setidaknya dua kali lebih banyak basa rRNA untuk mengisi celah tersebut.
Dengan demikian, kita dapat menunjukkan bahwa, melalui pelipatan yang tidak menguntungkan secara energetik, mikrosporidia parasit telah mengembangkan strategi untuk memendekkan bahkan segmen rRNA yang tetap terkonservasi secara luas di berbagai spesies dalam tiga domain kehidupan. Rupanya, dengan mengakumulasi mutasi yang mengubah heliks rRNA menjadi penghubung poli-U pendek, E. cuniculi dapat membentuk fragmen rRNA yang tidak biasa yang mengandung sesedikit mungkin nukleotida untuk ligasi fragmen rRNA distal. Ini membantu menjelaskan bagaimana mikrosporidia mencapai pengurangan dramatis dalam struktur molekul dasarnya tanpa kehilangan integritas struktural dan fungsionalnya.
Fitur tidak biasa lainnya dari rRNA E. cuniculi adalah munculnya rRNA tanpa penebalan (Gambar 4). Tonjolan adalah nukleotida tanpa pasangan basa yang terpelintir keluar dari heliks RNA alih-alih bersembunyi di dalamnya. Sebagian besar tonjolan rRNA bertindak sebagai perekat molekuler, membantu mengikat protein ribosom yang berdekatan atau fragmen rRNA lainnya. Beberapa tonjolan bertindak sebagai engsel, memungkinkan heliks rRNA untuk melentur dan melipat secara optimal untuk sintesis protein yang produktif 41.
a Tonjolan rRNA (penomoran S. cerevisiae) tidak ada pada struktur ribosom E. cuniculi, tetapi ada pada sebagian besar eukariota lainnya. b Ribosom internal E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens, dan E. cuniculi. Parasit kekurangan banyak tonjolan rRNA kuno yang sangat terkonservasi. Penebalan ini menstabilkan struktur ribosom; oleh karena itu, ketidakhadirannya pada mikrosporidia menunjukkan berkurangnya stabilitas pelipatan rRNA pada parasit mikrosporidia. Perbandingan dengan batang P (batang L7/L12 pada bakteri) menunjukkan bahwa hilangnya tonjolan rRNA terkadang bertepatan dengan munculnya tonjolan baru di sebelah tonjolan yang hilang. Helix H42 pada rRNA 23S/28S memiliki tonjolan kuno (U1206 pada Saccharomyces cerevisiae) yang diperkirakan berusia setidaknya 3,5 miliar tahun karena perlindungannya di tiga domain kehidupan. Pada mikrosporidia, tonjolan ini dihilangkan. Namun, tonjolan baru muncul di sebelah tonjolan yang hilang (A1306 pada E. cuniculi).
Menariknya, kami menemukan bahwa ribosom E. cuniculi tidak memiliki sebagian besar tonjolan rRNA yang ditemukan pada spesies lain, termasuk lebih dari 30 tonjolan yang terkonservasi pada eukariota lain (Gambar 4a). Hilangnya tonjolan ini menghilangkan banyak kontak antara subunit ribosom dan heliks rRNA yang berdekatan, terkadang menciptakan rongga besar di dalam ribosom, membuat ribosom E. cuniculi lebih berpori dibandingkan dengan ribosom yang lebih tradisional (Gambar 4b). Perlu dicatat, kami menemukan bahwa sebagian besar tonjolan ini juga hilang pada struktur ribosom V. necatrix dan P. locustae yang telah diidentifikasi sebelumnya, yang terlewatkan oleh analisis struktural sebelumnya31,32.
Terkadang hilangnya tonjolan rRNA disertai dengan perkembangan tonjolan baru di sebelah tonjolan yang hilang. Misalnya, batang P ribosom mengandung tonjolan U1208 (pada Saccharomyces cerevisiae) yang bertahan dari E. coli hingga manusia dan karenanya diperkirakan berusia 3,5 miliar tahun. Selama sintesis protein, tonjolan ini membantu batang P bergerak antara konformasi terbuka dan tertutup sehingga ribosom dapat merekrut faktor translasi dan mengirimkannya ke situs aktif. Pada ribosom E. cuniculi, penebalan ini tidak ada; namun, penebalan baru (G883) yang terletak hanya dalam tiga pasangan basa dapat berkontribusi pada pemulihan fleksibilitas optimal batang P (Gambar 4c).
Data kami tentang rRNA tanpa tonjolan menunjukkan bahwa minimisasi rRNA tidak terbatas pada hilangnya elemen rRNA di permukaan ribosom, tetapi mungkin juga melibatkan inti ribosom, menciptakan cacat molekuler spesifik parasit yang belum pernah dijelaskan pada sel yang hidup bebas.
Setelah memodelkan protein ribosom kanonik dan rRNA, kami menemukan bahwa komponen ribosom konvensional tidak dapat menjelaskan ketiga bagian gambar cryo-EM. Dua fragmen ini berukuran molekul kecil (Gambar 5, Gambar Tambahan 8). Segmen pertama terjepit di antara protein ribosom uL15 dan eL18 pada posisi yang biasanya ditempati oleh ujung C dari eL18, yang dipersingkat pada E. cuniculi. Meskipun kami tidak dapat menentukan identitas molekul ini, ukuran dan bentuk pulau kepadatan ini dijelaskan dengan baik oleh keberadaan molekul spermidin. Pengikatannya ke ribosom distabilkan oleh mutasi spesifik mikrosporidia pada protein uL15 (Asp51 dan Arg56), yang tampaknya meningkatkan afinitas ribosom terhadap molekul kecil ini, karena memungkinkan uL15 untuk membungkus molekul kecil tersebut ke dalam struktur ribosom. (Gambar Tambahan 2). 8, data tambahan 1, 2).
Pencitraan Cryo-EM menunjukkan keberadaan nukleotida di luar ribosa yang terikat pada ribosom E. cuniculi. Pada ribosom E. cuniculi, nukleotida ini menempati tempat yang sama dengan nukleotida 25S rRNA A3186 (penomoran Saccharomyces cerevisiae) pada sebagian besar ribosom eukariotik lainnya. b Dalam struktur ribosom E. cuniculi, nukleotida ini terletak di antara protein ribosom uL9 dan eL20, sehingga menstabilkan kontak antara kedua protein tersebut. cd Analisis konservasi sekuens eL20 di antara spesies mikrosporidia. Pohon filogenetik spesies Mikrosporidia (c) dan penyelarasan sekuens berganda protein eL20 (d) menunjukkan bahwa residu pengikat nukleotida F170 dan K172 dikonservasi pada sebagian besar Mikrosporidia tipikal, kecuali S. lophii, kecuali Mikrosporidia yang bercabang awal, yang mempertahankan ekstensi rRNA ES39L. Gambar ini menunjukkan bahwa residu pengikat nukleotida F170 dan K172 hanya terdapat pada eL20 genom mikrosporidia yang sangat tereduksi, tetapi tidak pada eukariota lain. Secara keseluruhan, data ini menunjukkan bahwa ribosom mikrosporidia telah mengembangkan situs pengikatan nukleotida yang tampaknya mengikat molekul AMP dan menggunakannya untuk menstabilkan interaksi protein-protein dalam struktur ribosom. Konservasi tinggi situs pengikatan ini pada mikrosporidia dan ketidakhadirannya pada eukariota lain menunjukkan bahwa situs ini dapat memberikan keuntungan selektif untuk kelangsungan hidup mikrosporidia. Dengan demikian, kantung pengikatan nukleotida dalam ribosom mikrosporidia tampaknya bukan merupakan fitur degeneratif atau bentuk akhir degradasi rRNA seperti yang dijelaskan sebelumnya, tetapi lebih merupakan inovasi evolusi yang bermanfaat yang memungkinkan ribosom mikrosporidia untuk secara langsung mengikat molekul kecil, menggunakannya sebagai blok bangunan molekuler untuk ribosom. Penemuan ini menjadikan ribosom mikrosporidia satu-satunya ribosom yang diketahui menggunakan satu nukleotida sebagai blok bangunan strukturalnya. f. Jalur evolusi hipotetis yang berasal dari pengikatan nukleotida.
Kepadatan berat molekul rendah kedua terletak pada antarmuka antara protein ribosom uL9 dan eL30 (Gambar 5a). Antarmuka ini sebelumnya telah dijelaskan dalam struktur ribosom Saccharomyces cerevisiae sebagai situs pengikatan untuk nukleotida 25S dari rRNA A3186 (bagian dari ekstensi rRNA ES39L)38. Telah ditunjukkan bahwa pada ribosom P. locustae ES39L yang terdegenerasi, antarmuka ini mengikat nukleotida tunggal yang tidak diketahui 31, dan diasumsikan bahwa nukleotida ini adalah bentuk akhir rRNA yang tereduksi, di mana panjang rRNA adalah ~130-230 basa. ES39L direduksi menjadi nukleotida tunggal 32.43. Gambar cryo-EM kami mendukung gagasan bahwa kepadatan dapat dijelaskan oleh nukleotida. Namun, resolusi yang lebih tinggi dari struktur kami menunjukkan bahwa nukleotida ini adalah molekul ekstraribosom, kemungkinan AMP (Gambar 5a, b).
Kemudian kami menanyakan apakah situs pengikatan nukleotida muncul di ribosom E. cuniculi atau apakah situs tersebut sudah ada sebelumnya. Karena pengikatan nukleotida terutama dimediasi oleh residu Phe170 dan Lys172 dalam protein ribosom eL30, kami menilai konservasi residu ini pada 4396 eukariota representatif. Seperti halnya uL15 di atas, kami menemukan bahwa residu Phe170 dan Lys172 sangat terkonservasi hanya pada Microsporidia tipikal, tetapi tidak ada pada eukariota lain, termasuk Microsporidia atipikal Mitosporidium dan Amphiamblys, di mana fragmen rRNA ES39L tidak tereduksi 44, 45, 46 (Gambar 5c). -e).
Secara keseluruhan, data ini mendukung gagasan bahwa E. cuniculi dan mungkin mikrosporidia kanonik lainnya telah mengembangkan kemampuan untuk secara efisien menangkap sejumlah besar metabolit kecil dalam struktur ribosom untuk mengimbangi penurunan kadar rRNA dan protein. Dengan demikian, mereka telah mengembangkan kemampuan unik untuk mengikat nukleotida di luar ribosom, menunjukkan bahwa struktur molekuler parasit mengkompensasi dengan menangkap metabolit kecil yang melimpah dan menggunakannya sebagai peniru struktural dari fragmen RNA dan protein yang terdegradasi.
Bagian ketiga yang tidak disimulasikan dari peta cryo-EM kami, ditemukan di subunit ribosom besar. Resolusi yang relatif tinggi (2,6 Å) dari peta kami menunjukkan bahwa kerapatan ini termasuk protein dengan kombinasi unik residu rantai samping besar, yang memungkinkan kami untuk mengidentifikasi kerapatan ini sebagai protein ribosom yang sebelumnya tidak dikenal yang kami identifikasi sebagai msL2 (protein spesifik Microsporidia L2) (metode, gambar 6). Pencarian homologi kami menunjukkan bahwa msL2 dikonservasi dalam klad Microsporidia dari genus Encephaliter dan Orosporidium, tetapi tidak ada pada spesies lain, termasuk Microsporidia lainnya. Dalam struktur ribosom, msL2 menempati celah yang terbentuk oleh hilangnya rRNA ES31L yang diperpanjang. Dalam kekosongan ini, msL2 membantu menstabilkan pelipatan rRNA dan dapat mengkompensasi hilangnya ES31L (Gambar 6).
a. Kepadatan elektron dan model protein ribosom spesifik Microsporidia msL2 yang ditemukan dalam ribosom E. cuniculi. b. Sebagian besar ribosom eukariotik, termasuk ribosom 80S dari Saccharomyces cerevisiae, kehilangan amplifikasi rRNA ES19L pada sebagian besar spesies Microsporidia. Struktur ribosom microsporidia V. necatrix yang telah ditetapkan sebelumnya menunjukkan bahwa hilangnya ES19L pada parasit ini dikompensasi oleh evolusi protein ribosom msL1 yang baru. Dalam penelitian ini, kami menemukan bahwa ribosom E. cuniculi juga mengembangkan protein peniru RNA ribosom tambahan sebagai kompensasi nyata atas hilangnya ES19L. Namun, msL2 (saat ini dianotasi sebagai protein hipotetis ECU06_1135) dan msL1 memiliki asal struktural dan evolusi yang berbeda. c. Penemuan generasi protein ribosom msL1 dan msL2 yang secara evolusi tidak terkait ini menunjukkan bahwa jika ribosom mengakumulasi mutasi yang merugikan pada rRNA-nya, mereka dapat mencapai tingkat keragaman komposisi yang belum pernah terjadi sebelumnya bahkan dalam subset kecil spesies yang berkerabat dekat. Penemuan ini dapat membantu memperjelas asal usul dan evolusi ribosom mitokondria, yang dikenal karena rRNA-nya yang sangat berkurang dan variabilitas abnormal dalam komposisi protein di berbagai spesies.
Kemudian, kami membandingkan protein msL2 dengan protein msL1 yang telah dijelaskan sebelumnya, satu-satunya protein ribosom spesifik mikrosporidia yang diketahui ditemukan dalam ribosom V. necatrix. Kami ingin menguji apakah msL1 dan msL2 memiliki hubungan evolusi. Analisis kami menunjukkan bahwa msL1 dan msL2 menempati rongga yang sama dalam struktur ribosom, tetapi memiliki struktur primer dan tersier yang berbeda, yang menunjukkan asal evolusi independen mereka (Gambar 6). Dengan demikian, penemuan msL2 kami memberikan bukti bahwa kelompok spesies eukariotik kompak dapat secara independen mengembangkan protein ribosom yang berbeda secara struktural untuk mengkompensasi hilangnya fragmen rRNA. Temuan ini penting karena sebagian besar ribosom eukariotik sitoplasma mengandung protein invarian, termasuk keluarga protein ribosom yang sama yang berjumlah 81. Kemunculan msL1 dan msL2 dalam berbagai klad mikrosporidia sebagai respons terhadap hilangnya segmen rRNA yang diperpanjang menunjukkan bahwa degradasi arsitektur molekuler parasit menyebabkan parasit mencari mutasi kompensasi, yang pada akhirnya dapat menyebabkan akuisisi struktur tersebut pada populasi parasit yang berbeda.
Akhirnya, ketika model kami selesai, kami membandingkan komposisi ribosom E. cuniculi dengan yang diprediksi dari urutan genom. Beberapa protein ribosom, termasuk eL14, eL38, eL41, dan eS30, sebelumnya dianggap hilang dari genom E. cuniculi karena tidak adanya homolognya dalam genom E. cuniculi. Hilangnya banyak protein ribosom juga diprediksi pada sebagian besar parasit intraseluler dan endosimbion yang sangat tereduksi lainnya. Misalnya, meskipun sebagian besar bakteri yang hidup bebas mengandung famili protein ribosom yang sama sebanyak 54, hanya 11 dari famili protein ini yang memiliki homolog yang terdeteksi di setiap genom bakteri yang terbatas pada inang yang dianalisis. Sebagai pendukung gagasan ini, hilangnya protein ribosom telah diamati secara eksperimental pada mikrosporidia V. necatrix dan P. locustae, yang kekurangan protein eL38 dan eL4131,32.
Namun, struktur kami menunjukkan bahwa hanya eL38, eL41, dan eS30 yang benar-benar hilang dalam ribosom E. cuniculi. Protein eL14 terkonservasi dan struktur kami menunjukkan mengapa protein ini tidak dapat ditemukan dalam pencarian homologi (Gambar 7). Dalam ribosom E. cuniculi, sebagian besar situs pengikatan eL14 hilang karena degradasi ES39L yang diamplifikasi rRNA. Tanpa ES39L, eL14 kehilangan sebagian besar struktur sekundernya, dan hanya 18% dari sekuens eL14 yang identik di E. cuniculi dan S. cerevisiae. Pelestarian sekuens yang buruk ini sangat luar biasa karena bahkan Saccharomyces cerevisiae dan Homo sapiens—organisme yang berevolusi terpisah selama 1,5 miliar tahun—memiliki lebih dari 51% residu yang sama dalam eL14. Hilangnya konservasi yang anomali ini menjelaskan mengapa E. cuniculi eL14 saat ini diberi anotasi sebagai protein M970_061160 dan bukan sebagai protein ribosom eL1427.
Ribosom Microsporidia kehilangan ekstensi rRNA ES39L, yang sebagian menghilangkan situs pengikatan protein ribosom eL14. Tanpa ES39L, protein mikrospora eL14 mengalami kehilangan struktur sekunder, di mana heliks α pengikat rRNA sebelumnya berubah menjadi loop dengan panjang minimal. b Penyelarasan sekuens berganda menunjukkan bahwa protein eL14 sangat terkonservasi pada spesies eukariotik (identitas sekuens 57% antara homolog ragi dan manusia), tetapi kurang terkonservasi dan berbeda pada mikrosporidia (di mana tidak lebih dari 24% residu identik dengan homolog eL14). dari S. cerevisiae atau H. sapiens). Konservasi sekuens yang buruk dan variabilitas struktur sekunder ini menjelaskan mengapa homolog eL14 tidak pernah ditemukan di E. cuniculi dan mengapa protein ini dianggap telah hilang di E. cuniculi. Sebaliknya, E. cuniculi eL14 sebelumnya dianotasi sebagai protein M970_061160 hipotetis. Pengamatan ini menunjukkan bahwa keragaman genom mikrosporidia saat ini dilebih-lebihkan: beberapa gen yang saat ini dianggap hilang pada mikrosporidia sebenarnya terpelihara, meskipun dalam bentuk yang sangat berbeda; sebaliknya, beberapa gen yang dianggap mengkode protein spesifik cacing (misalnya, protein hipotetis M970_061160) sebenarnya mengkode protein yang sangat beragam yang ditemukan pada eukariota lain.
Temuan ini menunjukkan bahwa denaturasi rRNA dapat menyebabkan hilangnya konservasi sekuens secara drastis pada protein ribosom yang berdekatan, sehingga protein-protein ini tidak terdeteksi dalam pencarian homologi. Dengan demikian, kita mungkin melebih-lebihkan tingkat degradasi molekuler yang sebenarnya pada organisme dengan genom kecil, karena beberapa protein yang dianggap hilang sebenarnya tetap ada, meskipun dalam bentuk yang sangat berubah.
Bagaimana parasit dapat mempertahankan fungsi mesin molekulernya dalam kondisi pengurangan genom yang ekstrem? Studi kami menjawab pertanyaan ini dengan mendeskripsikan struktur molekuler kompleks (ribosom) dari E. cuniculi, organisme dengan salah satu genom eukariotik terkecil.
Telah diketahui selama hampir dua dekade bahwa molekul protein dan RNA pada parasit mikroba seringkali berbeda dari molekul homolognya pada spesies yang hidup bebas karena kurangnya pusat kontrol kualitas, ukurannya berkurang hingga 50% dari ukuran pada mikroba yang hidup bebas, dan banyak mutasi yang melemahkan yang mengganggu pelipatan dan fungsi. Misalnya, ribosom organisme bergenom kecil, termasuk banyak parasit intraseluler dan endosimbion, diperkirakan kekurangan beberapa protein ribosom dan hingga sepertiga nukleotida rRNA dibandingkan dengan spesies yang hidup bebas 27, 29, 30, 49. Namun, cara kerja molekul-molekul ini pada parasit sebagian besar masih menjadi misteri, yang dipelajari terutama melalui genomika komparatif.
Studi kami menunjukkan bahwa struktur makromolekul dapat mengungkapkan banyak aspek evolusi yang sulit diekstrak dari studi genomik komparatif tradisional parasit intraseluler dan organisme lain yang terbatas pada inang (Gambar Tambahan 7). Misalnya, contoh protein eL14 menunjukkan bahwa kita dapat melebih-lebihkan tingkat degradasi sebenarnya dari aparatus molekuler pada spesies parasit. Parasit ensefalitis sekarang diyakini memiliki ratusan gen spesifik mikrosporidia. Namun, hasil kami menunjukkan bahwa beberapa gen yang tampaknya spesifik ini sebenarnya hanyalah varian yang sangat berbeda dari gen yang umum pada eukariota lain. Selain itu, contoh protein msL2 menunjukkan bagaimana kita mengabaikan protein ribosom baru dan meremehkan kandungan mesin molekuler parasit. Contoh molekul kecil menunjukkan bagaimana kita dapat mengabaikan inovasi paling cerdik dalam struktur molekuler parasit yang dapat memberi mereka aktivitas biologis baru.
Secara keseluruhan, hasil-hasil ini meningkatkan pemahaman kita tentang perbedaan antara struktur molekuler organisme yang terbatas pada inang dan organisme yang hidup bebas. Kami menunjukkan bahwa mesin molekuler, yang selama ini dianggap tereduksi, mengalami degenerasi, dan rentan terhadap berbagai mutasi yang melemahkan, justru memiliki serangkaian fitur struktural yang tidak biasa dan selama ini diabaikan.
Di sisi lain, fragmen rRNA non-bulky dan fragmen fusi yang kami temukan di ribosom E. cuniculi menunjukkan bahwa pengurangan genom dapat mengubah bahkan bagian-bagian dari mesin molekuler dasar yang dilestarikan dalam tiga domain kehidupan – setelah hampir 3,5 miliar tahun evolusi spesies secara independen.
Fragmen rRNA bebas tonjolan dan menyatu dalam ribosom E. cuniculi sangat menarik mengingat studi sebelumnya tentang molekul RNA pada bakteri endosimbion. Misalnya, pada endosimbion kutu daun Buchnera aphidicola, molekul rRNA dan tRNA telah terbukti memiliki struktur yang sensitif terhadap suhu karena bias komposisi A+T dan proporsi pasangan basa non-kanonik yang tinggi20,50. Perubahan pada RNA ini, serta perubahan pada molekul protein, sekarang dianggap bertanggung jawab atas ketergantungan endosimbion yang berlebihan pada mitra dan ketidakmampuan endosimbion untuk mentransfer panas 21, 23. Meskipun rRNA mikrosporidia parasit memiliki perubahan struktural yang berbeda, sifat perubahan ini menunjukkan bahwa stabilitas termal yang berkurang dan ketergantungan yang lebih tinggi pada protein chaperone mungkin merupakan ciri umum molekul RNA pada organisme dengan genom yang berkurang.
Di sisi lain, struktur kami menunjukkan bahwa mikrosporidia parasit telah mengembangkan kemampuan unik untuk melawan fragmen rRNA dan protein yang terkonservasi secara luas, mengembangkan kemampuan untuk menggunakan metabolit kecil yang melimpah dan mudah didapat sebagai peniru struktural dari fragmen rRNA dan protein yang mengalami degenerasi. Degradasi struktur molekuler. Pendapat ini didukung oleh fakta bahwa molekul kecil yang mengkompensasi hilangnya fragmen protein dalam rRNA dan ribosom E. cuniculi berikatan dengan residu spesifik mikrosporidia dalam protein uL15 dan eL30. Ini menunjukkan bahwa pengikatan molekul kecil ke ribosom mungkin merupakan produk seleksi positif, di mana mutasi spesifik mikrosporidia dalam protein ribosom telah dipilih karena kemampuannya untuk meningkatkan afinitas ribosom terhadap molekul kecil, yang dapat menyebabkan organisme ribosom yang lebih efisien. Penemuan ini mengungkapkan inovasi cerdas dalam struktur molekuler parasit mikroba dan memberi kita pemahaman yang lebih baik tentang bagaimana struktur molekuler parasit mempertahankan fungsinya meskipun terjadi evolusi reduktif.
Saat ini, identifikasi molekul-molekul kecil ini masih belum jelas. Belum jelas mengapa kemunculan molekul-molekul kecil ini dalam struktur ribosom berbeda antar spesies mikrosporidia. Secara khusus, belum jelas mengapa pengikatan nukleotida diamati pada ribosom E. cuniculi dan P. locustae, dan tidak pada ribosom V. necatrix, meskipun terdapat residu F170 pada protein eL20 dan K172 dari V. necatrix. Penghapusan ini mungkin disebabkan oleh residu 43 uL6 (terletak berdekatan dengan kantung pengikatan nukleotida), yang merupakan tirosin pada V. necatrix dan bukan treonin pada E. cuniculi dan P. locustae. Rantai samping aromatik Tyr43 yang besar dapat mengganggu pengikatan nukleotida karena tumpang tindih sterik. Atau, penghapusan nukleotida yang tampak mungkin disebabkan oleh resolusi rendah pencitraan cryo-EM, yang menghambat pemodelan fragmen ribosom V. necatrix.
Di sisi lain, penelitian kami menunjukkan bahwa proses peluruhan genom mungkin merupakan kekuatan inventif. Secara khusus, struktur ribosom E. cuniculi menunjukkan bahwa hilangnya fragmen rRNA dan protein dalam ribosom mikrosporidia menciptakan tekanan evolusi yang mendorong perubahan struktur ribosom. Varian ini terjadi jauh dari situs aktif ribosom dan tampaknya membantu mempertahankan (atau memulihkan) perakitan ribosom optimal yang seharusnya terganggu oleh pengurangan rRNA. Hal ini menunjukkan bahwa inovasi utama ribosom mikrosporidia tampaknya telah berevolusi menjadi kebutuhan untuk menahan pergeseran gen.
Mungkin hal ini paling baik diilustrasikan oleh pengikatan nukleotida, yang belum pernah diamati pada organisme lain sejauh ini. Fakta bahwa residu pengikat nukleotida hadir pada mikrosporidia tipikal, tetapi tidak pada eukariota lain, menunjukkan bahwa situs pengikatan nukleotida bukanlah sekadar peninggalan yang menunggu untuk menghilang, atau situs terakhir bagi rRNA untuk dikembalikan ke bentuk nukleotida individual. Sebaliknya, situs ini tampaknya merupakan fitur yang berguna yang mungkin telah berevolusi selama beberapa putaran seleksi positif. Situs pengikatan nukleotida mungkin merupakan produk sampingan dari seleksi alam: setelah ES39L terdegradasi, mikrosporidia dipaksa untuk mencari kompensasi untuk mengembalikan biogenesis ribosom yang optimal tanpa adanya ES39L. Karena nukleotida ini dapat meniru kontak molekuler nukleotida A3186 dalam ES39L, molekul nukleotida menjadi blok pembangun ribosom, yang pengikatannya lebih ditingkatkan oleh mutasi urutan eL30.
Berkaitan dengan evolusi molekuler parasit intraseluler, penelitian kami menunjukkan bahwa kekuatan seleksi alam Darwin dan hanyutan genetik dari kerusakan genom tidak beroperasi secara paralel, tetapi berosilasi. Pertama, hanyutan genetik menghilangkan fitur-fitur penting dari biomolekul, sehingga kompensasi sangat dibutuhkan. Hanya ketika parasit memenuhi kebutuhan ini melalui seleksi alam Darwin, makromolekul mereka akan memiliki kesempatan untuk mengembangkan sifat-sifatnya yang paling mengesankan dan inovatif. Yang penting, evolusi situs pengikatan nukleotida dalam ribosom E. cuniculi menunjukkan bahwa pola evolusi molekuler dari kehilangan menjadi keuntungan ini tidak hanya mengurangi mutasi yang merugikan, tetapi terkadang memberikan fungsi yang sama sekali baru pada makromolekul parasit.
Ide ini konsisten dengan teori keseimbangan bergerak Sewell Wright, yang menyatakan bahwa sistem seleksi alam yang ketat membatasi kemampuan organisme untuk berinovasi51,52,53. Namun, jika hanyutan genetik mengganggu seleksi alam, hanyutan ini dapat menghasilkan perubahan yang tidak adaptif (atau bahkan merugikan) tetapi mengarah pada perubahan lebih lanjut yang memberikan kebugaran yang lebih tinggi atau aktivitas biologis baru. Kerangka kerja kami mendukung ide ini dengan menggambarkan bahwa jenis mutasi yang sama yang mengurangi lipatan dan fungsi biomolekul tampaknya menjadi pemicu utama untuk peningkatannya. Sejalan dengan model evolusi saling menguntungkan, studi kami menunjukkan bahwa peluruhan genom, yang secara tradisional dipandang sebagai proses degeneratif, juga merupakan pendorong utama inovasi, kadang-kadang dan mungkin bahkan sering memungkinkan makromolekul untuk memperoleh aktivitas parasit baru.