Terima kasih kerana melayari Nature.com. Versi pelayar yang anda gunakan mempunyai sokongan CSS yang terhad. Untuk pengalaman terbaik, kami mengesyorkan agar anda menggunakan pelayar yang dikemas kini (atau melumpuhkan Mod Keserasian dalam Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan sokongan berterusan, kami akan memaparkan laman web tanpa gaya dan JavaScript.
Evolusi parasit mikrob melibatkan penentangan antara pemilihan semula jadi, yang menyebabkan parasit bertambah baik, dan hanyutan genetik, yang menyebabkan parasit kehilangan gen dan mengumpul mutasi yang merosakkan. Di sini, untuk memahami bagaimana penentangan ini berlaku pada skala makromolekul tunggal, kami menerangkan struktur krio-EM ribosom Encephalitozoon cuniculi, organisma eukariotik dengan salah satu genom terkecil dalam alam semula jadi. Pengurangan rRNA yang melampau dalam ribosom E. cuniculi disertai dengan perubahan struktur yang belum pernah terjadi sebelumnya, seperti evolusi penghubung rRNA terlakur yang sebelum ini tidak diketahui dan rRNA tanpa bonjolan. Di samping itu, ribosom E. cuniculi terselamat daripada kehilangan serpihan dan protein rRNA dengan membangunkan keupayaan untuk menggunakan molekul kecil sebagai tiruan struktur serpihan dan protein rRNA yang terdegradasi. Secara keseluruhan, kami menunjukkan bahawa struktur molekul yang lama dianggap berkurangan, merosot, dan tertakluk kepada mutasi yang melemahkan mempunyai beberapa mekanisme pampasan yang memastikan ia aktif walaupun terdapat pengecutan molekul yang melampau.
Oleh kerana kebanyakan kumpulan parasit mikrob mempunyai alat molekul unik untuk mengeksploitasi perumah mereka, kita sering perlu membangunkan terapeutik yang berbeza untuk kumpulan parasit yang berbeza1,2. Walau bagaimanapun, bukti baharu menunjukkan bahawa beberapa aspek evolusi parasit adalah konvergen dan sebahagian besarnya boleh diramal, menunjukkan asas yang berpotensi untuk intervensi terapeutik yang luas dalam parasit mikrob3,4,5,6,7,8,9.
Kerja-kerja terdahulu telah mengenal pasti trend evolusi biasa dalam parasit mikrob yang dipanggil pengurangan genom atau pereputan genom10,11,12,13. Kajian semasa menunjukkan bahawa apabila mikroorganisma melepaskan gaya hidup bebas mereka dan menjadi parasit intraselular (atau endosimbion), genom mereka mengalami metamorfosis yang perlahan tetapi menakjubkan selama berjuta-juta tahun9,11. Dalam proses yang dikenali sebagai pereputan genom, parasit mikrob mengumpul mutasi yang merosakkan yang menukarkan banyak gen yang sebelum ini penting kepada pseudogen, yang membawa kepada kehilangan gen secara beransur-ansur dan keruntuhan mutasi14,15. Keruntuhan ini boleh memusnahkan sehingga 95% gen dalam organisma intraselular tertua berbanding spesies hidup bebas yang berkait rapat. Oleh itu, evolusi parasit intraselular adalah tarikan antara dua kuasa yang bertentangan: pemilihan semula jadi Darwin, yang membawa kepada peningkatan parasit, dan keruntuhan genom, yang menyebabkan parasit dilupakan. Bagaimana parasit berjaya muncul daripada tarikan ini dan mengekalkan aktiviti struktur molekulnya masih tidak jelas.
Walaupun mekanisme pereputan genom tidak difahami sepenuhnya, ia nampaknya berlaku terutamanya disebabkan oleh hanyutan genetik yang kerap. Oleh kerana parasit hidup dalam populasi yang kecil, aseksual dan terhad secara genetik, ia tidak dapat menghapuskan mutasi berbahaya yang kadangkala berlaku semasa replikasi DNA secara berkesan. Ini membawa kepada pengumpulan mutasi berbahaya yang tidak dapat dipulihkan dan pengurangan genom parasit. Akibatnya, parasit bukan sahaja kehilangan gen yang tidak lagi diperlukan untuk kelangsungan hidupnya dalam persekitaran intrasel. Ketidakupayaan populasi parasit untuk menghapuskan mutasi berbahaya sporadis secara berkesan yang menyebabkan mutasi ini terkumpul di seluruh genom, termasuk gen mereka yang paling penting.
Kebanyakan pemahaman kita sekarang tentang pengurangan genom adalah berdasarkan semata-mata perbandingan jujukan genom, dengan kurang perhatian kepada perubahan dalam molekul sebenar yang melaksanakan fungsi pengemasan dan berfungsi sebagai sasaran ubat yang berpotensi. Kajian perbandingan telah menunjukkan bahawa beban mutasi mikrob intraselular yang merosakkan nampaknya mempengaruhi protein dan asid nukleik untuk tersalah lipatan dan agregat, menjadikannya lebih bergantung kepada pendamping dan hipersensitif terhadap haba19,20,21,22,23. Di samping itu, pelbagai parasit—evolusi bebas yang kadangkala dipisahkan sehingga 2.5 bilion tahun—mengalami kehilangan pusat kawalan kualiti yang serupa dalam sintesis protein5,6 dan mekanisme pembaikan DNA24. Walau bagaimanapun, sedikit yang diketahui tentang kesan gaya hidup intraselular terhadap semua sifat makromolekul selular yang lain, termasuk penyesuaian molekul kepada beban mutasi yang merosakkan yang semakin meningkat.
Dalam kajian ini, untuk lebih memahami evolusi protein dan asid nukleik mikroorganisma intraselular, kami menentukan struktur ribosom parasit intraselular Encephalitozoon cuniculi. E. cuniculi ialah organisma seperti kulat yang tergolong dalam sekumpulan mikrosporidia parasit yang mempunyai genom eukariotik yang luar biasa kecil dan oleh itu digunakan sebagai organisma model untuk mengkaji pereputan genom25,26,27,28,29,30. Baru-baru ini, struktur ribosom krio-EM telah ditentukan untuk genom Microsporidia, Paranosema locustae, dan Vairimorpha necatrix31,32 (genom ~3.2 Mb). Struktur ini menunjukkan bahawa sebahagian kehilangan amplifikasi rRNA dikompensasikan oleh perkembangan hubungan baharu antara protein ribosom bersebelahan atau pemerolehan protein ribosom msL131,32 baharu. Spesies Encephalitozoon (genom ~2.5 juta bp), bersama-sama dengan saudara terdekat mereka Ordospora, menunjukkan tahap pengurangan genom muktamad dalam eukariota – mereka mempunyai kurang daripada 2000 gen pengekod protein, dan dijangkakan bahawa ribosom mereka bukan sahaja tidak mempunyai serpihan pengembangan rRNA (serpihan rRNA yang membezakan ribosom eukariotik daripada ribosom bakteria) juga mempunyai empat protein ribosom kerana kekurangan homolog dalam genom E. cuniculi26,27,28. Oleh itu, kami menyimpulkan bahawa ribosom E. cuniculi boleh mendedahkan strategi yang sebelum ini tidak diketahui untuk penyesuaian molekul kepada pereputan genom.
Struktur krio-EM kami mewakili ribosom sitoplasma eukariotik terkecil yang akan dicirikan dan memberikan gambaran tentang bagaimana tahap pengurangan genom yang muktamad mempengaruhi struktur, pemasangan dan evolusi jentera molekul yang penting untuk sel. Kami mendapati bahawa ribosom E. cuniculi melanggar banyak prinsip lipatan RNA dan pemasangan ribosom yang dipelihara secara meluas, dan menemui protein ribosom baharu yang sebelum ini tidak diketahui. Secara tidak dijangka, kami menunjukkan bahawa ribosom mikrosporidia telah mengembangkan keupayaan untuk mengikat molekul kecil, dan membuat hipotesis bahawa pemotongan dalam rRNA dan protein mencetuskan inovasi evolusi yang akhirnya boleh memberikan kualiti berguna pada ribosom.
Untuk meningkatkan pemahaman kami tentang evolusi protein dan asid nukleik dalam organisma intraselular, kami memutuskan untuk mengasingkan spora E. cuniculi daripada kultur sel mamalia yang dijangkiti untuk menulenkan ribosomnya dan menentukan struktur ribosom ini. Sukar untuk mendapatkan sejumlah besar mikrosporidia parasit kerana mikrosporidia tidak boleh dikultur dalam medium nutrien. Sebaliknya, ia hanya tumbuh dan membiak di dalam sel perumah. Oleh itu, untuk mendapatkan biojisim E. cuniculi untuk penulenan ribosom, kami menjangkiti sel buah pinggang mamalia RK13 dengan spora E. cuniculi dan mengkultur sel-sel yang dijangkiti ini selama beberapa minggu untuk membolehkan E. cuniculi tumbuh dan membiak. Menggunakan lapisan tunggal sel yang dijangkiti seluas kira-kira setengah meter persegi, kami dapat menulenkan kira-kira 300 mg spora Microsporidia dan menggunakannya untuk mengasingkan ribosom. Kemudian kami mengganggu spora yang telah ditulenkan dengan manik kaca dan mengasingkan ribosom mentah menggunakan pecahan polietilena glikol langkah demi langkah bagi lisat. Ini membolehkan kami memperoleh kira-kira 300 µg ribosom E. cuniculi mentah untuk analisis struktur.
Kemudian, kami mengumpul imej krio-EM menggunakan sampel ribosom yang terhasil dan memproses imej-imej ini menggunakan topeng yang sepadan dengan subunit ribosom besar, kepala subunit kecil, dan subunit kecil. Semasa proses ini, kami mengumpul imej kira-kira 108,000 zarah ribosom dan mengira imej krio-EM dengan resolusi 2.7 Å (Rajah Tambahan 1-3). Kemudian, kami menggunakan imej krioEM untuk memodelkan rRNA, protein ribosom, dan faktor hibernasi Mdf1 yang dikaitkan dengan ribosom E. cuniculi (Rajah 1a, b).
a Struktur ribosom E. cuniculi dalam kompleks dengan faktor hibernasi Mdf1 (pdb id 7QEP). b Peta faktor hibernasi Mdf1 yang dikaitkan dengan ribosom E. cuniculi. c Peta struktur sekunder yang membandingkan rRNA yang dipulihkan dalam spesies Mikrosporidian dengan struktur ribosom yang diketahui. Panel menunjukkan lokasi serpihan rRNA (ES) yang diperkuat dan tapak aktif ribosom, termasuk tapak penyahkodan (DC), gelung sarcinicin (SRL), dan pusat transferase peptidil (PTC). d Ketumpatan elektron yang sepadan dengan pusat transferase peptidil ribosom E. cuniculi menunjukkan bahawa tapak pemangkin ini mempunyai struktur yang sama dalam parasit E. cuniculi dan perumahnya, termasuk H. sapiens. e, f Ketumpatan elektron yang sepadan bagi pusat penyahkodan (e) dan struktur skematik pusat penyahkodan (f) menunjukkan bahawa E. cuniculi mempunyai residu U1491 dan bukannya A1491 (penomboran E. coli) dalam banyak eukariot lain. Perubahan ini menunjukkan bahawa E. cuniculi mungkin sensitif terhadap antibiotik yang menyasarkan tapak aktif ini.
Berbeza dengan struktur ribosom V. necatrix dan P. locustae yang telah ditetapkan sebelum ini (kedua-dua struktur mewakili keluarga mikrosporidia yang sama Nosematidae dan sangat serupa antara satu sama lain), 31,32 ribosom E. cuniculi menjalani pelbagai proses rRNA dan pemecahan protein. Denaturasi selanjutnya (Rajah Tambahan 4-6). Dalam rRNA, perubahan yang paling ketara termasuk kehilangan lengkap serpihan rRNA 25S ES12L yang diperkuat dan degenerasi separa heliks h39, h41, dan H18 (Rajah 1c, Rajah Tambahan 4). Antara protein ribosom, perubahan yang paling ketara termasuk kehilangan lengkap protein eS30 dan pemendekan protein eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17, dan eS7 (Rajah Tambahan 4, 5).
Oleh itu, pengurangan genom spesies Encephalotozoon/Ordospora yang ekstrem tercermin dalam struktur ribosomnya: ribosom E. cuniculi mengalami kehilangan kandungan protein yang paling dramatik dalam ribosom sitoplasma eukariotik yang tertakluk kepada pencirian struktur, dan ia tidak mempunyai rRNA dan serpihan protein yang dipelihara secara meluas bukan sahaja dalam eukariota, tetapi juga dalam tiga domain kehidupan. Struktur ribosom E. cuniculi menyediakan model molekul pertama untuk perubahan ini dan mendedahkan peristiwa evolusi yang telah diabaikan oleh kedua-dua genomik perbandingan dan kajian struktur biomolekul intraselular (Rajah Tambahan 7). Di bawah, kami menerangkan setiap peristiwa ini bersama-sama dengan kemungkinan asal usul evolusi dan potensi kesannya terhadap fungsi ribosom.
Kami kemudian mendapati bahawa, selain pemotongan rRNA yang besar, ribosom E. cuniculi mempunyai variasi rRNA di salah satu tapak aktifnya. Walaupun pusat transferase peptidil ribosom E. cuniculi mempunyai struktur yang sama seperti ribosom eukariotik lain (Rajah 1d), pusat penyahkodan berbeza disebabkan oleh variasi jujukan pada nukleotida 1491 (penomboran E. coli, Rajah 1e, f). Pemerhatian ini penting kerana tapak penyahkodan ribosom eukariotik biasanya mengandungi residu G1408 dan A1491 berbanding residu jenis bakteria A1408 dan G1491. Variasi ini mendasari kepekaan ribosom bakteria dan eukariotik yang berbeza terhadap keluarga aminoglikosida antibiotik ribosom dan molekul kecil lain yang menyasarkan tapak penyahkodan. Di tapak penyahkodan ribosom E. cuniculi, residu A1491 digantikan dengan U1491, berpotensi mewujudkan antara muka pengikatan unik untuk molekul kecil yang menyasarkan tapak aktif ini. Varian A14901 yang sama juga terdapat dalam mikrosporidia lain seperti P. locustae dan V. necatrix, menunjukkan bahawa ia tersebar luas di kalangan spesies mikrosporidia (Rajah 1f).
Oleh kerana sampel ribosom E. cuniculi kami diasingkan daripada spora yang tidak aktif secara metabolik, kami menguji peta krio-EM E. cuniculi untuk pengikatan ribosom yang diterangkan sebelum ini di bawah keadaan tekanan atau kebuluran. Faktor hibernasi 31,32,36,37, 38. Kami memadankan struktur ribosom hibernasi yang telah ditetapkan sebelum ini dengan peta krio-EM ribosom E. cuniculi. Untuk dok, ribosom S. cerevisiae digunakan secara kompleks dengan faktor hibernasi Stm138, ribosom belalang dalam kompleks dengan faktor Lso232, dan ribosom V. necatrix dalam kompleks dengan faktor Mdf1 dan Mdf231. Pada masa yang sama, kami mendapati ketumpatan krio-EM sepadan dengan faktor rehat Mdf1. Sama seperti Mdf1 yang mengikat pada ribosom V. necatrix, Mdf1 juga mengikat pada ribosom E. cuniculi, di mana ia menyekat tapak E ribosom, mungkin membantu menyediakan ribosom apabila spora parasit menjadi tidak aktif secara metabolik apabila badan dinyahaktifkan (Rajah 2).
Mdf1 menyekat tapak E ribosom, yang nampaknya membantu menyahaktifkan ribosom apabila spora parasit menjadi tidak aktif secara metabolik. Dalam struktur ribosom E. cuniculi, kami mendapati bahawa Mdf1 membentuk sentuhan yang sebelum ini tidak diketahui dengan batang ribosom L1, bahagian ribosom yang memudahkan pembebasan tRNA terdeasilasi daripada ribosom semasa sintesis protein. Sentuhan ini menunjukkan bahawa Mdf1 berpisah daripada ribosom menggunakan mekanisme yang sama seperti tRNA terdeasetilasi, memberikan penjelasan yang mungkin tentang bagaimana ribosom menyingkirkan Mdf1 untuk mengaktifkan semula sintesis protein.
Walau bagaimanapun, struktur kami mendedahkan sentuhan yang tidak diketahui antara Mdf1 dan kaki ribosom L1 (bahagian ribosom yang membantu melepaskan tRNA terdeasilasi daripada ribosom semasa sintesis protein). Khususnya, Mdf1 menggunakan sentuhan yang sama seperti segmen siku molekul tRNA terdeasilasi (Rajah 2). Pemodelan molekul yang sebelum ini tidak diketahui ini menunjukkan bahawa Mdf1 bercerai daripada ribosom menggunakan mekanisme yang sama seperti tRNA terdeasetilasi, yang menjelaskan bagaimana ribosom menyingkirkan faktor hibernasi ini untuk mengaktifkan semula sintesis protein.
Semasa membina model rRNA, kami mendapati bahawa ribosom E. cuniculi mempunyai serpihan rRNA yang terlipat secara tidak normal, yang kami panggil rRNA yang terlakur (Rajah 3). Dalam ribosom yang merangkumi tiga domain kehidupan, rRNA melipat menjadi struktur di mana kebanyakan bes rRNA sama ada berpasangan dan melipat antara satu sama lain atau berinteraksi dengan protein ribosom38,39,40. Walau bagaimanapun, dalam ribosom E. cuniculi, rRNA nampaknya melanggar prinsip lipatan ini dengan menukarkan beberapa heliksnya menjadi kawasan rRNA yang tidak terlipat.
Struktur heliks rRNA H18 25S dalam S. cerevisiae, V. necatrix, dan E. cuniculi. Biasanya, dalam ribosom yang merangkumi tiga domain kehidupan, penghubung ini bergelung menjadi heliks RNA yang mengandungi 24 hingga 34 residu. Sebaliknya, dalam Microsporidia, penghubung rRNA ini secara beransur-ansur dikurangkan kepada dua penghubung kaya uridin untai tunggal yang hanya mengandungi 12 residu. Kebanyakan residu ini terdedah kepada pelarut. Rajah menunjukkan bahawa mikrosporidia parasit nampaknya melanggar prinsip umum lipatan rRNA, di mana bes rRNA biasanya digandingkan dengan bes lain atau terlibat dalam interaksi rRNA-protein. Dalam mikrosporidia, beberapa serpihan rRNA mengambil lipatan yang tidak menguntungkan, di mana heliks rRNA sebelumnya menjadi serpihan untai tunggal yang memanjang hampir dalam garis lurus. Kehadiran kawasan luar biasa ini membolehkan rRNA mikrosporidia mengikat serpihan rRNA yang jauh menggunakan bilangan bes RNA yang minimum.
Contoh paling menarik bagi peralihan evolusi ini boleh diperhatikan dalam heliks rRNA H18 25S (Rajah 3). Dalam spesies daripada E. coli kepada manusia, bes heliks rRNA ini mengandungi 24-32 nukleotida, membentuk heliks yang sedikit tidak sekata. Dalam struktur ribosom yang dikenal pasti sebelum ini daripada V. necatrix dan P. locustae,31,32, bes heliks H18 sebahagiannya tidak bergelung, tetapi pasangan bes nukleotida dikekalkan. Walau bagaimanapun, dalam E. cuniculi, serpihan rRNA ini menjadi penghubung terpendek 228UUUUGU232 dan 301UUUUUUUUUU307. Tidak seperti serpihan rRNA biasa, penghubung kaya uridin ini tidak bergelung atau membuat sentuhan meluas dengan protein ribosom. Sebaliknya, ia menggunakan struktur terbuka pelarut dan tidak berlipat sepenuhnya di mana untaian rRNA dipanjangkan hampir lurus. Konformasi yang diregangkan ini menjelaskan bagaimana E. cuniculi hanya menggunakan 12 bes RNA untuk mengisi jurang 33 Å antara heliks rRNA H16 dan H18, manakala spesies lain memerlukan sekurang-kurangnya dua kali ganda bes rRNA untuk mengisi jurang tersebut.
Oleh itu, kita dapat menunjukkan bahawa, melalui lipatan yang tidak menguntungkan secara energetik, mikrosporidia parasit telah mengembangkan strategi untuk mengecutkan walaupun segmen rRNA yang kekal terpelihara secara meluas merentasi spesies dalam tiga domain kehidupan. Nampaknya, dengan mengumpul mutasi yang mengubah heliks rRNA menjadi penghubung poli-U pendek, E. cuniculi boleh membentuk serpihan rRNA yang luar biasa yang mengandungi sesedikit mungkin nukleotida untuk ligasi serpihan rRNA distal. Ini membantu menjelaskan bagaimana mikrosporidia mencapai pengurangan dramatik dalam struktur molekul asasnya tanpa kehilangan integriti struktur dan fungsinya.
Satu lagi ciri luar biasa rRNA E. cuniculi ialah penampilan rRNA tanpa penebalan (Rajah 4). Bonjolan ialah nukleotida tanpa pasangan bes yang berpusing keluar dari heliks RNA dan bukannya bersembunyi di dalamnya. Kebanyakan penonjolan rRNA bertindak sebagai pelekat molekul, membantu mengikat protein ribosom bersebelahan atau serpihan rRNA lain. Sebahagian daripada bonjolan bertindak sebagai engsel, membolehkan heliks rRNA melentur dan melipat secara optimum untuk sintesis protein yang produktif 41.
a Penonjolan rRNA (penomboran S. cerevisiae) tiada dalam struktur ribosom E. cuniculi, tetapi terdapat dalam kebanyakan eukariot lain b. E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens dan ribosom dalaman E. cuniculi. Parasit kekurangan banyak bonjolan rRNA purba yang sangat terpelihara. Penebalan ini menstabilkan struktur ribosom; oleh itu, ketiadaannya dalam mikrosporidia menunjukkan kestabilan lipatan rRNA yang berkurangan dalam parasit mikrosporidia. Perbandingan dengan batang P (batang L7/L12 dalam bakteria) menunjukkan bahawa kehilangan bonjolan rRNA kadangkala bertepatan dengan kemunculan bonjolan baharu di sebelah bonjolan yang hilang. Heliks H42 dalam rRNA 23S/28S mempunyai bonjolan purba (U1206 dalam Saccharomyces cerevisiae) yang dianggarkan berusia sekurang-kurangnya 3.5 bilion tahun kerana perlindungannya dalam tiga domain kehidupan. Dalam mikrosporidia, bonjolan ini dihapuskan. Walau bagaimanapun, satu bonjolan baharu muncul di sebelah bonjolan yang hilang (A1306 dalam E. cuniculi).
Menariknya, kami mendapati bahawa ribosom E. cuniculi kekurangan kebanyakan bonjolan rRNA yang terdapat dalam spesies lain, termasuk lebih daripada 30 bonjolan yang dipelihara dalam eukariot lain (Rajah 4a). Kehilangan ini menghapuskan banyak sentuhan antara subunit ribosom dan heliks rRNA bersebelahan, kadangkala mewujudkan lompang berongga besar dalam ribosom, menjadikan ribosom E. cuniculi lebih berliang berbanding ribosom yang lebih tradisional (Rajah 4b). Terutamanya, kami mendapati bahawa kebanyakan bonjolan ini juga hilang dalam struktur ribosom V. necatrix dan P. locustae yang dikenal pasti sebelum ini, yang diabaikan oleh analisis struktur sebelumnya31,32.
Kadangkala kehilangan bonjolan rRNA disertai dengan perkembangan bonjolan baharu di sebelah bonjolan yang hilang. Contohnya, batang-P ribosom mengandungi bonjolan U1208 (dalam Saccharomyces cerevisiae) yang terselamat daripada E. coli kepada manusia dan oleh itu dianggarkan berusia 3.5 bilion tahun. Semasa sintesis protein, bonjolan ini membantu batang P bergerak antara konformasi terbuka dan tertutup supaya ribosom boleh merekrut faktor terjemahan dan menghantarnya ke tapak aktif. Dalam ribosom E. cuniculi, penebalan ini tidak wujud; walau bagaimanapun, penebalan baharu (G883) yang hanya terletak dalam tiga pasangan bes boleh menyumbang kepada pemulihan fleksibiliti optimum batang P (Rajah 4c).
Data kami tentang rRNA tanpa bonjolan menunjukkan bahawa pengurangan rRNA tidak terhad kepada kehilangan unsur rRNA pada permukaan ribosom, tetapi mungkin juga melibatkan nukleus ribosom, mewujudkan kecacatan molekul khusus parasit yang belum diterangkan dalam sel hidup bebas. Spesies hidup diperhatikan.
Selepas memodelkan protein ribosom kanonik dan rRNA, kami mendapati bahawa komponen ribosom konvensional tidak dapat menjelaskan tiga bahagian imej cryo-EM. Dua daripada serpihan ini bersaiz molekul kecil (Rajah 5, Rajah Tambahan 8). Segmen pertama diapit di antara protein ribosom uL15 dan eL18 dalam kedudukan yang biasanya diduduki oleh C-terminus eL18, yang dipendekkan dalam E. cuniculi. Walaupun kita tidak dapat menentukan identiti molekul ini, saiz dan bentuk pulau ketumpatan ini dijelaskan dengan baik oleh kehadiran molekul spermidin. Pengikatannya pada ribosom distabilkan oleh mutasi khusus mikrosporidia dalam protein uL15 (Asp51 dan Arg56), yang nampaknya meningkatkan afiniti ribosom untuk molekul kecil ini, kerana ia membolehkan uL15 membalut molekul kecil ke dalam struktur ribosom. Rajah Tambahan 2). 8, data tambahan 1, 2).
Pengimejan krio-EM menunjukkan kehadiran nukleotida di luar ribosa yang terikat pada ribosom E. cuniculi. Dalam ribosom E. cuniculi, nukleotida ini menduduki tempat yang sama dengan nukleotida 25S rRNA A3186 (penomboran Saccharomyces cerevisiae) dalam kebanyakan ribosom eukariotik lain. b Dalam struktur ribosom E. cuniculi, nukleotida ini terletak di antara protein ribosom uL9 dan eL20, sekali gus menstabilkan sentuhan antara kedua-dua protein. cd analisis pemuliharaan jujukan eL20 antara spesies mikrosporidia. Pokok filogenetik spesies Microsporidia (c) dan penjajaran jujukan berganda protein eL20 (d) menunjukkan bahawa residu pengikat nukleotida F170 dan K172 dipelihara dalam kebanyakan Microsporidia tipikal, kecuali S. lophii, kecuali Microsporidia bercabang awal, yang mengekalkan sambungan rRNA ES39L. e Rajah ini menunjukkan bahawa residu pengikat nukleotida F170 dan K172 hanya terdapat dalam eL20 genom mikrosporidia yang sangat berkurangan, tetapi tidak dalam eukariot lain. Secara keseluruhan, data ini menunjukkan bahawa ribosom Mikrosporidia telah membangunkan tapak pengikatan nukleotida yang nampaknya mengikat molekul AMP dan menggunakannya untuk menstabilkan interaksi protein-protein dalam struktur ribosom. Pemuliharaan tapak pengikatan yang tinggi dalam Mikrosporidia dan ketiadaannya dalam eukariot lain menunjukkan bahawa tapak ini mungkin memberikan kelebihan kemandirian terpilih untuk Mikrosporidia. Oleh itu, poket pengikatan nukleotida dalam ribosom mikrosporidia nampaknya bukan ciri degenerasi atau bentuk akhir degradasi rRNA seperti yang diterangkan sebelum ini, tetapi sebaliknya inovasi evolusi yang berguna yang membolehkan ribosom mikrosporidia mengikat molekul kecil secara langsung, menggunakannya sebagai blok binaan molekul. Penemuan ini menjadikan ribosom mikrosporidia satu-satunya ribosom yang diketahui menggunakan nukleotida tunggal sebagai blok binaan strukturnya. f Laluan evolusi hipotesis yang berasal daripada pengikatan nukleotida.
Ketumpatan berat molekul rendah kedua terletak pada antara muka antara protein ribosom uL9 dan eL30 (Rajah 5a). Antara muka ini sebelum ini diterangkan dalam struktur ribosom Saccharomyces cerevisiae sebagai tapak pengikatan untuk nukleotida 25S rRNA A3186 (sebahagian daripada sambungan rRNA ES39L)38. Telah ditunjukkan bahawa dalam ribosom P. locustae ES39L yang merosot, antara muka ini mengikat nukleotida tunggal yang tidak diketahui 31, dan diandaikan bahawa nukleotida ini adalah bentuk rRNA akhir yang dikurangkan, di mana panjang rRNA ialah ~130-230 bes. ES39L dikurangkan kepada nukleotida tunggal 32.43. Imej cryo-EM kami menyokong idea bahawa ketumpatan boleh dijelaskan oleh nukleotida. Walau bagaimanapun, resolusi struktur kami yang lebih tinggi menunjukkan bahawa nukleotida ini adalah molekul ekstraribosom, mungkin AMP (Rajah 5a, b).
Kemudian kami bertanya sama ada tapak pengikatan nukleotida muncul dalam ribosom E. cuniculi atau sama ada ia wujud sebelum ini. Memandangkan pengikatan nukleotida terutamanya dimediasi oleh residu Phe170 dan Lys172 dalam protein ribosom eL30, kami menilai pemuliharaan residu ini dalam 4396 eukariot perwakilan. Seperti dalam kes uL15 di atas, kami mendapati bahawa residu Phe170 dan Lys172 sangat terpelihara hanya dalam Microsporidia biasa, tetapi tiada dalam eukariot lain, termasuk Microsporidia atipikal Mitosporidium dan Amphiamblys, di mana serpihan rRNA ES39L tidak dikurangkan 44, 45, 46 (Rajah 5c). -e).
Secara keseluruhannya, data ini menyokong idea bahawa E. cuniculi dan mungkin mikrosporidia kanonik lain telah mengembangkan keupayaan untuk menangkap sejumlah besar metabolit kecil dalam struktur ribosom dengan cekap untuk mengimbangi penurunan tahap rRNA dan protein. Dengan berbuat demikian, mereka telah membangunkan keupayaan unik untuk mengikat nukleotida di luar ribosom, menunjukkan bahawa struktur molekul parasit mengimbangi dengan menangkap metabolit kecil yang banyak dan menggunakannya sebagai tiruan struktur serpihan RNA dan protein yang terdegradasi.
Bahagian ketiga peta krio-EM kami yang tidak disimulasikan, yang terdapat dalam subunit ribosom yang besar. Resolusi yang agak tinggi (2.6 Å) peta kami menunjukkan bahawa ketumpatan ini tergolong dalam protein dengan kombinasi unik residu rantai sisi yang besar, yang membolehkan kami mengenal pasti ketumpatan ini sebagai protein ribosom yang sebelum ini tidak diketahui yang kami kenal pasti sebagai. Ia dinamakan msL2 (protein khusus Mikrosporidia L2) (kaedah, rajah 6). Carian homologi kami menunjukkan bahawa msL2 dipelihara dalam klad Mikrosporidia daripada genus Encephaliter dan Orosporidium, tetapi tiada dalam spesies lain, termasuk Mikrosporidia lain. Dalam struktur ribosom, msL2 menempati jurang yang dibentuk oleh kehilangan rRNA ES31L yang dilanjutkan. Dalam lompang ini, msL2 membantu menstabilkan lipatan rRNA dan boleh mengimbangi kehilangan ES31L (Rajah 6).
a Ketumpatan elektron dan model protein ribosom khusus Microsporidia msL2 yang terdapat dalam ribosom E. cuniculi. b Kebanyakan ribosom eukariotik, termasuk ribosom 80S Saccharomyces cerevisiae, mempunyai amplifikasi rRNA ES19L yang hilang dalam kebanyakan spesies Microsporidian. Struktur ribosom microsporidia V. necatrix yang telah ditetapkan sebelum ini menunjukkan bahawa kehilangan ES19L dalam parasit ini dikompensasikan oleh evolusi protein ribosom msL1 baharu. Dalam kajian ini, kami mendapati bahawa ribosom E. cuniculi juga membangunkan protein tiruan RNA ribosom tambahan sebagai pampasan ketara untuk kehilangan ES19L. Walau bagaimanapun, msL2 (kini dianotasi sebagai protein hipotetikal ECU06_1135) dan msL1 mempunyai asal usul struktur dan evolusi yang berbeza. Penemuan penjanaan protein ribosom msL1 dan msL2 yang tidak berkaitan secara evolusi ini menunjukkan bahawa jika ribosom mengumpul mutasi berbahaya dalam rRNA mereka, ia boleh mencapai tahap kepelbagaian komposisi yang belum pernah terjadi sebelumnya walaupun dalam subset kecil spesies yang berkait rapat. Penemuan ini dapat membantu menjelaskan asal usul dan evolusi ribosom mitokondria, yang dikenali dengan rRNA yang sangat berkurangan dan kepelbagaian abnormal dalam komposisi protein merentasi spesies.
Kemudian, kami membandingkan protein msL2 dengan protein msL1 yang diterangkan sebelum ini, satu-satunya protein ribosom khusus mikrosporidia yang diketahui yang terdapat dalam ribosom V. necatrix. Kami ingin menguji sama ada msL1 dan msL2 berkaitan secara evolusi. Analisis kami menunjukkan bahawa msL1 dan msL2 menduduki rongga yang sama dalam struktur ribosom, tetapi mempunyai struktur primer dan tertier yang berbeza, yang menunjukkan asal usul evolusi bebas mereka (Rajah 6). Oleh itu, penemuan msL2 kami memberikan bukti bahawa kumpulan spesies eukariotik padat boleh mengembangkan protein ribosom yang berbeza secara struktur untuk mengimbangi kehilangan serpihan rRNA. Penemuan ini ketara kerana kebanyakan ribosom eukariotik sitoplasma mengandungi protein invarian, termasuk keluarga yang sama iaitu 81 protein ribosom. Kemunculan msL1 dan msL2 dalam pelbagai klad mikrosporidia sebagai tindak balas kepada kehilangan segmen rRNA yang dilanjutkan menunjukkan bahawa degradasi seni bina molekul parasit menyebabkan parasit mencari mutasi pampasan, yang akhirnya boleh menyebabkan pemerolehannya dalam populasi parasit yang berbeza.
Akhirnya, apabila model kami siap, kami membandingkan komposisi ribosom E. cuniculi dengan yang diramalkan daripada jujukan genom. Beberapa protein ribosom, termasuk eL14, eL38, eL41, dan eS30, sebelum ini dianggap hilang daripada genom E. cuniculi disebabkan oleh ketiadaan homolognya yang jelas daripada genom E. cuniculi. Kehilangan banyak protein ribosom juga diramalkan dalam kebanyakan parasit intraselular dan endosimbion yang sangat berkurangan. Contohnya, walaupun kebanyakan bakteria hidup bebas mengandungi keluarga yang sama iaitu 54 protein ribosom, hanya 11 daripada keluarga protein ini mempunyai homolog yang boleh dikesan dalam setiap genom bakteria terhad perumah yang dianalisis. Bagi menyokong tanggapan ini, kehilangan protein ribosom telah diperhatikan secara eksperimen dalam mikrosporidia V. necatrix dan P. locustae, yang kekurangan protein eL38 dan eL4131,32.
Walau bagaimanapun, struktur kami menunjukkan bahawa hanya eL38, eL41, dan eS30 sebenarnya hilang dalam ribosom E. cuniculi. Protein eL14 telah dipelihara dan struktur kami menunjukkan mengapa protein ini tidak dapat ditemui dalam carian homologi (Rajah 7). Dalam ribosom E. cuniculi, kebanyakan tapak pengikatan eL14 hilang disebabkan oleh degradasi ES39L yang diperkuatkan rRNA. Dengan ketiadaan ES39L, eL14 kehilangan sebahagian besar struktur sekundernya, dan hanya 18% daripada jujukan eL14 adalah sama dalam E. cuniculi dan S. cerevisiae. Pemeliharaan jujukan yang lemah ini adalah luar biasa kerana walaupun Saccharomyces cerevisiae dan Homo sapiens—organisma yang berevolusi 1.5 bilion tahun berbeza—berkongsi lebih daripada 51% residu yang sama dalam eL14. Kehilangan pemuliharaan yang anomali ini menjelaskan mengapa E. cuniculi eL14 kini dianotasi sebagai protein M970_061160 yang diandaikan dan bukan sebagai protein ribosom eL1427.
dan Ribosom Microsporidia kehilangan sambungan rRNA ES39L, yang sebahagiannya menghapuskan tapak pengikatan protein ribosom eL14. Dengan ketiadaan ES39L, protein mikrospora eL14 mengalami kehilangan struktur sekunder, di mana bekas α-heliks pengikat rRNA merosot menjadi gelung panjang minimum. b Penjajaran jujukan berganda menunjukkan bahawa protein eL14 sangat terpelihara dalam spesies eukariotik (57% identiti jujukan antara homolog yis dan manusia), tetapi kurang terpelihara dan mencapah dalam mikrosporidia (di mana tidak lebih daripada 24% residu adalah sama dengan homolog eL14). daripada S. cerevisiae atau H. sapiens). Pemuliharaan jujukan yang lemah dan kebolehubahan struktur sekunder ini menjelaskan mengapa homolog eL14 tidak pernah ditemui dalam E. cuniculi dan mengapa protein ini dianggap telah hilang dalam E. cuniculi. Sebaliknya, E. cuniculi eL14 sebelum ini telah dianotasi sebagai protein M970_061160 yang diandaikan. Pemerhatian ini menunjukkan bahawa kepelbagaian genom mikrosporidia pada masa ini dianggarkan secara berlebihan: beberapa gen yang kini dianggap hilang dalam mikrosporidia sebenarnya dipelihara, walaupun dalam bentuk yang sangat berbeza; sebaliknya, sesetengahnya dianggap mengekod gen mikrosporidia untuk protein khusus cacing (contohnya, protein hipotetikal M970_061160) sebenarnya mengekod protein yang sangat pelbagai yang terdapat dalam eukariot lain.
Penemuan ini menunjukkan bahawa denaturasi rRNA boleh menyebabkan kehilangan pemuliharaan jujukan yang dramatik dalam protein ribosom bersebelahan, menjadikan protein ini tidak dapat dikesan untuk carian homologi. Oleh itu, kita mungkin terlalu menganggarkan tahap sebenar degradasi molekul dalam organisma genom kecil, kerana sesetengah protein yang dianggap hilang sebenarnya kekal, walaupun dalam bentuk yang sangat berubah.
Bagaimanakah parasit boleh mengekalkan fungsi mesin molekul mereka di bawah keadaan pengurangan genom yang ekstrem? Kajian kami menjawab soalan ini dengan menerangkan struktur molekul kompleks (ribosom) E. cuniculi, sejenis organisma dengan salah satu genom eukariotik terkecil.
Telah diketahui selama hampir dua dekad bahawa molekul protein dan RNA dalam parasit mikrob sering berbeza daripada molekul homolognya dalam spesies hidup bebas kerana ia kekurangan pusat kawalan kualiti, dikurangkan kepada 50% daripada saiznya dalam mikrob hidup bebas, dan sebagainya. banyak mutasi yang melemahkan yang menjejaskan lipatan dan fungsi. Contohnya, ribosom organisma genom kecil, termasuk banyak parasit intraselular dan endosimbion, dijangka kekurangan beberapa protein ribosom dan sehingga satu pertiga daripada nukleotida rRNA berbanding spesies hidup bebas 27, 29, 30, 49. Walau bagaimanapun, cara molekul ini berfungsi dalam parasit sebahagian besarnya masih menjadi misteri, dikaji terutamanya melalui genomik perbandingan.
Kajian kami menunjukkan bahawa struktur makromolekul boleh mendedahkan banyak aspek evolusi yang sukar diekstrak daripada kajian genomik perbandingan tradisional parasit intraselular dan organisma lain yang terhad kepada hos (Rajah Tambahan 7). Contohnya, contoh protein eL14 menunjukkan bahawa kita boleh menganggarkan secara berlebihan tahap sebenar degradasi radas molekul dalam spesies parasit. Parasit ensefalitis kini dipercayai mempunyai beratus-ratus gen khusus mikrosporidia. Walau bagaimanapun, keputusan kami menunjukkan bahawa sebahagian daripada gen yang kelihatan spesifik ini sebenarnya hanyalah varian gen yang sangat berbeza yang biasa terdapat dalam eukariot lain. Selain itu, contoh protein msL2 menunjukkan bagaimana kita terlepas pandang protein ribosom baharu dan memandang rendah kandungan mesin molekul parasit. Contoh molekul kecil menunjukkan bagaimana kita boleh terlepas pandang inovasi paling bijak dalam struktur molekul parasit yang boleh memberi mereka aktiviti biologi baharu.
Secara keseluruhannya, hasil ini meningkatkan pemahaman kita tentang perbezaan antara struktur molekul organisma yang terhad kepada perumah dan rakan sejawatnya dalam organisma hidup bebas. Kami menunjukkan bahawa mesin molekul, yang telah lama dianggap berkurangan, merosot dan tertakluk kepada pelbagai mutasi yang melemahkan, sebaliknya mempunyai satu set ciri struktur luar biasa yang diabaikan secara sistematik.
Sebaliknya, serpihan rRNA yang tidak besar dan serpihan terlakur yang kami temui dalam ribosom E. cuniculi menunjukkan bahawa pengurangan genom boleh mengubah walaupun bahagian jentera molekul asas yang dipelihara dalam tiga domain kehidupan – selepas hampir 3.5 bilion tahun. evolusi spesies bebas.
Serpihan rRNA yang bebas bonjolan dan terlakur dalam ribosom E. cuniculi amat menarik perhatian berdasarkan kajian terdahulu tentang molekul RNA dalam bakteria endosimbiotik. Contohnya, dalam endosimbion aphid Buchnera aphidicola, molekul rRNA dan tRNA telah terbukti mempunyai struktur sensitif suhu disebabkan oleh bias komposisi A+T dan perkadaran pasangan bes bukan kanonik yang tinggi20,50. Perubahan dalam RNA ini, serta perubahan dalam molekul protein, kini dianggap bertanggungjawab terhadap kebergantungan endosimbion yang berlebihan pada pasangan dan ketidakupayaan endosimbion untuk memindahkan haba 21, 23. Walaupun rRNA mikrosporidia parasit mempunyai perubahan struktur yang berbeza, sifat perubahan ini menunjukkan bahawa kestabilan haba yang berkurangan dan kebergantungan yang lebih tinggi pada protein chaperone mungkin merupakan ciri umum molekul RNA dalam organisma dengan genom yang berkurangan.
Sebaliknya, struktur kami menunjukkan bahawa mikrosporidia parasit telah mengembangkan keupayaan unik untuk menahan serpihan rRNA dan protein yang terpelihara secara meluas, membangunkan keupayaan untuk menggunakan metabolit kecil yang banyak dan mudah didapati sebagai tiruan struktur serpihan rRNA dan protein yang merosot. Degradasi struktur molekul. . Pendapat ini disokong oleh fakta bahawa molekul kecil yang mengimbangi kehilangan serpihan protein dalam rRNA dan ribosom E. cuniculi mengikat kepada residu khusus mikrosporidia dalam protein uL15 dan eL30. Ini menunjukkan bahawa pengikatan molekul kecil pada ribosom mungkin merupakan hasil pemilihan positif, di mana mutasi khusus Mikrosporidia dalam protein ribosom telah dipilih kerana keupayaannya untuk meningkatkan afiniti ribosom untuk molekul kecil, yang boleh membawa kepada organisma ribosom yang lebih cekap. Penemuan ini mendedahkan inovasi pintar dalam struktur molekul parasit mikrob dan memberi kita pemahaman yang lebih baik tentang bagaimana struktur molekul parasit mengekalkan fungsinya walaupun evolusi reduktif.
Pada masa ini, pengenalpastian molekul-molekul kecil ini masih belum jelas. Tidak jelas mengapa penampilan molekul-molekul kecil ini dalam struktur ribosom berbeza antara spesies mikrosporidia. Khususnya, tidak jelas mengapa pengikatan nukleotida diperhatikan dalam ribosom E. cuniculi dan P. locustae, dan bukan dalam ribosom V. necatrix, walaupun terdapat residu F170 dalam protein eL20 dan K172 V. necatrix. Penghapusan ini mungkin disebabkan oleh residu 43 uL6 (terletak bersebelahan dengan poket pengikatan nukleotida), iaitu tirosin dalam V. necatrix dan bukan treonina dalam E. cuniculi dan P. locustae. Rantai sisi aromatik Tyr43 yang besar boleh mengganggu pengikatan nukleotida disebabkan oleh pertindihan sterik. Secara alternatif, penghapusan nukleotida yang ketara mungkin disebabkan oleh resolusi rendah pengimejan cryo-EM, yang menghalang pemodelan serpihan ribosom V. necatrix.
Sebaliknya, kajian kami menunjukkan bahawa proses pereputan genom mungkin merupakan daya ciptaan. Khususnya, struktur ribosom E. cuniculi menunjukkan bahawa kehilangan rRNA dan serpihan protein dalam ribosom mikrosporidia mewujudkan tekanan evolusi yang menggalakkan perubahan dalam struktur ribosom. Varian ini berlaku jauh dari tapak aktif ribosom dan kelihatan membantu mengekalkan (atau memulihkan) pemasangan ribosom optimum yang sebaliknya akan terganggu oleh rRNA yang dikurangkan. Ini menunjukkan bahawa inovasi utama ribosom mikrosporidia nampaknya telah berkembang menjadi keperluan untuk menimbal hanyutan gen.
Mungkin ini paling baik digambarkan oleh pengikatan nukleotida, yang belum pernah diperhatikan dalam organisma lain setakat ini. Hakikat bahawa residu pengikatan nukleotida terdapat dalam mikrosporidia biasa, tetapi tidak dalam eukariot lain, menunjukkan bahawa tapak pengikatan nukleotida bukan sekadar peninggalan yang menunggu untuk hilang, atau tapak terakhir untuk rRNA dipulihkan kepada bentuk nukleotida individu. Sebaliknya, tapak ini kelihatan seperti ciri berguna yang boleh berkembang melalui beberapa pusingan pemilihan positif. Tapak pengikatan nukleotida mungkin merupakan hasil sampingan pemilihan semula jadi: sebaik sahaja ES39L terdegradasi, mikrosporidia terpaksa mencari pampasan untuk memulihkan biogenesis ribosom yang optimum jika tiada ES39L. Oleh kerana nukleotida ini boleh meniru sentuhan molekul nukleotida A3186 dalam ES39L, molekul nukleotida menjadi blok binaan ribosom, pengikatannya dipertingkatkan lagi oleh mutasi jujukan eL30.
Berkenaan dengan evolusi molekul parasit intraselular, kajian kami menunjukkan bahawa daya pemilihan semula jadi Darwin dan hanyutan genetik pereputan genom tidak beroperasi secara selari, tetapi berayun. Pertama, hanyutan genetik menghapuskan ciri-ciri penting biomolekul, menjadikan pampasan sangat diperlukan. Hanya apabila parasit memenuhi keperluan ini melalui pemilihan semula jadi Darwin, barulah makromolekul mereka berpeluang untuk mengembangkan ciri-ciri mereka yang paling mengagumkan dan inovatif. Yang penting, evolusi tapak pengikatan nukleotida dalam ribosom E. cuniculi menunjukkan bahawa corak evolusi molekul kehilangan-untuk-mendapatkan ini bukan sahaja melunaskan mutasi yang merosakkan, tetapi kadangkala memberikan fungsi yang sama sekali baharu pada makromolekul parasit.
Idea ini selaras dengan teori keseimbangan bergerak Sewell Wright, yang menyatakan bahawa sistem pemilihan semula jadi yang ketat mengehadkan keupayaan organisma untuk berinovasi51,52,53. Walau bagaimanapun, jika hanyutan genetik mengganggu pemilihan semula jadi, hanyutan ini boleh menghasilkan perubahan yang tidak bersifat adaptif (atau malah memudaratkan) tetapi membawa kepada perubahan selanjutnya yang memberikan kecergasan yang lebih tinggi atau aktiviti biologi baharu. Kerangka kerja kami menyokong idea ini dengan menggambarkan bahawa jenis mutasi yang sama yang mengurangkan lipatan dan fungsi biomolekul nampaknya menjadi pencetus utama untuk penambahbaikannya. Selaras dengan model evolusi menang-menang, kajian kami menunjukkan bahawa pereputan genom, yang secara tradisinya dilihat sebagai proses degeneratif, juga merupakan pemacu utama inovasi, kadangkala dan mungkin juga sering membenarkan makromolekul memperoleh aktiviti parasit baharu.