Eskerrik asko Nature.com bisitatzeagatik. Erabiltzen ari zaren arakatzailearen bertsioak CSS laguntza mugatua du. Esperientzia onena lortzeko, arakatzaile eguneratua erabiltzea gomendatzen dizugu (edo Internet Explorer-en bateragarritasun modua desgaitzea). Bitartean, laguntza jarraitua bermatzeko, gunea estilo eta JavaScript gabe errendatuko dugu.
Mikrobio-parasitoen eboluzioak hautespen naturalaren eta jito genetikoaren arteko kontraesana dakar, zeinak parasitoek geneak galtzea eta mutazio kaltegarriak metatzea eragiten duen. Hemen, kontraesana hori makromolekula bakar baten eskalan nola gertatzen den ulertzeko, Encephalitozoon cuniculi-ren erribosomaren krio-EM egitura deskribatzen dugu, naturako genoma txikienetako bat duen organismo eukarioto bat. E. cuniculi erribosometan ARNr-aren murrizketa muturrekoa egitura-aldaketa paregabeekin batera gertatzen da, hala nola, lehenago ezezagunak ziren ARNr lotura fusionatuen eta hanturarik gabeko ARNr-aren eboluzioa. Gainera, E. cuniculi erribosomak ARNr zatien eta proteinen galera gainditu zuen molekula txikiak ARNr zati eta proteinen imitazio estruktural gisa erabiltzeko gaitasuna garatuz. Oro har, erakusten dugu aspalditik murriztuak, endekatuak eta mutazio ahultzaileen menpe zeudela uste zen egitura molekularrek hainbat mekanismo konpentsatzaile dituztela, uzkurdura molekular muturrekoak izan arren aktibo mantentzen dituztenak.
Mikrobio-parasitoen talde gehienek tresna molekular bereziak dituztelako beren ostalariak ustiatzeko, askotan terapia desberdinak garatu behar izaten ditugu parasito talde desberdinetarako1,2. Hala ere, ebidentzia berriek iradokitzen dute parasitoen eboluzioaren alderdi batzuk konbergenteak eta neurri handi batean aurreikusgarriak direla, eta horrek oinarri potentziala adierazten du mikrobio-parasitoetan esku-hartze terapeutiko zabaletarako3,4,5,6,7,8,9.
Aurreko lanek parasito mikrobianoetan genomaren murrizketa edo genomaren gainbehera izeneko joera ebolutibo komun bat identifikatu dute10,11,12,13. Gaur egungo ikerketek erakusten dute mikroorganismoek beren bizimodu askea uzten dutenean eta zelula barruko parasito (edo endosinbionte) bihurtzen direnean, haien genomak metamorfosi motela baina harrigarria jasaten dutela milioika urtetan zehar9,11. Genomaren gainbehera izeneko prozesu batean, parasito mikrobianoek mutazio kaltegarriak metatzen dituzte, eta horiek lehen garrantzitsuak ziren gene asko pseudogene bihurtzen dituzte, eta horrek geneen galera mailakatua eta mutazioen kolapsoa eragiten du14,15. Kolapso honek zelula barruko organismo zaharrenetan dauden geneen % 95 arte suntsitu ditzake, aske dauden espezieekin alderatuta. Beraz, zelula barruko parasitoen eboluzioa bi indar kontrajarrien arteko sokatira bat da: hautespen natural darwindarra, parasitoen hobekuntzara eramaten duena, eta genomaren kolapsoa, parasitoak ahanzturara botatzen dituena. Nola lortu zuen parasitoak sokatira honetatik ateratzea eta bere egitura molekularraren jarduera mantentzea ez dago argi oraindik.
Genomaren gainbeheraren mekanismoa guztiz ulertzen ez den arren, badirudi batez ere maiz gertatzen den jito genetikoari esker gertatzen dela. Parasitoak populazio txiki, asexual eta genetikoki mugatuetan bizi direnez, ezin dituzte eraginkortasunez ezabatu DNAren erreplikazioan batzuetan gertatzen diren mutazio kaltegarriak. Horrek mutazio kaltegarrien metaketa itzulezina eta parasitoaren genomaren murrizketa dakar. Ondorioz, parasitoak ez ditu soilik zelula barneko ingurunean bizirauteko beharrezkoak ez diren geneak galtzen. Parasitoen populazioek mutazio kaltegarri esporadikoak eraginkortasunez ezabatzeko ezintasunak eragiten du mutazio horiek genoma osoan metatzea, haien gene garrantzitsuenak barne.
Genomaren murrizketaren inguruko gure egungo ulermenaren zati handi bat genomaren sekuentzien konparaketetan oinarritzen da soilik, etxeko funtzioak betetzen dituzten eta sendagaien helburu potentzial gisa balio duten molekulen aldaketei arreta gutxiago jarriz. Ikerketa konparatiboek erakutsi dute zelula barruko mutazio mikrobiano kaltegarrien zamak proteinak eta azido nukleikoak gaizki tolestu eta agregatzera predisposatzen dituela, chaperonen menpekoagoak eta beroarekiko hipersentikorragoak bihurtuz19,20,21,22,23. Horrez gain, hainbat parasitok —batzuetan 2.500 milioi urtez bereizita dauden eboluzio independenteak— antzeko galera izan zuten proteinen sintesian5,6 eta DNA konpontzeko mekanismoetan24. Hala ere, gutxi dakigu zelula barruko bizimoduak makromolekulen beste propietate guztietan duen eraginari buruz, mutazio kaltegarrien zama gero eta handiagoarekiko egokitzapen molekularra barne.
Lan honetan, zelula barneko mikroorganismoen proteinen eta azido nukleikoen eboluzioa hobeto ulertzeko, Encephalitozoon cuniculi parasitoaren erribosomen egitura zehaztu dugu. E. cuniculi onddo itxurako organismo bat da, genoma eukarioto ezohiko txikiak dituzten mikrosporidio parasitoen talde batekoa, eta, beraz, genomaren desintegrazioa aztertzeko organismo eredugarri gisa erabiltzen direnak25,26,27,28,29,30. Duela gutxi, krio-EM erribosomen egitura zehaztu zen Microsporidia, Paranosema locustae eta Vairimorpha necatrix-en genoma neurriz murriztuetarako31,32 (~3,2 Mb genoma). Egitura hauek iradokitzen dute rRNA anplifikazio-galera batzuk erribosoma-proteina bizilagunen arteko kontaktu berriak garatuz edo msL131,32 erribosoma-proteina berriak eskuratuz konpentsatzen direla. Encephalitozoon espezieak (genoma ~2,5 milioi bp), bere ahaide hurbilen den Ordosporarekin batera, eukariotoetan genomaren murrizketa maila gorena erakusten dute – 2000 proteina kodetzen duten gene baino gutxiago dituzte, eta espero da haien erribosomak ez bakarrik rRNA hedapen zatirik gabe egotea (erribosoma eukariotikoak bakterioen erribosometatik bereizten dituzten rRNA zatiak), baita lau erribosoma proteina ere izatea, E. cuniculi genoman homologorik ez dutelako26,27,28. Beraz, ondorioztatu dugu E. cuniculi erribosomak genomaren desintegraziorako egokitzapen molekularreko estrategia ezezagunak agerian utzi ditzakeela.
Gure krio-EM egiturak karakterizatu den erribosoma zitoplasmatiko eukariotiko txikiena adierazten du, eta genomaren murrizketaren azken mailak zelularen funtsezko osagai den molekula-makineria egituran, muntaketan eta eboluzioan nola eragiten duen azaltzen du. E. cuniculi erribosomak RNA tolestearen eta erribosomen muntaketaren printzipio asko urratzen dituela ikusi dugu, eta erribosoma-proteina berri eta ezezagun bat aurkitu dugu. Ustekabean, mikrosporidio erribosomek molekula txikiak lotzeko gaitasuna garatu dutela erakusten dugu, eta ARNr eta proteinen mozketek eboluzio-berrikuntzak eragiten dituztela hipotesizatzen dugu, eta horrek, azkenean, erribosomari ezaugarri erabilgarriak eman diezazkioke.
Organismo intrazelularretan proteinen eta azido nukleikoen bilakaera hobeto ulertzeko, E. cuniculi esporak ugaztunen zelula infektatuen kulturetatik isolatzea erabaki genuen, haien erribosomak arazteko eta erribosomaren egitura zehazteko. Zaila da mikrosporidio parasito kopuru handia lortzea, mikrosporidioak ezin baitira mantenugai-ingurune batean landu. Horren ordez, zelula ostalariaren barruan bakarrik hazten eta ugaltzen dira. Beraz, erribosomak arazteko E. cuniculi biomasa lortzeko, ugaztunen giltzurruneko RK13 zelula-lerroa E. cuniculi esporekin infektatu genuen eta zelula infektatu hauek hainbat astez landu genituen E. cuniculi hazteko eta ugaltzeko aukera emateko. Metro karratuko erdi inguruko zelula-geruza infektatu bat erabiliz, 300 mg inguru Mikrosporidia espora araztea eta erribosomak isolatzeko erabiltzea lortu genuen. Ondoren, espora araztuak beirazko aleekin apurtu genituen eta erribosoma gordinak isolatu genituen lisatuen polietilen glikol frakzionamendu mailakatua erabiliz. Horri esker, gutxi gorabehera 300 µg E. cuniculi erribosoma gordin lortu ahal izan genituen egitura-analisirako.
Ondoren, lortutako erribosoma laginak erabiliz krio-EM irudiak bildu genituen eta irudi horiek erribosoma azpiunitate handiaren, azpiunitate txikiaren buruaren eta azpiunitate txikiaren maskarak erabiliz prozesatu genituen. Prozesu honetan zehar, 108.000 erribosoma partikula ingururen irudiak bildu genituen eta 2,7 Å-ko bereizmenarekin krio-EM irudiak kalkulatu genituen (1-3 irudi osagarriak). Ondoren, krioEM irudiak erabili genituen E. cuniculi erribosomekin lotutako rRNA, erribosoma proteina eta Mdf1 hibernazio faktorea modelatzeko (1a, b irudiak).
a E. cuniculi erribosomaren egitura Mdf1 hibernazio faktorearekin konplexuan (pdb id 7QEP). b Mdf1 hibernazio faktorearen mapa, E. cuniculi erribosomarekin lotuta. c Bigarren mailako egituraren mapa, mikrosporidio espezieetan berreskuratutako rRNA erribosoma-egiturak ezagutzen dituztenekin alderatzen duena. Panelek anplifikatutako rRNA zatien (ES) eta erribosomaren gune aktiboen kokapena erakusten dute, deskodetze gunea (DC), sarzinizina begizta (SRL) eta peptidil transferasa zentroa (PTC) barne. d E. cuniculi erribosomaren peptidil transferasa zentroari dagokion dentsitate elektronikoak iradokitzen du gune katalitiko honek egitura bera duela E. cuniculi parasitoan eta bere ostalarietan, H. sapiens barne. e, f Deskodetze zentroaren dagokion dentsitate elektronikoak (e) eta deskodetze zentroaren egitura eskematikoak (f) adierazten dute E. cuniculi-k U1491 hondarrak dituela A1491-en ordez (E. coli zenbaketa) beste eukarioto askotan. Aldaketa honek iradokitzen du E. cuniculi gune aktibo horri erasotzen dioten antibiotikoekiko sentikorra izan daitekeela.
Aurretik ezarritako V. necatrix eta P. locustae erribosomen egiturekin alderatuta (bi egiturek Nosematidae mikrosporidio familia bera ordezkatzen dute eta oso antzekoak dira elkarren artean), 31,32 E. cuniculi erribosomek ARNr eta proteinen zatikatze prozesu ugari jasaten dituzte. Desnaturalizazio gehiago (4-6 irudi osagarriak). ARNr-an, aldaketa deigarrienak anplifikatutako ES12L 25S ARNr zatiaren galera osoa eta h39, h41 eta H18 helizeen endekapen partziala izan ziren (1c irudia, 4. irudi osagarria). Erribosoma proteinen artean, aldaketa deigarrienak eS30 proteinaren galera osoa eta eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 eta eS7 proteinen laburdura izan ziren (4, 5 irudi osagarriak).
Horrela, Encephalotozoon/Ordospora espezieen genomaren murrizketa muturrekoa haien erribosoma-egituran islatzen da: E. cuniculi erribosomek proteina-edukiaren galera nabarmenena jasaten dute karakterizazio estrukturala behar duten eukarioto zitoplasmako erribosomatan, eta ez dituzte eukariotoetan ez ezik, bizitzaren hiru domeinuetan ere oso kontserbatuta dauden rRNA eta proteina-zati horiek ere. E. cuniculi erribosomaren egiturak aldaketa horien lehen eredu molekularra eskaintzen du eta genomika konparatiboak eta zelula barruko biomolekula-egitura azterketek baztertu dituzten eboluzio-gertaerak agerian uzten ditu (7. irudi osagarria). Jarraian, gertaera horietako bakoitza deskribatzen dugu, haien jatorri ebolutibo probablearekin eta erribosoma-funtzioan izan dezaketen eraginarekin batera.
Ondoren, ikusi genuen ARNr-mozketa handiez gain, E. cuniculi erribosomek ARNr-aldaerak dituztela beren gune aktiboetako batean. E. cuniculi erribosomaren peptidil transferasa zentroak beste erribosoma eukariotikoen egitura bera badu ere (1d irudia), deskodetze-zentroa desberdina da 1491 nukleotidoko sekuentzia-aldaeragatik (E. coli zenbakitzea, 1e eta f irudiak). Behaketa hau garrantzitsua da, erribosome eukariotikoen deskodetze-guneak normalean G1408 eta A1491 hondarrak dituelako, bakterio motako A1408 eta G1491 hondarrekin alderatuta. Aldaera honen oinarrian dago bakterio eta eukariotiko erribosomek erribosoma-antibiotikoen aminoglikosidoen familiako eta deskodetze-gunea helburu duten beste molekula txikiekiko duten sentikortasun desberdina. E. cuniculi erribosomaren deskodetze-gunean, A1491 hondarra U1491rekin ordezkatu zen, gune aktibo hau helburu duten molekula txikientzako lotura-interfaze berezi bat sortuz. A14901 aldaera bera beste mikrosporidio batzuetan ere badago, hala nola P. locustae eta V. necatrix-en, eta horrek iradokitzen du mikrosporidio espezieen artean oso hedatuta dagoela (1f irudia).
Gure E. cuniculi erribosoma laginak espora metabolikoki inaktiboetatik isolatu zirenez, E. cuniculi-ren krio-EM mapa probatu genuen estres edo gosete baldintzetan aurretik deskribatutako erribosomen lotura ikusteko. Hibernazio faktoreak 31,32,36,37, 38. Hibernatzen ari den erribosomaren aurretik ezarritako egitura E. cuniculi erribosomaren krio-EM maparekin parekatu genuen. Ainguratzeko, S. cerevisiae erribosomak erabili ziren Stm138 hibernazio faktorearekin konplexuan, locust erribosomak Lso232 faktorearekin konplexuan, eta V. necatrix erribosomak Mdf1 eta Mdf231 faktoreekin konplexuan. Aldi berean, Mdf1 atseden faktoreari dagokion krio-EM dentsitatea aurkitu genuen. Mdf1-ek V. necatrix erribosomara lotzen duen antzera, Mdf1-ek E. cuniculi erribosomara ere lotzen da, non erribosomaren E gunea blokeatzen duen, eta horrek, agian, parasitoen esporak metabolikoki inaktibo bihurtzen direnean gorputza inaktibatzen denean erribosomak eskuragarri jartzen laguntzen du (2. irudia).
Mdf1-ek erribosomaren E gunea blokeatzen du, eta horrek erribosoma inaktibatzen laguntzen duela dirudi parasitoen esporak metabolikoki inaktibo bihurtzen direnean. E. cuniculi erribosomaren egituran, ikusi genuen Mdf1-ek lehenago ezezaguna zen kontaktu bat sortzen duela L1 erribosomaren zurtoinarekin, hau da, proteinen sintesian zehar erribosomaren tRNA desazetilatua askatzea errazten duen erribosomaren zatiarekin. Kontaktu hauek iradokitzen dute Mdf1 erribosomaren bereizketa egiten duela tRNA desazetilatuarekin gertatzen den mekanismo bera erabiliz, eta horrek azalpen posible bat ematen du nola erribosomak Mdf1 kentzen duen proteinen sintesia berraktibatzeko.
Hala ere, gure egiturak kontaktu ezezagun bat agerian utzi zuen Mdf1 eta L1 erribosoma hankaren artean (proteinen sintesian zehar erribosomatik desazilatutako tRNA askatzen laguntzen duen erribosomaren zatia). Bereziki, Mdf1-ek desazilatutako tRNA molekularen ukondo segmentuaren kontaktu berdinak erabiltzen ditu (2. irudia). Aurretik ezezaguna zen eredu molekular honek erakutsi zuen Mdf1 erribosomatik bereizten dela desazetilatutako tRNAren mekanismo bera erabiliz, eta horrek azaltzen du nola kentzen duen erribosomak hibernazio faktore hau proteinen sintesia berraktibatzeko.
ARNr eredua eraikitzerakoan, E. cuniculi erribosomak ARNr zati anormalki tolestuak dituela ikusi genuen, eta horiei ARNr fusionatu deitu diegu (3. irudia). Bizitzaren hiru domeinuak hartzen dituzten erribosometan, ARNr-ak egituretan tolesten da, non ARNr base gehienak elkarren artean parekatu eta tolesten diren edo erribosoma-proteinekin elkarreragiten duten38,39,40. Hala ere, E. cuniculi erribosometan, ARNr-ek tolestura-printzipio hau urratzen dutela dirudi, beren helize batzuk ARNr eskualde tolestu bihurtuz.
S. cerevisiae, V. necatrix eta E. cuniculi-n H18 25S ARNr helizearen egitura. Normalean, hiru bizitza-domeinuak hartzen dituzten erribosometan, lotura-elementu hau 24 eta 34 hondar dituen ARN helize batean kiribiltzen da. Mikrosporidioetan, aldiz, ARNr lotura-elementu hau pixkanaka 12 hondar baino ez dituzten bi lotura-elementu uridina-kate bakarrekoetara murrizten da. Hondar horietako gehienak disolbatzaileen eraginpean daude. Irudiak erakusten du mikrosporidio parasitoek ARNr tolesturaren printzipio orokorrak urratzen dituztela, non ARNr baseak normalean beste base batzuei akoplatuta dauden edo ARNr-proteina interakzioetan parte hartzen duten. Mikrosporidioetan, ARNr zati batzuek tolestura desegokia hartzen dute, non aurreko ARNr helizea ia lerro zuzenean luzatutako zati kate bakarreko bihurtzen den. Eskualde ezohiko hauen presentziak mikrosporidio ARNr-ri urruneko ARN zatiak lotzeko aukera ematen dio ARN base kopuru minimoa erabiliz.
Eboluzio-trantsizio honen adibiderik deigarriena H18 25S ARNr helizean ikus daiteke (3. irudia). E. colitik gizakietarainoko espezieetan, ARNr helize honen baseek 24-32 nukleotido dituzte, helize apur bat irregularra osatuz. Aurretik identifikatutako V. necatrix eta P. locustae-ren erribosoma-egituretan,31,32 H18 helizearen baseak partzialki deseginak daude, baina nukleotidoen baseen parekatzea mantentzen da. Hala ere, E. cuniculi-n ARNr zati hau bihurtzen da lotura-emaile laburrena, 228UUUGU232 eta 301UUUUUUUUUU307. Ohiko ARNr zatiek ez bezala, uridinaz aberatsak diren lotura-emaile hauek ez dira kiribiltzen edo kontaktu zabala egiten erribosoma-proteinekin. Horren ordez, disolbatzailearekiko irekiak eta guztiz zabaldutako egiturak hartzen dituzte, non ARNr kateak ia zuzen luzatzen diren. Konformazio luzatu honek azaltzen du nola E. cuniculi-k 12 RNA base bakarrik erabiltzen dituen H16 eta H18 rRNA helizeen arteko 33 Å-ko hutsunea betetzeko, beste espezie batzuek, berriz, gutxienez rRNA base bikoitza behar dituzten hutsunea betetzeko.
Horrela, froga dezakegu, energetikoki tolestura desegokiaren bidez, mikrosporidio parasitoek estrategia bat garatu dutela bizitzaren hiru domeinuetan espezieen artean kontserbatuta jarraitzen duten rRNA segmentuak ere uzkurtzeko. Antza denez, rRNA helizeak poli-U lotura labur bihurtzen dituzten mutazioak metatuz, E. cuniculi-k rRNA zati ezohikoak sor ditzake, ahalik eta nukleotido gutxien dituztenak, distaleko rRNA zatien ligadurarako. Horrek azaltzen laguntzen du nola mikrosporidioek beren oinarrizko egitura molekularrean murrizketa dramatikoa lortu zuten beren egitura- eta funtzionaltasun-osotasuna galdu gabe.
E. cuniculi ARNr-aren beste ezaugarri ezohiko bat ARNr-aren itxura loditzerik gabea da (4. irudia). Gorabeherak base-parerik gabeko nukleotidoak dira, ARN helizetik kanpo bihurritzen direnak, bertan ezkutatu beharrean. ARNr-aren irtengune gehienek itsasgarri molekular gisa jokatzen dute, ondoko erribosoma-proteinak edo beste ARNr zati batzuk lotzen lagunduz. Gorabehera batzuek gontz gisa jokatzen dute, ARNr-aren helizea modu optimoan tolestu eta malgutzea ahalbidetuz proteinen sintesi produktiborako 41.
a ARNr irtengune bat (S. cerevisiae zenbakitzea) ez dago E. cuniculi erribosoma egituran, baina beste eukarioto gehienetan agertzen da b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens eta E. cuniculi barne erribosomatan. Parasitoek ez dituzte ARNr-ren koska zahar eta oso kontserbatu asko. Loditze hauek erribosoma egitura egonkortzen dute; beraz, mikrosporidioetan ez egoteak mikrosporidio parasitoetan ARNr-ren tolesturaren egonkortasun murriztua adierazten du. P zurtoinekin (L7/L12 zurtoinak bakterioetan) alderatzeak erakusten du ARNr-ren koska galtzea batzuetan galdutako koska berrien agerpenarekin bat datorrela. 23S/28S ARNr-ko H42 helizeak koska zahar bat du (U1206 Saccharomyces cerevisiae-n), gutxienez 3.500 milioi urte dituela kalkulatzen dena, bizitzaren hiru domeinutan duen babesagatik. Mikrosporidioetan, koska hau ezabatzen da. Hala ere, koska berri bat agertu zen galdutako koska horren ondoan (A1306 E. cuniculi-n).
Harrigarria bada ere, aurkitu genuen E. cuniculi erribosomek ez dituztela beste espezie batzuetan aurkitzen diren rRNA irtengune gehienak, beste eukarioto batzuetan kontserbatzen diren 30 irtengune baino gehiago barne (4a irudia). Galera honek erribosomaren azpiunitateen eta ondoko rRNA helizeen arteko kontaktu asko ezabatzen ditu, batzuetan hutsune handiak sortuz erribosomaren barruan, E. cuniculi erribosoma erribosoma tradizionalagoekin alderatuta porotsuagoa bihurtuz (4b irudia). Aipagarria da, aurkitu genuen irtengune horietako gehienak lehenago identifikatutako V. necatrix eta P. locustae erribosoma egituretan ere galdu zirela, aurreko egitura-analisietan baztertu baitziren31,32.
Batzuetan, ARNr-ren gongoilak galtzearekin batera, galdutako gongoilaren ondoan gongoil berriak garatzen dira. Adibidez, erribosomaren P-zurtoinak U1208 gongoil bat dauka (Saccharomyces cerevisiae-n), E. coli-tik gizakietara bizirik iraun zuena eta, beraz, 3.500 milioi urte dituela kalkulatzen da. Proteinen sintesian zehar, gongoil honek P zurtoinari konformazio ireki eta itxien artean mugitzen laguntzen dio, erribosomak itzulpen faktoreak kontratatu eta gune aktibora eraman ahal izan ditzan. E. cuniculi erribosometan, loditze hori ez dago; hala ere, hiru base-paretan bakarrik kokatutako loditze berri batek (G883) P zurtoinaren malgutasun optimoa berreskuratzen lagun dezake (4c irudia).
Gure datuek, eztandarik gabeko ARNr-ari buruz, iradokitzen dute ARNr-aren minimizazioa ez dela erribosomaren gainazaleko ARNr elementuen galerara mugatzen, baizik eta erribosomaren nukleoa ere inplika dezakeela, zelula askeetan deskribatu ez den parasitoaren akats molekular espezifiko bat sortuz. Espezie bizidunak ikusten dira.
Erribosomaren proteina kanonikoak eta ARNr modelatu ondoren, ohiko erribosomaren osagaiek ezin dituztela azaldu krio-EM irudiaren hiru zatiak. Zati horietako bi molekula txikiak dira (5. irudia, 8. irudi osagarria). Lehenengo segmentua uL15 eta eL18 erribosomaren proteinen artean dago, normalean eL18-ren C-muturrak hartzen duen posizioan, E. cuniculi-n laburtzen dena. Molekula honen identitatea zehaztu ezin badugu ere, dentsitate-uharte honen tamaina eta forma ondo azaltzen dira espermidina molekulen presentziak. Erribosomarekiko lotura uL15 proteinen (Asp51 eta Arg56) mikrosporidioen mutazio espezifikoek egonkortzen dute, eta badirudi erribosomaren molekula txiki honen afinitatea handitzen dutela, uL15-ek molekula txikia erribosomaren egitura batean biltzea ahalbidetzen baitute. 2. irudi osagarria). 8, 1, 2 datu gehigarriak.
Krio-EM irudiek E. cuniculi erribosomari lotutako erribosaren kanpoaldeko nukleotidoen presentzia erakusten dute. E. cuniculi erribosoman, nukleotido honek 25S rRNA A3186 nukleotidoaren (Saccharomyces cerevisiae zenbakitzea) leku bera hartzen du beste erribosoma eukarioto gehienetan. b E. cuniculi-ren erribosoma-egituran, nukleotido hau uL9 eta eL20 erribosoma-proteinen artean dago, eta horrela bi proteinen arteko kontaktua egonkortzen du. cd eL20 sekuentziaren kontserbazioaren analisia mikrosporidio espezieen artean. Mikrosporidio espezieen zuhaitz filogenetikoak (c) eta eL20 proteinaren sekuentzia anitzeko lerrokatzeak (d) erakusten dute F170 eta K172 nukleotidoen lotura-hondakinak mikrosporidio tipiko gehienetan kontserbatzen direla, S. lophii izan ezik, adarkatze goiztiarreko Mikrosporidioak izan ezik, zeinek ES39L rRNA luzapena mantendu baitzuten. e Irudi honek erakusten du F170 eta K172 nukleotidoen lotura-hondakinak mikrosporidioen genoma oso murriztuaren eL20-n bakarrik daudela, baina ez beste eukarioto batzuetan. Oro har, datu hauek iradokitzen dute mikrosporidio erribosomek nukleotidoen lotura-gune bat garatu dutela, AMP molekulak lotzen dituena eta erribosomen egituran proteina-proteina elkarrekintzak egonkortzeko erabiltzen dituena. Lotura-gune honen kontserbazio handiak mikrosporidioetan eta beste eukarioto batzuetan duen gabeziak iradokitzen du gune honek mikrosporidioentzako biziraupen selektiboko abantaila eman dezakeela. Beraz, mikrosporidio erribosoman nukleotidoen lotura-poltsikoa ez dirudi rRNA degradazioaren ezaugarri endekatua edo amaierako forma denik, aurretik deskribatu bezala, baizik eta eboluzio-berrikuntza erabilgarria, mikrosporidio erribosomari molekula txikiak zuzenean lotzeko aukera ematen diona, erribosomen eraikuntza-bloke molekular gisa erabiliz. Aurkikuntza honek mikrosporidio erribosoma bihurtzen du nukleotido bakarra bere eraikuntza-bloke estruktural gisa erabiltzen duen erribosoma bakarra. f Nukleotidoen loturatik eratorritako eboluzio-bide hipotetikoa.
Bigarren pisu molekular baxuko dentsitatea uL9 eta eL30 erribosoma-proteinen arteko interfazean dago (5a irudia). Interfaze hau lehenago deskribatu zen Saccharomyces cerevisiae erribosomaren egituran A3186 rRNAren 25S nukleotidoaren lotura-gune gisa (ES39L rRNA luzapenaren parte)38. Frogatu zen P. locustae ES39L erribosoma endekatuetan interfaze honek nukleotido bakar ezezagun bati lotzen diola 31, eta nukleotido hau rRNAren forma final murriztua dela suposatzen da, non rRNAren luzera ~130-230 base den. ES39L nukleotido bakar batera murrizten da 32.43. Gure krio-EM irudiek dentsitatea nukleotidoen bidez azal daitekeela dioen ideia babesten dute. Hala ere, gure egituraren bereizmen handiagoak erakutsi zuen nukleotido hau erribosomatik kanpoko molekula bat dela, agian AMP (5a eta b irudiak).
Ondoren, nukleotidoen lotura-gunea E. cuniculi erribosoman agertzen zen ala lehenago existitzen zen galdetu genuen. Nukleotidoen lotura batez ere eL30 erribosoma-proteinaren Phe170 eta Lys172 hondarrek bitartekatzen dutenez, hondar horien kontserbazioa ebaluatu genuen 4396 eukarioto adierazgarritan. Goiko uL15-aren kasuan bezala, ikusi genuen Phe170 eta Lys172 hondarrak oso kontserbatuta daudela Microsporidia tipikoetan bakarrik, baina ez daudela beste eukarioto batzuetan, Mitosporidium eta Amphiamblys Microsporidia atipikoak barne, non ES39L rRNA zatia ez den murriztua 44, 45, 46 (5c irudia). -e).
Datu hauek guztiek bat eginda, E. cuniculi-k eta agian beste mikrosporidio kanoniko batzuek erribosoma-egituran metabolito txiki kopuru handia eraginkortasunez harrapatzeko gaitasuna garatu dutela dioten ideia babesten dute, ARNr eta proteina mailen beherakada konpentsatzeko. Horrela, erribosomatik kanpo nukleotidoak lotzeko gaitasun berezia garatu dute, eta horrek erakusten du egitura molekular parasitoek metabolito txiki ugari harrapatuz eta ARN eta proteina zati degradatuen imitazio estruktural gisa erabiliz konpentsatzen dutela.
Gure krio-EM maparen hirugarren zati simulatu gabea, erribosoma azpiunitate handian aurkitua. Gure maparen bereizmen nahiko altuak (2,6 Å) iradokitzen du dentsitate hau alboko kate handiko hondarren konbinazio bereziak dituzten proteinei dagokiela, eta horrek dentsitate hau aurretik ezezaguna zen erribosoma-proteina gisa identifikatzea ahalbidetu zigun, eta msL2 (Microsporidia-specific protein L2) izena eman zitzaion (metodoak, 6. irudia). Gure homologia-bilaketa honek erakutsi zuen msL2 Encephaliter eta Orosporidium generoko Microsporidia kladoan kontserbatzen dela, baina beste espezie batzuetan ez dagoela, beste Microsporidia batzuk barne. Erribosoma-egituran, msL2-k ES31L rRNA luzatuaren galerak sortutako hutsune bat hartzen du. Hutsune horretan, msL2-k rRNAren tolestura egonkortzen laguntzen du eta ES31L-ren galera konpentsatu dezake (6. irudia).
a E. cuniculi erribosometan aurkitutako Microsporidia-ren msL2 erribosom proteina espezifikoaren dentsitate elektronikoa eta eredua. b Eukarioto erribosoma gehienek, Saccharomyces cerevisiae-ren 80S erribosoma barne, ES19L rRNA anplifikazioa galdu dute Microsporidian espezie gehienetan. V. necatrix mikrosporidia erribosomaren aurretik ezarritako egiturak iradokitzen du parasito hauetan ES19L-ren galera msL1 erribosom proteina berriaren eboluzioak konpentsatzen duela. Ikerketa honetan, ikusi dugu E. cuniculi erribosomak erribosomaren RNA imitazio-proteina gehigarri bat ere garatu duela, ES19L-ren galeraren itxurazko konpentsazio gisa. Hala ere, msL2-k (gaur egun ECU06_1135 proteina hipotetiko gisa anotatua) eta msL1-k jatorri estruktural eta ebolutibo desberdinak dituzte. c Eboluzionari dagokionez erlazionatu gabeko msL1 eta msL2 erribosomaren proteinen sorreraren aurkikuntza honek iradokitzen du erribosomek beren ARNr-an mutazio kaltegarriak metatzen badituzte, konposizio-aniztasun maila paregabeak lor ditzaketela espezie estuki erlazionatuen azpimultzo txiki batean ere. Aurkikuntza honek mitokondrio-erribosomaren jatorria eta eboluzioa argitzen lagun dezake, zeina ARNr oso murriztua eta espezieen arteko proteinen konposizioan aldakortasun anormala duelako ezaguna den.
Ondoren, msL2 proteina aurretik deskribatutako msL1 proteinarekin alderatu genuen, V. necatrix erribosoman aurkitzen den mikrosporidioen aurkako erribosoma-proteina bakarrarekin. msL1 eta msL2 eboluzionari dagokionez erlazionatuta dauden egiaztatu nahi genuen. Gure analisiak erakutsi zuen msL1 eta msL2 erribosoma-egiturako barrunbe bera okupatzen dutela, baina lehen eta hirugarren mailako egitura desberdinak dituztela, eta horrek haien jatorri ebolutibo independentea adierazten du (6. irudia). Beraz, msL2-ren aurkikuntzak frogatzen du espezie eukarioto trinkoen taldeek modu independentean eboluzionatu dezaketela egitura aldetik desberdinak diren erribosoma-proteinak rRNA zatien galera konpentsatzeko. Aurkikuntza hau nabarmena da, zitoplasmako eukarioto erribosoma gehienek proteina aldaezin bat dutelako, 81 erribosoma-proteinako familia bera barne. msL1 eta msL2 mikrosporidioen hainbat kladotan agertzeak rRNA segmentu luzatuen galerari erantzunez iradokitzen du parasitoaren arkitektura molekularraren degradazioak parasitoak konpentsazio-mutazioak bilatzera bultzatzen dituela, eta horrek azkenean parasito-populazio desberdinetan eskuratzea ekar dezakeela.
Azkenik, gure eredua amaitutakoan, E. cuniculi erribosomaren konposizioa genomaren sekuentziatik aurreikusitakoarekin alderatu genuen. Aurretik uste zen hainbat erribosom proteina, besteak beste, eL14, eL38, eL41 eta eS30, E. cuniculi genoman falta zirela, haien homologoak E. cuniculi genoman itxuraz ez zeudelako. Erribosom proteina askoren galera beste zelula barneko parasito eta endosinbionte gehienetan ere aurreikusten da. Adibidez, bakterio bizidun gehienek 54 erribosom proteinako familia bera badute ere, proteina familia horietako 11k baino ez dituzte detektagarriak diren homologoak ostalariaren murrizketa duten bakterioen genoma bakoitzean. Ideia hau babesteko, erribosom proteinen galera esperimentalki ikusi da V. necatrix eta P. locustae mikrosporidioetan, eta hauek ez dute eL38 eta eL4131,32 proteinarik.
Hala ere, gure egiturek erakusten dute eL38, eL41 eta eS30 bakarrik galtzen direla benetan E. cuniculi erribosoman. eL14 proteina kontserbatu zen eta gure egiturak erakutsi zuen zergatik ezin izan zen proteina hau homologia bilaketan aurkitu (7. irudia). E. cuniculi erribosoman, eL14 lotura-gunearen zatirik handiena galtzen da rRNAz anplifikatutako ES39L-ren degradazioaren ondorioz. ES39Lrik ezean, eL14-k bere bigarren mailako egituraren zatirik handiena galdu zuen, eta eL14 sekuentziaren % 18 baino ez zen berdina E. cuniculi eta S. cerevisiae-n. Sekuentziaren kontserbazio eskas hau nabarmena da, Saccharomyces cerevisiae eta Homo sapiens-ek ere —1.500 milioi urteko aldearekin eboluzionatu zuten organismoek— hondakin berdinen % 51 baino gehiago partekatzen baitituzte eL14-n. Kontserbazio-galera anomalo honek azaltzen du zergatik E. cuniculi eL14 gaur egun ustezko M970_061160 proteina gisa anotatuta dagoen eta ez eL1427 erribosoma-proteina gisa.
Eta Microsporidia erribosomak ES39L rRNA luzapena galdu zuen, eta horrek eL14 erribosoma proteina lotzeko gunea partzialki ezabatu zuen. ES39Lrik ezean, eL14 mikrospora proteinak bigarren mailako egitura galtzen du, eta bertan, aurreko rRNA lotura-α-helizea luzera minimoko begizta batean endekatzen da. b Sekuentzia anitzeko lerrokatzeak erakusten du eL14 proteina oso kontserbatuta dagoela espezie eukariotoetan (% 57ko sekuentzia-identitatea legamia eta gizakien homologoen artean), baina gaizki kontserbatuta eta dibergentea dela mikrosporidioetan (non hondakinen % 24 baino gehiago ez diren eL14 homologoaren berdinak). S. cerevisiae edo H. sapiens-etik). Sekuentziaren kontserbazio eskas honek eta bigarren mailako egituraren aldakortasun horrek azaltzen dute zergatik ez den inoiz eL14 homologoa aurkitu E. cuniculi-n eta zergatik uste den proteina hau galdu dela E. cuniculi-n. Aitzitik, E. cuniculi eL14 lehenago M970_061160 proteina gisa anotatua izan zen. Behaketa honek iradokitzen du mikrosporidioen genomaren dibertsitatea gehiegi estimatzen dela gaur egun: mikrosporidioetan galduta daudela uste den gene batzuk, egia esan, kontserbatzen dira, oso forma bereizietan bada ere; horren ordez, batzuek zizare-proteina espezifikoetarako mikrosporidioen geneak kodetzen dituztela uste da (adibidez, M970_061160 proteina hipotetikoak, hain zuzen ere, beste eukarioto batzuetan aurkitzen diren proteina oso anitzak kodetzen ditu.
Aurkikuntza honek iradokitzen du ARNraren desnaturalizazioak sekuentzia-kontserbazioaren galera nabarmena ekar dezakeela ondoko erribosoma-proteinetan, eta horrek proteina horiek detektaezin bihurtzen dituela homologia-bilaketetarako. Beraz, gehiegi estimatu dezakegu genoma txikiko organismoetan gertatzen den degradazio molekularraren benetako maila, galdu direla uste den proteina batzuk benetan irauten baitute, oso forma aldatuetan bada ere.
Nola mantendu dezakete parasitoek beren makina molekularren funtzioa genomaren murrizketa muturreko baldintzetan? Gure ikerketak galdera honi erantzuten dio E. cuniculi-ren egitura molekular konplexua (erribosoma) deskribatuz, genoma eukarioto txikienetako bat duen organismo bat.
Ia bi hamarkadaz jakina da mikrobio-parasitoetako proteina eta RNA molekulak espezie askeetan dituzten molekula homologoetatik desberdinak direla, kalitate-kontrol zentrorik ez dutelako, mikrobio askeetan beren tamainaren % 50era murrizten direlako, etab. tolestura eta funtzioa kaltetzen dituzten mutazio ahultzaile asko dituztelako. Adibidez, genoma txikiko organismoen erribosomek, zelula barneko parasito eta endosinbionte asko barne, hainbat erribosomaren proteina eta rRNA nukleotidoen heren bat falta izatea espero da, espezie askeekin alderatuta 27, 29, 30, 49. Hala ere, molekula hauek parasitoetan nola funtzionatzen duten misterio bat da oraindik ere, batez ere genomika konparatiboaren bidez aztertua.
Gure ikerketak erakusten du makromolekulen egiturak eboluzioaren alderdi asko agerian utzi ditzakeela, eta alderdi horiek zailak dira zelula barruko parasitoen eta ostalari mugatuko beste organismo batzuen genomikako ikerketa konparatibo tradizionaletatik ateratzea (7. irudi osagarria). Adibidez, eL14 proteinen adibideak erakusten du espezie parasitoetan molekula-aparatuaren degradazio-maila gehiegi estimatu dezakegula. Uste da orain ehunka mikrosporidio-gene espezifiko dituztela parasito entzefalitikoek. Hala ere, gure emaitzek erakusten dute itxuraz espezifiko diren gene horietako batzuk, egia esan, beste eukarioto batzuetan ohikoak diren geneen aldaera oso desberdinak direla. Gainera, msL2 proteinen adibideak erakusten du nola baztertzen ditugun erribosoma-proteina berriak eta gutxiesten ditugun makina molekular parasitoen edukia. Molekula txikien adibideak erakusten du nola bazter ditzakegun jarduera biologiko berria eman diezaieketen egitura molekular parasitoetan dauden berrikuntza burutsuenak.
Emaitza hauek, oro har, ostalari mugatuko organismoen eta organismo bizidun askeen egitura molekularren arteko desberdintasunen ulermena hobetzen dute. Erakusten dugu makina molekularrek, aspalditik murriztuak, endekatuak eta hainbat mutazio ahultzaileren menpe daudela uste izan direnek, sistematikoki ahaztutako ezaugarri estruktural ezohiko multzo bat dutela.
Bestalde, E. cuniculi-ren erribosometan aurkitu ditugun rRNA zati ez-handiek eta fusionatutako zatiek iradokitzen dute genomaren murrizketak bizitzaren hiru domeinuetan kontserbatzen diren oinarrizko molekula-makineria zatiak ere alda ditzakeela – ia 3.500 milioi urte igaro ondoren. espezieen eboluzio independentea.
E. cuniculi erribosomako ARNr zati fusionatu eta hanturarik gabekoak bereziki interesgarriak dira bakterio endosinbiotikoen ARN molekulen aurreko ikerketen argitan. Adibidez, Buchnera aphidicola zorri endosinbiontean, ARNr eta ARNt molekulek tenperaturarekiko egiturak sentikorrak dituztela frogatu da, A+T konposizio-alborapenaren eta base-pare ez-kanonikoen proportzio handi baten ondorioz20,50. ARNn izandako aldaketa hauek, baita proteina molekulen aldaketak ere, endosinbionteen bikotekideekiko gehiegizko menpekotasunaren eta endosinbionteek beroa transferitzeko ezintasunaren erantzule direla uste da orain 21, 23. Mikrosporidio parasitoen ARNr-ak egitura aldetik aldaketa desberdinak dituen arren, aldaketa horien izaerak iradokitzen du egonkortasun termiko murriztua eta chaperona proteinen menpekotasun handiagoa genoma murriztua duten organismoetako ARN molekulen ezaugarri komunak izan daitezkeela.
Bestalde, gure egiturek erakusten dute parasitoen mikrosporidioek gaitasun berezia garatu dutela ARNr eta proteina zatiki kontserbatuak erresistentzia egiteko, metabolito txiki ugari eta erraz eskuragarriak erabiltzeko gaitasuna garatuz ARNr eta proteina zatiki endekatuen imitazio estruktural gisa. Egitura molekularraren degradazioa. . Iritzi hau E. cuniculi-ren ARNr eta erribosometan proteina zatikien galera konpentsatzen duten molekula txikiek uL15 eta eL30 proteinetako mikrosporidioen hondar espezifikoetara lotzen direlako egitateak babesten du. Horrek iradokitzen du molekula txikien erribosometara lotzea hautespen positiboaren produktua izan daitekeela, non erribosom proteinen mikrosporidioen mutazio espezifikoak hautatu baitira molekula txikiekiko erribosomek duten afinitatea handitzeko gaitasunagatik, eta horrek erribosom organismo eraginkorragoak ekar ditzake. Aurkikuntzak berrikuntza adimentsu bat agerian uzten du parasito mikrobianoen egitura molekularrean, eta hobeto ulertzen laguntzen digu nola mantentzen duten parasitoen egitura molekularrek beren funtzioa eboluzio murriztailea izan arren.
Gaur egun, molekula txiki hauen identifikazioa ez dago argi. Ez dago argi zergatik den desberdina molekula txiki hauen itxura erribosoma-egituran mikrosporidio espezieen artean. Bereziki, ez dago argi zergatik ikusten den nukleotidoen lotura E. cuniculi eta P. locustae-ren erribosometan, eta ez V. necatrix-en erribosometan, V. necatrix-en eL20 eta K172 proteinetan F170 hondarra egon arren. Ezabatze hau 43 uL6 hondarrak eragin dezake (nukleotidoen lotura-poltsikoaren ondoan kokatua), tirosina dena V. necatrix-en eta ez treonina E. cuniculi eta P. locustae-n. Tyr43-ren alboko kate aromatiko handiak nukleotidoen loturan eragin dezake gainjartze esterikoagatik. Bestela, nukleotidoen ezabatze itxurazkoa krio-EM irudien bereizmen baxuaren ondorio izan daiteke, eta horrek V. necatrix-en erribosomen zatien modelizazioa oztopatzen du.
Bestalde, gure lanak iradokitzen du genomaren gainbehera prozesua indar berritzailea izan daitekeela. Bereziki, E. cuniculi erribosomaren egiturak iradokitzen du mikrosporidio erribosomaren ARNr eta proteina zatien galerak eboluzio-presioa sortzen duela, eta horrek erribosomaren egituran aldaketak sustatzen dituela. Aldaera hauek erribosomaren gune aktibotik urrun gertatzen dira eta badirudi ARNr murriztuak bestela eten egingo lukeen erribosomaren muntaketa optimoa mantentzen (edo berreskuratzen) laguntzen dutela. Horrek iradokitzen du mikrosporidio erribosomaren berrikuntza garrantzitsu bat geneen jitoa leuntzeko behar bihurtu dela.
Agian hau ondoen ilustratzen du nukleotidoen loturak, orain arte beste organismo batzuetan inoiz ikusi ez dena. Nukleotidoen lotura-hondakinak mikrosporidio tipikoetan egoteak, baina ez beste eukarioto batzuetan, iradokitzen du nukleotidoen lotura-guneak ez direla desagertzeko zain dauden erlikiak edo ARNr nukleotido indibidualen formara berreskuratzeko azken gunea. Horren ordez, gune hau hainbat hautespen positiboko txandatan zehar eboluzionatu zezakeen ezaugarri erabilgarria dela dirudi. Nukleotidoen lotura-guneak hautespen naturalaren azpiproduktu bat izan daitezke: ES39L degradatzen denean, mikrosporidioak konpentsazioa bilatu behar izaten dute erribosomaren biogenesi optimoa berreskuratzeko ES39L gabe. Nukleotido honek ES39L-ko A3186 nukleotidoaren kontaktu molekularrak imita ditzakeenez, nukleotido molekula erribosomaren eraikuntza-bloke bihurtzen da, eta lotura are gehiago hobetzen da eL30 sekuentziaren mutazioaren bidez.
Zelula barneko parasitoen eboluzio molekularrari dagokionez, gure ikerketak erakusten du hautespen natural darwindarraren eta genomaren gainbeheraren jito genetikoaren indarrak ez direla paraleloan funtzionatzen, baizik eta oszilatzen direla. Lehenik eta behin, jito genetikoak biomolekulen ezaugarri garrantzitsuak ezabatzen ditu, eta horrek konpentsazioa oso beharrezkoa bihurtzen du. Parasitoek behar hori hautespen natural darwindarraren bidez asetzen dutenean bakarrik izango dute haien makromolekulek beren ezaugarri ikusgarrienak eta berritzaileenak garatzeko aukera. Garrantzitsua da, E. cuniculi erribosoman nukleotidoen lotura-guneen eboluzioak iradokitzen du eboluzio molekularraren galera-irabazi eredu honek ez dituela mutazio kaltegarriak amortizatzen bakarrik, baizik eta batzuetan funtzio guztiz berriak ematen dizkiela makromolekula parasitoei.
Ideia hau Sewell Wright-en oreka mugikorraren teoriarekin bat dator, zeinak dioen hautespen naturalaren sistema zorrotz batek organismoen berrikuntza-gaitasuna mugatzen duela51,52,53. Hala ere, jito genetikoak hautespen naturala eten egiten badu, jito horiek berez moldagarriak ez diren (edo kaltegarriak ere) aldaketak sor ditzakete, baina egokitasun handiagoa edo jarduera biologiko berria ematen duten aldaketa gehiago dakartzate. Gure esparruak ideia hau babesten du, biomolekula baten tolestura eta funtzioa murrizten duen mutazio mota bera dela bere hobekuntzaren eragile nagusia erakusten baitu. Irabazi-irabazi eboluzio ereduarekin bat etorriz, gure ikerketak erakusten du genomaren gainbehera, tradizionalki prozesu degeneratibo gisa ikusten dena, berrikuntzaren eragile nagusia ere badela, batzuetan eta agian askotan makromolekulei jarduera parasito berriak eskuratzea ahalbidetuz. horiek erabil ditzakete.