Salamat sa pagbisita sa Nature.com. Limitado ang suporta sa CSS sa bersyon ng browser na iyong ginagamit. Para sa pinakamahusay na karanasan, inirerekomenda namin na gumamit ka ng updated na browser (o i-disable ang Compatibility Mode sa Internet Explorer). Samantala, upang matiyak ang patuloy na suporta, ire-render namin ang site nang walang mga style at JavaScript.
Ang ebolusyon ng mga microbial parasite ay kinabibilangan ng isang kontraksyon sa pagitan ng natural selection, na nagiging sanhi ng pagbuti ng mga parasito, at genetic drift, na nagiging sanhi ng pagkawala ng mga gene ng mga parasito at pag-iipon ng mga nakapipinsalang mutasyon. Dito, upang maunawaan kung paano nangyayari ang kontraksyong ito sa laki ng isang macromolecule, inilalarawan namin ang istrukturang cryo-EM ng ribosome ng Encephalitozoon cuniculi, isang eukaryotic na organismo na may isa sa pinakamaliit na genome sa kalikasan. Ang matinding pagbawas ng rRNA sa mga ribosome ng E. cuniculi ay sinasamahan ng mga walang kapantay na pagbabago sa istruktura, tulad ng ebolusyon ng mga dating hindi kilalang fused rRNA linker at rRNA na walang mga umbok. Bilang karagdagan, ang ribosome ng E. cuniculi ay nakaligtas sa pagkawala ng mga fragment at protina ng rRNA sa pamamagitan ng pagbuo ng kakayahang gumamit ng maliliit na molekula bilang mga structural mimic ng mga degraded na fragment at protina ng rRNA. Sa pangkalahatan, ipinapakita namin na ang mga istrukturang molekular na matagal nang inaakalang nabawasan, nabubulok, at napapailalim sa mga nakakapanghinang mutasyon ay may ilang mga mekanismo ng compensatory na nagpapanatili sa kanila na aktibo sa kabila ng matinding molecular contractions.
Dahil karamihan sa mga grupo ng mga microbial parasite ay may natatanging mga molekular na kagamitan upang samantalahin ang kanilang mga host, madalas tayong kailangang bumuo ng iba't ibang therapeutic para sa iba't ibang grupo ng mga parasite1,2. Gayunpaman, iminumungkahi ng mga bagong ebidensya na ang ilang aspeto ng ebolusyon ng parasito ay magkakaugnay at higit na nahuhulaan, na nagpapahiwatig ng isang potensyal na batayan para sa malawak na therapeutic interventions sa mga microbial parasite3,4,5,6,7,8,9.
Natukoy ng mga nakaraang pag-aaral ang isang karaniwang ebolusyonaryong kalakaran sa mga microbial parasite na tinatawag na genome reduction o genome decay10,11,12,13. Ipinapakita ng kasalukuyang pananaliksik na kapag tinalikuran ng mga mikroorganismo ang kanilang malayang pamumuhay at naging mga intracellular parasite (o endosymbiont), ang kanilang mga genome ay sumasailalim sa mabagal ngunit kamangha-manghang mga metamorphoses sa loob ng milyun-milyong taon9,11. Sa isang prosesong kilala bilang genome decay, ang mga microbial parasite ay nag-iipon ng mga nakapipinsalang mutasyon na ginagawang pseudogenes ang maraming dating mahahalagang gene, na humahantong sa unti-unting pagkawala ng gene at mutational collapse14,15. Ang pagbagsak na ito ay maaaring sumira ng hanggang 95% ng mga gene sa pinakamatandang intracellular organism kumpara sa malapit na kaugnay na mga malayang pamumuhay na species. Kaya, ang ebolusyon ng mga intracellular parasite ay isang labanan sa pagitan ng dalawang magkasalungat na puwersa: ang Darwinian natural selection, na humahantong sa pagbuti ng mga parasite, at ang pagbagsak ng genome, na naglalagay sa mga parasite sa limot. Kung paano nagawang lumabas ng parasite mula sa labanang ito at mapanatili ang aktibidad ng istrukturang molekular nito ay nananatiling hindi malinaw.
Bagama't hindi pa lubos na nauunawaan ang mekanismo ng pagkabulok ng genome, tila ito ay pangunahing nangyayari dahil sa madalas na genetic drift. Dahil ang mga parasito ay nabubuhay sa maliliit, asekswal, at limitado sa genetikong populasyon, hindi nila epektibong maaalis ang mga nakapipinsalang mutasyon na minsan ay nangyayari sa panahon ng replikasyon ng DNA. Ito ay humahantong sa hindi na mababaligtad na akumulasyon ng mga mapaminsalang mutasyon at pagbawas ng genome ng parasito. Bilang resulta, ang parasito ay hindi lamang nawawala ang mga gene na hindi na kinakailangan para sa kaligtasan nito sa intracellular na kapaligiran. Ang kawalan ng kakayahan ng mga populasyon ng parasito na epektibong maalis ang mga kalat-kalat na nakapipinsalang mutasyon ang nagiging sanhi ng pag-iipon ng mga mutasyong ito sa buong genome, kabilang ang kanilang pinakamahalagang mga gene.
Karamihan sa ating kasalukuyang pag-unawa sa pagbawas ng genome ay batay lamang sa mga paghahambing ng mga pagkakasunud-sunod ng genome, na may mas kaunting atensyon sa mga pagbabago sa aktwal na mga molekula na gumaganap ng mga tungkulin sa pag-aalaga ng bahay at nagsisilbing mga potensyal na target ng gamot. Ipinakita ng mga paghahambing na pag-aaral na ang pasanin ng mga nakapipinsalang intracellular microbial mutations ay tila naglalagay sa mga protina at nucleic acid sa maling pagkakatiklop at pagsasama-sama, na ginagawa silang mas umaasa sa chaperone at hypersensitive sa init19,20,21,22,23. Bilang karagdagan, ang iba't ibang mga parasito—mga independiyenteng ebolusyon na minsan ay pinaghihiwalay ng hanggang 2.5 bilyong taon—ay nakaranas ng katulad na pagkawala ng mga quality control center sa kanilang protein synthesis5,6 at mga mekanismo ng pagkukumpuni ng DNA24. Gayunpaman, kaunti lamang ang nalalaman tungkol sa epekto ng intracellular lifestyle sa lahat ng iba pang mga katangian ng mga cellular macromolecule, kabilang ang molecular adaptation sa isang lumalaking pasanin ng mga nakapipinsalang mutasyon.
Sa gawaing ito, upang mas maunawaan ang ebolusyon ng mga protina at nucleic acid ng mga intracellular microorganism, natukoy namin ang istruktura ng mga ribosome ng intracellular parasite na Encephalitozoon cuniculi. Ang E. cuniculi ay isang organismong parang fungus na kabilang sa isang grupo ng parasitic microsporidia na may hindi pangkaraniwang maliliit na eukaryotic genomes at samakatuwid ay ginagamit bilang mga modelo ng organismo upang pag-aralan ang pagkabulok ng genome25,26,27,28,29,30. Kamakailan lamang, natukoy ang istruktura ng cryo-EM ribosome para sa mga katamtamang nabawasang genome ng Microsporidia, Paranosema locustae, at Vairimorpha necatrix31,32 (~3.2 Mb genome). Ang mga istrukturang ito ay nagmumungkahi na ang ilang pagkawala ng rRNA amplification ay nababayaran ng pagbuo ng mga bagong kontak sa pagitan ng mga kalapit na ribosomal protein o ang pagkuha ng mga bagong msL131,32 ribosomal protein. Ang mga uri na Encephalitozoon (genome na ~2.5 milyong bp), kasama ang kanilang pinakamalapit na kamag-anak na Ordospora, ay nagpapakita ng sukdulang antas ng pagbawas ng genome sa mga eukaryote – mayroon silang mas mababa sa 2000 na mga gene na nagko-code ng protina, at inaasahan na ang kanilang mga ribosome ay hindi lamang walang mga rRNA expansion fragment (mga rRNA fragment na nagpapaiba sa mga eukaryotic ribosome mula sa mga bacterial ribosome) kundi mayroon ding apat na ribosomal na protina dahil sa kanilang kakulangan ng mga homologue sa genome ng E. cuniculi26,27,28. Samakatuwid, napagpasyahan namin na ang ribosome ng E. cuniculi ay maaaring magbunyag ng mga dating hindi kilalang estratehiya para sa molecular adaptation sa pagkabulok ng genome.
Ang aming istrukturang cryo-EM ay kumakatawan sa pinakamaliit na eukaryotic cytoplasmic ribosome na mailalarawan at nagbibigay ng pananaw sa kung paano nakakaapekto ang sukdulang antas ng pagbawas ng genome sa istruktura, pagpupulong, at ebolusyon ng makinaryang molekular na mahalaga sa selula. Natuklasan namin na ang E. cuniculi ribosome ay lumalabag sa marami sa malawakang napreserbang mga prinsipyo ng RNA folding at ribosome assembly, at natuklasan ang isang bago, dating hindi kilalang ribosomal protein. Sa hindi inaasahang pagkakataon, ipinakita namin na ang mga microsporidia ribosome ay nakapagpaunlad ng kakayahang magbigkis ng maliliit na molekula, at ipinapalagay na ang mga truncation sa rRNA at mga protina ay nagpapalitaw ng mga ebolusyonaryong inobasyon na maaaring magbigay ng mga kapaki-pakinabang na katangian sa ribosome.
Upang mapabuti ang aming pag-unawa sa ebolusyon ng mga protina at nucleic acid sa mga intracellular organism, napagpasyahan naming ihiwalay ang mga spores ng E. cuniculi mula sa mga kultura ng mga nahawaang selula ng mammalian upang madalisay ang kanilang mga ribosome at matukoy ang istruktura ng mga ribosome na ito. Mahirap makakuha ng maraming parasitic microsporidia dahil ang microsporidia ay hindi maaaring ikultura sa isang nutrient medium. Sa halip, lumalaki at nagpaparami lamang ang mga ito sa loob ng host cell. Samakatuwid, upang makakuha ng biomass ng E. cuniculi para sa pagdalisay ng ribosome, hinawaan namin ang mammalian kidney cell line na RK13 ng mga spores ng E. cuniculi at kinultura ang mga nahawaang selulang ito sa loob ng ilang linggo upang payagan ang E. cuniculi na lumaki at dumami. Gamit ang isang nahawaang cell monolayer na halos kalahating metro kuwadrado, nagawa naming linisin ang humigit-kumulang 300 mg ng mga spores ng Microsporidia at gamitin ang mga ito upang ihiwalay ang mga ribosome. Pagkatapos ay hinaluan namin ang mga nadalisay na spores gamit ang mga glass beads at ihiwalay ang mga krudong ribosome gamit ang stepwise polyethylene glycol fractionation ng mga lysate. Nagbigay-daan ito sa amin na makakuha ng humigit-kumulang 300 µg ng hilaw na E. cuniculi ribosome para sa structural analysis.
Pagkatapos ay nangolekta kami ng mga imahe ng cryo-EM gamit ang mga nagresultang sample ng ribosome at pinroseso ang mga imaheng ito gamit ang mga mask na katumbas ng malaking ribosomal subunit, small subunit head, at small subunit. Sa prosesong ito, nangolekta kami ng mga imahe ng humigit-kumulang 108,000 ribosomal particle at kinalkula ang mga imahe ng cryo-EM na may resolusyon na 2.7 Å (Mga Karagdagang Larawan 1-3). Pagkatapos ay ginamit namin ang mga imahe ng cryoEM upang imodelo ang rRNA, ribosomal protein, at hibernation factor Mdf1 na nauugnay sa E. cuniculi ribosomes (Fig. 1a, b).
a Istruktura ng E. cuniculi ribosome na kasama ng hibernation factor na Mdf1 (pdb id 7QEP). b Mapa ng hibernation factor na Mdf1 na nauugnay sa E. cuniculi ribosome. c Mapa ng pangalawang istruktura na naghahambing sa narekober na rRNA sa mga Microsporidian species sa mga kilalang istrukturang ribosomal. Ipinapakita ng mga panel ang lokasyon ng mga pinalaking rRNA fragment (ES) at mga aktibong site ng ribosome, kabilang ang decoding site (DC), ang sarcinicin loop (SRL), at ang peptidyl transferase center (PTC). d Ang densidad ng electron na tumutugma sa peptidyl transferase center ng E. cuniculi ribosome ay nagmumungkahi na ang catalytic site na ito ay may parehong istruktura sa parasite ng E. cuniculi at mga host nito, kabilang ang H. sapiens. e, f Ang katumbas na densidad ng electron ng decoding center (e) at ang eskematiko na istruktura ng decoding center (f) ay nagpapahiwatig na ang E. cuniculi ay may mga residue na U1491 sa halip na A1491 (pagnunumero ng E. coli) sa maraming iba pang eukaryote. Ang pagbabagong ito ay nagmumungkahi na ang E. cuniculi ay maaaring sensitibo sa mga antibiotic na tumatarget sa aktibong site na ito.
Kabaligtaran sa mga dating itinatag na istruktura ng mga ribosome ng V. necatrix at P. locustae (parehong istruktura ang kumakatawan sa parehong pamilya ng microsporidia na Nosematidae at halos magkapareho), ang mga ribosome ng 31,32 E. cuniculi ay sumasailalim sa maraming proseso ng rRNA at pagkapira-piraso ng protina. Karagdagang denaturasyon (Mga Karagdagang Larawan 4-6). Sa rRNA, ang mga pinakakapansin-pansing pagbabago ay kinabibilangan ng kumpletong pagkawala ng pinalaking 25S rRNA fragment na ES12L at bahagyang pagkabulok ng mga helice ng h39, h41, at H18 (Larawan 1c, Karagdagang Larawan 4). Sa mga protina ng ribosomal, ang mga pinakakapansin-pansing pagbabago ay kinabibilangan ng kumpletong pagkawala ng protina ng eS30 at pag-ikli ng mga protina ng eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17, at eS7 (Mga Karagdagang Larawan 4, 5).
Kaya naman, ang matinding pagbawas ng mga genome ng mga uri ng Encephalotozoon/Ordospora ay makikita sa kanilang istruktura ng ribosome: Ang mga ribosome ng E. cuniculi ang nakakaranas ng pinakamalaking pagkawala ng nilalaman ng protina sa mga eukaryotic cytoplasmic ribosome na sumasailalim sa istrukturang katangian, at wala man lang silang mga rRNA at mga piraso ng protina na malawakang nakonserba hindi lamang sa mga eukaryote, kundi pati na rin sa tatlong larangan ng buhay. Ang istruktura ng ribosome ng E. cuniculi ang nagbibigay ng unang molekular na modelo para sa mga pagbabagong ito at nagpapakita ng mga pangyayaring ebolusyonaryo na hindi napapansin ng parehong comparative genomics at mga pag-aaral ng intracellular biomolecular structure (Karagdagang Larawan 7). Sa ibaba, inilalarawan namin ang bawat isa sa mga pangyayaring ito kasama ang kanilang malamang na pinagmulang ebolusyonaryo at ang kanilang potensyal na epekto sa tungkulin ng ribosome.
Natuklasan namin na, bukod pa sa malalaking rRNA truncations, ang mga ribosome ng E. cuniculi ay may mga pagkakaiba-iba ng rRNA sa isa sa kanilang mga aktibong site. Bagama't ang peptidyl transferase center ng E. cuniculi ribosome ay may parehong istraktura gaya ng iba pang eukaryotic ribosome (Fig. 1d), ang decoding center ay naiiba dahil sa pagkakaiba-iba ng sequence sa nucleotide 1491 (E. coli numbering, Fig. 1e, f). Mahalaga ang obserbasyong ito dahil ang decoding site ng mga eukaryotic ribosome ay karaniwang naglalaman ng mga residue na G1408 at A1491 kumpara sa mga bacterial-type residue na A1408 at G1491. Ang pagkakaiba-iba na ito ang pinagbabatayan ng magkakaibang sensitivity ng bacterial at eukaryotic ribosome sa aminoglycoside family ng ribosomal antibiotics at iba pang maliliit na molekula na nagta-target sa decoding site. Sa decoding site ng E. cuniculi ribosome, ang residue na A1491 ay pinalitan ng U1491, na posibleng lumikha ng isang natatanging binding interface para sa maliliit na molekula na nagta-target sa aktibong site na ito. Ang parehong variant na A14901 ay makikita rin sa iba pang microsporidia tulad ng P. locustae at V. necatrix, na nagmumungkahi na ito ay laganap sa mga uri ng microsporidia (Larawan 1f).
Dahil ang aming mga sample ng ribosome ng E. cuniculi ay nakahiwalay mula sa mga metabolically inactive spores, sinubukan namin ang cryo-EM map ng E. cuniculi para sa naunang inilarawang ribosome binding sa ilalim ng mga kondisyon ng stress o gutom. Mga hibernation factor 31,32,36,37, 38. Itinugma namin ang dating itinatag na istruktura ng hibernating ribosome sa cryo-EM map ng E. cuniculi ribosome. Para sa docking, ang mga ribosome ng S. cerevisiae ay ginamit kasama ang hibernation factor na Stm138, mga locust ribosome na kasama ang Lso232 factor, at mga ribosome ng V. necatrix na kasama ang Mdf1 at Mdf231 factor. Kasabay nito, natagpuan namin ang cryo-EM density na katumbas ng rest factor na Mdf1. Katulad ng pagbibigkis ng Mdf1 sa ribosome ng V. necatrix, ang Mdf1 ay nagbibigkis din sa ribosome ng E. cuniculi, kung saan hinaharangan nito ang E site ng ribosome, na posibleng nakakatulong upang maging available ang mga ribosome kapag ang mga spore ng parasito ay nagiging metabolically inactive sa oras na hindi na aktibo ang katawan (Larawan 2).
Hinaharangan ng Mdf1 ang E site ng ribosome, na tila nakakatulong sa pag-inactivate ng ribosome kapag ang mga spore ng parasito ay nagiging hindi aktibo sa metabolismo. Sa istruktura ng ribosome ng E. cuniculi, natuklasan namin na ang Mdf1 ay bumubuo ng isang dating hindi kilalang kontak sa tangkay ng L1 ribosome, ang bahagi ng ribosome na nagpapadali sa paglabas ng deacylated tRNA mula sa ribosome habang ginagawa ang synthesis ng protina. Ang mga kontak na ito ay nagmumungkahi na ang Mdf1 ay humihiwalay mula sa ribosome gamit ang parehong mekanismo tulad ng deacetylated tRNA, na nagbibigay ng posibleng paliwanag kung paano inaalis ng ribosome ang Mdf1 upang muling buhayin ang synthesis ng protina.
Gayunpaman, ang aming istraktura ay nagsiwalat ng isang hindi kilalang kontak sa pagitan ng Mdf1 at ng L1 ribosome leg (ang bahagi ng ribosome na tumutulong sa paglabas ng deacylated tRNA mula sa ribosome habang ginagawa ang protein synthesis). Sa partikular, ginagamit ng Mdf1 ang parehong mga kontak gaya ng elbow segment ng deacylated tRNA molecule (Fig. 2). Ipinakita ng dating hindi kilalang molecular modeling na ito na ang Mdf1 ay humihiwalay mula sa ribosome gamit ang parehong mekanismo gaya ng deacetylated tRNA, na nagpapaliwanag kung paano inaalis ng ribosome ang hibernation factor na ito upang muling buhayin ang protein synthesis.
Nang binubuo ang modelo ng rRNA, natuklasan namin na ang ribosome ng E. cuniculi ay may mga fragment ng rRNA na hindi normal na nakatiklop, na tinawag naming fused rRNA (Larawan 3). Sa mga ribosome na sumasaklaw sa tatlong domain ng buhay, ang rRNA ay natitiklop sa mga istruktura kung saan ang karamihan sa mga base ng rRNA ay maaaring magpares ng base at magtiklop sa isa't isa o nakikipag-ugnayan sa mga ribosomal protein38,39,40. Gayunpaman, sa mga ribosome ng E. cuniculi, tila nilalabag ng mga rRNA ang prinsipyong ito ng pagtiklop sa pamamagitan ng pag-convert ng ilan sa kanilang mga helice sa mga rehiyon ng rRNA na hindi nabuksan.
Istruktura ng H18 25S rRNA helix sa S. cerevisiae, V. necatrix, at E. cuniculi. Kadalasan, sa mga ribosome na sumasaklaw sa tatlong life domain, ang linker na ito ay pumipilit sa isang RNA helix na naglalaman ng 24 hanggang 34 na residue. Sa kabilang banda, sa Microsporidia, ang rRNA linker na ito ay unti-unting nababawasan sa dalawang single-stranded uridine-rich linker na naglalaman lamang ng 12 residue. Karamihan sa mga residue na ito ay nakalantad sa mga solvent. Ipinapakita ng pigura na ang parasitic microsporidia ay tila lumalabag sa mga pangkalahatang prinsipyo ng rRNA folding, kung saan ang mga rRNA base ay karaniwang nakakabit sa iba pang mga base o kasangkot sa mga interaksyon ng rRNA-protein. Sa microsporidia, ang ilang mga fragment ng rRNA ay nagkakaroon ng hindi kanais-nais na fold, kung saan ang dating rRNA helix ay nagiging isang single-stranded fragment na halos pahaba sa isang tuwid na linya. Ang pagkakaroon ng mga hindi pangkaraniwang rehiyon na ito ay nagbibigay-daan sa microsporidia rRNA na magbigkis sa malalayong mga fragment ng rRNA gamit ang kaunting bilang ng mga RNA base.
Ang pinakakapansin-pansing halimbawa ng ebolusyonaryong transisyon na ito ay makikita sa H18 25S rRNA helix (Larawan 3). Sa mga uri mula E. coli hanggang sa mga tao, ang mga base ng rRNA helix na ito ay naglalaman ng 24-32 nucleotides, na bumubuo ng isang bahagyang irregular na helix. Sa mga dating natukoy na istrukturang ribosomal mula sa V. necatrix at P. locustae,31,32 ang mga base ng H18 helix ay bahagyang nakabukas, ngunit ang pagpapares ng base ng nucleotide ay napanatili. Gayunpaman, sa E. cuniculi, ang fragment ng rRNA na ito ang nagiging pinakamaikling linker na 228UUUUGU232 at 301UUUUUUUUUU307. Hindi tulad ng mga karaniwang fragment ng rRNA, ang mga linker na mayaman sa uridine na ito ay hindi umiikot o gumagawa ng malawak na pakikipag-ugnayan sa mga ribosomal na protina. Sa halip, gumagamit sila ng mga istrukturang bukas sa solvent at ganap na nakabukas kung saan ang mga hibla ng rRNA ay halos tuwid na nakaunat. Ipinapaliwanag ng nakaunat na konpormasyong ito kung paano gumagamit lamang ang E. cuniculi ng 12 RNA base upang punan ang 33 Å na puwang sa pagitan ng H16 at H18 rRNA helices, habang ang ibang mga species ay nangangailangan ng hindi bababa sa doble ng bilang ng mga rRNA base upang punan ang puwang.
Kaya, maipapakita natin na, sa pamamagitan ng hindi kanais-nais na pagtiklop sa enerhiya, ang parasitic microsporidia ay nakabuo ng isang estratehiya upang paikliin kahit ang mga segment ng rRNA na nananatiling malawak na nakonserba sa iba't ibang uri ng hayop sa tatlong larangan ng buhay. Tila, sa pamamagitan ng pag-iipon ng mga mutasyon na nagbabago sa mga rRNA helice tungo sa maiikling poly-U linker, ang E. cuniculi ay maaaring bumuo ng mga hindi pangkaraniwang fragment ng rRNA na naglalaman ng kaunting nucleotide hangga't maaari para sa ligation ng mga distal na fragment ng rRNA. Nakakatulong ito na ipaliwanag kung paano nakamit ng microsporidia ang isang dramatikong pagbawas sa kanilang pangunahing istrukturang molekular nang hindi nawawala ang kanilang integridad sa istruktura at paggana.
Isa pang hindi pangkaraniwang katangian ng E. cuniculi rRNA ay ang paglitaw ng rRNA nang walang mga kapal (Larawan 4). Ang mga umbok ay mga nucleotide na walang mga pares ng base na pumipilipit palabas ng RNA helix sa halip na magtago dito. Karamihan sa mga nakausling rRNA ay gumaganap bilang mga molekular na pandikit, na tumutulong sa pagbigkis sa mga katabing ribosomal na protina o iba pang mga piraso ng rRNA. Ang ilan sa mga umbok ay gumaganap bilang mga bisagra, na nagpapahintulot sa rRNA helix na yumuko at tiklupin nang mahusay para sa produktibong synthesis ng protina 41.
a Ang isang rRNA protrusion (S. cerevisiae numbering) ay wala sa istruktura ng ribosome ng E. cuniculi, ngunit makikita sa karamihan ng iba pang mga eukaryote b. E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens, at E. cuniculi internal ribosomes. Ang mga parasito ay kulang sa marami sa mga sinauna at lubos na napreserbang mga umbok ng rRNA. Ang mga pampalapot na ito ay nagpapatatag sa istruktura ng ribosome; samakatuwid, ang kanilang kawalan sa microsporidia ay nagpapahiwatig ng nabawasang katatagan ng pagtiklop ng rRNA sa mga parasito ng microsporidia. Ang paghahambing sa mga tangkay ng P (mga tangkay ng L7/L12 sa bacteria) ay nagpapakita na ang pagkawala ng mga bukol ng rRNA ay minsan ay kasabay ng paglitaw ng mga bagong bukol sa tabi ng mga nawawalang bukol. Ang H42 helix sa 23S/28S rRNA ay may sinaunang umbok (U1206 sa Saccharomyces cerevisiae) na tinatayang hindi bababa sa 3.5 bilyong taong gulang dahil sa proteksyon nito sa tatlong larangan ng buhay. Sa microsporidia, ang umbok na ito ay naaalis. Gayunpaman, isang bagong umbok ang lumitaw sa tabi ng nawalang umbok (A1306 sa E. cuniculi).
Kapansin-pansin, natuklasan namin na ang mga ribosome ng E. cuniculi ay kulang sa karamihan ng mga umbok ng rRNA na matatagpuan sa ibang mga species, kabilang ang mahigit 30 umbok na napanatili sa ibang mga eukaryote (Fig. 4a). Ang pagkawalang ito ay nag-aalis ng maraming kontak sa pagitan ng mga ribosomal subunit at mga katabing rRNA helice, kung minsan ay lumilikha ng malalaking guwang na puwang sa loob ng ribosome, na ginagawang mas porous ang ribosome ng E. cuniculi kumpara sa mas tradisyonal na mga ribosome (Fig. 4b). Kapansin-pansin, natuklasan namin na karamihan sa mga umbok na ito ay nawala rin sa mga dating natukoy na istruktura ng ribosome ng V. necatrix at P. locustae, na hindi napansin ng mga nakaraang pagsusuri sa istruktura31,32.
Minsan, ang pagkawala ng mga umbok ng rRNA ay sinasamahan ng pagbuo ng mga bagong umbok sa tabi ng nawalang umbok. Halimbawa, ang ribosomal P-stem ay naglalaman ng isang umbok na U1208 (sa Saccharomyces cerevisiae) na nakaligtas mula sa E. coli hanggang sa mga tao at samakatuwid ay tinatayang 3.5 bilyong taong gulang na. Sa panahon ng synthesis ng protina, ang umbok na ito ay tumutulong sa P stem na gumalaw sa pagitan ng bukas at saradong mga conformation upang ang ribosome ay makapagrekrut ng mga translation factor at maihatid ang mga ito sa aktibong site. Sa E. cuniculi ribosomes, ang pagkapal na ito ay wala; gayunpaman, ang isang bagong pagkapal (G883) na matatagpuan lamang sa tatlong base pair ay maaaring mag-ambag sa pagpapanumbalik ng pinakamainam na flexibility ng P stem (Fig. 4c).
Ang aming datos sa rRNA na walang mga umbok ay nagmumungkahi na ang pagliit ng rRNA ay hindi limitado sa pagkawala ng mga elemento ng rRNA sa ibabaw ng ribosome, ngunit maaari ring may kinalaman sa nucleus ng ribosome, na lumilikha ng isang depekto sa molekula na partikular sa parasito na hindi pa nailarawan sa mga selulang malayang nabubuhay. May mga naoobserbahang nabubuhay na uri ng hayop.
Matapos imodelo ang mga canonical ribosomal protein at rRNA, natuklasan namin na ang mga conventional ribosomal component ay hindi kayang ipaliwanag ang tatlong bahagi ng cryo-EM image. Dalawa sa mga fragment na ito ay maliliit na molekula ang laki (Fig. 5, Supplementary Fig. 8). Ang unang segment ay nasa pagitan ng mga ribosomal protein na uL15 at eL18 sa isang posisyon na karaniwang inookupahan ng C-terminus ng eL18, na pinaikli sa E. cuniculi. Bagama't hindi natin matukoy ang pagkakakilanlan ng molekulang ito, ang laki at hugis ng density island na ito ay mahusay na ipinaliwanag ng pagkakaroon ng mga molekula ng spermidine. Ang pagkakagapos nito sa ribosome ay pinatatag ng mga microsporidia-specific mutations sa mga protina ng uL15 (Asp51 at Arg56), na tila nagpapataas ng affinity ng ribosome para sa maliit na molekulang ito, dahil pinapayagan nila ang uL15 na ibalot ang maliit na molekula sa isang ribosomal na istraktura. Karagdagang Larawan 2). 8, karagdagang datos 1, 2).
Ang cryo-EM imaging ay nagpapakita ng presensya ng mga nucleotide sa labas ng ribose na nakagapos sa ribosome ng E. cuniculi. Sa ribosome ng E. cuniculi, ang nucleotide na ito ay sumasakop sa parehong lugar gaya ng 25S rRNA A3186 nucleotide (Saccharomyces cerevisiae numbering) sa karamihan ng iba pang eukaryotic ribosome. b Sa istrukturang ribosomal ng E. cuniculi, ang nucleotide na ito ay matatagpuan sa pagitan ng mga ribosomal na protina na uL9 at eL20, sa gayon ay pinapatatag ang kontak sa pagitan ng dalawang protina. cd eL20 sequence conservation analysis sa mga species ng microsporidia. Ang phylogenetic tree ng mga species ng Microsporidia (c) at multiple sequence alignment ng eL20 protein (d) ay nagpapakita na ang mga nucleotide-binding residue na F170 at K172 ay napanatili sa karamihan ng mga tipikal na Microsporidia, maliban sa S. lophii, maliban sa maagang sumasanga na Microsporidia, na nagpapanatili ng ES39L rRNA extension. e Ipinapakita ng pigurang ito na ang mga nucleotide-binding residue na F170 at K172 ay naroroon lamang sa eL20 ng highly reduced microsporidia genome, ngunit wala sa ibang mga eukaryote. Sa pangkalahatan, iminumungkahi ng mga datos na ito na ang mga Microsporidian ribosome ay nakabuo ng isang nucleotide binding site na tila nagbibigkis sa mga molekula ng AMP at ginagamit ang mga ito upang patatagin ang mga interaksyon ng protina-protina sa istruktura ng ribosomal. Ang mataas na konserbasyon ng binding site na ito sa Microsporidia at ang kawalan nito sa ibang mga eukaryote ay nagmumungkahi na ang site na ito ay maaaring magbigay ng isang selective survival advantage para sa Microsporidia. Kaya, ang nucleotide-binding pocket sa microsporidia ribosome ay hindi lumilitaw na isang degenerate feature o end form ng rRNA degradation gaya ng naunang inilarawan, kundi isang kapaki-pakinabang na evolutionary innovation na nagpapahintulot sa microsporidia ribosome na direktang magbigkis sa maliliit na molekula, gamit ang mga ito bilang mga molecular building block. building block para sa mga ribosome. Ang pagtuklas na ito ay ginagawang ang microsporidia ribosome ang tanging ribosome na kilalang gumagamit ng isang nucleotide bilang structural building block nito. f Hypothetical evolutionary pathway na nagmula sa nucleotide binding.
Ang pangalawang low molecular weight density ay matatagpuan sa interface sa pagitan ng mga ribosomal protein na uL9 at eL30 (Fig. 5a). Ang interface na ito ay dati nang inilarawan sa istruktura ng Saccharomyces cerevisiae ribosome bilang isang binding site para sa 25S nucleotide ng rRNA A3186 (bahagi ng ES39L rRNA extension)38. Ipinakita na sa mga degenerate na P. locustae ES39L ribosome, ang interface na ito ay nagbibigkis sa isang hindi kilalang single nucleotide 31, at ipinapalagay na ang nucleotide na ito ay isang pinababang pangwakas na anyo ng rRNA, kung saan ang haba ng rRNA ay ~130-230 bases. Ang ES39L ay nabawasan sa isang single nucleotide 32.43. Sinusuportahan ng aming mga cryo-EM na imahe ang ideya na ang density ay maaaring ipaliwanag ng mga nucleotide. Gayunpaman, ang mas mataas na resolution ng aming istraktura ay nagpakita na ang nucleotide na ito ay isang extraribosomal molecule, posibleng AMP (Fig. 5a, b).
Pagkatapos ay tinanong namin kung ang nucleotide binding site ay lumitaw sa E. cuniculi ribosome o kung ito ay umiral na dati. Dahil ang nucleotide binding ay pangunahing namamagitan sa mga Phe170 at Lys172 residues sa eL30 ribosomal protein, tinasa namin ang konserbasyon ng mga residue na ito sa 4396 na kinatawan ng mga eukaryote. Tulad ng sa kaso ng uL15 sa itaas, natuklasan namin na ang mga Phe170 at Lys172 residues ay lubos na nakonserba lamang sa tipikal na Microsporidia, ngunit wala sa iba pang mga eukaryote, kabilang ang atypical Microsporidia Mitosporidium at Amphiamblys, kung saan ang fragment ng ES39L rRNA ay hindi nabawasan 44, 45, 46 (Fig. 5c). -e).
Kung pagsasama-samahin, sinusuportahan ng mga datos na ito ang ideya na ang E. cuniculi at posibleng iba pang canonical microsporidia ay nakapagpaunlad ng kakayahang mahusay na makuha ang malaking bilang ng maliliit na metabolite sa istruktura ng ribosome upang mabawi ang pagbaba ng antas ng rRNA at protina. Sa paggawa nito, nakabuo sila ng kakaibang kakayahang magbigkis ng mga nucleotide sa labas ng ribosome, na nagpapakita na ang mga parasitic molecular structure ay nakakabawi sa pamamagitan ng pagkuha ng masaganang maliliit na metabolite at paggamit sa mga ito bilang mga estruktural na ginagaya ng mga nasira na RNA at mga piraso ng protina.
Ang ikatlong hindi simuladong bahagi ng aming cryo-EM map, na matatagpuan sa malaking ribosomal subunit. Ang medyo mataas na resolution (2.6 Å) ng aming mapa ay nagmumungkahi na ang density na ito ay kabilang sa mga protina na may natatanging mga kumbinasyon ng malalaking side chain residues, na nagbigay-daan sa amin upang matukoy ang density na ito bilang isang dating hindi kilalang ribosomal protein na aming natukoy bilang. Ito ay pinangalanang msL2 (Microsporidia-specific protein L2) (mga pamamaraan, figure 6). Ipinakita ng aming homology search na ang msL2 ay nakonserba sa Microsporidia clade ng genus na Encephaliter at Orosporidium, ngunit wala sa ibang mga species, kabilang ang iba pang Microsporidia. Sa ribosomal structure, ang msL2 ay sumasakop sa isang puwang na nabuo sa pamamagitan ng pagkawala ng pinahabang ES31L rRNA. Sa void na ito, ang msL2 ay tumutulong sa pag-stabilize ng rRNA folding at maaaring mabawi ang pagkawala ng ES31L (Figure 6).
a Densidad ng elektron at modelo ng protina ng ribosomal na partikular sa Microsporidia na msL2 na matatagpuan sa mga ribosome ng E. cuniculi. b Karamihan sa mga eukaryotic ribosome, kabilang ang 80S ribosome ng Saccharomyces cerevisiae, ay may nawala na ES19L rRNA amplification sa karamihan ng mga uri ng Microsporidian. Ang dating itinatag na istruktura ng ribosome ng V. necatrix microsporidia ay nagmumungkahi na ang pagkawala ng ES19L sa mga parasitong ito ay nababayaran ng ebolusyon ng bagong protina ng ribosomal na msL1. Sa pag-aaral na ito, natuklasan namin na ang ribosome ng E. cuniculi ay nakabuo rin ng karagdagang protina na mimic ng ribosomal RNA bilang isang maliwanag na kabayaran para sa pagkawala ng ES19L. Gayunpaman, ang msL2 (kasalukuyang nakasaad bilang ang hipotetikal na protina ng ECU06_1135) at msL1 ay may magkaibang istruktura at ebolusyonaryong pinagmulan. c Ang pagtuklas na ito sa pagbuo ng mga protina na msL1 at msL2 na walang kaugnayan sa ebolusyon ay nagmumungkahi na kung ang mga ribosome ay makakaipon ng mga nakapipinsalang mutasyon sa kanilang rRNA, makakamit nila ang walang kapantay na antas ng pagkakaiba-iba ng komposisyon kahit sa isang maliit na subset ng malapit na magkakaugnay na species. Ang pagtuklas na ito ay maaaring makatulong na linawin ang pinagmulan at ebolusyon ng mitochondrial ribosome, na kilala sa lubos na nabawasang rRNA at abnormal na pagkakaiba-iba sa komposisyon ng protina sa iba't ibang species.
Pagkatapos ay inihambing namin ang protina ng msL2 sa naunang inilarawan na protina ng msL1, ang tanging kilalang protina ng ribosomal na partikular sa microsporidia na matatagpuan sa V. necatrix ribosome. Nais naming subukan kung ang msL1 at msL2 ay magkaugnay sa ebolusyon. Ipinakita ng aming pagsusuri na ang msL1 at msL2 ay sumasakop sa parehong lukab sa istruktura ng ribosomal, ngunit may magkakaibang pangunahin at tersyarya na istruktura, na nagpapahiwatig ng kanilang independiyenteng pinagmulang ebolusyon (Larawan 6). Kaya, ang aming pagtuklas sa msL2 ay nagbibigay ng ebidensya na ang mga grupo ng compact eukaryotic species ay maaaring mag-isa na mag-evolve ng mga natatanging istrukturang ribosomal na protina upang mabawi ang pagkawala ng mga fragment ng rRNA. Kapansin-pansin ang natuklasang ito dahil ang karamihan sa mga cytoplasmic eukaryotic ribosome ay naglalaman ng isang invariant na protina, kabilang ang parehong pamilya ng 81 ribosomal na protina. Ang paglitaw ng msL1 at msL2 sa iba't ibang clade ng microsporidia bilang tugon sa pagkawala ng pinahabang mga segment ng rRNA ay nagmumungkahi na ang pagkasira ng arkitektura ng molekular ng parasito ay nagiging sanhi ng mga parasito na maghanap ng mga compensatory mutations, na maaaring humantong sa kanilang pagkakamit sa iba't ibang populasyon ng parasito.
Sa wakas, nang makumpleto ang aming modelo, inihambing namin ang komposisyon ng ribosome ng E. cuniculi sa hinulaang mula sa pagkakasunud-sunod ng genome. Maraming ribosomal na protina, kabilang ang eL14, eL38, eL41, at eS30, ang dating inaakalang nawawala sa genome ng E. cuniculi dahil sa maliwanag na kawalan ng kanilang mga homologue mula sa genome ng E. cuniculi. Ang pagkawala ng maraming ribosomal na protina ay hinuhulaan din sa karamihan ng iba pang mga intracellular parasite at endosymbiont na may mataas na reduced. Halimbawa, bagama't karamihan sa mga free-living bacteria ay naglalaman ng parehong pamilya ng 54 ribosomal na protina, 11 lamang sa mga pamilya ng protina na ito ang may mga nakikitang homologue sa bawat sinuring genome ng host-restricted bacteria. Bilang suporta sa paniwala na ito, ang pagkawala ng mga ribosomal na protina ay naobserbahan sa eksperimento sa V. necatrix at P. locustae microsporidia, na kulang sa mga protina ng eL38 at eL4131,32.
Gayunpaman, ipinapakita ng aming mga istruktura na tanging ang eL38, eL41, at eS30 lamang ang aktwal na nawawala sa ribosome ng E. cuniculi. Napanatili ang protina ng eL14 at ipinakita ng aming istruktura kung bakit hindi matagpuan ang protina na ito sa paghahanap ng homology (Larawan 7). Sa mga ribosome ng E. cuniculi, karamihan sa eL14 binding site ay nawawala dahil sa pagkasira ng rRNA-amplified ES39L. Sa kawalan ng ES39L, nawala ng eL14 ang karamihan sa pangalawang istruktura nito, at 18% lamang ng sequence ng eL14 ang magkapareho sa E. cuniculi at S. cerevisiae. Kapansin-pansin ang mahinang pangangalaga ng sequence na ito dahil maging ang Saccharomyces cerevisiae at Homo sapiens—mga organismo na umunlad nang 1.5 bilyong taon ang pagitan—ay nagbabahagi ng mahigit 51% ng parehong residue sa eL14. Ang maanomalyang pagkawala ng konserbasyon na ito ay nagpapaliwanag kung bakit ang E. cuniculi eL14 ay kasalukuyang nakatala bilang ang maaaring M970_061160 na protina at hindi bilang eL1427 ribosomal na protina.
at Nawala sa ribosome ng Microsporidia ang extension ng ES39L rRNA, na bahagyang nag-alis sa eL14 ribosomal protein binding site. Sa kawalan ng ES39L, ang eL14 microspore protein ay sumasailalim sa pagkawala ng pangalawang istruktura, kung saan ang dating rRNA-binding α-helix ay nabubulok at nagiging isang minimal length loop. b Ipinapakita ng multiple sequence alignment na ang eL14 protein ay lubos na na-conserve sa eukaryotic species (57% sequence identity sa pagitan ng yeast at human homologues), ngunit hindi gaanong na-conserve at divergent sa microsporidia (kung saan hindi hihigit sa 24% ng mga residue ang magkapareho sa eL14 homologue). mula sa S. cerevisiae o H. sapiens). Ang mahinang konserbasyon ng sequence at secondary structure variability na ito ay nagpapaliwanag kung bakit ang eL14 homologue ay hindi kailanman natagpuan sa E. cuniculi at kung bakit pinaniniwalaang nawala ang protina na ito sa E. cuniculi. Sa kabaligtaran, ang E. cuniculi eL14 ay dating itinala bilang isang maaaring M970_061160 na protina. Ipinahihiwatig ng obserbasyong ito na ang pagkakaiba-iba ng genome ng microsporidia ay kasalukuyang labis na tinatantya: ang ilang mga gene na kasalukuyang pinaniniwalaang nawawala sa microsporidia ay sa katunayan ay napreserba, bagama't nasa mga anyong lubos na naiiba; sa halip, ang ilan ay pinaniniwalaang nagko-code para sa mga gene ng microsporidia para sa mga protina na partikular sa bulate (hal., ang hipotetikal na protina na M970_061160) ay talagang nagko-code para sa magkakaibang mga protina na matatagpuan sa iba pang mga eukaryote.
Ipinahihiwatig ng natuklasang ito na ang denaturasyon ng rRNA ay maaaring humantong sa isang malaking pagkawala ng konserbasyon ng sequence sa mga katabing ribosomal na protina, na nagiging dahilan upang hindi matukoy ang mga protina na ito para sa mga paghahanap ng homology. Kaya, maaari nating labis na tantiyahin ang aktwal na antas ng molecular degradation sa maliliit na organismo ng genome, dahil ang ilang mga protina na inaakalang nawawala ay talagang nananatili, bagama't nasa mga anyo na lubos na nabago.
Paano mapapanatili ng mga parasito ang tungkulin ng kanilang mga molekular na makina sa ilalim ng mga kondisyon ng matinding pagbawas ng genome? Sinasagot ng aming pag-aaral ang tanong na ito sa pamamagitan ng paglalarawan ng masalimuot na istrukturang molekular (ribosome) ng E. cuniculi, isang organismo na may isa sa pinakamaliit na eukaryotic genome.
Halos dalawang dekada nang alam na ang mga molekula ng protina at RNA sa mga microbial parasite ay kadalasang naiiba sa kanilang mga homologous na molekula sa mga malayang nabubuhay na uri dahil kulang ang mga ito sa mga quality control center, nababawasan sa 50% ng kanilang laki sa mga malayang nabubuhay na mikrobyo, atbp. maraming nakapanghihinang mutasyon na nakakasira sa pagtitiklop at paggana. Halimbawa, ang mga ribosome ng maliliit na genome organism, kabilang ang maraming intracellular parasite at endosymbiont, ay inaasahang kulang sa ilang ribosomal na protina at hanggang isang-katlo ng mga rRNA nucleotide kumpara sa mga malayang nabubuhay na uri 27, 29, 30, 49. Gayunpaman, ang paraan ng paggana ng mga molekulang ito sa parasite ay nananatiling isang misteryo, na pinag-aaralan pangunahin sa pamamagitan ng comparative genomics.
Ipinapakita ng aming pag-aaral na ang istruktura ng mga macromolecule ay maaaring magbunyag ng maraming aspeto ng ebolusyon na mahirap makuha mula sa tradisyonal na paghahambing na mga pag-aaral ng genomic ng mga intracellular parasite at iba pang mga organismong pinaghihigpitan ng host (Karagdagang Larawan 7). Halimbawa, ang halimbawa ng protina ng eL14 ay nagpapakita na maaari nating labis na tantiyahin ang aktwal na antas ng pagkasira ng molekular na aparato sa mga parasitikong uri. Ang mga encephalitic parasite ngayon ay pinaniniwalaang mayroong daan-daang mga gene na partikular sa microsporidia. Gayunpaman, ipinapakita ng aming mga resulta na ang ilan sa mga tila partikular na gene na ito ay talagang ibang-iba lamang na mga variant ng mga gene na karaniwan sa ibang mga eukaryote. Bukod dito, ang halimbawa ng protina ng msL2 ay nagpapakita kung paano natin binabalewala ang mga bagong ribosomal na protina at minamaliit ang nilalaman ng mga parasitikong molekular na makina. Ang halimbawa ng maliliit na molekula ay nagpapakita kung paano natin maaaring balewalain ang mga pinaka-mapanlikhang inobasyon sa mga istrukturang molekular ng parasito na maaaring magbigay sa kanila ng bagong biyolohikal na aktibidad.
Kung pagsasama-samahin, ang mga resultang ito ay nagpapabuti sa ating pag-unawa sa mga pagkakaiba sa pagitan ng mga istrukturang molekular ng mga organismong pinaghihigpitan ng host at ng kanilang mga katapat sa mga organismong malayang nabubuhay. Ipinapakita namin na ang mga makinang molekular, na matagal nang inaakalang nabawasan, nabubulok, at napapailalim sa iba't ibang nakapanghihinang mutasyon, sa halip ay mayroong isang hanay ng sistematikong hindi napapansing mga hindi pangkaraniwang katangian ng istruktura.
Sa kabilang banda, ang mga hindi-malalaking piraso ng rRNA at mga nagsanib na piraso na aming natagpuan sa mga ribosome ng E. cuniculi ay nagmumungkahi na ang pagbawas ng genome ay maaaring magbago kahit na ang mga bahagi ng pangunahing makinarya ng molekula na napreserba sa tatlong larangan ng buhay – pagkatapos ng halos 3.5 bilyong taon. malayang ebolusyon ng mga uri.
Ang mga fragment ng rRNA na walang umbok at nagsanib-puwersa sa mga ribosome ng E. cuniculi ay partikular na interesante batay sa mga nakaraang pag-aaral ng mga molekula ng RNA sa endosymbiotic bacteria. Halimbawa, sa aphid endosymbiont na Buchnera aphidicola, ang mga molekula ng rRNA at tRNA ay naipakita na may mga istrukturang sensitibo sa temperatura dahil sa bias ng komposisyon ng A+T at isang mataas na proporsyon ng mga non-canonical base pairs20,50. Ang mga pagbabagong ito sa RNA, pati na rin ang mga pagbabago sa mga molekula ng protina, ay pinaniniwalaang responsable ngayon para sa labis na pagdepende ng mga endosymbiont sa mga kasosyo at ang kawalan ng kakayahan ng mga endosymbiont na maglipat ng init 21, 23. Bagama't ang parasitic microsporidia rRNA ay may mga natatanging pagbabago sa istruktura, ang katangian ng mga pagbabagong ito ay nagmumungkahi na ang nabawasang thermal stability at mas mataas na pagdepende sa mga protina ng chaperone ay maaaring mga karaniwang katangian ng mga molekula ng RNA sa mga organismo na may nabawasang genome.
Sa kabilang banda, ipinapakita ng aming mga istruktura na ang parasite microsporidia ay nagkaroon ng kakaibang kakayahang labanan ang malawakang nakonserbang rRNA at mga piraso ng protina, na nagpapaunlad ng kakayahang gumamit ng masagana at madaling makuhang maliliit na metabolite bilang mga estruktural na panggagaya ng mga nabubulok na rRNA at mga piraso ng protina. Pagkasira ng istrukturang molekular. . Ang opinyong ito ay sinusuportahan ng katotohanan na ang maliliit na molekula na bumabawi sa pagkawala ng mga piraso ng protina sa rRNA at mga ribosome ng E. cuniculi ay nagbubuklod sa mga residue na partikular sa microsporidia sa mga protina na uL15 at eL30. Ipinahihiwatig nito na ang pagbubuklod ng maliliit na molekula sa mga ribosome ay maaaring isang produkto ng positibong seleksyon, kung saan ang mga mutasyon na partikular sa Microsporidia sa mga protina na ribosomal ay napili dahil sa kanilang kakayahang mapataas ang affinity ng mga ribosome para sa maliliit na molekula, na maaaring humantong sa mas mahusay na mga organismong ribosomal. Ang pagtuklas ay nagpapakita ng isang matalinong inobasyon sa istrukturang molekular ng mga microbial parasite at nagbibigay sa amin ng mas mahusay na pag-unawa kung paano pinapanatili ng mga istrukturang molekular ng parasito ang kanilang tungkulin sa kabila ng reductive evolution.
Sa kasalukuyan, ang pagkakakilanlan ng maliliit na molekulang ito ay nananatiling hindi malinaw. Hindi malinaw kung bakit ang hitsura ng maliliit na molekulang ito sa istrukturang ribosomal ay magkakaiba sa pagitan ng mga uri ng microsporidia. Sa partikular, hindi malinaw kung bakit naobserbahan ang pagbubuklod ng nucleotide sa mga ribosome ng E. cuniculi at P. locustae, at hindi sa mga ribosome ng V. necatrix, sa kabila ng pagkakaroon ng F170 residue sa mga protina ng eL20 at K172 ng V. necatrix. Ang pagbura na ito ay maaaring sanhi ng residue 43 uL6 (na matatagpuan katabi ng bulsa ng pagbubuklod ng nucleotide), na tyrosine sa V. necatrix at hindi threonine sa E. cuniculi at P. locustae. Ang malaking aromatic side chain ng Tyr43 ay maaaring makagambala sa pagbubuklod ng nucleotide dahil sa steric overlap. Bilang kahalili, ang maliwanag na pagbura ng nucleotide ay maaaring dahil sa mababang resolution ng cryo-EM imaging, na humahadlang sa pagmomodelo ng mga fragment ng ribosomal ng V. necatrix.
Sa kabilang banda, iminumungkahi ng aming trabaho na ang proseso ng pagkabulok ng genome ay maaaring isang malikhaing puwersa. Sa partikular, ang istruktura ng ribosome ng E. cuniculi ay nagmumungkahi na ang pagkawala ng rRNA at mga piraso ng protina sa microsporidia ribosome ay lumilikha ng evolutionary pressure na nagtataguyod ng mga pagbabago sa istruktura ng ribosome. Ang mga variant na ito ay nangyayari malayo sa aktibong site ng ribosome at lumilitaw na tumutulong sa pagpapanatili (o pagpapanumbalik) ng pinakamainam na pagpupulong ng ribosome na kung hindi man ay maaantala ng nabawasang rRNA. Ipinapahiwatig nito na ang isang pangunahing inobasyon ng microsporidia ribosome ay tila umunlad sa isang pangangailangan na i-buffer ang gene drift.
Marahil ito ay pinakamahusay na inilalarawan ng pagbubuklod ng nucleotide, na hindi pa naoobserbahan sa ibang mga organismo sa ngayon. Ang katotohanan na ang mga residue ng pagbubuklod ng nucleotide ay naroroon sa karaniwang microsporidia, ngunit wala sa ibang mga eukaryote, ay nagmumungkahi na ang mga site ng pagbubuklod ng nucleotide ay hindi lamang mga labi na naghihintay na mawala, o ang pangwakas na site para maibalik ang rRNA sa anyo ng mga indibidwal na nucleotide. Sa halip, ang site na ito ay tila isang kapaki-pakinabang na katangian na maaaring umunlad sa ilang mga round ng positibong seleksyon. Ang mga site ng pagbubuklod ng nucleotide ay maaaring isang by-product ng natural na seleksyon: kapag ang ES39L ay nasira, ang mga microsporidia ay napipilitang humingi ng kabayaran upang maibalik ang pinakamainam na biogenesis ng ribosome sa kawalan ng ES39L. Dahil ang nucleotide na ito ay maaaring gayahin ang mga molekular na kontak ng A3186 nucleotide sa ES39L, ang molekula ng nucleotide ay nagiging isang bloke ng gusali ng ribosome, ang pagbubuklod nito ay lalong pinapabuti ng mutation ng eL30 sequence.
Tungkol sa molekular na ebolusyon ng mga intracellular parasite, ipinapakita ng aming pag-aaral na ang mga puwersa ng Darwinian natural selection at genetic drift ng pagkabulok ng genome ay hindi gumagana nang sabay-sabay, kundi nagbabago-bago. Una, inaalis ng genetic drift ang mahahalagang katangian ng mga biomolecule, na ginagawang lubhang kailangan ang kabayaran. Kapag natugunan lamang ng mga parasito ang pangangailangang ito sa pamamagitan ng Darwinian natural selection saka magkakaroon ng pagkakataon ang kanilang mga macromolecule na bumuo ng kanilang pinakakahanga-hanga at makabagong mga katangian. Mahalaga, ang ebolusyon ng mga nucleotide binding site sa E. cuniculi ribosome ay nagmumungkahi na ang loss-to-gain pattern na ito ng molekular na ebolusyon ay hindi lamang nagpapawalang-bisa sa mga nakapipinsalang mutasyon, kundi minsan ay nagbibigay ng ganap na bagong mga tungkulin sa mga parasitic macromolecule.
Ang ideyang ito ay naaayon sa moving equilibrium theory ni Sewell Wright, na nagsasaad na ang isang mahigpit na sistema ng natural selection ay naglilimita sa kakayahan ng mga organismo na mag-innovate51,52,53. Gayunpaman, kung ang genetic drift ay nakakagambala sa natural selection, ang mga drift na ito ay maaaring magdulot ng mga pagbabago na hindi naman talaga adaptive (o nakakasama pa nga) kundi hahantong sa mga karagdagang pagbabago na nagbibigay ng mas mataas na fitness o bagong biological activity. Sinusuportahan ng aming balangkas ang ideyang ito sa pamamagitan ng paglalarawan na ang parehong uri ng mutation na nagbabawas sa fold at function ng isang biomolecule ang tila pangunahing nag-uudyok sa pagpapabuti nito. Alinsunod sa win-win evolutionary model, ipinapakita ng aming pag-aaral na ang genome decay, na tradisyonal na tinitingnan bilang isang degenerative process, ay isa ring pangunahing driver ng inobasyon, kung minsan at marahil ay madalas pa ngang nagpapahintulot sa mga macromolecule na makakuha ng mga bagong parasitic activity.