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微生物寄生生物の進化には、寄生生物の改良を促す自然選択と、遺伝子の喪失や有害な突然変異の蓄積を促す遺伝的浮動との間の拮抗作用が関わっている。本稿では、この拮抗作用が単一の巨大分子のスケールでどのように起こるかを理解するために、自然界で最もゲノムが小さい真核生物の一つであるエンセファリトゾーン・クニクリのリボソームのクライオ電子顕微鏡構造を記述する。E. クニクリのリボソームにおけるrRNAの極端な減少は、これまで知られていなかった融合rRNAリンカーやバルジのないrRNAの進化など、前例のない構造変化を伴う。さらに、E. クニクリのリボソームは、分解されたrRNA断片やタンパク質の構造模倣体として小分子を利用する能力を発達させることで、rRNA断片やタンパク質の喪失を生き延びた。総じて、これまで縮小し、退化し、衰弱させるような突然変異を受けやすいと考えられてきた分子構造には、極端な分子収縮にもかかわらず活性を維持する多くの代償機構が存在することを示す。
ほとんどの微生物寄生虫は宿主を利用するための独自の分子ツールを持っているため、寄生虫のグループごとに異なる治療法を開発する必要がある場合が多い1,2。しかし、新たな証拠は、寄生虫の進化のいくつかの側面が収束的で大部分が予測可能であることを示唆しており、微生物寄生虫に対する広範な治療介入の潜在的な基盤を示しています3,4,5,6,7,8,9。
これまでの研究では、微生物寄生生物に共通する進化傾向として、ゲノム縮小またはゲノム崩壊と呼ばれる現象が特定されている10,11,12,13。現在の研究では、微生物が自由生活様式を放棄して細胞内寄生生物（または内共生体）になると、そのゲノムは何百万年にもわたってゆっくりと驚くべき変容を遂げることが示されている9,11。ゲノム崩壊として知られるプロセスでは、微生物寄生生物は有害な突然変異を蓄積し、以前は重要だった多くの遺伝子を偽遺伝子に変え、徐々に遺伝子が失われ、突然変異による崩壊が起こる14,15。この崩壊は、最も古い細胞内生物では、近縁の自由生活種と比較して、最大95%の遺伝子を破壊する可能性がある。したがって、細胞内寄生生物の進化は、ダーウィンの自然選択による寄生生物の改良と、ゲノム崩壊による寄生生物の絶滅という、相反する2つの力の綱引きである。寄生生物がどのようにしてこの綱引きから抜け出し、分子構造の活性を維持できたのかは、依然として不明である。
ゲノム劣化のメカニズムは完全には解明されていないものの、主に頻繁な遺伝的浮動が原因であると考えられている。寄生生物は小規模で無性生殖を行い、遺伝的に限られた集団で生活しているため、DNA複製中に発生する有害な突然変異を効果的に除去することができない。このため、有害な突然変異が不可逆的に蓄積し、寄生生物のゲノムが縮小する。結果として、寄生生物は細胞内環境での生存にもはや必要のない遺伝子を失うだけでなく、散発的に発生する有害な突然変異を効果的に除去できないことが、最も重要な遺伝子を含むゲノム全体にこれらの突然変異が蓄積する原因となる。
ゲノム縮小に関する現在の理解の多くは、ゲノム配列の比較のみに基づいており、ハウスキーピング機能を果たし、潜在的な薬剤標的となる実際の分子の変化にはあまり注意が払われていない。比較研究では、有害な細胞内微生物変異の負担が、タンパク質や核酸のミスフォールディングや凝集を引き起こし、シャペロン依存性を高め、熱に対する過敏性を高めることが示されている19,20,21,22,23。さらに、さまざまな寄生虫（時には25億年もの隔たりがある独立した進化を遂げた）は、タンパク質合成5,6およびDNA修復機構24において同様の品質管理センターの喪失を経験した。しかし、細胞内生活様式が、有害な変異の負担増加に対する分子適応を含む、細胞高分子の他のすべての特性に与える影響についてはほとんど知られていない。
この研究では、細胞内微生物のタンパク質と核酸の進化をよりよく理解するために、細胞内寄生虫 Encephalitozoon cuniculi のリボソームの構造を決定しました。E. cuniculi は、真核生物のゲノムが異常に小さい寄生性微胞子虫のグループに属する真菌様生物であり、そのためゲノム崩壊の研究のモデル生物として使用されています25,26,27,28,29,30。最近、微胞子虫、Paranosema locustae、および Vairimorpha necatrix の適度に縮小したゲノム (~3.2 Mb ゲノム) のクライオ電子顕微鏡リボソーム構造が決定されました31,32。これらの構造は、rRNA 増幅の損失の一部が、隣接するリボソームタンパク質間の新しい接触の発達または新しい msL131,32 リボソームタンパク質の獲得によって補償されることを示唆しています。エンセファリトゾーン種（ゲノムは約250万bp）は、最も近縁なオルドスポラ種とともに、真核生物におけるゲノム縮小の究極的な度合いを示しており、タンパク質をコードする遺伝子は2000個未満であり、リボソームにはrRNA拡張断片（真核生物のリボソームと細菌のリボソームを区別するrRNA断片）がないだけでなく、E. cuniculiゲノムに相同体がないため、リボソームタンパク質も4つしかないと予想されます26,27,28。したがって、E. cuniculiのリボソームは、ゲノム劣化に対する分子適応のこれまで知られていなかった戦略を明らかにすることができると結論付けました。
我々のクライオ電子顕微鏡構造は、これまでに特徴づけられた最小の真核生物細胞質リボソームを表しており、ゲノム縮小の究極的な程度が、細胞に不可欠な分子機構の構造、組み立て、および進化にどのように影響するかについての洞察を提供します。我々は、E. cuniculiのリボソームが、RNAの折り畳みとリボソームの組み立てに関する広く保存されている多くの原則に違反していることを発見し、これまで知られていなかった新しいリボソームタンパク質を発見しました。全く予想外のことに、微胞子虫のリボソームは小分子に結合する能力を進化させており、rRNAとタンパク質の切断が、最終的にリボソームに有用な特性を与える可能性のある進化的革新を引き起こすという仮説を立てています。
細胞内生物におけるタンパク質と核酸の進化に関する理解を深めるため、感染した哺乳類細胞の培養物からE. cuniculi胞子を分離し、そのリボソームを精製して、これらのリボソームの構造を決定することにした。寄生性微胞子虫は栄養培地で培養できないため、大量に入手することは困難である。微胞子虫は宿主細胞内でのみ増殖する。そこで、リボソーム精製用のE. cuniculiバイオマスを得るために、哺乳類腎臓細胞株RK13にE. cuniculi胞子を感染させ、感染した細胞を数週間培養してE. cuniculiを増殖させた。約0.5平方メートルの感染細胞単層を用いて、約300 mgの微胞子虫胞子を精製し、それらを用いてリボソームを分離することができた。次に、精製した胞子をガラスビーズで破砕し、溶解液を段階的にポリエチレングリコールで分画することにより、粗リボソームを単離した。これにより、構造解析に用いるための約300 µgの未処理のE. cuniculiリボソームを得ることができた。
次に、得られたリボソームサンプルを用いてクライオ電子顕微鏡画像を収集し、リボソーム大サブユニット、小サブユニットヘッド、および小サブユニットに対応するマスクを使用してこれらの画像を処理しました。この過程で、約108,000個のリボソーム粒子の画像を収集し、2.7 Åの解像度でクライオ電子顕微鏡画像を計算しました（補足図1～3）。次に、クライオ電子顕微鏡画像を使用して、E. cuniculiリボソームに関連するrRNA、リボソームタンパク質、および冬眠因子Mdf1をモデル化しました（図1a、b）。
a 冬眠因子 Mdf1 と複合体を形成した E. cuniculi リボソームの構造 (pdb id 7QEP)。 b E. cuniculi リボソームに結合した冬眠因子 Mdf1 のマップ。 c 微胞子虫種で回収された rRNA と既知のリボソーム構造を比較した二次構造マップ。パネルには、増幅された rRNA 断片 (ES) と、デコード部位 (DC)、サルシニシン ループ (SRL)、ペプチジル転移酵素中心 (PTC) を含むリボソーム活性部位の位置が示されている。 d E. cuniculi リボソームのペプチジル転移酵素中心に対応する電子密度は、この触媒部位が E. cuniculi 寄生虫とその宿主 (H. sapiens を含む) で同じ構造を持つことを示唆している。 e、f デコードセンターの対応する電子密度（e）とデコードセンターの模式図（f）は、E. cuniculi では他の多くの真核生物の A1491（大腸菌の番号付け）の代わりに U1491 残基が存在することを示している。この変化は、E. cuniculi がこの活性部位を標的とする抗生物質に感受性がある可能性を示唆している。
以前に確立された V. necatrix および P. locustae リボソームの構造とは対照的に (両方の構造は同じ微胞子虫科 Nosematidae に属し、互いに非常によく似ている)、31,32 E. cuniculi リボソームは、rRNA およびタンパク質の断片化の多数のプロセスを経る。さらに変性する (補足図 4-6)。rRNA では、最も顕著な変化として、増幅された 25S rRNA 断片 ES12L の完全な消失と、h39、h41、および H18 ヘリックスの部分的な変性が挙げられた (図 1c、補足図 4)。リボソームタンパク質の中では、最も顕著な変化として、eS30タンパク質の完全な消失と、eL8、eL13、eL18、eL22、eL29、eL40、uS3、uS9、uS14、uS17、eS7タンパク質の短縮が挙げられます（補足図4、5）。
このように、エンセファロトゾーン/オルドスポラ種のゲノムの極端な縮小は、リボソーム構造に反映されています。E. cuniculiのリボソームは、構造解析の対象となる真核生物の細胞質リボソームの中で最も劇的なタンパク質含有量の減少を経験しており、真核生物だけでなく生命の3つのドメイン全体で広く保存されているrRNAやタンパク質断片さえ持っていません。E. cuniculiのリボソームの構造は、これらの変化の最初の分子モデルを提供し、比較ゲノミクスと細胞内生体分子構造の研究の両方で見過ごされてきた進化イベントを明らかにします（補足図7）。以下では、これらのイベントのそれぞれについて、その可能性のある進化上の起源とリボソーム機能への潜在的な影響とともに説明します。
我々は、大きなrRNA切断に加えて、E. cuniculiリボソームの活性部位の1つにrRNA変異があることを発見した。E. cuniculiリボソームのペプチジル転移酵素中心は他の真核生物リボソームと同じ構造をしているが（図1d）、デコード中心はヌクレオチド1491の配列変異により異なっている（大腸菌の番号付け、図1e、f）。この観察は重要である。なぜなら、真核生物リボソームのデコード部位は通常、細菌型リボソームの残基A1408とG1491に対して、残基G1408とA1491を含んでいるからである。この変異は、細菌リボソームと真核生物リボソームのアミノグリコシド系リボソーム抗生物質やデコード部位を標的とする他​​の低分子に対する感受性の違いの根底にある。 E. cuniculiリボソームのデコード部位では、残基A1491がU1491に置換されており、この活性部位を標的とする小分子の特異的な結合界面が形成される可能性がある。同じA14901変異体は、P. locustaeやV. necatrixなどの他の微胞子虫にも存在しており、微胞子虫種の間で広く分布していることが示唆される（図1f）。
我々の E. cuniculi リボソーム サンプルは代謝的に不活性な胞子から分離されたため、ストレスまたは飢餓条件下での既知のリボソーム結合について E. cuniculi のクライオ EM マップをテストした。 休眠因子 31,32,36,37, 38。 我々は、以前に確立された休眠リボソームの構造を E. cuniculi リボソームのクライオ EM マップに一致させた。 ドッキングには、休眠因子 Stm138 と複合体を形成した S. cerevisiae リボソーム、Lso232 因子と複合体を形成したバッタ リボソーム、および Mdf1 および Mdf231 因子と複合体を形成した V. necatrix リボソームを使用した。 同時に、休止因子 Mdf1 に対応するクライオ EM 密度を見つけた。 Mdf1がV. necatrixのリボソームに結合するのと同様に、Mdf1はE. cuniculiのリボソームにも結合し、リボソームのE部位をブロックすることで、寄生虫の胞子が体内で不活性化されて代謝的に不活性になったときにリボソームが利用可能になるのを助けている可能性がある（図2）。
Mdf1はリボソームのE部位をブロックし、寄生虫の胞子が代謝的に不活性になった際にリボソームを不活性化するのに役立っていると考えられます。E. cuniculiのリボソームの構造を調べたところ、Mdf1はこれまで知られていなかったL1リボソームステム（タンパク質合成中に脱アセチル化tRNAをリボソームから放出する役割を担う部分）と接触していることが分かりました。これらの接触は、Mdf1が脱アセチル化tRNAと同じメカニズムでリボソームから解離することを示唆しており、リボソームがMdf1を除去してタンパク質合成を再活性化する仕組みを説明できる可能性があります。
しかし、我々の構造解析により、Mdf1とリボソームL1脚（タンパク質合成中に脱アシル化tRNAをリボソームから放出するのを助けるリボソームの一部）との間に未知の接触が存在することが明らかになった。具体的には、Mdf1は脱アシル化tRNA分子のエルボー部分と同じ接触部位を利用している（図2）。このこれまで知られていなかった分子モデリングにより、Mdf1は脱アセチル化tRNAと同じメカニズムでリボソームから解離することが示され、リボソームがこの休眠因子を除去してタンパク質合成を再活性化する仕組みが説明された。
rRNAモデルを構築する際に、E. cuniculiリボソームには異常に折り畳まれたrRNA断片が存在することがわかり、これを融合rRNAと名付けました（図3）。生命の3つのドメインにまたがるリボソームでは、rRNAは、ほとんどのrRNA塩基が互いに塩基対を形成して折り畳まれるか、リボソームタンパク質と相互作用する構造に折り畳まれます38,39,40。しかし、E. cuniculiリボソームでは、rRNAは、らせん構造の一部を折り畳まれていないrRNA領域に変換することで、この折り畳み原理に違反しているようです。
S. cerevisiae、V. necatrix、および E. cuniculi における H18 25S rRNA ヘリックスの構造。通常、3 つの生命ドメインにまたがるリボソームでは、このリンカーは 24 ～ 34 残基を含む RNA ヘリックスに巻き込まれます。一方、ミクロスポリディアでは、この rRNA リンカーは徐々に 2 つの一本鎖ウリジンリッチリンカーに縮小し、わずか 12 残基しか含みません。これらの残基のほとんどは溶媒に露出しています。図は、寄生性ミクロスポリディアが、rRNA 塩基が通常他の塩基と結合するか、rRNA-タンパク質相互作用に関与するという rRNA 折り畳みの一般原則に違反しているように見えることを示しています。ミクロスポリディアでは、一部の rRNA 断片が好ましくない折り畳みをし、以前の rRNA ヘリックスはほぼ直線状に伸びた一本鎖断片になります。これらの特異な領域の存在により、微胞子虫のrRNAは最小限のRNA塩基数で遠く離れたrRNA断片に結合することができる。
この進化的な変化の最も顕著な例は、H18 25S rRNA ヘリックスで観察できます (図 3)。大腸菌からヒトまでの種では、この rRNA ヘリックスの塩基は 24-32 ヌクレオチドを含み、わずかに不規則なヘリックスを形成します。V. necatrix および P. locustae の既知のリボソーム構造では、31,32 H18 ヘリックスの塩基は部分的にほどけていますが、ヌクレオチド塩基対は保持されています。しかし、E. cuniculi では、この rRNA 断片は最短のリンカー 228UUUGU232 および 301UUUUUUUUU307 になります。典型的な rRNA 断片とは異なり、これらのウリジンに富むリンカーは、リボソームタンパク質と巻き付いたり、広範囲に接触したりしません。代わりに、溶媒が開いた完全にほどけた構造をとり、rRNA 鎖はほぼまっすぐに伸びています。この引き伸ばされた構造は、E. cuniculiがH16とH18のrRNAヘリックス間の33Åの隙間を埋めるのにわずか12個のRNA塩基しか使用しないのに対し、他の種ではその隙間を埋めるのに少なくとも2倍のrRNA塩基が必要であることを説明している。
このように、寄生性微胞子虫は、エネルギー的に不利な折り畳みによって、生命の3つのドメインの種間で広く保存されているrRNAセグメントさえも短縮する戦略を発達させてきたことが実証できる。明らかに、E. cuniculiは、rRNAヘリックスを短いポリUリンカーに変換する突然変異を蓄積することで、遠位rRNA断片の連結に必要なヌクレオチド数が可能な限り少ない、特異なrRNA断片を形成することができる。これは、微胞子虫が構造的および機能的な完全性を失うことなく、基本的な分子構造を劇的に縮小できた理由を説明するのに役立つ。
E. cuniculi rRNA のもう 1 つの珍しい特徴は、rRNA に肥厚がないことです (図 4)。バルジは、塩基対を持たないヌクレオチドで、RNA ヘリックスの中に隠れるのではなく、ヘリックスからねじれて出てきます。ほとんどの rRNA の突出部は分子接着剤として機能し、隣接するリボソームタンパク質や他の rRNA 断片の結合を助けます。バルジの中にはヒンジとして機能するものもあり、rRNA ヘリックスが柔軟に曲がり、タンパク質合成に最適な形で折り畳まれることを可能にします 41 。
a rRNA突出部（S. cerevisiaeの番号付け）はE. cuniculiのリボソーム構造には存在しないが、他のほとんどの真核生物に存在する。b E. coli、S. cerevisiae、H. sapiens、およびE. cuniculiの内部リボソーム。寄生虫は、古く高度に保存されているrRNAバルジの多くを欠いている。これらの肥厚部はリボソーム構造を安定化させるため、微胞子虫におけるこれらの肥厚部の欠如は、微胞子虫寄生虫におけるrRNA折り畳みの安定性の低下を示している。Pステム（細菌のL7/L12ステム）との比較から、rRNAバンプの消失は、消失したバンプの隣に新しいバンプが出現することと一致することがあることがわかる。23S/28S rRNAのH42ヘリックスには、生命の3つのドメインで保護されていることから、少なくとも35億年前のものと推定される古代のバルジ（Saccharomyces cerevisiaeのU1206）がある。微胞子虫では、この膨らみは消失する。しかし、消失した膨らみの隣に新たな膨らみが現れた（E. cuniculiのA1306）。
驚くべきことに、E. cuniculiのリボソームには、他の種に見られるrRNAバルジのほとんどが欠けており、他の真核生物で保存されている30以上のバルジも含まれていないことがわかった（図4a）。このバルジの喪失により、リボソームサブユニットと隣接するrRNAヘリックス間の多くの接触がなくなり、リボソーム内に大きな空洞が生じる場合があり、E. cuniculiのリボソームは、より伝統的なリボソームと比較して多孔質になっている（図4b）。注目すべきことに、これらのバルジのほとんどは、以前に同定されたV. necatrixおよびP. locustaeのリボソーム構造でも失われており、これは以前の構造解析では見落とされていたことがわかった31,32。
rRNAの膨らみが失われると、失われた膨らみの隣に新しい膨らみが形成されることがあります。たとえば、リボソームのPステムには、大腸菌からヒトまで生き残ったU1208膨らみ（Saccharomyces cerevisiae）があり、35億年前のものと推定されています。タンパク質合成中、この膨らみはPステムが開いた状態と閉じた状態の間を移動するのに役立ち、リボソームが翻訳因子をリクルートして活性部位に運ぶことができます。E. cuniculiのリボソームでは、この膨らみは存在しませんが、3塩基対のみに存在する新しい膨らみ（G883）がPステムの最適な柔軟性の回復に寄与する可能性があります（図4c）。
膨らみのないrRNAに関する我々のデータは、rRNAの最小化がリボソーム表面のrRNA要素の喪失にとどまらず、リボソーム核にも関与し、自由生活細胞では説明されていない寄生虫特有の分子欠陥を生み出す可能性があることを示唆している。
標準的なリボソームタンパク質とrRNAをモデル化した後、従来のリボソーム構成要素ではクライオEM画像の3つの部分を説明できないことがわかりました。これらの断片のうち2つは小さな分子サイズです（図5、補足図8）。最初のセグメントは、リボソームタンパク質uL15とeL18の間に挟まれており、通常はeL18のC末端が占める位置にあります。このC末端はE. cuniculiでは短縮されています。この分子の正体を特定することはできませんが、この密度アイランドのサイズと形状はスペルミジン分子の存在によってよく説明できます。リボソームへの結合は、uL15タンパク質の微胞子虫特異的変異（Asp51とArg56）によって安定化されており、これらの変異はuL15がこの小さな分子をリボソーム構造に巻き付けることができるため、リボソームのこの小さな分子に対する親和性を高めているようです（補足図2）。8、追加データ1、2）。
クライオ電子顕微鏡画像により、E. cuniculi リボソームに結合したリボースの外側にヌクレオチドが存在することが示された。E. cuniculi リボソームでは、このヌクレオチドは、他のほとんどの真核生物リボソームの 25S rRNA A3186 ヌクレオチド (Saccharomyces cerevisiae の番号付け) と同じ位置を占めている。b E. cuniculi のリボソーム構造では、このヌクレオチドはリボソームタンパク質 uL9 と eL20 の間に位置しており、それによって 2 つのタンパク質間の接触を安定化させている。cd 微胞子虫種間での eL20 配列の保存性解析。微胞子虫種の系統樹（c）とeL20タンパク質の多重配列アライメント（d）は、ヌクレオチド結合残基F170とK172が、ES39L rRNA伸長を保持した初期分岐微胞子虫を除いて、ほとんどの典型的な微胞子虫で保存されていることを示している。e この図は、ヌクレオチド結合残基F170とK172が、高度に縮小した微胞子虫ゲノムのeL20にのみ存在し、他の真核生物には存在しないことを示している。全体として、これらのデータは、微胞子虫のリボソームが、AMP分子に結合し、リボソーム構造内のタンパク質間相互作用を安定化するために使用すると思われるヌクレオチド結合部位を発達させたことを示唆している。微胞子虫におけるこの結合部位の高い保存性と、他の真核生物におけるその不在は、この部位が微胞子虫の選択的生存上の利点をもたらす可能性があることを示唆している。したがって、微胞子虫リボソームのヌクレオチド結合ポケットは、以前に説明されたような退化した特徴やrRNA分解の最終形態ではなく、微胞子虫リボソームが小さな分子を直接結合し、それらをリボソームの分子構成要素として利用することを可能にする有用な進化上の革新であるように思われる。この発見により、微胞子虫リボソームは、単一のヌクレオチドを構造構成要素として使用することが知られている唯一のリボソームとなった。f ヌクレオチド結合から派生した仮説上の進化経路。
2番目の低分子量密度は、リボソームタンパク質uL9とeL30の間の界面に位置しています（図5a）。この界面は、以前にSaccharomyces cerevisiaeリボソームの構造において、rRNA A3186の25Sヌクレオチド（ES39L rRNA伸長の一部）の結合部位として記述されていました38。退化したP. locustae ES39Lリボソームでは、この界面に未知の単一ヌクレオチド31が結合することが示されており、このヌクレオチドはrRNAの長さが約130～230塩基であるrRNAの還元最終形態であると想定されています。ES39Lは単一ヌクレオチド32に還元されます43。私たちのクライオEM画像は、密度がヌクレオチドによって説明できるという考えを支持しています。しかし、私たちの構造のより高い解像度は、このヌクレオチドがリボソーム外分子、おそらくAMPであることを示しました（図5a、b）。
次に、ヌクレオチド結合部位がE. cuniculiリボソームに出現したのか、それとも以前から存在していたのかを調べた。ヌクレオチド結合は主にeL30リボソームタンパク質のPhe170およびLys172残基によって媒介されるため、4396の代表的な真核生物におけるこれらの残基の保存性を評価した。上記のuL15の場合と同様に、Phe170およびLys172残基は典型的な微胞子虫でのみ高度に保存されており、ES39L rRNA断片が還元されていない非典型的な微胞子虫であるMitosporidiumやAmphiamblysを含む他の真核生物には存在しないことがわかった（図5c）。-e）。
これらのデータを総合すると、E. cuniculi、そしておそらく他の典型的な微胞子虫は、rRNAとタンパク質レベルの低下を補うために、リボソーム構造内に大量の低分子代謝物を効率的に取り込む能力を進化させてきたという考えを裏付けている。その過程で、リボソーム外でヌクレオチドに結合する独自の能力を発達させており、寄生性の分子構造は、豊富な低分子代謝物を取り込み、それを分解されたRNAやタンパク質断片の構造的模倣物として利用することで、不足分を補っていることを示している。
クライオEMマップの3番目のシミュレーションされていない部分は、大きなリボソームサブユニットに見られます。マップの比較的高い解像度（2.6 Å）は、この密度が大きな側鎖残基のユニークな組み合わせを持つタンパク質に属することを示唆しており、この密度をこれまで知られていなかったリボソームタンパク質として特定することができました。このタンパク質はmsL2（Microsporidia-specific protein L2）と名付けられました（方法、図6）。相同性検索の結果、msL2はEncephaliter属とOrosporidium属のMicrosporidiaクレードで保存されていますが、他のMicrosporidiaを含む他の種には存在しないことがわかりました。リボソーム構造では、msL2は伸長したES31L rRNAの喪失によって形成されたギャップを占めています。この空隙で、msL2はrRNAの折り畳みを安定化させ、ES31Lの喪失を補うことができます（図6）。
a E. cuniculi リボソームに見られるミクロスポリディア特異的リボソームタンパク質 msL2 の電子密度とモデル。 b Saccharomyces cerevisiae の 80S リボソームを含むほとんどの真核生物リボソームは ES19L rRNA 増幅を持ち、ほとんどのミクロスポリディア種で失われている。以前に確立された V. necatrix ミクロスポリディア リボソームの構造は、これらの寄生虫における ES19L の喪失が新しい msL1 リボソームタンパク質の進化によって補償されていることを示唆している。本研究では、E. cuniculi リボソームも ES19L の喪失に対する明らかな補償として追加のリボソーム RNA 模倣タンパク質を発達させたことを発見した。しかし、msL2 (現在仮説上の ECU06_1135 タンパク質として注釈付けされている) と msL1 は構造的および進化的起源が異なる。 c 進化的に無関係なmsL1およびmsL2リボソームタンパク質の生成に関するこの発見は、リボソームのrRNAに有害な突然変異が蓄積すると、近縁種のごく一部であっても、前例のないレベルの組成多様性を達成できることを示唆している。この発見は、rRNAが極めて小さく、種間でタンパク質組成に異常な変動が見られることで知られるミトコンドリアリボソームの起源と進化を解明するのに役立つ可能性がある。
次に、msL2タンパク質を、以前に記述されたmsL1タンパク質（V. necatrixリボソームで見つかった唯一の既知の微胞子虫特異的リボソームタンパク質）と比較しました。msL1とmsL2が進化的に関連しているかどうかを検証したかったのです。解析の結果、msL1とmsL2はリボソーム構造の同じ空洞を占めているものの、一次構造と三次構造が異なっており、独立した進化起源であることが示されました（図6）。したがって、msL2の発見は、コンパクトな真核生物種群が、rRNA断片の喪失を補うために、構造的に異なるリボソームタンパク質を独立して進化させることができるという証拠となります。この発見は、ほとんどの細胞質真核生物リボソームが、81種類のリボソームタンパク質からなる同じファミリーを含む不変タンパク質を含んでいることを考えると注目に値します。拡張rRNAセグメントの喪失に応答して、ミクロスポリディアのさまざまな系統群にmsL1とmsL2が出現することは、寄生虫の分子構造の劣化が寄生虫に代償変異を探索させ、それが最終的に異なる寄生虫集団におけるそれらの獲得につながる可能性があることを示唆している。
最後に、モデルが完成したら、E. cuniculi リボソームの構成をゲノム配列から予測される構成と比較しました。eL14、eL38、eL41、eS30 を含むいくつかのリボソームタンパク質は、E. cuniculi ゲノムに相同タンパク質が見当たらないことから、これまで E. cuniculi ゲノムには存在しないと考えられていました。多くのリボソームタンパク質の喪失は、他のほとんどの高度に退化した細胞内寄生虫や内共生体でも予測されています。たとえば、ほとんどの自由生活細菌は同じ 54 種類のリボソームタンパク質ファミリーを持っていますが、これらのタンパク質ファミリーのうち、宿主限定細菌の各ゲノムで検出可能な相同タンパク質を持つのは 11 種類だけです。この考えを裏付けるように、eL38 および eL4131,32 タンパク質を欠く V. necatrix および P. locustae 微胞子虫では、リボソームタンパク質の喪失が実験的に観察されています。
しかし、我々の構造解析によると、E. cuniculi リボソームでは、eL38、eL41、eS30 のみが実際に失われている。eL14 タンパク質は保存されており、我々の構造解析により、このタンパク質が相同性検索で見つからなかった理由が明らかになった (図 7)。E. cuniculi リボソームでは、rRNA 増幅された ES39L の分解により、eL14 結合部位の大部分が失われている。ES39L が存在しない場合、eL14 はその二次構造の大部分を失い、E. cuniculi と S. cerevisiae では eL14 配列の 18% しか同一ではなかった。この配列保存性の低さは注目に値する。なぜなら、15 億年も離れて進化してきた Saccharomyces cerevisiae と Homo sapiens でさえ、eL14 の同じ残基の 51% 以上を共有しているからである。この異常な保存性の喪失は、E. cuniculi eL14が現在、eL1427リボソームタンパク質ではなく、推定M970_061160タンパク質として注釈付けされている理由を説明する。
また、微胞子虫のリボソームはES39L rRNA伸長を失い、eL14リボソームタンパク質結合部位が部分的に消失した。ES39Lがない場合、eL14小胞子タンパク質は二次構造を失い、以前のrRNA結合αヘリックスは最小長のループに退化する。b 多重配列アライメントは、eL14タンパク質が真核生物種では高度に保存されている（酵母とヒトの相同体間で57%の配列同一性）が、微胞子虫では保存性が低く、多様化している（eL14相同体と同一の残基は24%以下）ことを示している。S. cerevisiaeまたはH. sapiens由来）。この低い配列保存性と二次構造の多様性により、eL14相同体がE. cuniculiで発見されたことがなく、このタンパク質がE. cuniculiで失われたと考えられている理由が説明される。対照的に、E. cuniculi eL14 は以前は推定 M970_061160 タンパク質として注釈付けされていました。この観察は、微胞子虫のゲノムの多様性が現在過大評価されていることを示唆しています。微胞子虫で失われたと考えられている遺伝子のいくつかは、実際には高度に分化した形で保存されています。代わりに、線虫特有のタンパク質をコードする微胞子虫遺伝子 (例えば、仮説上のタンパク質 M970_061160) は、実際には他の真核生物に見られる非常に多様なタンパク質をコードしています。
この発見は、rRNAの変性が隣接するリボソームタンパク質の配列保存性を著しく低下させ、これらのタンパク質を相同性検索で検出不可能にする可能性を示唆している。したがって、ゲノムサイズの小さい生物では、失われたと考えられていたタンパク質が、大きく変化した形ではあるものの実際には残存しているため、分子分解の実際の程度を過大評価している可能性がある。
寄生生物は、ゲノムが極度に縮小した状況下で、どのようにして分子機械の機能を維持できるのでしょうか？本研究では、真核生物の中で最もゲノムサイズが小さい生物の一つであるE. cuniculiの複雑な分子構造（リボソーム）を解析することで、この疑問に答えます。
微生物寄生生物のタンパク質およびRNA分子は、品質管理センターを欠いていること、自由生活性微生物のサイズが50%に縮小していること、折り畳みと機能を損なう多くの衰弱性変異などにより、自由生活性種の相同分子と異なることが多いことは、ほぼ20年前から知られています。たとえば、多くの細胞内寄生生物や内共生体を含む小型ゲノム生物のリボソームは、自由生活性種と比較して、いくつかのリボソームタンパク質とrRNAヌクレオチドの最大3分の1を欠いていると予想されます27、29、30、49。しかし、これらの分子が寄生生物でどのように機能するかは、主に比較ゲノミクスを通じて研究されており、依然としてほとんど謎のままです。
私たちの研究は、高分子の構造が、細胞内寄生虫やその他の宿主限定生物の従来の比較ゲノム研究から抽出するのが難しい進化の多くの側面を明らかにすることができることを示しています（補足図7）。たとえば、eL14タンパク質の例は、寄生生物における分子装置の実際の劣化度を過大評価している可能性があることを示しています。脳炎性寄生虫は現在、数百の微胞子虫特異的遺伝子を持っていると考えられています。しかし、私たちの結果は、これらの特異的に見える遺伝子のいくつかは、実際には他の真核生物に共通する遺伝子の非常に異なる変異体であることを示しています。さらに、msL2タンパク質の例は、新しいリボソームタンパク質を見落とし、寄生生物の分子機械の内容を過小評価していることを示しています。小分子の例は、寄生生物の分子構造における最も独創的な革新を見落とし、それによって新たな生物学的活性を得ている可能性があることを示しています。
これらの結果を総合すると、宿主限定型生物の分子構造と自由生活型生物の分子構造の違いについての理解が深まる。これまで、縮小化、退化、そして様々な有害な突然変異を受けやすいと考えられてきた分子機械は、実は体系的に見過ごされてきた一連の特異な構造的特徴を持っていることが明らかになった。
一方、E. cuniculi のリボソームで見つかったかさばらない rRNA 断片と融合断片は、ゲノム縮小が、35 億年近くもの間、種の独立した進化を経て生命の 3 つのドメインで保存されてきた基本的な分子機構の部分さえも変化させる可能性があることを示唆している。
E. cuniculi リボソームのバルジのない融合 rRNA 断片は、内共生細菌の RNA 分子に関するこれまでの研究を踏まえると特に興味深い。例えば、アブラムシの内共生細菌 Buchnera aphidicola では、rRNA および tRNA 分子は、A+T 組成の偏りと非標準塩基対の割合が高いため、温度感受性構造を持つことが示されている 20,50。これらの RNA の変化、およびタンパク質分子の変化は、内共生生物がパートナーに過度に依存し、内共生生物が熱を伝達できない原因であると考えられている 21, 23。寄生性微胞子虫の rRNA は構造的に異なる変化を示すが、これらの変化の性質から、熱安定性の低下とシャペロンタンパク質への依存度の増加は、ゲノムが縮小した生物の RNA 分子に共通する特徴である可能性がある。
一方、我々の構造は、寄生性微胞子虫が広く保存されたrRNAおよびタンパク質断片に抵抗する独自の能力を進化させ、豊富で容易に入手可能な低分子代謝物を、退化したrRNAおよびタンパク質断片の構造模倣物として利用する能力を発達させてきたことを示している。分子構造の劣化。この見解は、E. cuniculiのrRNAおよびリボソームにおけるタンパク質断片の損失を補償する低分子が、uL15およびeL30タンパク質の微胞子虫特異的残基に結合するという事実によって裏付けられている。これは、低分子のリボソームへの結合が正の選択の結果である可能性を示唆しており、リボソームタンパク質における微胞子虫特異的変異が、低分子に対するリボソームの親和性を高める能力のために選択され、より効率的なリボソーム生物につながる可能性がある。この発見は、微生物寄生虫の分子構造における巧妙な革新を明らかにし、寄生虫の分子構造が還元進化にもかかわらずどのように機能を維持しているかについての理解を深めるものである。
現時点では、これらの小分子の同定は不明である。これらの小分子がリボソーム構造に現れる様式が微胞子虫種によって異なる理由は不明である。特に、V. necatrixのeL20およびK172タンパク質にF170残基が存在するにもかかわらず、E. cuniculiおよびP. locustaeのリボソームではヌクレオチド結合が観察されるのに、V. necatrixのリボソームでは観察されない理由は不明である。この欠失は、ヌクレオチド結合ポケットに隣接する残基43 uL6によって引き起こされる可能性があり、この残基はV. necatrixではチロシンであるが、E. cuniculiおよびP. locustaeではトレオニンではない。Tyr43の嵩高い芳香族側鎖は、立体的な重なりによってヌクレオチド結合を阻害する可能性がある。あるいは、見かけ上のヌクレオチド欠失は、クライオ電子顕微鏡画像の解像度が低いため、V. necatrixのリボソーム断片のモデリングが困難であることに起因する可能性もある。
一方、我々の研究は、ゲノム劣化の過程が進化を促す原動力となり得ることを示唆している。特に、E. cuniculiのリボソームの構造は、微胞子虫リボソームにおけるrRNAおよびタンパク質断片の喪失が、リボソーム構造の変化を促進する進化的な圧力を生み出していることを示唆している。これらの変異はリボソームの活性部位から遠く離れた場所に存在し、rRNAの減少によって阻害されるであろう最適なリボソームアセンブリの維持（または回復）に役立っていると考えられる。これは、微胞子虫リボソームの大きな革新が、遺伝子ドリフトを緩和する必要性へと進化してきたことを示唆している。
おそらく、このことはヌクレオチド結合によって最もよく説明されるだろう。ヌクレオチド結合は、これまで他の生物では観察されたことがない。典型的な微胞子虫にはヌクレオチド結合残基が存在するが、他の真核生物には存在しないという事実は、ヌクレオチド結合部位が単に消滅を待つ遺物、あるいはrRNAが個々のヌクレオチドの形に復元される最終部位ではないことを示唆している。むしろ、この部位は、幾度もの正の選択を経て進化してきた有用な特徴であるように思われる。ヌクレオチド結合部位は自然選択の副産物である可能性がある。ES39Lが分解されると、微胞子虫はES39Lが存在しない状況で最適なリボソーム生合成を回復するために補償を模索せざるを得なくなる。このヌクレオチドはES39LのA3186ヌクレオチドの分子接触を模倣できるため、ヌクレオチド分子はリボソームの構成要素となり、eL30配列の変異によってその結合がさらに改善される。
細胞内寄生生物の分子進化に関して、本研究は、ダーウィン的自然選択とゲノム劣化の遺伝的浮動という二つの力が並行して働くのではなく、振動的に作用することを示している。まず、遺伝的浮動は生体分子の重要な特徴を消失させるため、その補償が切実に必要となる。寄生生物がダーウィン的自然選択によってこの必要性を満たした時のみ、その高分子は最も印象的で革新的な特性を発達させる機会を得る。重要なことに、E. cuniculiのリボソームにおけるヌクレオチド結合部位の進化は、この損失から獲得へと至る分子進化のパターンが、有害な突然変異を償却するだけでなく、時には寄生生物の高分子に全く新しい機能を与えることを示唆している。
この考え方は、自然選択の厳密なシステムが生物の革新能力を制限すると述べるセウェル・ライトの移動平衡理論と一致しています51,52,53。しかし、遺伝的浮動が自然選択を阻害する場合、これらの浮動はそれ自体は適応的ではない（あるいは有害ですらない）変化を生み出し、より高い適応度や新しい生物学的活性をもたらすさらなる変化につながる可能性があります。私たちのフレームワークは、生体分子の折り畳みと機能を低下させる同じタイプの突然変異が、その改善の主な引き金となることを示すことで、この考え方を支持しています。ウィンウィン進化モデルに沿って、私たちの研究は、従来退化プロセスと見なされてきたゲノム劣化が、革新の主要な推進力でもあり、時には、そしておそらく多くの場合、高分子が新しい寄生活性を獲得することを可能にすることを示しています。