Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com. Używana przez Ciebie wersja przeglądarki ma ograniczoną obsługę CSS. Aby zapewnić Ci najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie z nowszej wersji przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w Internet Explorerze). W międzyczasie, aby zapewnić ciągłą obsługę, będziemy renderować witrynę bez stylów i JavaScriptu.
Ewolucja pasożytów mikrobiologicznych wiąże się z działaniem doboru naturalnego, który powoduje rozwój pasożytów, oraz dryfu genetycznego, który powoduje utratę genów i akumulację szkodliwych mutacji. Aby zrozumieć, jak to przeciwdziałanie zachodzi w skali pojedynczej makrocząsteczki, opisujemy strukturę kriomikroskopową rybosomu Encephalitozoon cuniculi, organizmu eukariotycznego o jednym z najmniejszych genomów w naturze. Ekstremalnej redukcji rRNA w rybosomach E. cuniculi towarzyszą bezprecedensowe zmiany strukturalne, takie jak ewolucja nieznanych wcześniej łączników rRNA i rRNA bez wybrzuszeń. Ponadto rybosom E. cuniculi przetrwał utratę fragmentów rRNA i białek, rozwijając zdolność do wykorzystywania małych cząsteczek jako strukturalnych naśladowców zdegradowanych fragmentów rRNA i białek. Ogólnie rzecz biorąc, wykazaliśmy, że struktury molekularne, które od dawna uważano za zredukowane, zdegenerowane i podatne na wyniszczające mutacje, posiadają szereg mechanizmów kompensacyjnych, które utrzymują je aktywne pomimo ekstremalnych kontrakcji molekularnych.
Ponieważ większość grup pasożytniczych drobnoustrojów dysponuje unikalnymi narzędziami molekularnymi do wykorzystywania swoich żywicieli, często musimy opracowywać różne terapie dla różnych grup pasożytów1,2. Jednak nowe dowody sugerują, że niektóre aspekty ewolucji pasożytów są zbieżne i w dużej mierze przewidywalne, co wskazuje na potencjalną podstawę dla szeroko zakrojonych interwencji terapeutycznych w odniesieniu do pasożytów drobnoustrojów3,4,5,6,7,8,9.
Poprzednie prace zidentyfikowały powszechny trend ewolucyjny u pasożytów mikrobiologicznych zwany redukcją genomu lub rozpadem genomu10,11,12,13. Obecne badania pokazują, że gdy mikroorganizmy porzucają swój wolnożyjący tryb życia i stają się pasożytami wewnątrzkomórkowymi (lub endosymbiontami), ich genomy przechodzą powolne, ale zdumiewające metamorfozy na przestrzeni milionów lat9,11. W procesie znanym jako rozpad genomu, pasożyty mikrobiologiczne akumulują szkodliwe mutacje, które przekształcają wiele wcześniej ważnych genów w pseudogeny, co prowadzi do stopniowej utraty genów i zapaści mutacyjnej14,15. To załamanie może zniszczyć do 95% genów u najstarszych organizmów wewnątrzkomórkowych w porównaniu do blisko spokrewnionych gatunków wolnożyjących. Zatem ewolucja pasożytów wewnątrzkomórkowych jest przeciąganiem liny między dwiema przeciwnymi siłami: darwinowską selekcją naturalną, prowadzącą do ulepszenia pasożytów, i załamaniem genomu, rzucającym pasożyty w zapomnienie. W jaki sposób pasożytowi udało się wyjść z tej walki i zachować aktywność swojej struktury molekularnej, pozostaje niejasne.
Chociaż mechanizm rozkładu genomu nie jest w pełni poznany, wydaje się, że jest on spowodowany głównie częstym dryfem genetycznym. Ponieważ pasożyty żyją w małych, bezpłciowych i genetycznie ograniczonych populacjach, nie są w stanie skutecznie eliminować szkodliwych mutacji, które czasami pojawiają się podczas replikacji DNA. Prowadzi to do nieodwracalnej akumulacji szkodliwych mutacji i redukcji genomu pasożyta. W rezultacie pasożyt nie tylko traci geny, które nie są już niezbędne do jego przetrwania w środowisku wewnątrzkomórkowym. To właśnie niezdolność populacji pasożytów do skutecznego eliminowania sporadycznych, szkodliwych mutacji powoduje ich akumulację w całym genomie, w tym w ich najważniejszych genach.
Znaczna część naszej obecnej wiedzy na temat redukcji genomu opiera się wyłącznie na porównaniach sekwencji genomu, przywiązując mniejszą wagę do zmian w rzeczywistych cząsteczkach, które pełnią funkcje porządkowe i stanowią potencjalne cele dla leków. Badania porównawcze wykazały, że obciążenie szkodliwymi mutacjami mikroorganizmów wewnątrzkomórkowych wydaje się predysponować białka i kwasy nukleinowe do nieprawidłowego fałdowania i agregacji, czyniąc je bardziej zależnymi od chaperonów i nadwrażliwymi na ciepło19,20,21,22,23. Ponadto, różne pasożyty – niezależne ewolucyjnie, czasami oddzielone od siebie nawet o 2,5 miliarda lat – doświadczyły podobnej utraty centrów kontroli jakości w mechanizmach syntezy białek5,6 i naprawy DNA24. Jednak niewiele wiadomo na temat wpływu wewnątrzkomórkowego trybu życia na wszystkie inne właściwości makrocząsteczek komórkowych, w tym na adaptację molekularną do rosnącego obciążenia szkodliwymi mutacjami.
W tej pracy, aby lepiej zrozumieć ewolucję białek i kwasów nukleinowych mikroorganizmów wewnątrzkomórkowych, określiliśmy strukturę rybosomów pasożyta wewnątrzkomórkowego Encephalitozoon cuniculi. E. cuniculi to grzybopodobny organizm należący do grupy pasożytniczych mikrosporydiów, które mają niezwykle małe genomy eukariotyczne i dlatego są wykorzystywane jako organizmy modelowe do badania rozpadu genomu25,26,27,28,29,30. Niedawno określono strukturę rybosomu kriomikroskopem elektronowym dla umiarkowanie zredukowanych genomów Microsporidia, Paranosema locustae i Vairimorpha necatrix31,32 (genom ~3,2 Mb). Struktury te sugerują, że pewna utrata amplifikacji rRNA jest kompensowana przez rozwój nowych kontaktów między sąsiednimi białkami rybosomalnymi lub nabycie nowych białek rybosomalnych msL131,32. Gatunek Encephalitozoon (genom ~2,5 mln pz), wraz z najbliższym krewnym Ordospora, wykazują najwyższy stopień redukcji genomu u eukariontów – mają mniej niż 2000 genów kodujących białka i oczekuje się, że ich rybosomy nie tylko nie zawierają fragmentów ekspansji rRNA (fragmentów rRNA, które odróżniają rybosomy eukariotyczne od rybosomów bakteryjnych), ale także posiadają cztery białka rybosomalne ze względu na brak homologów w genomie E. cuniculi26,27,28. Dlatego doszliśmy do wniosku, że rybosom E. cuniculi może ujawnić nieznane dotąd strategie adaptacji molekularnej do rozpadu genomu.
Nasza struktura kriomikroskopowa reprezentuje najmniejszy eukariotyczny rybosom cytoplazmatyczny, jaki udało się scharakteryzować, i dostarcza wglądu w to, jak ostateczny stopień redukcji genomu wpływa na strukturę, montaż i ewolucję maszynerii molekularnej, która jest integralną częścią komórki. Odkryliśmy, że rybosom E. cuniculi narusza wiele powszechnie uznanych zasad fałdowania RNA i montażu rybosomów, a także odkryliśmy nowe, wcześniej nieznane białko rybosomalne. Dość nieoczekiwanie wykazaliśmy, że rybosomy mikrosporydiów wyewoluowały zdolność wiązania małych cząsteczek i postawiliśmy hipotezę, że skrócenia w rRNA i białkach wyzwalają innowacje ewolucyjne, które mogą ostatecznie nadać rybosomowi użyteczne właściwości.
Aby lepiej zrozumieć ewolucję białek i kwasów nukleinowych w organizmach wewnątrzkomórkowych, postanowiliśmy wyizolować zarodniki E. cuniculi z hodowli zakażonych komórek ssaków w celu oczyszczenia ich rybosomów i określenia ich struktury. Uzyskanie dużej liczby pasożytniczych mikrosporydiów jest trudne, ponieważ nie można ich hodować w pożywce. Rosną i rozmnażają się one wyłącznie wewnątrz komórki gospodarza. Dlatego, aby uzyskać biomasę E. cuniculi do oczyszczania rybosomów, zainfekowaliśmy linię komórkową nerki ssaków RK13 zarodnikami E. cuniculi i hodowaliśmy te zakażone komórki przez kilka tygodni, umożliwiając wzrost i namnażanie się E. cuniculi. Używając monowarstwy zakażonych komórek o powierzchni około pół metra kwadratowego, udało nam się oczyścić około 300 mg zarodników Microsporidia i wykorzystać je do wyizolowania rybosomów. Następnie rozbiliśmy oczyszczone zarodniki szklanymi kulkami i wyizolowaliśmy surowe rybosomy, stosując stopniową frakcjonację lizatów glikolem polietylenowym. Pozwoliło nam to uzyskać około 300 µg surowych rybosomów E. cuniculi do analizy strukturalnej.
Następnie zebraliśmy obrazy kriomikroskopowe z wykorzystaniem uzyskanych próbek rybosomów i przetworzyliśmy je za pomocą masek odpowiadających dużej podjednostce rybosomowej, głowie małej podjednostki i małej podjednostce. W trakcie tego procesu zebraliśmy obrazy około 108 000 cząsteczek rybosomów i obliczyliśmy obrazy kriomikroskopowe z rozdzielczością 2,7 Å (rysunki uzupełniające 1-3). Następnie wykorzystaliśmy obrazy kriomikroskopowe do modelowania rRNA, białka rybosomalnego i czynnika hibernacji Mdf1 związanego z rybosomami E. cuniculi (ryc. 1a, b).
a Struktura rybosomu E. cuniculi w kompleksie z czynnikiem hibernacji Mdf1 (identyfikator pliku referencyjnego 7QEP). b Mapa czynnika hibernacji Mdf1 związanego z rybosomem E. cuniculi. c Mapa struktury drugorzędowej porównująca odzyskany rRNA u gatunków Microsporidia ze znanymi strukturami rybosomów. Panele przedstawiają lokalizację amplifikowanych fragmentów rRNA (ES) oraz miejsc aktywnych rybosomu, w tym miejsca dekodującego (DC), pętli sarkicyny (SRL) i centrum peptydylotransferazy (PTC). d Gęstość elektronowa odpowiadająca centrum peptydylotransferazy rybosomu E. cuniculi sugeruje, że to miejsce katalityczne ma taką samą strukturę u pasożyta E. cuniculi i jego żywicieli, w tym H. sapiens. e, f Odpowiednia gęstość elektronowa centrum dekodującego (e) i schematyczna struktura centrum dekodującego (f) wskazują, że E. cuniculi ma reszty U1491 zamiast A1491 (numeracja E. coli) u wielu innych eukariontów. Ta zmiana sugeruje, że E. cuniculi może być wrażliwa na antybiotyki działające na to miejsce aktywne.
W przeciwieństwie do wcześniej ustalonych struktur rybosomów V. necatrix i P. locustae (obie struktury reprezentują tę samą rodzinę mikrosporydiów Nosematidae i są do siebie bardzo podobne), rybosomy E. cuniculi ulegają licznym procesom fragmentacji rRNA i białek. Dalsza denaturacja (rysunki uzupełniające 4-6). W rRNA najbardziej uderzające zmiany obejmowały całkowitą utratę amplifikowanego fragmentu 25S rRNA ES12L oraz częściową degenerację helis h39, h41 i H18 (ryc. 1c, ryc. uzupełniająca 4). Wśród białek rybosomalnych najbardziej rzucające się w oczy zmiany obejmowały całkowitą utratę białka eS30 i skrócenie białek eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 i ​​eS7 (rysunki uzupełniające 4, 5).
Zatem radykalna redukcja genomów gatunków Encephalotozoon/Ordospora znajduje odzwierciedlenie w ich strukturze rybosomów: rybosomy E. cuniculi doświadczają najbardziej drastycznej utraty zawartości białka spośród eukariotycznych rybosomów cytoplazmatycznych poddanych charakteryzacji strukturalnej, a nie posiadają nawet tych fragmentów rRNA i białek, które są powszechnie konserwowane nie tylko u eukariontów, ale także w trzech domenach życia. Struktura rybosomu E. cuniculi stanowi pierwszy model molekularny tych zmian i ujawnia wydarzenia ewolucyjne, które zostały pominięte zarówno przez genomikę porównawczą, jak i badania wewnątrzkomórkowej struktury biomolekularnej (rys. uzupełniający 7). Poniżej opisujemy każde z tych wydarzeń wraz z ich prawdopodobnym pochodzeniem ewolucyjnym i potencjalnym wpływem na funkcję rybosomów.
Następnie odkryliśmy, że oprócz dużych skróceń rRNA, rybosomy E. cuniculi wykazują zmienność rRNA w jednym z miejsc aktywnych. Chociaż centrum peptydylotransferazy rybosomu E. cuniculi ma taką samą strukturę jak inne rybosomy eukariotyczne (ryc. 1d), centrum dekodujące różni się ze względu na zmienność sekwencji w nukleotydzie 1491 (numeracja E. coli, ryc. 1e, f). Ta obserwacja jest istotna, ponieważ miejsce dekodowania rybosomów eukariotycznych zazwyczaj zawiera reszty G1408 i A1491 w porównaniu z resztami A1408 i G1491 u bakterii. Ta zmienność leży u podstaw odmiennej wrażliwości rybosomów bakteryjnych i eukariotycznych na antybiotyki rybosomalne z rodziny aminoglikozydów i inne małe cząsteczki, które celują w miejsce dekodujące. W miejscu dekodowania rybosomu E. cuniculi, reszta A1491 została zastąpiona przez U1491, co potencjalnie tworzy unikalną powierzchnię wiążącą dla małych cząsteczek ukierunkowanych na to miejsce aktywne. Ten sam wariant A14901 występuje również u innych mikrosporydiów, takich jak P. locustae i V. necatrix, co sugeruje, że jest on szeroko rozpowszechniony wśród gatunków mikrosporydiów (ryc. 1f).
Ponieważ nasze próbki rybosomów E. cuniculi zostały wyizolowane z metabolicznie nieaktywnych zarodników, przetestowaliśmy mapę kriomikroskopową E. cuniculi pod kątem wcześniej opisanego wiązania rybosomu w warunkach stresu lub głodu. Czynniki hibernacji 31, 32, 36, 37, 38. Porównaliśmy wcześniej ustaloną strukturę hibernującego rybosomu z mapą kriomikroskopową rybosomu E. cuniculi. Do dokowania wykorzystano rybosomy S. cerevisiae w kompleksie z czynnikiem hibernacji Stm138, rybosomy szarańczy w kompleksie z czynnikiem Lso232 oraz rybosomy V. necatrix w kompleksie z czynnikami Mdf1 i Mdf231. Jednocześnie uzyskaliśmy gęstość kriomikroskopową odpowiadającą czynnikowi spoczynku Mdf1. Podobnie jak wiązanie Mdf1 do rybosomu V. necatrix, Mdf1 wiąże się również z rybosomem E. cuniculi, gdzie blokuje miejsce E rybosomu, co może pomóc w udostępnieniu rybosomów, gdy zarodniki pasożyta staną się metabolicznie nieaktywne po inaktywacji organizmu (ryc. 2).
Mdf1 blokuje miejsce E rybosomu, co wydaje się pomagać w jego inaktywacji, gdy zarodniki pasożyta stają się metabolicznie nieaktywne. W strukturze rybosomu E. cuniculi odkryliśmy, że Mdf1 tworzy nieznany wcześniej kontakt z trzonem rybosomu L1, częścią rybosomu, która ułatwia uwalnianie deacylowanego tRNA z rybosomu podczas syntezy białka. Kontakty te sugerują, że Mdf1 dysocjuje od rybosomu, wykorzystując ten sam mechanizm co deacetylowany tRNA, co może wyjaśniać, w jaki sposób rybosom usuwa Mdf1, aby reaktywować syntezę białka.
Jednak nasza struktura ujawniła nieznany kontakt między Mdf1 a odnogą rybosomu L1 (częścią rybosomu, która pomaga uwolnić deacylowany tRNA z rybosomu podczas syntezy białka). W szczególności Mdf1 wykorzystuje te same kontakty, co segment łokciowy deacylowanej cząsteczki tRNA (ryc. 2). To wcześniej nieznane modelowanie molekularne wykazało, że Mdf1 dysocjuje od rybosomu, wykorzystując ten sam mechanizm co deacetylowany tRNA, co wyjaśnia, w jaki sposób rybosom usuwa ten czynnik hibernacji, aby reaktywować syntezę białka.
Konstruując model rRNA, odkryliśmy, że rybosom E. cuniculi ma nieprawidłowo pofałdowane fragmenty rRNA, które nazwaliśmy zfuzowanym rRNA (ryc. 3). W rybosomach obejmujących trzy domeny życia, rRNA fałduje się w struktury, w których większość zasad rRNA albo łączy się w pary i fałduje ze sobą, albo oddziałuje z białkami rybosomalnymi38,39,40. Jednak w rybosomach E. cuniculi rRNA wydają się naruszać tę zasadę fałdowania, przekształcając niektóre ze swoich helis w niepofałdowane regiony rRNA.
Struktura helisy H18 25S rRNA u S. cerevisiae, V. necatrix i E. cuniculi. Zazwyczaj w rybosomach obejmujących trzy domeny życiowe łącznik ten zwija się w helisę RNA zawierającą od 24 do 34 reszt. Natomiast u mikrosporydów ten łącznik rRNA ulega stopniowej redukcji do dwóch jednoniciowych łączników bogatych w urydynę, zawierających zaledwie 12 reszt. Większość tych reszt jest wystawiona na działanie rozpuszczalników. Rysunek pokazuje, że pasożytnicze mikrosporydia wydają się naruszać ogólne zasady fałdowania rRNA, gdzie zasady rRNA są zazwyczaj sprzężone z innymi zasadami lub zaangażowane w interakcje rRNA-białko. U mikrosporydów niektóre fragmenty rRNA przyjmują niekorzystną strukturę, w której poprzednia helisa rRNA staje się jednoniciowym fragmentem wydłużonym niemal w linii prostej. Obecność tych niezwykłych regionów pozwala mikrosporydiom rRNA wiązać odległe fragmenty rRNA przy użyciu minimalnej liczby zasad RNA.
Najbardziej uderzający przykład tej ewolucyjnej transformacji można zaobserwować w helisie 25S rRNA H18 (ryc. 3). U gatunków od E. coli do człowieka, zasady tej helisy rRNA zawierają 24-32 nukleotydy, tworząc lekko nieregularną helisę. W zidentyfikowanych wcześniej strukturach rybosomalnych V. necatrix i P. locustae,31,32 zasady helisy H18 są częściowo rozwinięte, ale parowanie zasad nukleotydowych jest zachowane. Jednak u E. cuniculi ten fragment rRNA staje się najkrótszymi łącznikami 228UUUGU232 i 301UUUUUUUU307. W przeciwieństwie do typowych fragmentów rRNA, te bogate w urydynę łączniki nie zwijają się ani nie mają rozległego kontaktu z białkami rybosomalnymi. Zamiast tego przyjmują strukturę otwartą w rozpuszczalniku i w pełni rozwiniętą, w której nici rRNA są wydłużone niemal prosto. Rozciągnięta konformacja wyjaśnia, w jaki sposób E. cuniculi wykorzystuje tylko 12 zasad rRNA do wypełnienia przerwy 33 Å między helisami rRNA H16 i H18, podczas gdy inne gatunki potrzebują co najmniej dwukrotnie więcej zasad rRNA, aby wypełnić tę przerwę.
Możemy zatem wykazać, że poprzez energetycznie niekorzystne fałdowanie, pasożytnicze mikrosporydia rozwinęły strategię kurczenia nawet tych segmentów rRNA, które pozostają szeroko konserwatywne u różnych gatunków w trzech domenach życia. Najwyraźniej, poprzez akumulację mutacji, które przekształcają helisy rRNA w krótkie łączniki poli-U, E. cuniculi może tworzyć nietypowe fragmenty rRNA, zawierające jak najmniej nukleotydów, umożliwiających ligację dystalnych fragmentów rRNA. Pomaga to wyjaśnić, w jaki sposób mikrosporydia osiągnęły drastyczną redukcję swojej podstawowej struktury molekularnej bez utraty integralności strukturalnej i funkcjonalnej.
Kolejną niezwykłą cechą rRNA E. cuniculi jest występowanie rRNA bez zgrubień (ryc. 4). Wybrzuszenia to nukleotydy bez par zasad, które wykręcają się z helisy RNA zamiast się w niej chować. Większość wybrzuszeń rRNA działa jak kleje molekularne, pomagając w wiązaniu sąsiednich białek rybosomalnych lub innych fragmentów rRNA. Niektóre z wybrzuszeń działają jak zawiasy, umożliwiając helisie rRNA optymalne zginanie i fałdowanie, co umożliwia produktywną syntezę białek41.
a Wypustka rRNA (numeracja S. cerevisiae) nie występuje w strukturze rybosomu E. cuniculi, ale występuje u większości innych eukariontów. b Wewnętrzne rybosomy E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens i E. cuniculi. Pasożytom brakuje wielu dawnych, silnie konserwatywnych wybrzuszeń rRNA. Te zgrubienia stabilizują strukturę rybosomu; dlatego ich brak w mikrosporydiach wskazuje na zmniejszoną stabilność fałdowania rRNA u pasożytów mikrosporydiów. Porównanie z łodygami P (łodygi L7/L12 u bakterii) pokazuje, że utrata guzków rRNA czasami zbiega się z pojawieniem się nowych guzków obok utraconych guzków. Helisa H42 w rRNA 23S/28S ma starożytne wybrzuszenie (U1206 w Saccharomyces cerevisiae), którego wiek szacuje się na co najmniej 3,5 miliarda lat ze względu na jego ochronę w trzech domenach życia. U mikrosporydiów to wybrzuszenie zanika. Jednak obok utraconego wybrzuszenia pojawiło się nowe (A1306 w E. cuniculi).
Co zaskakujące, odkryliśmy, że rybosomy E. cuniculi nie posiadają większości wybrzuszeń rRNA występujących u innych gatunków, w tym ponad 30 wybrzuszeń zachowanych u innych eukariontów (ryc. 4a). Ta utrata eliminuje wiele kontaktów między podjednostkami rybosomu a sąsiednimi helisami rRNA, czasami tworząc duże puste przestrzenie wewnątrz rybosomu, co sprawia, że ​​rybosom E. cuniculi jest bardziej porowaty w porównaniu z bardziej tradycyjnymi rybosomami (ryc. 4b). Co istotne, odkryliśmy, że większość tych wybrzuszeń została utracona również we wcześniej zidentyfikowanych strukturach rybosomów V. necatrix i P. locustae, które zostały pominięte we wcześniejszych analizach strukturalnych31,32.
Czasami utracie wybrzuszeń rRNA towarzyszy rozwój nowych wybrzuszeń obok utraconego wybrzuszenia. Na przykład, rybosomalny trzon P zawiera wybrzuszenie U1208 (u Saccharomyces cerevisiae), które przetrwało od E. coli do człowieka, a zatem szacuje się, że ma 3,5 miliarda lat. Podczas syntezy białek wybrzuszenie to pomaga trzonowi P przemieszczać się między konformacją otwartą i zamkniętą, umożliwiając rybosomowi rekrutację czynników translacyjnych i dostarczanie ich do miejsca aktywnego. W rybosomach E. cuniculi to pogrubienie nie występuje; jednak nowe pogrubienie (G883), zlokalizowane tylko w trzech parach zasad, może przyczynić się do przywrócenia optymalnej elastyczności trzonu P (ryc. 4c).
Nasze dane dotyczące rRNA bez wybrzuszeń sugerują, że minimalizacja rRNA nie ogranicza się do utraty elementów rRNA na powierzchni rybosomu, ale może również obejmować jądro rybosomu, tworząc specyficzny dla pasożyta defekt molekularny, którego nie opisano w komórkach wolno żyjących.
Po modelowaniu kanonicznych białek rybosomalnych i rRNA odkryliśmy, że konwencjonalne składniki rybosomalne nie mogą wyjaśnić trzech części obrazu kriomikroskopii elektronowej. Dwa z tych fragmentów to cząsteczki o małych rozmiarach (ryc. 5, ryc. uzupełniająca 8). Pierwszy segment jest umieszczony pomiędzy białkami rybosomalnymi uL15 i eL18 w pozycji zazwyczaj zajmowanej przez C-koniec eL18, który jest skrócony u E. cuniculi. Chociaż nie możemy określić tożsamości tej cząsteczki, rozmiar i kształt tej wyspy gęstości dobrze wyjaśnia obecność cząsteczek spermidyny. Jej wiązanie z rybosomem jest stabilizowane przez specyficzne dla mikrosporydiów mutacje w białkach uL15 (Asp51 i Arg56), które wydają się zwiększać powinowactwo rybosomu do tej małej cząsteczki, ponieważ pozwalają uL15 na owinięcie jej w strukturę rybosomu (ryc. uzupełniająca 2). 8, dane dodatkowe 1, 2).
Obrazowanie kriomikroskopowe (Cryo-EM) pokazujące obecność nukleotydów poza rybozą związaną z rybosomem E. cuniculi. W rybosomie E. cuniculi nukleotyd ten zajmuje to samo miejsce, co nukleotyd 25S rRNA A3186 (numeracja Saccharomyces cerevisiae) w większości innych rybosomów eukariotycznych. b W strukturze rybosomalnej E. cuniculi nukleotyd ten znajduje się pomiędzy białkami rybosomalnymi uL9 i eL20, stabilizując w ten sposób kontakt między tymi dwoma białkami. cd Analiza konserwatywności sekwencji eL20 u gatunków mikrosporydiów. Drzewo filogenetyczne gatunków Microsporidia (c) i wielokrotne porównanie sekwencji białka eL20 (d) pokazują, że reszty wiążące nukleotydy F170 i K172 są konserwatywne u większości typowych Microsporidia, z wyjątkiem S. lophii, z wyjątkiem wcześnie rozgałęzionych Microsporidia, które zachowały rozszerzenie rRNA ES39L. e Ta rycina pokazuje, że reszty wiążące nukleotydy F170 i K172 są obecne tylko w eL20 silnie zredukowanego genomu Microsporidia, ale nie u innych eukariontów. Ogólnie rzecz biorąc, dane te sugerują, że rybosomy Microsporidia rozwinęły miejsce wiązania nukleotydów, które wydaje się wiązać cząsteczki AMP i wykorzystywać je do stabilizacji oddziaływań białko-białko w strukturze rybosomu. Wysoki stopień konserwatywności tego miejsca wiązania u Microsporidia i jego brak u innych eukariontów sugeruje, że miejsce to może zapewniać selektywną przewagę w zakresie przeżycia dla Microsporidia. Zatem kieszeń wiążąca nukleotydy w rybosomie mikrosporydiów nie wydaje się być cechą zdegenerowaną ani końcową formą degradacji rRNA, jak opisano wcześniej, lecz raczej użyteczną innowacją ewolucyjną, która pozwala rybosomowi mikrosporydiów bezpośrednio wiązać małe cząsteczki, wykorzystując je jako molekularne cegiełki budulcowe. To odkrycie czyni rybosom mikrosporydiów jedynym znanym rybosomem wykorzystującym pojedynczy nukleotyd jako swój strukturalny element budulcowy. f Hipotetyczna ścieżka ewolucyjna wywodząca się z wiązania nukleotydów.
Druga gęstość o niskiej masie cząsteczkowej znajduje się na styku białek rybosomalnych uL9 i eL30 (ryc. 5a). Ten styk został wcześniej opisany w strukturze rybosomu Saccharomyces cerevisiae jako miejsce wiązania nukleotydu 25S rRNA A3186 (część wydłużenia rRNA ES39L)38. Wykazano, że w zdegenerowanych rybosomach ES39L P. locustae, styk ten wiąże nieznany pojedynczy nukleotyd 31 i zakłada się, że ten nukleotyd jest zredukowaną, finalną formą rRNA, w której długość rRNA wynosi ~130-230 zasad. ES39L jest zredukowany do pojedynczego nukleotydu 32,43. Nasze obrazy kriomikroskopowe potwierdzają hipotezę, że gęstość można wyjaśnić za pomocą nukleotydów. Jednakże wyższa rozdzielczość naszej struktury pokazała, że ​​ten nukleotyd jest cząsteczką pozarybosomalną, prawdopodobnie AMP (ryc. 5a, b).
Następnie zapytaliśmy, czy miejsce wiązania nukleotydów pojawiło się w rybosomie E. cuniculi, czy też istniało wcześniej. Ponieważ wiązanie nukleotydów jest głównie pośredniczone przez reszty Phe170 i Lys172 w białku rybosomalnym eL30, oceniliśmy konserwatywność tych reszt u 4396 reprezentatywnych eukariontów. Podobnie jak w przypadku uL15, stwierdziliśmy, że reszty Phe170 i Lys172 są silnie konserwatywne tylko u typowych mikrosporidiów, ale nie występują u innych eukariontów, w tym atypowych mikrosporidiów Mitosporidium i Amphiamblys, w których fragment rRNA ES39L nie ulega redukcji 44, 45, 46 (ryc. 5c). -e).
Łącznie, dane te potwierdzają hipotezę, że E. cuniculi i prawdopodobnie inne kanoniczne mikrosporydia wyewoluowały zdolność do efektywnego wychwytywania dużej liczby małych metabolitów w strukturze rybosomu, aby kompensować spadek poziomu rRNA i białka. W ten sposób rozwinęły unikalną zdolność wiązania nukleotydów poza rybosomem, co dowodzi, że pasożytnicze struktury molekularne kompensują ten proces, wychwytując liczne małe metabolity i wykorzystując je jako strukturalne odpowiedniki zdegradowanych fragmentów RNA i białek.
Trzecia niesymulowana część naszej mapy kriomikroskopowej znajduje się w dużej podjednostce rybosomalnej. Stosunkowo wysoka rozdzielczość (2,6 Å) naszej mapy sugeruje, że gęstość ta należy do białek o unikalnych kombinacjach dużych reszt łańcucha bocznego, co pozwoliło nam zidentyfikować tę gęstość jako wcześniej nieznane białko rybosomalne, które zidentyfikowaliśmy jako Nazwano je msL2 (Microsporidia-specific protein L2) (metody, rycina 6). Nasze poszukiwania homologii wykazały, że msL2 jest konserwatywne w kladzie Microsporidia z rodzaju Encephaliter i Orosporidium, ale nieobecne u innych gatunków, w tym innych Microsporidia. W strukturze rybosomu msL2 zajmuje lukę utworzoną przez utratę wydłużonego rRNA ES31L. W tej luce msL2 pomaga stabilizować fałdowanie rRNA i może kompensować utratę ES31L (rycina 6).
a Gęstość elektronowa i model specyficznego dla Microsporidia białka rybosomalnego msL2 występującego w rybosomach E. cuniculi. b Większość eukariotycznych rybosomów, w tym rybosom 80S Saccharomyces cerevisiae, ma utraconą amplifikację rRNA ES19L u większości gatunków Microsporidia. Wcześniej ustalona struktura rybosomu Microsporidia V. necatrix sugeruje, że utrata ES19L u tych pasożytów jest kompensowana przez ewolucję nowego białka rybosomalnego msL1. W niniejszym badaniu odkryliśmy, że rybosom E. cuniculi wytworzył również dodatkowe białko imitujące rybosomalne RNA jako pozorną kompensację utraty ES19L. Jednakże msL2 (obecnie określane jako hipotetyczne białko ECU06_1135) i msL1 mają różne pochodzenie strukturalne i ewolucyjne. c Odkrycie generacji ewolucyjnie niespokrewnionych białek rybosomalnych msL1 i msL2 sugeruje, że jeśli rybosomy akumulują szkodliwe mutacje w swoim rRNA, mogą osiągnąć bezprecedensowy poziom różnorodności kompozycyjnej nawet w niewielkiej grupie blisko spokrewnionych gatunków. Odkrycie to może pomóc w wyjaśnieniu pochodzenia i ewolucji rybosomu mitochondrialnego, znanego z silnie zredukowanego rRNA i nieprawidłowej zmienności składu białkowego między gatunkami.
Następnie porównaliśmy białko msL2 z wcześniej opisanym białkiem msL1, jedynym znanym białkiem rybosomalnym specyficznym dla mikrosporydiów, znalezionym w rybosomie V. necatrix. Chcieliśmy sprawdzić, czy msL1 i msL2 są ewolucyjnie spokrewnione. Nasza analiza wykazała, że ​​msL1 i msL2 zajmują tę samą jamę w strukturze rybosomu, ale mają różne struktury pierwszorzędowe i trzeciorzędowe, co wskazuje na ich niezależne pochodzenie ewolucyjne (ryc. 6). Zatem nasze odkrycie msL2 dostarcza dowodów na to, że grupy zwartych gatunków eukariotycznych mogą niezależnie ewoluować strukturalnie odmienne białka rybosomalne, aby skompensować utratę fragmentów rRNA. Odkrycie to jest godne uwagi, ponieważ większość cytoplazmatycznych rybosomów eukariotycznych zawiera białko niezmienne, w tym tę samą rodzinę 81 białek rybosomalnych. Pojawienie się msL1 i msL2 w różnych kladach mikrosporydiów w odpowiedzi na utratę rozszerzonych segmentów rRNA sugeruje, że degradacja architektury molekularnej pasożyta sprawia, że ​​pasożyty poszukują mutacji kompensacyjnych, co może ostatecznie doprowadzić do ich nabycia w innych populacjach pasożytów. struktury.
Wreszcie, po ukończeniu naszego modelu, porównaliśmy skład rybosomu E. cuniculi ze składem przewidywanym na podstawie sekwencji genomu. Wcześniej sądzono, że kilka białek rybosomalnych, w tym eL14, eL38, eL41 i eS30, brakuje w genomie E. cuniculi z powodu pozornego braku ich homologów w genomie E. cuniculi. Utrata wielu białek rybosomalnych jest również przewidywana u większości innych silnie zredukowanych pasożytów wewnątrzkomórkowych i endosymbiontów. Na przykład, chociaż większość wolno żyjących bakterii zawiera tę samą rodzinę 54 białek rybosomalnych, tylko 11 z tych rodzin białek ma wykrywalne homologi w każdym analizowanym genomie bakterii ograniczonych do gospodarza. Na poparcie tej tezy, utratę białek rybosomalnych zaobserwowano eksperymentalnie w mikrosporydiach V. necatrix i P. locustae, w których brakuje białek eL38 i eL4131,32.
Jednakże nasze struktury pokazują, że jedynie eL38, eL41 i eS30 są faktycznie tracone w rybosomie E. cuniculi. Białko eL14 było konserwatywne, a nasza struktura pokazała, dlaczego nie udało się go znaleźć w badaniu homologicznym (ryc. 7). W rybosomach E. cuniculi większość miejsca wiązania eL14 jest tracona z powodu degradacji amplifikowanego przez rRNA ES39L. W przypadku braku ES39L, eL14 utraciło większość swojej struktury drugorzędowej, a tylko 18% sekwencji eL14 było identyczne u E. cuniculi i S. cerevisiae. To słabe zachowanie sekwencji jest niezwykłe, ponieważ nawet Saccharomyces cerevisiae i Homo sapiens – organizmy, które ewoluowały w odstępie 1,5 miliarda lat – mają ponad 51% tych samych reszt w eL14. Ta nietypowa utrata właściwości konserwujących wyjaśnia, dlaczego białko eL14 u E. cuniculi jest obecnie określane jako domniemane białko M970_061160, a nie jako białko rybosomalne eL1427.
Rybosom Microsporidia utracił przedłużenie rRNA ES39L, co częściowo wyeliminowało miejsce wiązania białka rybosomalnego eL14. W przypadku braku ES39L białko mikrospory eL14 ulega utracie struktury drugorzędowej, w której dawna α-helisa wiążąca rRNA degeneruje się do pętli o minimalnej długości. b Wielokrotne wyrównanie sekwencji pokazuje, że białko eL14 jest wysoce konserwatywne u gatunków eukariotycznych (57% identyczności sekwencji między homologami drożdży i człowieka), ale słabo konserwatywne i rozbieżne w mikrosporydiach (w których nie więcej niż 24% reszt jest identycznych z homologiem eL14). z S. cerevisiae lub H. sapiens). Ta słaba konserwacja sekwencji i zmienność struktury drugorzędowej wyjaśnia, dlaczego homolog eL14 nigdy nie został znaleziony u E. cuniculi i dlaczego uważa się, że to białko zostało utracone u E. cuniculi. Natomiast eL14 z E. cuniculi było wcześniej opisywane jako domniemane białko M970_061160. Ta obserwacja sugeruje, że różnorodność genomu mikrosporydiów jest obecnie przeceniana: niektóre geny, które obecnie uważa się za utracone w mikrosporydiach, są w rzeczywistości zachowane, aczkolwiek w wysoce zróżnicowanych formach; zamiast tego uważa się, że niektóre kodują geny mikrosporydiów dla białek specyficznych dla robaków (np. hipotetyczne białko M970_061160) w rzeczywistości koduje bardzo zróżnicowane białka występujące u innych eukariontów.
Odkrycie to sugeruje, że denaturacja rRNA może prowadzić do drastycznej utraty konserwatywności sekwencji w sąsiednich białkach rybosomalnych, co czyni je niewykrywalnymi w badaniach homologicznych. Możemy zatem przeceniać rzeczywisty stopień degradacji molekularnej w organizmach o małym genomie, ponieważ niektóre białka uważane za utracone w rzeczywistości pozostają, aczkolwiek w silnie zmienionych formach.
W jaki sposób pasożyty mogą zachować funkcjonowanie swoich maszyn molekularnych w warunkach skrajnej redukcji genomu? Nasze badanie odpowiada na to pytanie, opisując złożoną strukturę molekularną (rybosom) E. cuniculi, organizmu o jednym z najmniejszych genomów eukariotycznych.
Od prawie dwóch dekad wiadomo, że cząsteczki białek i RNA u pasożytów mikrobiologicznych często różnią się od homologicznych cząsteczek u gatunków wolno żyjących, ponieważ brakuje im centrów kontroli jakości, są zredukowane do 50% swojej wielkości u wolno żyjących mikrobów itd., a także występują liczne wyniszczające mutacje, które upośledzają fałdowanie i funkcjonowanie. Na przykład, rybosomy organizmów o małym genomie, w tym wielu pasożytów wewnątrzkomórkowych i endosymbiontów, prawdopodobnie będą pozbawione kilku białek rybosomalnych i do jednej trzeciej nukleotydów rRNA w porównaniu z gatunkami wolno żyjącymi27, 29, 30, 49. Jednak sposób funkcjonowania tych cząsteczek u pasożytów pozostaje w dużej mierze zagadką, badaną głównie za pomocą genomiki porównawczej.
Nasze badanie pokazuje, że struktura makrocząsteczek może ujawnić wiele aspektów ewolucji, które trudno wyekstrahować z tradycyjnych porównawczych badań genomicznych pasożytów wewnątrzkomórkowych i innych organizmów ograniczonych do żywiciela (Rys. uzupełniający 7). Na przykład przykład białka eL14 pokazuje, że możemy przeceniać rzeczywisty stopień degradacji aparatu molekularnego u gatunków pasożytniczych. Obecnie uważa się, że pasożyty wywołujące zapalenie mózgu posiadają setki genów specyficznych dla mikrosporydiów. Jednak nasze wyniki pokazują, że niektóre z tych pozornie specyficznych genów są w rzeczywistości po prostu bardzo różnymi wariantami genów, które są powszechne u innych eukariotów. Co więcej, przykład białka msL2 pokazuje, jak pomijamy nowe białka rybosomalne i niedoceniamy zawartość pasożytniczych maszyn molekularnych. Przykład małych cząsteczek pokazuje, jak możemy przeoczyć najbardziej pomysłowe innowacje w pasożytniczych strukturach molekularnych, które mogą nadać im nową aktywność biologiczną.
Łącznie, wyniki te pogłębiają nasze zrozumienie różnic między strukturami molekularnymi organizmów ograniczonych do gospodarza a ich odpowiednikami w organizmach wolno żyjących. Wykazujemy, że maszyny molekularne, od dawna uważane za zredukowane, zdegenerowane i podatne na różne wyniszczające mutacje, posiadają zamiast tego zestaw systematycznie pomijanych, nietypowych cech strukturalnych.
Z drugiej strony, niemasywne fragmenty rRNA i fragmenty połączone, które znaleźliśmy w rybosomach E. cuniculi, sugerują, że redukcja genomu może zmienić nawet te części podstawowego mechanizmu molekularnego, które są zachowane w trzech domenach życia – po prawie 3,5 miliarda lat niezależnej ewolucji gatunków.
Fragmenty rRNA pozbawione wypukłości i połączone w rybosomach E. cuniculi są szczególnie interesujące w świetle wcześniejszych badań cząsteczek RNA w bakteriach endosymbiotycznych. Na przykład u endosymbionta mszycy Buchnera aphidicola wykazano, że cząsteczki rRNA i tRNA mają struktury wrażliwe na temperaturę ze względu na odchylenie składu A+T i wysoki odsetek niekanonicznych par zasad20,50. Uważa się obecnie, że te zmiany w RNA, a także zmiany w cząsteczkach białek, są odpowiedzialne za nadmierną zależność endosymbiontów od partnerów i niezdolność endosymbiontów do przenoszenia ciepła21,23. Chociaż rRNA pasożytniczych mikrosporydiów ma strukturalnie odrębne zmiany, charakter tych zmian sugeruje, że zmniejszona stabilność termiczna i większa zależność od białek chaperonowych mogą być wspólnymi cechami cząsteczek RNA w organizmach o zredukowanych genomach.
Z drugiej strony, nasze struktury pokazują, że pasożytnicze mikrosporydia wyewoluowały unikalną zdolność do opierania się szeroko konserwatywnym fragmentom rRNA i białek, rozwijając zdolność do wykorzystywania licznych i łatwo dostępnych małych metabolitów jako strukturalnych naśladowców zdegenerowanych fragmentów rRNA i białek. Degradacja struktury molekularnej. . Pogląd ten jest poparty faktem, że małe cząsteczki, które kompensują utratę fragmentów białek w rRNA i rybosomach E. cuniculi, wiążą się z resztami specyficznymi dla mikrosporydiów w białkach uL15 i eL30. Sugeruje to, że wiązanie małych cząsteczek z rybosomami może być produktem selekcji pozytywnej, w której mutacje specyficzne dla mikrosporydiów w białkach rybosomalnych zostały wyselekcjonowane ze względu na ich zdolność do zwiększania powinowactwa rybosomów do małych cząsteczek, co może prowadzić do bardziej wydajnych organizmów rybosomalnych. Odkrycie to ujawnia inteligentną innowację w strukturze molekularnej pasożytniczych mikroorganizmów i pozwala nam lepiej zrozumieć, w jaki sposób molekularne struktury pasożytów zachowują swoją funkcję pomimo reduktywnej ewolucji.
Obecnie identyfikacja tych małych cząsteczek pozostaje niejasna. Nie jest jasne, dlaczego ich wygląd w strukturze rybosomów różni się między gatunkami mikrosporydiów. W szczególności nie jest jasne, dlaczego wiązanie nukleotydów obserwuje się w rybosomach E. cuniculi i P. locustae, a nie w rybosomach V. necatrix, pomimo obecności reszty F170 w białkach eL20 i K172 V. necatrix. Ta delecja może być spowodowana przez resztę 43 uL6 (znajdującą się w sąsiedztwie kieszeni wiążącej nukleotydy), która jest tyrozyną w V. necatrix, a nie treoniną w E. cuniculi i P. locustae. Obszerny aromatyczny łańcuch boczny Tyr43 może zakłócać wiązanie nukleotydów z powodu nakładania się przestrzennego. Alternatywnie, pozorne usunięcie nukleotydów może być spowodowane niską rozdzielczością obrazowania kriomikroskopowego, co utrudnia modelowanie fragmentów rybosomalnych V. necatrix.
Z drugiej strony, nasza praca sugeruje, że proces rozpadu genomu może być siłą innowacyjną. W szczególności struktura rybosomu E. cuniculi sugeruje, że utrata rRNA i fragmentów białek w rybosomie mikrosporydiów wywiera presję ewolucyjną, która promuje zmiany w strukturze rybosomu. Warianty te występują daleko od miejsca aktywnego rybosomu i wydają się pomagać w utrzymaniu (lub przywróceniu) optymalnego montażu rybosomu, który w przeciwnym razie zostałby zakłócony przez zredukowaną ilość rRNA. Sugeruje to, że główna innowacja rybosomu mikrosporydiów prawdopodobnie wyewoluowała w kierunku potrzeby buforowania dryfu genów.
Być może najlepiej ilustruje to wiązanie nukleotydów, którego dotychczas nie zaobserwowano u innych organizmów. Fakt, że reszty wiążące nukleotydy są obecne u typowych mikrosporydiów, ale nie u innych eukariontów, sugeruje, że miejsca wiązania nukleotydów nie są jedynie reliktami czekającymi na zanik, ani ostatecznym miejscem, w którym rRNA może zostać przywrócone do postaci pojedynczych nukleotydów. Zamiast tego, miejsce to wydaje się użyteczną cechą, która mogła ewoluować w ciągu kilku rund selekcji pozytywnej. Miejsca wiązania nukleotydów mogą być produktem ubocznym doboru naturalnego: po degradacji ES39L, mikrosporydia są zmuszone do poszukiwania kompensacji, aby przywrócić optymalną biogenezę rybosomu przy braku ES39L. Ponieważ nukleotyd ten może naśladować kontakty molekularne nukleotydu A3186 w ES39L, cząsteczka nukleotydu staje się elementem budulcowym rybosomu, którego wiązanie jest dodatkowo ulepszone przez mutację sekwencji eL30.
W odniesieniu do ewolucji molekularnej pasożytów wewnątrzkomórkowych, nasze badania pokazują, że siły darwinowskiego doboru naturalnego i dryfu genetycznego rozkładu genomu nie działają równolegle, lecz oscylują. Po pierwsze, dryf genetyczny eliminuje ważne cechy biocząsteczek, co sprawia, że ​​kompensacja jest niezwykle potrzebna. Dopiero gdy pasożyty zaspokoją tę potrzebę poprzez darwinowski dobór naturalny, ich makrocząsteczki będą miały szansę rozwinąć swoje najbardziej imponujące i innowacyjne cechy. Co ważne, ewolucja miejsc wiązania nukleotydów w rybosomie E. cuniculi sugeruje, że ten wzór ewolucji molekularnej „strata-zysk” nie tylko amortyzuje szkodliwe mutacje, ale czasami nadaje pasożytniczym makrocząsteczkom zupełnie nowe funkcje.
Ta koncepcja jest zgodna z teorią równowagi ruchomej Sewella Wrighta, która głosi, że ścisły system doboru naturalnego ogranicza zdolność organizmów do innowacji51,52,53. Jednakże, jeśli dryf genetyczny zaburza dobór naturalny, może on prowadzić do zmian, które same w sobie nie są adaptacyjne (ani nawet szkodliwe), ale prowadzą do dalszych zmian, które zapewniają lepsze dostosowanie lub nową aktywność biologiczną. Nasze ramy teoretyczne wspierają tę ideę, ilustrując, że ten sam rodzaj mutacji, który zmniejsza fałdowanie i funkcję biocząsteczki, wydaje się być głównym czynnikiem jej rozwoju. Zgodnie z ewolucyjnym modelem „wygrana-wygrana”, nasze badanie pokazuje, że rozpad genomu, tradycyjnie postrzegany jako proces degeneracyjny, jest również głównym motorem innowacji, czasami, a może nawet często, umożliwiając makrocząsteczkom nabycie nowych aktywności pasożytniczych.