Дякуємо за відвідування Nature.com. Версія браузера, яку ви використовуєте, має обмежену підтримку CSS. Для найкращого досвіду рекомендуємо використовувати оновлений браузер (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer). Тим часом, щоб забезпечити постійну підтримку, ми відображатимемо сайт без стилів та JavaScript.
Еволюція мікробних паразитів включає протидію між природним відбором, який призводить до вдосконалення паразитів, та генетичним дрейфом, який призводить до втрати паразитами генів та накопичення шкідливих мутацій. Тут, щоб зрозуміти, як ця протидія відбувається в масштабі однієї макромолекули, ми описуємо кріо-ЕМ структуру рибосоми Encephalitozoon cuniculi, еукаріотичного організму з одним із найменших геномів у природі. Надзвичайне зменшення рРНК у рибосомах E. cuniculi супроводжується безпрецедентними структурними змінами, такими як еволюція раніше невідомих злитих лінкерів рРНК та рРНК без опуклостей. Крім того, рибосома E. cuniculi пережила втрату фрагментів рРНК та білків, розвинувши здатність використовувати малі молекули як структурні імітатори деградованих фрагментів рРНК та білків. Загалом, ми показуємо, що молекулярні структури, які довго вважалися редукованими, дегенеративними та схильними до виснажливих мутацій, мають низку компенсаторних механізмів, які підтримують їх активність, незважаючи на екстремальні молекулярні скорочення.
Оскільки більшість груп мікробних паразитів мають унікальні молекулярні інструменти для використання своїх господарів, нам часто доводиться розробляти різні методи лікування для різних груп паразитів1,2. Однак нові дані свідчать про те, що деякі аспекти еволюції паразитів є конвергентними та значною мірою передбачуваними, що вказує на потенційну основу для широких терапевтичних втручань у боротьбу з мікробними паразитами3,4,5,6,7,8,9.
Попередні дослідження виявили спільну еволюційну тенденцію мікробних паразитів, яка називається редукцією геному або розпадом геному10,11,12,13. Сучасні дослідження показують, що коли мікроорганізми відмовляються від свого вільного способу життя та стають внутрішньоклітинними паразитами (або ендосимбіонтами), їхні геноми зазнають повільних, але дивовижних метаморфоз протягом мільйонів років9,11. У процесі, відомому як розпад геному, мікробні паразити накопичують шкідливі мутації, які перетворюють багато раніше важливих генів на псевдогени, що призводить до поступової втрати генів та мутаційного колапсу14,15. Цей колапс може знищити до 95% генів у найстаріших внутрішньоклітинних організмах порівняно з близькоспорідненими вільноживучими видами. Таким чином, еволюція внутрішньоклітинних паразитів – це перетягування каната між двома протилежними силами: дарвінівським природним відбором, що призводить до вдосконалення паразитів, та колапсом геному, що кидає паразитів у забуття. Як паразиту вдалося вийти з цього перетягування каната та зберегти активність своєї молекулярної структури, залишається незрозумілим.
Хоча механізм розпаду геному до кінця не вивчений, він, ймовірно, відбувається головним чином через часті генетичні зміщення. Оскільки паразити живуть у невеликих, безстатевих та генетично обмежених популяціях, вони не можуть ефективно усувати шкідливі мутації, які іноді виникають під час реплікації ДНК. Це призводить до незворотного накопичення шкідливих мутацій та зменшення геному паразита. В результаті паразит не лише втрачає гени, які більше не є необхідними для його виживання у внутрішньоклітинному середовищі. Саме нездатність популяцій паразитів ефективно усувати спорадичні шкідливі мутації призводить до накопичення цих мутацій по всьому геному, включаючи їхні найважливіші гени.
Значна частина нашого сучасного розуміння редукції геному базується виключно на порівняннях послідовностей геному, приділяючи менше уваги змінам у фактичних молекулах, які виконують функції ведення домашнього господарства та служать потенційними мішенями для ліків. Порівняльні дослідження показали, що тягар шкідливих внутрішньоклітинних мікробних мутацій, здається, схильний до неправильного згортання та агрегації білків та нуклеїнових кислот, роблячи їх більш залежними від шаперонів та гіперчутливими до тепла19,20,21,22,23. Крім того, різні паразити – незалежна еволюція, іноді розділена цілих 2,5 мільярдами років – зазнали подібної втрати центрів контролю якості в синтезі білка5,6 та механізмах репарації ДНК24. Однак мало що відомо про вплив внутрішньоклітинного способу життя на всі інші властивості клітинних макромолекул, включаючи молекулярну адаптацію до зростаючого тягаря шкідливих мутацій.
У цій роботі, щоб краще зрозуміти еволюцію білків та нуклеїнових кислот внутрішньоклітинних мікроорганізмів, ми визначили структуру рибосом внутрішньоклітинного паразита Encephalitozoon cuniculi. E. cuniculi – це грибоподібний організм, що належить до групи паразитичних мікроспоридій, які мають надзвичайно малі еукаріотичні геноми і тому використовуються як модельні організми для вивчення розпаду геному25,26,27,28,29,30. Нещодавно кріо-ЕМ структура рибосом була визначена для помірно редукованих геномів Microsporidia, Paranosema locustae та Vairimorpha necatrix31,32 (геном ~3,2 Мб). Ці структури свідчать про те, що деяка втрата ампліфікації рРНК компенсується розвитком нових контактів між сусідніми рибосомними білками або придбанням нових рибосомних білків msL131,32. Вид Encephalitozoon (геном ~2,5 млн. п.н.), разом зі своїм найближчим родичем Ordospora, демонструють найвищий ступінь редукції геному серед еукаріотів – вони мають менше 2000 генів, що кодують білки, і очікується, що їхні рибосоми не тільки позбавлені фрагментів розширення рРНК (фрагментів рРНК, що відрізняють еукаріотичні рибосоми від бактеріальних рибосом), але й мають чотири рибосомні білки через відсутність гомологів у геномі E. cuniculi26,27,28. Таким чином, ми дійшли висновку, що рибосома E. cuniculi може виявляти раніше невідомі стратегії молекулярної адаптації до розпаду геному.
Наша кріо-ЕМ структура являє собою найменшу еукаріотичну цитоплазматичну рибосому, яку потрібно охарактеризувати, і дає уявлення про те, як кінцевий ступінь редукції геному впливає на структуру, збірку та еволюцію молекулярного апарату, що є невід'ємною частиною клітини. Ми виявили, що рибосома E. cuniculi порушує багато широко збережених принципів згортання РНК та збірки рибосом, і відкрили новий, раніше невідомий рибосомний білок. Зовсім несподівано ми показуємо, що рибосоми мікроспоридій розвинули здатність зв'язувати малі молекули, і висуваємо гіпотезу, що укорочення в рРНК та білках запускають еволюційні інновації, які зрештою можуть надати рибосомі корисні якості.
Щоб покращити наше розуміння еволюції білків та нуклеїнових кислот у внутрішньоклітинних організмах, ми вирішили виділити спори E. cuniculi з культур інфікованих клітин ссавців, щоб очистити їхні рибосоми та визначити структуру цих рибосом. Важко отримати велику кількість паразитичних мікроспоридій, оскільки мікроспоридії не можна культивувати в живильному середовищі. Натомість вони ростуть і розмножуються лише всередині клітини-хазяїна. Тому, щоб отримати біомасу E. cuniculi для очищення рибосом, ми інфікували лінію клітин нирок ссавців RK13 спорами E. cuniculi та культивували ці інфіковані клітини протягом кількох тижнів, щоб дозволити E. cuniculi рости та розмножуватися. Використовуючи моношар інфікованих клітин площею близько півквадратного метра, ми змогли очистити близько 300 мг спор мікроспоридій та використати їх для виділення рибосом. Потім ми розірвали очищені спори скляними кульками та виділили необроблені рибосоми, використовуючи поетапне фракціонування лізатів поліетиленгліколем. Це дозволило нам отримати приблизно 300 мкг необроблених рибосом E. cuniculi для структурного аналізу.
Потім ми зібрали кріоЕМ-зображення, використовуючи отримані зразки рибосом, та обробили ці зображення за допомогою масок, що відповідають великій рибосомній субодиниці, головці малої субодиниці та малій субодиниці. Під час цього процесу ми зібрали зображення близько 108 000 рибосомних частинок та обчислили кріоЕМ-зображення з роздільною здатністю 2,7 Å (Додаткові рисунки 1-3). Далі ми використали кріоЕМ-зображення для моделювання рРНК, рибосомного білка та фактора гібернації Mdf1, пов'язаних з рибосомами E. cuniculi (Рис. 1a, b).
a Структура рибосоми E. cuniculi в комплексі з фактором гібернації Mdf1 (pdb id 7QEP). b Карта фактора гібернації Mdf1, пов'язаного з рибосомою E. cuniculi. c Карта вторинної структури, що порівнює відновлену рРНК у видах мікроспоридій з відомими структурами рибосом. Панелі показують розташування ампліфікованих фрагментів рРНК (ES) та активних центрів рибосом, включаючи сайт декодування (DC), петлю сарциніцину (SRL) та центр пептидилтрансферази (PTC). d Електронна щільність, що відповідає центру пептидилтрансферази рибосоми E. cuniculi, свідчить про те, що цей каталітичний сайт має таку ж структуру у паразита E. cuniculi та його хазяїв, включаючи H. sapiens. e, f Відповідна електронна щільність центру декодування (e) та схематична структура центру декодування (f) вказують на те, що E. cuniculi має залишки U1491 замість A1491 (нумерація E. coli) у багатьох інших еукаріотів. Ця зміна свідчить про те, що E. cuniculi може бути чутливим до антибіотиків, які впливають на цей активний центр.
На відміну від раніше встановлених структур рибосом V. necatrix та P. locustae (обидві структури представляють одну й ту саму родину мікроспоридій Nosematidae та дуже схожі одна на одну),31,32 рибосоми E. cuniculi зазнають численних процесів фрагментації рРНК та білків. Подальша денатурація (Додаткові рисунки 4-6). У рРНК найвражаючі зміни включали повну втрату ампліфікованого фрагмента 25S рРНК ES12L та часткову дегенерацію спіралей h39, h41 та H18 (Рис. 1c, Додатковий рис. 4). Серед рибосомних білків найвражаючі зміни включали повну втрату білка eS30 та скорочення білків eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 та eS7 (Додаткові рисунки 4, 5).
Таким чином, надзвичайне скорочення геномів видів Encephalotozoon/Ordospora відображається в структурі їхніх рибосом: рибосоми E. cuniculi зазнають найбільшої втрати вмісту білка в еукаріотичних цитоплазматичних рибосомах, що підлягають структурній характеристиці, і вони навіть не мають тих рРНК та білкових фрагментів, які широко консервативні не лише у еукаріотів, але й у трьох доменах життя. Структура рибосоми E. cuniculi забезпечує першу молекулярну модель цих змін та розкриває еволюційні події, які були пропущені як порівняльною геномікою, так і дослідженнями внутрішньоклітинної біомолекулярної структури (Додатковий рис. 7). Нижче ми описуємо кожну з цих подій разом з їх ймовірним еволюційним походженням та їхнім потенційним впливом на функцію рибосом.
Потім ми виявили, що, окрім великих укорочень рРНК, рибосоми E. cuniculi мають варіації рРНК в одному зі своїх активних центрів. Хоча пептидилтрансферазний центр рибосоми E. cuniculi має таку ж структуру, як і інші еукаріотичні рибосоми (рис. 1d), декодуючий центр відрізняється через варіацію послідовності в нуклеотиді 1491 (нумерація E. coli, рис. 1e, f). Це спостереження є важливим, оскільки декодуючий сайт еукаріотичних рибосом зазвичай містить залишки G1408 та A1491 порівняно із залишками бактеріального типу A1408 та G1491. Ця варіація лежить в основі різної чутливості бактеріальних та еукаріотичних рибосом до родини аміноглікозидів рибосомних антибіотиків та інших малих молекул, що націлені на декодуючий сайт. У декодуючому сайті рибосоми E. cuniculi залишок A1491 був замінений на U1491, що потенційно створює унікальний інтерфейс зв'язування для малих молекул, що націлені на цей активний сайт. Той самий варіант A14901 також присутній в інших мікроспоридіях, таких як P. locustae та V. necatrix, що свідчить про його широке поширення серед видів мікроспоридій (рис. 1f).
Оскільки наші зразки рибосом E. cuniculi були виділені з метаболічно неактивних спор, ми протестували кріо-ЕМ карту E. cuniculi на предмет раніше описаного зв'язування рибосом в умовах стресу або голодування. Фактори гібернації 31, 32, 36, 37, 38. Ми зіставили раніше встановлену структуру рибосоми, що гібернує, з кріо-ЕМ картою рибосоми E. cuniculi. Для докінгу використовували рибосоми S. cerevisiae в комплексі з фактором гібернації Stm138, рибосоми сарани в комплексі з фактором Lso232 та рибосоми V. necatrix в комплексі з факторами Mdf1 та Mdf231. Водночас ми виявили кріо-ЕМ щільність, що відповідає фактору спокою Mdf1. Подібно до зв'язування Mdf1 з рибосомою V. necatrix, Mdf1 також зв'язується з рибосомою E. cuniculi, де він блокує E-сайт рибосоми, можливо, допомагаючи зробити рибосоми доступними, коли спори паразита стають метаболічно неактивними після інактивації організму (Рисунок 2).
Mdf1 блокує E-сайт рибосоми, що, ймовірно, допомагає інактивувати рибосому, коли спори паразита стають метаболічно неактивними. У структурі рибосоми E. cuniculi ми виявили, що Mdf1 утворює раніше невідомий контакт зі стеблом рибосоми L1, частиною рибосоми, яка сприяє вивільненню деацильованої тРНК з рибосоми під час синтезу білка. Ці контакти свідчать про те, що Mdf1 дисоціює від рибосоми, використовуючи той самий механізм, що й деацетильована тРНК, що дає можливе пояснення тому, як рибосома видаляє Mdf1 для реактивації синтезу білка.
Однак, наша структура виявила невідомий контакт між Mdf1 та ніжкою рибосоми L1 (частина рибосоми, яка допомагає вивільняти деацильовану тРНК з рибосоми під час синтезу білка). Зокрема, Mdf1 використовує ті ж контакти, що й ліктьовий сегмент деацильованої молекули тРНК (рис. 2). Це раніше невідоме молекулярне моделювання показало, що Mdf1 дисоціює від рибосоми, використовуючи той самий механізм, що й деацетильована тРНК, що пояснює, як рибосома видаляє цей фактор гібернації, щоб реактивувати синтез білка.
Під час побудови моделі рРНК ми виявили, що рибосома E. cuniculi має аномально складені фрагменти рРНК, які ми назвали злитою рРНК (рис. 3). У рибосомах, що охоплюють три домени життя, рРНК складається в структури, в яких більшість основ рРНК або об'єднуються в пари основ і складаються одна з одною, або взаємодіють з рибосомними білками38,39,40. Однак у рибосомах E. cuniculi рРНК, здається, порушують цей принцип згортання, перетворюючи деякі зі своїх спіралей на розгорнуті області рРНК.
Структура спіралі H18 25S рРНК у S. cerevisiae, V. necatrix та E. cuniculi. Як правило, у рибосомах, що охоплюють три життєві домени, цей лінкер згортається у спіраль РНК, яка містить від 24 до 34 залишків. У мікроспоридіях, навпаки, цей лінкер рРНК поступово відновлюється до двох одноланцюгових лінкерів, багатих на уридин, що містять лише 12 залишків. Більшість цих залишків піддаються впливу розчинників. На рисунку показано, що паразитичні мікроспоридії, здається, порушують загальні принципи згортання рРНК, де основи рРНК зазвичай з'єднані з іншими основами або беруть участь у взаємодії рРНК-білок. У мікроспоридіях деякі фрагменти рРНК приймають несприятливу складку, при якій колишня спіраль рРНК перетворюється на одноланцюговий фрагмент, витягнутий майже по прямій лінії. Наявність цих незвичайних ділянок дозволяє рРНК мікроспоридій зв'язуватися з віддаленими фрагментами рРНК, використовуючи мінімальну кількість основ РНК.
Найяскравіший приклад цього еволюційного переходу можна спостерігати у спіралі H18 25S рРНК (рис. 3). У видів від E. coli до людини основи цієї спіралі рРНК містять 24-32 нуклеотиди, утворюючи дещо неправильну спіраль. У раніше ідентифікованих рибосомних структурах V. necatrix та P. locustae,31,32 основи спіралі H18 частково розгорнуті, але спарювання нуклеотидних основ зберігається. Однак у E. cuniculi цей фрагмент рРНК стає найкоротшими лінкерами 228UUUGU232 та 301UUUUUUUUUU307. На відміну від типових фрагментів рРНК, ці багаті на уридин лінкери не скручуються та не контактують з рибосомними білками. Натомість вони приймають відкриті для розчинника та повністю розгорнуті структури, в яких нитки рРНК витягнуті майже прямо. Ця розтягнута конформація пояснює, як E. cuniculi використовує лише 12 основ РНК для заповнення проміжку 33 Å між спіралями рРНК H16 та H18, тоді як іншим видам потрібно щонайменше вдвічі більше основ рРНК для заповнення проміжку.
Таким чином, ми можемо продемонструвати, що завдяки енергетично несприятливому згортанню паразитичні мікроспоридії розробили стратегію скорочення навіть тих сегментів рРНК, які залишаються широко консервативними у різних видів у трьох доменах життя. Очевидно, накопичуючи мутації, які перетворюють спіралі рРНК на короткі полі-U-лінкери, E. cuniculi може утворювати незвичайні фрагменти рРНК, що містять якомога менше нуклеотидів, для лігування дистальних фрагментів рРНК. Це допомагає пояснити, як мікроспоридії досягли різкого зменшення своєї основної молекулярної структури, не втрачаючи своєї структурної та функціональної цілісності.
Ще однією незвичайною особливістю рРНК E. cuniculi є поява рРНК без потовщень (рис. 4). Випинання – це нуклеотиди без пар основ, які вигинаються зі спіралі РНК, а не ховаються в ній. Більшість випинань рРНК діють як молекулярні адгезиви, допомагаючи зв'язувати сусідні рибосомні білки або інші фрагменти рРНК. Деякі з випинань діють як шарніри, дозволяючи спіралі рРНК оптимально згинатися та складатися для продуктивного синтезу білка 41.
a Випинання рРНК (нумерація S. cerevisiae) відсутнє в структурі рибосоми E. cuniculi, але присутнє в більшості інших еукаріотів b Внутрішні рибосоми E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens та E. cuniculi. паразитам бракує багатьох стародавніх, висококонсервативних опуклостей рРНК. Ці потовщення стабілізують структуру рибосом; тому їх відсутність у мікроспоридіях вказує на знижену стабільність згортання рРНК у паразитів-мікроспоридіях. Порівняння з P-стеблами (стебла L7/L12 у бактерій) показує, що втрата опуклостей рРНК іноді збігається з появою нових опуклостей поруч із втраченими. Спіраль H42 у 23S/28S рРНК має стародавнє опуклість (U1206 у Saccharomyces cerevisiae), вік якої оцінюється щонайменше в 3,5 мільярда років завдяки її захисту у трьох сферах життя. У мікроспоридіях ця опуклість усунена. Однак поруч із втраченою опуклістю з'явилася нова (A1306 у E. cuniculi).
Вражаюче, ми виявили, що рибосомам E. cuniculi бракує більшості опуклостей рРНК, виявлених в інших видів, включаючи понад 30 опуклостей, збережених в інших еукаріотів (рис. 4a). Ця втрата усуває багато контактів між субодиницями рибосом та сусідніми спіралями рРНК, іноді створюючи великі порожнисті порожнини всередині рибосоми, що робить рибосому E. cuniculi більш пористою порівняно з більш традиційними рибосомами (рис. 4b). Примітно, що ми виявили, що більшість цих опуклостей також були втрачені в раніше ідентифікованих структурах рибосом V. necatrix та P. locustae, які були пропущені попередніми структурними аналізами31,32.
Іноді втрата випинань рРНК супроводжується розвитком нових випинань поруч із втраченим випинанням. Наприклад, P-стебло рибосоми містить випинання U1208 (у Saccharomyces cerevisiae), яке пережило перехід від E. coli до людини і тому його вік оцінюється в 3,5 мільярда років. Під час синтезу білка це випинання допомагає P-стеблу переходити між відкритою та закритою конформаціями, щоб рибосома могла залучати фактори трансляції та доставляти їх до активного центру. У рибосомах E. cuniculi це потовщення відсутнє; однак нове потовщення (G883), розташоване лише в трьох парах основ, може сприяти відновленню оптимальної гнучкості P-стебла (рис. 4c).
Наші дані щодо рРНК без опуклостей свідчать про те, що мінімізація рРНК не обмежується втратою елементів рРНК на поверхні рибосоми, а може також стосуватися ядра рибосоми, створюючи специфічний для паразита молекулярний дефект, який не був описаний у вільноживучих клітинах. Спостерігаються значні зміни у живих видів.
Після моделювання канонічних рибосомних білків та рРНК ми виявили, що звичайні рибосомні компоненти не можуть пояснити три частини кріо-ЕМ зображення. Два з цих фрагментів є молекулами малого розміру (рис. 5, додатковий рис. 8). Перший сегмент розташований між рибосомними білками uL15 та eL18 у положенні, яке зазвичай займає C-кінець eL18, який укорочений у E. cuniculi. Хоча ми не можемо визначити ідентичність цієї молекули, розмір та форму цього острівця щільності добре пояснюються наявністю молекул спермідину. Його зв'язування з рибосомою стабілізується специфічними для мікроспоридій мутаціями в білках uL15 (Asp51 та Arg56), які, здається, збільшують спорідненість рибосоми до цієї малої молекули, оскільки вони дозволяють uL15 обгортати малу молекулу в рибосомну структуру. Додатковий рисунок 2). 8, додаткові дані 1, 2).
Кріо-ЕМ-візуалізація показує наявність нуклеотидів поза рибозою, зв'язаною з рибосомою E. cuniculi. У рибосомі E. cuniculi цей нуклеотид займає те саме місце, що й нуклеотид 25S рРНК A3186 (нумерація Saccharomyces cerevisiae) у більшості інших еукаріотичних рибосом. b У структурі рибосом E. cuniculi цей нуклеотид розташований між рибосомними білками uL9 та eL20, тим самим стабілізуючи контакт між цими двома білками. cd Аналіз збереження послідовності eL20 серед видів мікроспоридій. Філогенетичне дерево видів мікроспоридій (c) та множинне вирівнювання послідовностей білка eL20 (d) показують, що нуклеотид-зв'язуючі залишки F170 та K172 збережені у більшості типових мікроспоридій, за винятком S. lophii, за винятком ранньорозгалужених мікроспоридій, які зберегли розширення рРНК ES39L. e На цьому рисунку показано, що залишки F170 та K172, що зв'язують нуклеотиди, присутні лише в eL20 сильно редукованого геному мікроспоридій, але не в інших еукаріотів. Загалом, ці дані свідчать про те, що рибосоми мікроспоридій розвинули сайт зв'язування нуклеотидів, який, здається, зв'язує молекули АМФ та використовує їх для стабілізації білок-білкових взаємодій у структурі рибосоми. Висока консервативність цього сайту зв'язування у мікроспоридій та його відсутність в інших еукаріотів свідчить про те, що цей сайт може забезпечити селективну перевагу виживання для мікроспоридій. Таким чином, кишеня зв'язування нуклеотидів у рибосомі мікроспоридій не є виродженою ознакою або кінцевою формою деградації рРНК, як було описано раніше, а радше корисним еволюційним нововведенням, яке дозволяє рибосомі мікроспоридій безпосередньо зв'язуватися з малими молекулами, використовуючи їх як молекулярні будівельні блоки для рибосом. Це відкриття робить рибосому мікроспоридій єдиною відомою рибосомою, яка використовує один нуклеотид як свій структурний будівельний блок. f Гіпотетичний еволюційний шлях, похідний від зв'язування нуклеотидів.
Друга низькомолекулярна щільність розташована на межі розділу рибосомних білків uL9 та eL30 (рис. 5a). Цей інтерфейс раніше був описаний у структурі рибосоми Saccharomyces cerevisiae як сайт зв'язування для 25S нуклеотиду рРНК A3186 (частина розширення рРНК ES39L)38. Було показано, що в дегенерованих рибосомах P. locustae ES39L цей інтерфейс зв'язується з невідомим окремим нуклеотидом 31, і передбачається, що цей нуклеотид є редукованою кінцевою формою рРНК, в якій довжина рРНК становить ~130-230 основ. ES39L редукується до одного нуклеотиду 32.43. Наші кріо-ЕМ зображення підтверджують ідею про те, що щільність можна пояснити нуклеотидами. Однак, вища роздільна здатність нашої структури показала, що цей нуклеотид є позарибосомною молекулою, можливо, AMP (рис. 5a, b).
Потім ми запитали, чи з'явився сайт зв'язування нуклеотидів на рибосомі E. cuniculi, чи він існував раніше. Оскільки зв'язування нуклеотидів опосередковується переважно залишками Phe170 та Lys172 у рибосомному білку eL30, ми оцінили збереження цих залишків у 4396 репрезентативних еукаріотів. Як і у випадку з uL15 вище, ми виявили, що залишки Phe170 та Lys172 є висококонсервативними лише у типових мікроспоридіях, але відсутні в інших еукаріотів, включаючи атипові мікроспоридії Mitosporidium та Amphiamblys, у яких фрагмент рРНК ES39L не відновлений 44, 45, 46 (рис. 5c).-e).
У сукупності ці дані підтверджують ідею про те, що E. cuniculi та, можливо, інші канонічні мікроспоридії розвинули здатність ефективно захоплювати велику кількість малих метаболітів у структурі рибосом, щоб компенсувати зниження рівня рРНК та білка. При цьому вони розвинули унікальну здатність зв'язувати нуклеотиди поза рибосомою, що показує, що паразитичні молекулярні структури компенсують це, захоплюючи велику кількість малих метаболітів та використовуючи їх як структурні імітації деградованих фрагментів РНК та білка.
Третя немодельована частина нашої кріо-ЕМ карти, знайдена у великій рибосомній субодиниці. Відносно висока роздільна здатність (2,6 Å) нашої карти свідчить про те, що ця щільність належить білкам з унікальними комбінаціями залишків великого бічного ланцюга, що дозволило нам ідентифікувати цю щільність як раніше невідомий рибосомний білок, який ми ідентифікували як. Він був названий msL2 (Microsporidia-specific protein L2) (методи, рисунок 6). Наш пошук гомології показав, що msL2 консервативний у кладі Microsporidia роду Encephaliter та Orosporidium, але відсутній у інших видів, включаючи інші Microsporidia. У структурі рибосоми msL2 займає проміжок, утворений втратою розширеної рРНК ES31L. У цій порожнечі msL2 допомагає стабілізувати згортання рРНК і може компенсувати втрату ES31L (рисунок 6).
a Електронна щільність та модель специфічного для мікроспоридій рибосомного білка msL2, знайденого в рибосомах E. cuniculi. b У більшості еукаріотичних рибосом, включаючи 80S рибосому Saccharomyces cerevisiae, ампліфікація ES19L рРНК втрачена у більшості видів мікроспоридій. Раніше встановлена ​​структура рибосоми мікроспоридій V. necatrix свідчить про те, що втрата ES19L у цих паразитів компенсується еволюцією нового рибосомного білка msL1. У цьому дослідженні ми виявили, що рибосома E. cuniculi також розвинула додатковий білок, що мімікує рибосомну РНК, як очевидну компенсацію за втрату ES19L. Однак msL2 (наразі позначений як гіпотетичний білок ECU06_1135) та msL1 мають різне структурне та еволюційне походження. Це відкриття генерації еволюційно не пов'язаних між собою рибосомних білків msL1 та msL2 свідчить про те, що якщо рибосоми накопичують шкідливі мутації у своїй рРНК, вони можуть досягти безпрецедентного рівня різноманітності складу навіть у невеликій підгрупі близькоспоріднених видів. Це відкриття може допомогти з'ясувати походження та еволюцію мітохондріальної рибосоми, яка відома своєю сильно зниженою рРНК та аномальною мінливістю складу білків у різних видів.
Потім ми порівняли білок msL2 з раніше описаним білком msL1, єдиним відомим рибосомним білком, специфічним для мікроспоридій, знайденим у рибосомі V. necatrix. Ми хотіли перевірити, чи є msL1 та msL2 еволюційно пов'язаними. Наш аналіз показав, що msL1 та msL2 займають одну й ту саму порожнину в рибосомній структурі, але мають різні первинні та третинні структури, що вказує на їх незалежне еволюційне походження (рис. 6). Таким чином, наше відкриття msL2 надає докази того, що групи компактних еукаріотичних видів можуть незалежно еволюціонувати структурно різні рибосомні білки, щоб компенсувати втрату фрагментів рРНК. Це відкриття примітне тим, що більшість цитоплазматичних еукаріотичних рибосом містять інваріантний білок, включаючи ту саму родину з 81 рибосомного білка. Поява msL1 та msL2 у різних кладах мікроспоридій у відповідь на втрату розширених сегментів рРНК свідчить про те, що деградація молекулярної архітектури паразита змушує паразитів шукати компенсаторні мутації, що зрештою може призвести до їх придбання в різних популяціях паразитів.
Зрештою, коли наша модель була завершена, ми порівняли склад рибосоми E. cuniculi з тим, що було передбачено на основі послідовності геному. Раніше вважалося, що кілька рибосомних білків, включаючи eL14, eL38, eL41 та eS30, відсутні в геномі E. cuniculi через очевидну відсутність їхніх гомологів у геномі E. cuniculi. Втрата багатьох рибосомних білків також передбачається у більшості інших сильно редукованих внутрішньоклітинних паразитів та ендосимбіонтів. Наприклад, хоча більшість вільноживучих бактерій містять ту саму родину з 54 рибосомних білків, лише 11 з цих родин білків мають виявлені гомологи в кожному аналізованому геномі бактерій, обмежених хазяїном. На підтвердження цієї гіпотези експериментально спостерігалася втрата рибосомних білків у мікроспоридіях V. necatrix та P. locustae, у яких відсутні білки eL38 та eL4131,32.
Однак, наші структури показують, що лише eL38, eL41 та eS30 фактично втрачені в рибосомі E. cuniculi. Білок eL14 був консервативним, і наша структура показала, чому цей білок не міг бути знайдений під час пошуку гомології (рис. 7). У рибосомах E. cuniculi більша частина сайту зв'язування eL14 втрачається через деградацію ES39L, ампліфікованого рРНК. За відсутності ES39L eL14 втрачав більшу частину своєї вторинної структури, і лише 18% послідовності eL14 було ідентичним у E. cuniculi та S. cerevisiae. Ця погана збереженість послідовності є примітною, оскільки навіть Saccharomyces cerevisiae та Homo sapiens — організми, які еволюціонували з різницею в 1,5 мільярда років — мають понад 51% однакових залишків в eL14. Ця аномальна втрата збереженості пояснює, чому E. cuniculi eL14 наразі позначається як передбачуваний білок M970_061160, а не як рибосомний білок eL1427.
і Рибосома мікроспоридії втратила подовження рРНК ES39L, що частково знищило сайт зв'язування рибосомного білка eL14. За відсутності ES39L білок мікроспоридії eL14 зазнає втрати вторинної структури, при якій колишня α-спіраль, що зв'язує рРНК, дегенерує в петлю мінімальної довжини. b Множинне вирівнювання послідовностей показує, що білок eL14 є висококонсервативним у еукаріотичних видів (57% ідентичності послідовності між гомологами дріжджів та людини), але погано консервативним та дивергентним у мікроспоридіях (у яких не більше 24% залишків ідентичні гомологу eL14). від S. cerevisiae або H. sapiens). Ця погана консервативність послідовності та варіабельність вторинної структури пояснюють, чому гомолог eL14 ніколи не був знайдений у E. cuniculi і чому вважається, що цей білок був втрачений у E. cuniculi. На противагу цьому, eL14 E. cuniculi раніше був анотований як передбачуваний білок M970_061160. Це спостереження свідчить про те, що різноманітність геному мікроспоридій наразі переоцінена: деякі гени, які наразі вважаються втраченими в мікроспоридіях, насправді збереглися, хоча й у високодиференційованих формах; натомість, вважається, що деякі з них кодують гени мікроспоридій, що відповідають за специфічні для черв'яків білки (наприклад, гіпотетичний білок M970_061160), насправді кодує дуже різноманітні білки, що зустрічаються в інших еукаріотів.
Це відкриття свідчить про те, що денатурація рРНК може призвести до різкої втрати збереженості послідовностей у сусідніх рибосомних білках, що робить ці білки невиявними для пошуку гомології. Таким чином, ми можемо переоцінювати фактичний ступінь молекулярної деградації в організмах з малим геномом, оскільки деякі білки, які вважаються втраченими, насправді зберігаються, хоча й у сильно змінених формах.
Як паразити можуть зберігати функції своїх молекулярних машин в умовах екстремального скорочення геному? Наше дослідження відповідає на це питання, описуючи складну молекулярну структуру (рибосому) E. cuniculi, організму з одним із найменших еукаріотичних геномів.
Вже майже два десятиліття відомо, що молекули білків і РНК у мікробних паразитів часто відрізняються від своїх гомологічних молекул у вільноживучих видів, оскільки їм бракує центрів контролю якості, вони зменшені до 50% свого розміру у вільноживучих мікробів тощо, мають багато виснажливих мутацій, які порушують згортання та функціонування. Наприклад, очікується, що рибосоми організмів з малим геномом, включаючи багатьох внутрішньоклітинних паразитів та ендосимбіонтів, не містять кількох рибосомних білків і до третини нуклеотидів рРНК порівняно з вільноживучими видами [27, 29, 30, 49]. Однак, спосіб функціонування цих молекул у паразитів залишається значною мірою загадкою, яку вивчають переважно за допомогою порівняльної геноміки.
Наше дослідження показує, що структура макромолекул може розкрити багато аспектів еволюції, які важко виділити з традиційних порівняльних геномних досліджень внутрішньоклітинних паразитів та інших організмів, обмежених хазяїном (Додатковий рис. 7). Наприклад, приклад білка eL14 показує, що ми можемо переоцінити фактичний ступінь деградації молекулярного апарату у паразитичних видів. Вважається, що енцефалітичні паразити мають сотні генів, специфічних для мікроспоридій. Однак наші результати показують, що деякі з цих, здавалося б, специфічних генів насправді є лише дуже різними варіантами генів, поширених у інших еукаріотів. Більше того, приклад білка msL2 показує, як ми не помічаємо нових рибосомних білків і недооцінюємо вміст паразитичних молекулярних машин. Приклад малих молекул показує, як ми можемо не помічати найвинахідливіші інновації в паразитичних молекулярних структурах, які можуть надати їм нової біологічної активності.
У сукупності ці результати покращують наше розуміння відмінностей між молекулярними структурами організмів, обмежених хазяїном, та їхніми аналогами у вільноживучих організмах. Ми показуємо, що молекулярні машини, які довго вважалися редукованими, дегенеративними та схильними до різних виснажливих мутацій, натомість мають набір систематично ігнорованих незвичайних структурних особливостей.
З іншого боку, не об'ємні фрагменти рРНК та злиті фрагменти, які ми виявили в рибосомах E. cuniculi, свідчать про те, що редукція геному може змінити навіть ті частини основного молекулярного апарату, які збереглися в трьох доменах життя – після майже 3,5 мільярдів років незалежної еволюції видів.
Вільні від опуклостей та злиті фрагменти рРНК у рибосомах E. cuniculi становлять особливий інтерес у світлі попередніх досліджень молекул РНК у ендосимбіотичних бактерій. Наприклад, у ендосимбіонта попелиці Buchnera aphidicola було показано, що молекули рРНК та тРНК мають температурно-чутливі структури через зміщення складу A+T та високу частку неканонічних пар основ20,50. Ці зміни в РНК, а також зміни в молекулах білків, зараз вважаються відповідальними за надмірну залежність ендосимбіонтів від партнерів та нездатність ендосимбіонтів передавати тепло21,23. Хоча рРНК паразитичних мікроспоридій має структурно відмінні зміни, природа цих змін свідчить про те, що знижена термостабільність та вища залежність від шаперонних білків можуть бути спільними рисами молекул РНК в організмах з редукованими геномами.
З іншого боку, наші структури показують, що мікроспоридії паразитів розвинули унікальну здатність протистояти широко консервативним рРНК та білковим фрагментам, розвинувши здатність використовувати рясні та легкодоступні малі метаболіти як структурні імітатори дегенерованих рРНК та білкових фрагментів. Деградація молекулярної структури. Ця думка підтверджується тим фактом, що малі молекули, які компенсують втрату білкових фрагментів у рРНК та рибосомах E. cuniculi, зв'язуються зі специфічними для мікроспоридій залишками в білках uL15 та eL30. Це свідчить про те, що зв'язування малих молекул з рибосомами може бути продуктом позитивного відбору, в якому специфічні для мікроспоридій мутації в рибосомних білках були відібрані за їх здатність підвищувати спорідненість рибосом до малих молекул, що може призвести до більш ефективних рибосомних організмів. Це відкриття розкриває розумну інновацію в молекулярній структурі мікробних паразитів і дає нам краще розуміння того, як молекулярні структури паразитів зберігають свою функцію, незважаючи на редуктивну еволюцію.
Наразі ідентифікація цих малих молекул залишається неясною. Незрозуміло, чому зовнішній вигляд цих малих молекул у рибосомній структурі відрізняється між видами мікроспоридій. Зокрема, незрозуміло, чому зв'язування нуклеотидів спостерігається в рибосомах E. cuniculi та P. locustae, а не в рибосомах V. necatrix, незважаючи на наявність залишку F170 у білках eL20 та K172 V. necatrix. Ця делеція може бути спричинена залишком 43 uL6 (розташованим поруч із кишенею зв'язування нуклеотидів), який є тирозином у V. necatrix, а не треоніном у E. cuniculi та P. locustae. Об'ємний ароматичний бічний ланцюг Tyr43 може перешкоджати зв'язуванню нуклеотидів через стеричне перекриття. Як альтернатива, очевидна делеція нуклеотидів може бути пов'язана з низькою роздільною здатністю кріо-ЕМ-візуалізації, що перешкоджає моделюванню рибосомних фрагментів V. necatrix.
З іншого боку, наша робота показує, що процес розпаду геному може бути винахідницькою силою. Зокрема, структура рибосоми E. cuniculi свідчить про те, що втрата рРНК та білкових фрагментів у рибосомі мікроспоридій створює еволюційний тиск, який сприяє змінам у структурі рибосом. Ці варіанти виникають далеко від активного центру рибосоми та, здається, допомагають підтримувати (або відновлювати) оптимальну збірку рибосом, яка в іншому випадку була б порушена редукованою рРНК. Це свідчить про те, що головне нововведення рибосоми мікроспоридій, ймовірно, перетворилося на необхідність буферизації дрейфу генів.
Можливо, це найкраще ілюструється зв'язуванням нуклеотидів, яке досі ніколи не спостерігалося в інших організмів. Той факт, що залишки зв'язування нуклеотидів присутні в типових мікроспоридіях, але не в інших еукаріотів, свідчить про те, що сайти зв'язування нуклеотидів - це не просто релікти, що чекають на зникнення, або остаточне місце для відновлення рРНК до форми окремих нуклеотидів. Натомість, цей сайт здається корисною особливістю, яка могла еволюціонувати протягом кількох раундів позитивного відбору. Сайти зв'язування нуклеотидів можуть бути побічним продуктом природного відбору: після деградації ES39L мікроспоридії змушені шукати компенсацію для відновлення оптимального біогенезу рибосом за відсутності ES39L. Оскільки цей нуклеотид може імітувати молекулярні контакти нуклеотиду A3186 в ES39L, молекула нуклеотиду стає будівельним блоком рибосоми, зв'язування якого додатково покращується мутацією послідовності eL30.
Щодо молекулярної еволюції внутрішньоклітинних паразитів, наше дослідження показує, що сили дарвінівського природного відбору та генетичного дрейфу розпаду геному діють не паралельно, а коливаються. По-перше, генетичний дрейф усуває важливі особливості біомолекул, що робить компенсацію вкрай необхідною. Тільки коли паразити задовольняють цю потребу за допомогою дарвінівського природного відбору, їхні макромолекули матимуть шанс розвинути свої найвражаючіші та найінноваційніші риси. Важливо, що еволюція сайтів зв'язування нуклеотидів у рибосомі E. cuniculi свідчить про те, що ця схема молекулярної еволюції «втрата заради отримання» не лише амортизує шкідливі мутації, але й іноді надає паразитичним макромолекулам абсолютно нові функції.
Ця ідея узгоджується з теорією рухомої рівноваги Сьюелла Райта, яка стверджує, що сувора система природного відбору обмежує здатність організмів до інновацій51,52,53. Однак, якщо генетичний дрейф порушує природний відбір, ці дрейфи можуть призвести до змін, які самі по собі не є адаптивними (або навіть шкідливими), але призводять до подальших змін, що забезпечують вищу пристосованість або нову біологічну активність. Наша модель підтверджує цю ідею, ілюструючи, що той самий тип мутації, який зменшує складку та функцію біомолекули, здається, є основним рушієм її вдосконалення. Відповідно до еволюційної моделі «виграш для всіх», наше дослідження показує, що розпад геному, який традиційно розглядається як дегенеративний процес, також є основним рушієм інновацій, іноді, а можливо, навіть часто, дозволяючи макромолекулам набувати нових паразитичних видів діяльності. Вони можуть їх використовувати.