Grazas por visitar Nature.com. A versión do navegador que estás a usar ten compatibilidade limitada con CSS. Para obter a mellor experiencia, recomendámosche que uses un navegador actualizado (ou que desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer). Mentres tanto, para garantir a compatibilidade continua, renderizaremos o sitio sen estilos nin JavaScript.
A evolución dos parasitos microbianos implica unha contraposición entre a selección natural, que fai que os parasitos melloren, e a deriva xenética, que fai que os parasitos perdan xenes e acumulen mutacións nocivas. Aquí, para comprender como se produce esta contraposición á escala dunha soa macromolécula, describimos a estrutura crio-EM do ribosoma de Encephalitozoon cuniculi, un organismo eucariota cun dos xenomas máis pequenos da natureza. A extrema redución do ARNr nos ribosomas de E. cuniculi vai acompañada de cambios estruturais sen precedentes, como a evolución de conectores de ARNr fusionados previamente descoñecidos e ARNr sen protuberancias. Ademais, o ribosoma de E. cuniculi sobreviviu á perda de fragmentos e proteínas de ARNr ao desenvolver a capacidade de usar pequenas moléculas como imitacións estruturais de fragmentos e proteínas de ARNr degradados. En xeral, demostramos que as estruturas moleculares que durante moito tempo se consideraban reducidas, dexeneradas e suxeitas a mutacións debilitantes teñen unha serie de mecanismos compensatorios que as manteñen activas a pesar das contraccións moleculares extremas.
Dado que a maioría dos grupos de parasitos microbianos dispoñen de ferramentas moleculares únicas para explotar os seus hóspedes, a miúdo temos que desenvolver diferentes terapias para diferentes grupos de parasitos1,2. Non obstante, novas evidencias suxiren que algúns aspectos da evolución dos parasitos son converxentes e en gran medida predicibles, o que indica unha base potencial para amplas intervencións terapéuticas en parasitos microbianos3,4,5,6,7,8,9.
Traballos anteriores identificaron unha tendencia evolutiva común nos parasitos microbianos chamada redución do xenoma ou decadencia do xenoma10,11,12,13. A investigación actual mostra que cando os microorganismos abandonan o seu estilo de vida libre e se converten en parasitos intracelulares (ou endosimbiontes), os seus xenomas sofren metamorfoses lentas pero sorprendentes ao longo de millóns de anos9,11. Nun proceso coñecido como decadencia do xenoma, os parasitos microbianos acumulan mutacións nocivas que converten moitos xenes previamente importantes en pseudoxenes, o que leva á perda gradual de xenes e ao colapso mutacional14,15. Este colapso pode destruír ata o 95 % dos xenes nos organismos intracelulares máis antigos en comparación coas especies de vida libre estreitamente relacionadas. Polo tanto, a evolución dos parasitos intracelulares é un tira e afrouxa entre dúas forzas opostas: a selección natural darwiniana, que leva á mellora dos parasitos, e o colapso do xenoma, que deixa os parasitos no esquecemento. Non está claro como o parasito conseguiu saír deste tira e afrouxa e manter a actividade da súa estrutura molecular.
Aínda que o mecanismo da deterioración do xenoma non se comprende completamente, parece ocorrer principalmente debido á frecuente deriva xenética. Debido a que os parasitos viven en poboacións pequenas, asexuales e xeneticamente limitadas, non poden eliminar eficazmente as mutacións nocivas que ás veces se producen durante a replicación do ADN. Isto leva á acumulación irreversible de mutacións nocivas e á redución do xenoma do parasito. Como resultado, o parasito non só perde xenes que xa non son necesarios para a súa supervivencia no ambiente intracelular. É a incapacidade das poboacións de parasitos para eliminar eficazmente as mutacións nocivas esporádicas o que fai que estas mutacións se acumulen en todo o xenoma, incluídos os seus xenes máis importantes.
Gran parte da nosa comprensión actual da redución do xenoma baséase unicamente en comparacións de secuencias xenómicas, con menos atención aos cambios nas moléculas reais que realizan funcións básicas e serven como posibles dianas farmacolóxicas. Estudos comparativos demostraron que a carga de mutacións microbianas intracelulares nocivas parece predispor as proteínas e os ácidos nucleicos a pregarse e agregarse incorrectamente, o que os fai máis dependentes das chaperonas e hipersensibles á calor19,20,21,22,23. Ademais, varios parasitos (con evolución independente ás veces separada por ata 2.500 millóns de anos) experimentaron unha perda similar de centros de control de calidade na súa síntese de proteínas5,6 e nos mecanismos de reparación do ADN24. Non obstante, sábese pouco sobre o impacto do estilo de vida intracelular en todas as demais propiedades das macromoléculas celulares, incluída a adaptación molecular a unha carga crecente de mutacións nocivas.
Neste traballo, para comprender mellor a evolución das proteínas e os ácidos nucleicos dos microorganismos intracelulares, determinamos a estrutura dos ribosomas do parasito intracelular Encephalitozoon cuniculi. E. cuniculi é un organismo semellante a un fungo que pertence a un grupo de microsporidios parasitos que teñen xenomas eucariotas inusualmente pequenos e, polo tanto, utilízanse como organismos modelo para estudar a degradación do xenoma25,26,27,28,29,30. Recentemente, determinouse a estrutura dos ribosomas crio-EM para xenomas moderadamente reducidos de Microsporidia, Paranosema locustae e Vairimorpha necatrix31,32 (xenoma de ~3,2 Mb). Estas estruturas suxiren que certa perda de amplificación do ARNr se compensa co desenvolvemento de novos contactos entre proteínas ribosómicas veciñas ou a adquisición de novas proteínas ribosómicas msL131,32. A especie Encephalitozoon (xenoma ~2,5 millóns de pb), xunto co seu parente máis próximo Ordospora, demostra o grao máximo de redución do xenoma nos eucariotas: teñen menos de 2000 xenes codificantes de proteínas e espérase que os seus ribosomas non só carezan de fragmentos de expansión de ARNr (fragmentos de ARNr que distinguen os ribosomas eucariotas dos ribosomas bacterianos), senón que tamén teñan catro proteínas ribosómicas debido á súa falta de homólogos no xenoma de E. cuniculi26,27,28. Polo tanto, concluímos que o ribosoma de E. cuniculi pode revelar estratexias previamente descoñecidas para a adaptación molecular á decadencia do xenoma.
A nosa estrutura crio-EM representa o ribosoma citoplasmático eucariótico máis pequeno que se caracterizou e proporciona información sobre como o grao final de redución do xenoma afecta á estrutura, o ensamblaxe e a evolución da maquinaria molecular que é integral para a célula. Descubrimos que o ribosoma de E. cuniculi viola moitos dos principios amplamente conservados do pregamento do ARN e o ensamblaxe dos ribosomas, e descubrimos unha nova proteína ribosómica previamente descoñecida. De forma bastante inesperada, demostramos que os ribosomas de microsporidios desenvolveron a capacidade de unirse a pequenas moléculas e formulamos a hipótese de que os truncamentos no ARNr e nas proteínas desencadean innovacións evolutivas que poden, en última instancia, conferir calidades útiles ao ribosoma.
Para mellorar a nosa comprensión da evolución das proteínas e os ácidos nucleicos nos organismos intracelulares, decidimos illar as esporas de E. cuniculi de cultivos de células de mamíferos infectadas para purificar os seus ribosomas e determinar a estrutura destes ribosomas. É difícil obter un gran número de microsporidios parasitos porque os microsporidios non se poden cultivar nun medio nutritivo. En cambio, crecen e reprodúcense só dentro da célula hóspede. Polo tanto, para obter biomasa de E. cuniculi para a purificación de ribosomas, infectamos a liña celular de ril de mamífero RK13 con esporas de E. cuniculi e cultivamos estas células infectadas durante varias semanas para permitir que E. cuniculi crecese e se multiplicase. Usando unha monocapa de células infectadas de aproximadamente medio metro cadrado, puidemos purificar uns 300 mg de esporas de Microsporidios e usalas para illar ribosomas. Despois, rompemos as esporas purificadas con esferas de vidro e illamos os ribosomas brutos usando o fraccionamento gradual de polietilenglicol dos lisados. Isto permitiunos obter aproximadamente 300 µg de ribosomas de E. cuniculi en bruto para a súa análise estrutural.
Despois, recompilamos imaxes de crio-EM utilizando as mostras de ribosomas resultantes e procesamos estas imaxes utilizando máscaras correspondentes á subunidade ribosómica grande, á cabeza da subunidade pequena e á subunidade pequena. Durante este proceso, recompilamos imaxes duns 108 000 partículas ribosómicas e calculamos imaxes de crio-EM cunha resolución de 2,7 Å (Figuras suplementarias 1-3). Despois, empregamos imaxes de crio-EM para modelar o ARNr, a proteína ribosómica e o factor de hibernación Mdf1 asociado aos ribosomas de E. cuniculi (Fig. 1a, b).
a Estrutura do ribosoma de E. cuniculi en complexo co factor de hibernación Mdf1 (pdb id 7QEP). b Mapa do factor de hibernación Mdf1 asociado co ribosoma de E. cuniculi. c Mapa da estrutura secundaria que compara o ARNr recuperado en especies de microsporidios con estruturas ribosómicas coñecidas. Os paneis mostran a localización dos fragmentos de ARNr amplificados (ES) e os sitios activos do ribosoma, incluíndo o sitio de descodificación (DC), o bucle de sarcinicina (SRL) e o centro de peptidil transferase (PTC). d A densidade electrónica correspondente ao centro de peptidil transferase do ribosoma de E. cuniculi suxire que este sitio catalítico ten a mesma estrutura no parasito E. cuniculi e nos seus hóspedes, incluíndo H. sapiens. e, f A densidade electrónica correspondente do centro de descodificación (e) e a estrutura esquemática do centro de descodificación (f) indican que E. cuniculi ten residuos U1491 en lugar de A1491 (numeración de E. coli) en moitos outros eucariotas. Este cambio suxire que a E. cuniculi pode ser sensible aos antibióticos que se dirixen a este sitio activo.
En contraste coas estruturas previamente establecidas dos ribosomas de V. necatrix e P. locustae (ambas as dúas estruturas representan a mesma familia de microsporidios Nosematidae e son moi similares entre si),31,32 os ribosomas de E. cuniculi sofren numerosos procesos de fragmentación do ARNr e das proteínas. Desnaturalización adicional (Figuras suplementarias 4-6). No ARNr, os cambios máis rechamantes incluíron a perda completa do fragmento de ARNr 25S amplificado ES12L e a dexeneración parcial das hélices h39, h41 e H18 (Fig. 1c, Fig. suplementaria 4). Entre as proteínas ribosómicas, os cambios máis rechamantes incluíron a perda completa da proteína eS30 e o acurtamento das proteínas eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 e eS7 (Figuras suplementarias 4, 5).
Así, a extrema redución dos xenomas das especies de Encephalotozoon/Ordospora reflíctese na súa estrutura ribosómica: os ribosomas de E. cuniculi experimentan a perda máis drástica de contido proteico nos ribosomas citoplasmáticos eucariotas suxeitos a caracterización estrutural, e nin sequera teñen eses fragmentos de ARNr e proteínas que se conservan amplamente non só nos eucariotas, senón tamén nos tres dominios da vida. A estrutura do ribosoma de E. cuniculi proporciona o primeiro modelo molecular para estes cambios e revela eventos evolutivos que foron pasados ​​por alto tanto pola xenómica comparativa como polos estudos de estrutura biomolecular intracelular (Figura suplementaria 7). A continuación, describimos cada un destes eventos xunto coas súas probables orixes evolutivas e o seu posible impacto na función dos ribosomas.
Despois descubrimos que, ademais dos grandes truncamentos de ARNr, os ribosomas de E. cuniculi presentan variacións de ARNr nun dos seus sitios activos. Aínda que o centro de peptidil transferase do ribosoma de E. cuniculi ten a mesma estrutura que outros ribosomas eucariotas (Fig. 1d), o centro de descodificación difire debido á variación da secuencia no nucleótido 1491 (numeración de E. coli, Fig. 1e, f). Esta observación é importante porque o sitio de descodificación dos ribosomas eucariotas contén normalmente residuos G1408 e A1491 en comparación cos residuos de tipo bacteriano A1408 e G1491. Esta variación subxace á diferente sensibilidade dos ribosomas bacterianos e eucariotas á familia de aminoglicósidos dos antibióticos ribosómicos e outras moléculas pequenas que se dirixen ao sitio de descodificación. No sitio de descodificación do ribosoma de E. cuniculi, o residuo A1491 foi substituído por U1491, creando potencialmente unha interface de unión única para moléculas pequenas que se dirixen a este sitio activo. A mesma variante A14901 tamén está presente noutros microsporidios como P. locustae e V. necatrix, o que suxire que está moi estendida entre as especies de microsporidios (Fig. 1f).
Dado que as nosas mostras de ribosomas de E. cuniculi foron illadas de esporas metabolicamente inactivas, probamos o mapa crio-EM de E. cuniculi para a unión de ribosomas descrita previamente en condicións de estrés ou inanición. Factores de hibernación 31,32,36,37, 38. Comparamos a estrutura previamente establecida do ribosoma hibernante co mapa crio-EM do ribosoma de E. cuniculi. Para o acoplamento, utilizáronse ribosomas de S. cerevisiae en complexo co factor de hibernación Stm138, ribosomas de lagosta en complexo co factor Lso232 e ribosomas de V. necatrix en complexo cos factores Mdf1 e Mdf231. Ao mesmo tempo, atopamos que a densidade crio-EM corresponde ao factor de repouso Mdf1. De xeito similar á unión de Mdf1 ao ribosoma de V. necatrix, Mdf1 tamén se une ao ribosoma de E. cuniculi, onde bloquea o sitio E do ribosoma, o que posiblemente axuda a que os ribosomas estean dispoñibles cando as esporas do parasito se volven metabolicamente inactivas tras a inactivación corporal (Figura 2).
Mdf1 bloquea o sitio E do ribosoma, o que parece axudar a inactivar o ribosoma cando as esporas do parasito se volven metabolicamente inactivas. Na estrutura do ribosoma de E. cuniculi, descubrimos que Mdf1 forma un contacto previamente descoñecido co talo do ribosoma L1, a parte do ribosoma que facilita a liberación do ARNt desacetilado do ribosoma durante a síntese de proteínas. Estes contactos suxiren que Mdf1 se disocia do ribosoma usando o mesmo mecanismo que o ARNt desacetilado, o que proporciona unha posible explicación de como o ribosoma elimina Mdf1 para reactivar a síntese de proteínas.
Non obstante, a nosa estrutura revelou un contacto descoñecido entre Mdf1 e a pata L1 do ribosoma (a parte do ribosoma que axuda a liberar o ARNt desacilado do ribosoma durante a síntese de proteínas). En particular, Mdf1 usa os mesmos contactos que o segmento de cóbado da molécula de ARNt desacilado (Fig. 2). Este modelo molecular previamente descoñecido mostrou que Mdf1 se disócia do ribosoma usando o mesmo mecanismo que o ARNt desacetilado, o que explica como o ribosoma elimina este factor de hibernación para reactivar a síntese de proteínas.
Ao construír o modelo de ARNr, descubrimos que o ribosoma de E. cuniculi ten fragmentos de ARNr pregados de forma anormal, que denominamos ARNr fusionado (Fig. 3). Nos ribosomas que abarcan os tres dominios da vida, o ARNr pregárase en estruturas nas que a maioría das bases do ARNr se emparellan e pregáranse entre si ou interactúan con proteínas ribosómicas38,39,40. Non obstante, nos ribosomas de E. cuniculi, os ARNr parecen violar este principio de pregamento ao converter algunhas das súas hélices en rexións de ARNr despregadas.
Estrutura da hélice de ARNr H18 25S en S. cerevisiae, V. necatrix e E. cuniculi. Normalmente, nos ribosomas que abarcan os tres dominios vitais, este conector enrólase nunha hélice de ARN que contén de 24 a 34 residuos. Nos microsporidios, pola contra, este conector de ARNr redúcese gradualmente a dous conectores monocatenarios ricos en uridina que conteñen só 12 residuos. A maioría destes residuos están expostos a solventes. A figura mostra que os microsporidios parasitos parecen violar os principios xerais do pregamento do ARNr, onde as bases do ARNr adoitan estar acopladas a outras bases ou implicadas en interaccións ARNr-proteína. Nos microsporidios, algúns fragmentos de ARNr adoptan un pregamento desfavorable, no que a antiga hélice de ARNr se converte nun fragmento monocatenario alongado case en liña recta. A presenza destas rexións pouco comúns permite que o ARNr dos microsporidios se una a fragmentos de ARNr distantes utilizando un número mínimo de bases de ARN.
O exemplo máis rechamante desta transición evolutiva pódese observar na hélice H18 25S do ARNr (Fig. 3). En especies que van desde *E. coli* ata os humanos, as bases desta hélice de ARNr conteñen de 24 a 32 nucleótidos, formando unha hélice lixeiramente irregular. En estruturas ribosómicas previamente identificadas de *V. necatrix* e *P. locustae*,31,32 as bases da hélice H18 están parcialmente desenroladas, pero consérvase o emparellamento de bases de nucleótidos. Non obstante, en *E. cuniculi* este fragmento de ARNr convértese nos conectores máis curtos 228UUUGU232 e 301UUUUUUUUUU307. A diferenza dos fragmentos típicos de ARNr, estes conectores ricos en uridina non se enrolan nin fan contacto extensivo coas proteínas ribosómicas. En cambio, adoptan estruturas abertas ao solvente e completamente despregadas nas que as febras de ARNr se estenden case en liña recta. Esta conformación alongada explica como E. cuniculi usa só 12 bases de ARN para encher o oco de 33 Å entre as hélices de ARNr H16 e H18, mentres que outras especies requiren polo menos o dobre de bases de ARNr para encher o oco.
Así, podemos demostrar que, mediante un pregamento enerxeticamente desfavorable, os microsporidios parasitos desenvolveron unha estratexia para contraer mesmo aqueles segmentos de ARNr que permanecen amplamente conservados entre especies nos tres dominios da vida. Ao parecer, ao acumular mutacións que transforman as hélices de ARNr en curtos conectores poli-U, E. cuniculi pode formar fragmentos de ARNr pouco comúns que conteñen o menor número posible de nucleótidos para a ligación de fragmentos de ARNr distais. Isto axuda a explicar como os microsporidios lograron unha redución drástica na súa estrutura molecular básica sen perder a súa integridade estrutural e funcional.
Outra característica inusual do ARNr de E. cuniculi é a aparencia do ARNr sen engrosamentos (Fig. 4). Os bulbos son nucleótidos sen pares de bases que se retorcen fóra da hélice do ARNr en lugar de agocharse nela. A maioría das protuberancias do ARNr actúan como adhesivos moleculares, axudando a unirse a proteínas ribosómicas adxacentes ou outros fragmentos de ARNr. Algúns dos bulbos actúan como bisagras, o que permite que a hélice do ARNr se flexione e pregue de forma óptima para unha síntese de proteínas produtiva 41.
a Unha protuberancia de ARNr (numeración de S. cerevisiae) está ausente na estrutura dos ribosomas de E. cuniculi, pero está presente na maioría dos outros eucariotas b Ribosomas internos de E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens e E. cuniculi. Os parasitos carecen de moitos dos protuberancias antigas e altamente conservadas de ARNr. Estes engrosamentos estabilizan a estrutura dos ribosomas; polo tanto, a súa ausencia nos microsporidios indica unha estabilidade reducida do pregamento do ARNr nos parasitos de microsporidios. A comparación cos talos P (talos L7/L12 en bacterias) mostra que a perda de protuberancias de ARNr ás veces coincide coa aparición de novas protuberancias xunto ás protuberancias perdidas. A hélice H42 no ARNr 23S/28S ten unha protuberancia antiga (U1206 en Saccharomyces cerevisiae) que se estima que ten polo menos 3.500 millóns de anos debido á súa protección en tres dominios da vida. Nos microsporidios, esta protuberancia elimínase. Non obstante, apareceu un novo bulto xunto ao bulto perdido (A1306 en E. cuniculi).
Sorprendentemente, descubrimos que os ribosomas de E. cuniculi carecen da maioría dos bulbos de ARNr que se atopan noutras especies, incluíndo máis de 30 bulbos conservados noutros eucariotas (Fig. 4a). Esta perda elimina moitos contactos entre as subunidades ribosómicas e as hélices de ARNr adxacentes, ás veces creando grandes ocos dentro do ribosoma, facendo que o ribosoma de E. cuniculi sexa máis poroso en comparación cos ribosomas máis tradicionais (Fig. 4b). Cabe destacar que descubrimos que a maioría destes bulbos tamén se perdían nas estruturas ribosómicas de V. necatrix e P. locustae identificadas previamente, que foran pasadas por alto por análises estruturais anteriores31,32.
Ás veces, a perda de protuberancias de ARNr vai acompañada do desenvolvemento de novas protuberancias xunto á protuberancia perdida. Por exemplo, o talo P ribosómico contén unha protuberancia U1208 (en Saccharomyces cerevisiae) que sobreviviu desde E. coli ata os humanos e, polo tanto, estímase que ten 3.500 millóns de anos. Durante a síntese de proteínas, esta protuberancia axuda ao talo P a moverse entre conformacións abertas e pechadas para que o ribosoma poida recrutar factores de tradución e levalos ao sitio activo. Nos ribosomas de E. cuniculi, este engrosamento está ausente; non obstante, un novo engrosamento (G883) localizado só en tres pares de bases pode contribuír á restauración da flexibilidade óptima do talo P (Fig. 4c).
Os nosos datos sobre o ARNr sen protuberancias suxiren que a minimización do ARNr non se limita á perda de elementos de ARNr na superficie do ribosoma, senón que tamén pode implicar o núcleo do ribosoma, creando un defecto molecular específico do parasito que non se describiu en células de vida libre. Obsérvanse especies vivas.
Tras modelar as proteínas ribosómicas canónicas e o ARNr, descubrimos que os compoñentes ribosómicos convencionais non poden explicar as tres partes da imaxe crio-EM. Dous destes fragmentos son moléculas de pequeno tamaño (Fig. 5, Fig. suplementaria 8). O primeiro segmento está intercalado entre as proteínas ribosómicas uL15 e eL18 nunha posición que normalmente ocupa o extremo C-terminal de eL18, que se acurta en E. cuniculi. Aínda que non podemos determinar a identidade desta molécula, o tamaño e a forma desta illa de densidade explícanse ben pola presenza de moléculas de espermidina. A súa unión ao ribosoma estabilízase mediante mutacións específicas de microsporidios nas proteínas uL15 (Asp51 e Arg56), que parecen aumentar a afinidade do ribosoma por esta pequena molécula, xa que permiten que uL15 envolva a pequena molécula nunha estrutura ribosómica. Figura suplementaria 2). 8, datos adicionais 1, 2).
Imaxes crioelectrónicas que mostran a presenza de nucleótidos fóra da ribosa unida ao ribosoma de E. cuniculi. No ribosoma de E. cuniculi, este nucleótido ocupa o mesmo lugar que o nucleótido A3186 do ARNr 25S (numeración de Saccharomyces cerevisiae) na maioría dos outros ribosomas eucariotas. b Na estrutura ribosómica de E. cuniculi, este nucleótido está situado entre as proteínas ribosómicas uL9 e eL20, o que estabiliza o contacto entre as dúas proteínas. cd Análise da conservación da secuencia eL20 entre especies de microsporidios. A árbore filoxenética das especies de Microsporidios (c) e o aliñamento de secuencias múltiples da proteína eL20 (d) mostran que os residuos de unión a nucleótidos F170 e K172 consérvanse na maioría dos Microsporidios típicos, coa excepción de S. lophii, coa excepción dos Microsporidios de ramificación temperá, que conservaron a extensión do ARNr ES39L. e Esta figura mostra que os residuos de unión a nucleótidos F170 e K172 están presentes só en eL20 do xenoma de microsporidios altamente reducido, pero non noutros eucariotas. En xeral, estes datos suxiren que os ribosomas microsporidios desenvolveron un sitio de unión a nucleótidos que parece unirse a moléculas de AMP e usalas para estabilizar as interaccións proteína-proteína na estrutura ribosómica. A alta conservación deste sitio de unión en Microsporidios e a súa ausencia noutros eucariotas suxire que este sitio pode proporcionar unha vantaxe de supervivencia selectiva para Microsporidios. Polo tanto, o peto de unión a nucleótidos no ribosoma de microsporidios non parece ser unha característica dexenerada ou unha forma final de degradación do ARNr como se describiu anteriormente, senón unha innovación evolutiva útil que permite que o ribosoma de microsporidios se una directamente a pequenas moléculas, usándoas como bloques de construción moleculares para ribosomas. Este descubrimento converte o ribosoma de microsporidios no único ribosoma coñecido que usa un só nucleótido como o seu bloque de construción estrutural. f Vía evolutiva hipotética derivada da unión a nucleótidos.
A segunda densidade de baixo peso molecular está situada na interface entre as proteínas ribosómicas uL9 e eL30 (Fig. 5a). Esta interface foi descrita previamente na estrutura do ribosoma de Saccharomyces cerevisiae como un sitio de unión para o nucleótido 25S do ARNr A3186 (parte da extensión do ARNr ES39L)38. Demostrouse que nos ribosomas ES39L dexenerados de P. locustae, esta interface únese a un único nucleótido descoñecido 31, e asúmese que este nucleótido é unha forma final reducida de ARNr, na que a lonxitude do ARNr é de ~130-230 bases. O ES39L redúcese a un só nucleótido 32,43. As nosas imaxes de crio-EM apoian a idea de que a densidade pode explicarse por nucleótidos. Non obstante, a maior resolución da nosa estrutura mostrou que este nucleótido é unha molécula extrarribosómica, posiblemente AMP (Fig. 5a, b).
Despois preguntamos se o sitio de unión de nucleótidos aparecía no ribosoma de E. cuniculi ou se existía previamente. Dado que a unión de nucleótidos está mediada principalmente polos residuos de Phe170 e Lys172 na proteína ribosómica eL30, avaliamos a conservación destes residuos en 4396 eucariotas representativos. Do mesmo xeito que no caso de uL15 anterior, descubrimos que os residuos de Phe170 e Lys172 están altamente conservados só en Microsporidia típica, pero ausentes noutros eucariotas, incluíndo Microsporidia atípica Mitosporidium e Amphiamblys, nos que o fragmento de ARNr ES39L non se reduce 44, 45, 46 (Fig. 5c). -e).
En conxunto, estes datos apoian a idea de que E. cuniculi e posiblemente outros microsporidios canónicos desenvolveron a capacidade de capturar eficientemente un gran número de pequenos metabolitos na estrutura do ribosoma para compensar o declive nos niveis de ARNr e proteínas. Ao facelo, desenvolveron unha capacidade única para unirse a nucleótidos fóra do ribosoma, o que demostra que as estruturas moleculares parasitas compensan capturando abundantes pequenos metabolitos e usándoos como imitadores estruturais de fragmentos de ARN e proteínas degradados.
A terceira parte non simulada do noso mapa crio-EM, atopada na subunidade ribosómica grande. A resolución relativamente alta (2,6 Å) do noso mapa suxire que esta densidade pertence a proteínas con combinacións únicas de residuos de cadeas laterais grandes, o que nos permitiu identificar esta densidade como unha proteína ribosómica previamente descoñecida que identificamos como msL2 (proteína L2 específica de microsporidia) (métodos, figura 6). A nosa busca de homoloxía mostrou que msL2 está conservada no clado Microsporidia dos xéneros Encephaliter e Orosporidium, pero ausente noutras especies, incluíndo outras Microsporidia. Na estrutura ribosómica, msL2 ocupa un oco formado pola perda do ARNr ES31L estendido. Neste oco, msL2 axuda a estabilizar o pregamento do ARNr e pode compensar a perda de ES31L (Figura 6).
a Densidade electrónica e modelo da proteína ribosómica msL2 específica de microsporidios que se atopa nos ribosomas de E. cuniculi. b A maioría dos ribosomas eucariotas, incluído o ribosoma 80S de Saccharomyces cerevisiae, perden a amplificación do ARNr ES19L na maioría das especies de microsporidios. A estrutura previamente establecida do ribosoma de microsporidios de V. necatrix suxire que a perda de ES19L nestes parasitos se compensa coa evolución da nova proteína ribosómica msL1. Neste estudo, descubrimos que o ribosoma de E. cuniculi tamén desenvolveu unha proteína adicional que imita o ARN ribosómico como unha compensación aparente pola perda de ES19L. Non obstante, msL2 (actualmente anotado como a hipotética proteína ECU06_1135) e msL1 teñen orixes estruturais e evolutivas diferentes. c Este descubrimento da xeración de proteínas ribosómicas msL1 e msL2 evolutivamente non relacionadas suxire que se os ribosomas acumulan mutacións prexudiciais no seu ARNr, poden alcanzar niveis sen precedentes de diversidade composicional mesmo nun pequeno subconxunto de especies estreitamente relacionadas. Este descubrimento podería axudar a aclarar a orixe e a evolución do ribosoma mitocondrial, que é coñecido polo seu ARNr moi reducido e a variabilidade anormal na composición de proteínas entre especies.
Despois comparamos a proteína msL2 coa proteína msL1 descrita previamente, a única proteína ribosómica específica de microsporidios coñecida que se atopa no ribosoma de V. necatrix. Queriamos comprobar se msL1 e msL2 están evolutivamente relacionadas. A nosa análise mostrou que msL1 e msL2 ocupan a mesma cavidade na estrutura ribosómica, pero teñen estruturas primarias e terciarias diferentes, o que indica a súa orixe evolutiva independente (Fig. 6). Polo tanto, o noso descubrimento de msL2 proporciona evidencia de que grupos de especies eucariotas compactas poden evolucionar independentemente proteínas ribosómicas estruturalmente distintas para compensar a perda de fragmentos de ARNr. Este achado é notable porque a maioría dos ribosomas eucariotas citoplasmáticos conteñen unha proteína invariante, incluíndo a mesma familia de 81 proteínas ribosómicas. A aparición de msL1 e msL2 en varios clados de microsporidios en resposta á perda de segmentos de ARNr estendidos suxire que a degradación da arquitectura molecular do parasito fai que os parasitos busquen mutacións compensatorias, o que pode levar finalmente á súa adquisición en diferentes poboacións de parasitos con estruturas diferentes.
Finalmente, cando o noso modelo estivo completo, comparamos a composición do ribosoma de E. cuniculi coa predicida a partir da secuencia do xenoma. Anteriormente pensábase que varias proteínas ribosómicas, incluídas eL14, eL38, eL41 e eS30, faltaban no xenoma de E. cuniculi debido á aparente ausencia dos seus homólogos no xenoma de E. cuniculi. A perda de moitas proteínas ribosómicas tamén se prevé na maioría dos outros parasitos intracelulares e endosimbiontes altamente reducidos. Por exemplo, aínda que a maioría das bacterias de vida libre conteñen a mesma familia de 54 proteínas ribosómicas, só 11 destas familias de proteínas teñen homólogos detectables en cada xenoma analizado de bacterias restrinxidas ao hóspede. En apoio desta noción, observouse experimentalmente unha perda de proteínas ribosómicas en microsporidios de V. necatrix e P. locustae, que carecen das proteínas eL38 e eL4131,32.
Non obstante, as nosas estruturas amosan que só eL38, eL41 e eS30 se perden realmente no ribosoma de E. cuniculi. A proteína eL14 conservouse e a nosa estrutura mostrou por que non se puido atopar esta proteína na busca de homoloxía (Fig. 7). Nos ribosomas de E. cuniculi, a maior parte do sitio de unión de eL14 pérdese debido á degradación do ES39L amplificado con rRNA. En ausencia de ES39L, eL14 perdeu a maior parte da súa estrutura secundaria e só o 18 % da secuencia de eL14 era idéntica en E. cuniculi e S. cerevisiae. Esta deficiente preservación da secuencia é notable porque mesmo Saccharomyces cerevisiae e Homo sapiens (organismos que evolucionaron con 1500 millóns de anos de diferenza) comparten máis do 51 % dos mesmos residuos en eL14. Esta perda anómala de conservación explica por que a proteína eL14 de E. cuniculi está actualmente anotada como a putativa proteína M970_061160 e non como a proteína ribosómica eL1427.
e o ribosoma Microsporidia perdeu a extensión de ARNr ES39L, o que eliminou parcialmente o sitio de unión á proteína ribosómica eL14. En ausencia de ES39L, a proteína da microespora eL14 sofre unha perda de estrutura secundaria, na que a antiga α-hélice de unión ao ARNr dexenera nun bucle de lonxitude mínima. b O aliñamento de secuencias múltiples mostra que a proteína eL14 está moi conservada nas especies eucariotas (identidade de secuencia do 57 % entre homólogos de lévedos e humanos), pero pouco conservada e diverxente nos microsporidios (nos que non máis do 24 % dos residuos son idénticos ao homólogo de eL14). de S. cerevisiae ou H. sapiens). Esta escasa conservación da secuencia e variabilidade da estrutura secundaria explica por que o homólogo de eL14 nunca se atopou en E. cuniculi e por que se cre que esta proteína se perdeu en E. cuniculi. Pola contra, E. cuniculi eL14 foi anotado previamente como unha suposta proteína M970_061160. Esta observación suxire que a diversidade do xenoma dos microsporidios está actualmente sobreestimada: algúns xenes que se cre que se perden nos microsporidios están de feito preservados, aínda que en formas altamente diferenciadas; en cambio, pénsase que algúns codifican xenes de microsporidios para proteínas específicas de vermes (por exemplo, a hipotética proteína M970_061160) en realidade codifica as proteínas moi diversas que se atopan noutros eucariotas.
Este achado suxire que a desnaturalización do ARNr pode levar a unha perda drástica da conservación da secuencia nas proteínas ribosómicas adxacentes, o que fai que estas proteínas sexan indetectables para as buscas de homoloxía. Polo tanto, podemos sobreestimar o grao real de degradación molecular en organismos de xenoma pequeno, xa que algunhas proteínas que se cre que se perden en realidade persisten, aínda que en formas moi alteradas.
Como poden os parasitos manter a función das súas máquinas moleculares en condicións de redución extrema do xenoma? O noso estudo responde a esta pregunta describindo a complexa estrutura molecular (ribosoma) de E. cuniculi, un organismo cun dos xenomas eucariotas máis pequenos.
Sábese desde hai case dúas décadas que as moléculas de proteínas e ARN nos parasitos microbianos a miúdo difiren das súas moléculas homólogas nas especies de vida libre porque carecen de centros de control de calidade, redúcense ao 50 % do seu tamaño nos microbios de vida libre, etc., moitas mutacións debilitantes que prexudican o pregamento e a función. Por exemplo, espérase que os ribosomas dos organismos de xenoma pequeno, incluídos moitos parasitos intracelulares e endosimbiontes, carezan de varias proteínas ribosómicas e ata un terzo dos nucleótidos de ARNr en comparación coas especies de vida libre 27, 29, 30, 49. Non obstante, o xeito en que funcionan estas moléculas no parasito segue sendo en gran parte un misterio, estudado principalmente a través da xenómica comparativa.
O noso estudo demostra que a estrutura das macromoléculas pode revelar moitos aspectos da evolución que son difíciles de extraer dos estudos xenómicos comparativos tradicionais de parasitos intracelulares e outros organismos con restricións no hóspede (Figura suplementaria 7). Por exemplo, o exemplo da proteína eL14 demostra que podemos sobreestimar o grao real de degradación do aparato molecular nas especies parasitas. Crese agora que os parasitos encefalíticos teñen centos de xenes específicos de microsporidios. Non obstante, os nosos resultados mostran que algúns destes xenes aparentemente específicos son en realidade só variantes moi diferentes de xenes que son comúns noutros eucariotas. Ademais, o exemplo da proteína msL2 demostra como pasamos por alto as novas proteínas ribosómicas e subestimamos o contido das máquinas moleculares parasitas. O exemplo das moléculas pequenas demostra como podemos pasar por alto as innovacións máis inxeniosas nas estruturas moleculares parasitas que poden darlles unha nova actividade biolóxica.
En conxunto, estes resultados melloran a nosa comprensión das diferenzas entre as estruturas moleculares dos organismos con restricións de hóspede e as súas contrapartes nos organismos de vida libre. Demostramos que as máquinas moleculares, que durante moito tempo se consideraban reducidas, dexeneradas e suxeitas a diversas mutacións debilitantes, en cambio teñen un conxunto de características estruturais pouco comúns que se pasan por alto sistematicamente.
Por outra banda, os fragmentos de ARNr non voluminosos e os fragmentos fusionados que atopamos nos ribosomas de E. cuniculi suxiren que a redución do xenoma pode cambiar mesmo aquelas partes da maquinaria molecular básica que se conservan nos tres dominios da vida, despois de case 3.500 millóns de anos de evolución independente das especies.
Os fragmentos de ARNr fusionados e sen protuberancias nos ribosomas de *E. cuniculi* son de especial interese á luz de estudos previos de moléculas de ARN en bacterias endosimbióticas. Por exemplo, no endosimbiótico do áfido *Buchnera aphidicola*, demostrouse que as moléculas de ARNr e ARNt teñen estruturas sensibles á temperatura debido ao nesgo de composición A+T e a unha alta proporción de pares de bases non canónicos20,50. Agora pénsase que estes cambios no ARN, así como os cambios nas moléculas de proteínas, son responsables da sobredependencia dos endosimbiontes dos socios e da incapacidade dos endosimbiontes para transferir calor21, 23. Aínda que o ARNr das microsporidios parasitas ten cambios estruturalmente distintos, a natureza destes cambios suxire que a redución da estabilidade térmica e a maior dependencia das proteínas chaperonas poden ser características comúns das moléculas de ARN en organismos con xenomas reducidos.
Por outra banda, as nosas estruturas amosan que os microsporidios dos parasitos desenvolveron unha capacidade única para resistir fragmentos de ARNr e proteínas amplamente conservados, desenvolvendo a capacidade de usar pequenos metabolitos abundantes e facilmente dispoñibles como imitadores estruturais de fragmentos de ARNr e proteínas dexenerados. Degradación da estrutura molecular. Esta opinión está apoiada polo feito de que as pequenas moléculas que compensan a perda de fragmentos de proteínas no ARNr e nos ribosomas de E. cuniculi únense a residuos específicos de microsporidios nas proteínas uL15 e eL30. Isto suxire que a unión de pequenas moléculas aos ribosomas pode ser un produto da selección positiva, na que as mutacións específicas de microsporidios nas proteínas ribosómicas foron seleccionadas pola súa capacidade para aumentar a afinidade dos ribosomas polas pequenas moléculas, o que pode levar a organismos ribosómicos máis eficientes. O descubrimento revela unha innovación intelixente na estrutura molecular dos parasitos microbianos e dános unha mellor comprensión de como as estruturas moleculares dos parasitos manteñen a súa función a pesar da evolución redutiva.
Na actualidade, a identificación destas pequenas moléculas segue sen estar clara. Non está claro por que a aparencia destas pequenas moléculas na estrutura ribosómica difire entre as especies de microsporidios. En particular, non está claro por que se observa a unión de nucleótidos nos ribosomas de E. cuniculi e P. locustae, e non nos ribosomas de V. necatrix, a pesar da presenza do residuo F170 nas proteínas eL20 e K172 de V. necatrix. Esta deleción pode estar causada polo residuo 43 uL6 (situado adxacente ao peto de unión de nucleótidos), que é tirosina en V. necatrix e non treonina en E. cuniculi e P. locustae. A voluminosa cadea lateral aromática de Tyr43 pode interferir coa unión de nucleótidos debido á superposición estérica. Alternativamente, a aparente deleción de nucleótidos pode estar debida á baixa resolución das imaxes crio-EM, o que dificulta a modelización dos fragmentos ribosómicos de V. necatrix.
Por outra banda, o noso traballo suxire que o proceso de decadencia do xenoma pode ser unha forza inventiva. En particular, a estrutura do ribosoma de E. cuniculi suxire que a perda de ARNr e fragmentos de proteínas no ribosoma de microsporidios crea unha presión evolutiva que promove cambios na estrutura do ribosoma. Estas variantes prodúcense lonxe do sitio activo do ribosoma e parecen axudar a manter (ou restaurar) o ensamblaxe óptima dos ribosomas que doutro xeito se vería interrompida pola redución do ARNr. Isto suxire que unha innovación importante do ribosoma de microsporidios parece ter evolucionado cara á necesidade de amortecer a deriva xénica.
Quizais isto se ilustre mellor coa unión de nucleótidos, que nunca se observou noutros organismos ata o de agora. O feito de que os residuos de unión de nucleótidos estean presentes en microsporidios típicos, pero non noutros eucariotas, suxire que os sitios de unión de nucleótidos non son só reliquias á espera de desaparecer, ou o sitio final para que o ARNr se restaure á forma de nucleótidos individuais. Pola contra, este sitio semella unha característica útil que podería ter evolucionado ao longo de varias roldas de selección positiva. Os sitios de unión de nucleótidos poden ser un subproduto da selección natural: unha vez que o ES39L se degrada, os microsporidios vense obrigados a buscar unha compensación para restaurar a bioxénese óptima dos ribosomas en ausencia de ES39L. Dado que este nucleótido pode imitar os contactos moleculares do nucleótido A3186 en ES39L, a molécula de nucleótido convértese nun elemento básico do ribosoma, cuxa unión mellora aínda máis coa mutación da secuencia eL30.
En canto á evolución molecular dos parasitos intracelulares, o noso estudo demostra que as forzas da selección natural darwiniana e a deriva xenética da deterioración do xenoma non operan en paralelo, senón que oscilan. En primeiro lugar, a deriva xenética elimina características importantes das biomoléculas, o que fai que a compensación sexa moi necesaria. Só cando os parasitos satisfagan esta necesidade a través da selección natural darwiniana, as súas macromoléculas terán a oportunidade de desenvolver os seus trazos máis impresionantes e innovadores. É importante destacar que a evolución dos sitios de unión de nucleótidos no ribosoma de E. cuniculi suxire que este patrón de perda a ganancia da evolución molecular non só amortiza as mutacións nocivas, senón que ás veces confire funcións completamente novas ás macromoléculas parasitas.
Esta idea é coherente coa teoría do equilibrio móbil de Sewell Wright, que afirma que un sistema estrito de selección natural limita a capacidade dos organismos para innovar51,52,53. Non obstante, se a deriva xenética interrompe a selección natural, estas derivas poden producir cambios que non son en si mesmos adaptativos (nin sequera prexudiciais), senón que conducen a cambios adicionais que proporcionan unha maior aptitude ou unha nova actividade biolóxica. O noso marco apoia esta idea ilustrando que o mesmo tipo de mutación que reduce o pregamento e a función dunha biomolécula parece ser o principal desencadeante da súa mellora. En liña co modelo evolutivo vantaxoso para todos, o noso estudo demostra que a decadencia do xenoma, tradicionalmente vista como un proceso dexenerativo, tamén é un motor importante da innovación, permitindo ás veces e quizais incluso a miúdo que as macromoléculas adquiran novas actividades parasitarias que poden usalas.