از بازدید شما از Nature.com متشکریم. نسخه مرورگری که استفاده می‌کنید پشتیبانی محدودی از CSS دارد. برای بهترین تجربه، توصیه می‌کنیم از یک مرورگر به‌روز استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در Internet Explorer غیرفعال کنید). در عین حال، برای اطمینان از ادامه پشتیبانی، سایت را بدون استایل‌ها و جاوا اسکریپت رندر خواهیم کرد.
تکامل انگل‌های میکروبی شامل یک تقابل بین انتخاب طبیعی، که باعث بهبود انگل‌ها می‌شود، و رانش ژنتیکی، که باعث می‌شود انگل‌ها ژن‌ها را از دست بدهند و جهش‌های مضر را تجمع دهند، می‌شود. در اینجا، برای درک چگونگی وقوع این تقابل در مقیاس یک ماکرومولکول واحد، ساختار cryo-EM ریبوزوم Encephalitozoon cuniculi، یک ارگانیسم یوکاریوتی با یکی از کوچکترین ژنوم‌ها در طبیعت را شرح می‌دهیم. کاهش شدید rRNA در ریبوزوم‌های E. cuniculi با تغییرات ساختاری بی‌سابقه‌ای، مانند تکامل اتصال‌دهنده‌های rRNA ادغام‌شده که قبلاً ناشناخته بودند و rRNA بدون برآمدگی، همراه است. علاوه بر این، ریبوزوم E. cuniculi با ایجاد توانایی استفاده از مولکول‌های کوچک به عنوان تقلیدهای ساختاری از قطعات rRNA و پروتئین‌های تخریب‌شده، از دست دادن قطعات rRNA و پروتئین‌ها را نجات داد. به طور کلی، ما نشان می‌دهیم که ساختارهای مولکولی که مدت‌ها تصور می‌شد کاهش یافته، منحط شده و در معرض جهش‌های ناتوان‌کننده هستند، تعدادی مکانیسم جبرانی دارند که آنها را با وجود انقباضات مولکولی شدید فعال نگه می‌دارد.
از آنجا که اکثر گروه‌های انگل‌های میکروبی ابزارهای مولکولی منحصر به فردی برای بهره‌برداری از میزبان‌های خود دارند، ما اغلب باید درمان‌های متفاوتی را برای گروه‌های مختلف انگل‌ها توسعه دهیم1،2. با این حال، شواهد جدید نشان می‌دهد که برخی از جنبه‌های تکامل انگل همگرا و تا حد زیادی قابل پیش‌بینی هستند، که نشان‌دهنده‌ی مبنای بالقوه‌ای برای مداخلات درمانی گسترده در انگل‌های میکروبی است3،4،5،6،7،8،9.
کارهای قبلی یک روند تکاملی رایج در انگل‌های میکروبی به نام کاهش ژنوم یا فروپاشی ژنوم را شناسایی کرده‌اند10،11،12،13. تحقیقات فعلی نشان می‌دهد که وقتی میکروارگانیسم‌ها سبک زندگی آزاد خود را رها می‌کنند و به انگل‌های درون سلولی (یا اندوسیمبیونت‌ها) تبدیل می‌شوند، ژنوم‌های آنها طی میلیون‌ها سال دچار دگردیسی‌های آهسته اما شگفت‌انگیزی می‌شوند9،11. در فرآیندی که به عنوان فروپاشی ژنوم شناخته می‌شود، انگل‌های میکروبی جهش‌های مضری را انباشته می‌کنند که بسیاری از ژن‌های مهم قبلی را به شبه‌ژن‌ها تبدیل می‌کند و منجر به از دست دادن تدریجی ژن و فروپاشی جهشی می‌شود14،15. این فروپاشی می‌تواند تا 95٪ از ژن‌ها را در قدیمی‌ترین موجودات درون سلولی در مقایسه با گونه‌های آزاد نزدیک به هم از بین ببرد. بنابراین، تکامل انگل‌های درون سلولی یک رقابت بین دو نیروی متضاد است: انتخاب طبیعی داروینی که منجر به بهبود انگل‌ها می‌شود و فروپاشی ژنوم که انگل‌ها را به ورطه فراموشی می‌افکند. اینکه انگل چگونه موفق شده از این رقابت بیرون بیاید و فعالیت ساختار مولکولی خود را حفظ کند، هنوز مشخص نیست.
اگرچه مکانیسم زوال ژنوم به طور کامل درک نشده است، اما به نظر می‌رسد که عمدتاً به دلیل رانش ژنتیکی مکرر رخ می‌دهد. از آنجا که انگل‌ها در جمعیت‌های کوچک، غیرجنسی و از نظر ژنتیکی محدود زندگی می‌کنند، نمی‌توانند جهش‌های مضری را که گاهی اوقات در طول تکثیر DNA رخ می‌دهند، به طور مؤثر حذف کنند. این امر منجر به تجمع برگشت‌ناپذیر جهش‌های مضر و کاهش ژنوم انگل می‌شود. در نتیجه، انگل نه تنها ژن‌هایی را که دیگر برای بقای آن در محیط درون سلولی ضروری نیستند، از دست می‌دهد. بلکه ناتوانی جمعیت‌های انگل در حذف مؤثر جهش‌های مضر پراکنده است که باعث می‌شود این جهش‌ها در سراسر ژنوم، از جمله مهم‌ترین ژن‌های آنها، تجمع یابند.
بخش عمده‌ای از درک فعلی ما از کاهش ژنوم صرفاً مبتنی بر مقایسه توالی‌های ژنوم است و توجه کمتری به تغییرات در مولکول‌های واقعی که عملکردهای خانه‌داری را انجام می‌دهند و به عنوان اهداف دارویی بالقوه عمل می‌کنند، می‌شود. مطالعات تطبیقی ​​نشان داده‌اند که به نظر می‌رسد بار جهش‌های میکروبی درون سلولی مضر، پروتئین‌ها و اسیدهای نوکلئیک را مستعد تاخوردگی نادرست و تجمع می‌کند و آنها را بیشتر وابسته به چاپرون و حساس به گرما می‌کند19،20،21،22،23. علاوه بر این، انگل‌های مختلف - که تکامل مستقلی دارند و گاهی اوقات تا 2.5 میلیارد سال از هم فاصله دارند - از دست دادن مشابهی از مراکز کنترل کیفیت را در سنتز پروتئین 5،6 و مکانیسم‌های ترمیم DNA خود تجربه کرده‌اند24. با این حال، اطلاعات کمی در مورد تأثیر سبک زندگی درون سلولی بر سایر خواص ماکرومولکول‌های سلولی، از جمله سازگاری مولکولی با بار فزاینده جهش‌های مضر، وجود دارد.
در این کار، به منظور درک بهتر تکامل پروتئین‌ها و اسیدهای نوکلئیک میکروارگانیسم‌های درون سلولی، ساختار ریبوزوم‌های انگل درون سلولی Encephalitozoon cuniculi را تعیین کردیم. E. cuniculi یک ارگانیسم قارچ مانند متعلق به گروهی از میکروسپوریدیاهای انگلی است که ژنوم‌های یوکاریوتی غیرمعمول کوچکی دارند و بنابراین به عنوان ارگانیسم‌های مدل برای مطالعه تجزیه ژنوم استفاده می‌شوند25،26،27،28،29،30. اخیراً، ساختار ریبوزوم cryo-EM برای ژنوم‌های نسبتاً کاهش یافته میکروسپوریدیا، Paranosema locustae و Vairimorpha necatrix31،32 (ژنوم تقریباً 3.2 مگابایت) تعیین شده است. این ساختارها نشان می‌دهند که مقداری از دست دادن تکثیر rRNA با ایجاد تماس‌های جدید بین پروتئین‌های ریبوزومی همسایه یا کسب پروتئین‌های ریبوزومی جدید msL131،32 جبران می‌شود. گونه‌های Encephalitozoon (ژنوم حدود 2.5 میلیون جفت باز) به همراه نزدیکترین خویشاوند خود Ordospora، درجه نهایی کاهش ژنوم در یوکاریوت‌ها را نشان می‌دهند - آنها کمتر از 2000 ژن کدکننده پروتئین دارند و انتظار می‌رود که ریبوزوم‌های آنها نه تنها فاقد قطعات گسترش rRNA (قطعات rRNA که ریبوزوم‌های یوکاریوتی را از ریبوزوم‌های باکتریایی متمایز می‌کنند) باشند، بلکه به دلیل عدم وجود همولوگ در ژنوم E. cuniculi، چهار پروتئین ریبوزومی نیز دارند26،27،28. بنابراین، ما نتیجه گرفتیم که ریبوزوم E. cuniculi می‌تواند استراتژی‌های ناشناخته قبلی را برای سازگاری مولکولی با پوسیدگی ژنوم آشکار کند.
ساختار cryo-EM ما کوچکترین ریبوزوم سیتوپلاسمی یوکاریوتی است که باید توصیف شود و بینشی در مورد چگونگی تأثیر درجه نهایی کاهش ژنوم بر ساختار، مونتاژ و تکامل ماشین مولکولی که جزئی جدایی‌ناپذیر از سلول است، ارائه می‌دهد. ما دریافتیم که ریبوزوم E. cuniculi بسیاری از اصول به طور گسترده حفظ شده تاخوردگی RNA و مونتاژ ریبوزوم را نقض می‌کند و یک پروتئین ریبوزومی جدید و قبلاً ناشناخته را کشف کردیم. کاملاً غیرمنتظره، ما نشان می‌دهیم که ریبوزوم‌های میکروسپوریدیا توانایی اتصال به مولکول‌های کوچک را تکامل داده‌اند و فرض می‌کنیم که برش‌ها در rRNA و پروتئین‌ها باعث نوآوری‌های تکاملی می‌شوند که در نهایت ممکن است ویژگی‌های مفیدی را به ریبوزوم اعطا کنند.
برای بهبود درک خود از تکامل پروتئین‌ها و اسیدهای نوکلئیک در موجودات درون سلولی، تصمیم گرفتیم اسپورهای E. cuniculi را از کشت سلول‌های پستانداران آلوده جدا کنیم تا ریبوزوم‌های آنها را خالص‌سازی کرده و ساختار این ریبوزوم‌ها را تعیین کنیم. به دست آوردن تعداد زیادی میکروسپوریدیای انگلی دشوار است زیرا میکروسپوریدیا را نمی‌توان در محیط مغذی کشت داد. در عوض، آنها فقط در داخل سلول میزبان رشد و تولید مثل می‌کنند. بنابراین، برای به دست آوردن زیست‌توده E. cuniculi برای خالص‌سازی ریبوزوم، رده سلولی کلیه پستانداران RK13 را با اسپورهای E. cuniculi آلوده کردیم و این سلول‌های آلوده را برای چندین هفته کشت دادیم تا به E. cuniculi اجازه رشد و تکثیر دهیم. با استفاده از یک تک لایه سلول آلوده به مساحت حدود نیم متر مربع، توانستیم حدود 300 میلی‌گرم اسپور میکروسپوریدیا را خالص‌سازی کرده و از آنها برای جداسازی ریبوزوم‌ها استفاده کنیم. سپس اسپورهای خالص‌سازی شده را با مهره‌های شیشه‌ای از هم جدا کردیم و ریبوزوم‌های خام را با استفاده از جداسازی مرحله‌ای پلی‌اتیلن گلیکول از لیزات‌ها جدا کردیم. این به ما اجازه داد تا تقریباً 300 میکروگرم ریبوزوم خام E. cuniculi را برای تجزیه و تحلیل ساختاری به دست آوریم.
سپس تصاویر cryo-EM را با استفاده از نمونه‌های ریبوزوم حاصل جمع‌آوری کردیم و این تصاویر را با استفاده از ماسک‌های مربوط به زیر واحد بزرگ ریبوزومی، سر زیر واحد کوچک و زیر واحد کوچک پردازش کردیم. در طول این فرآیند، تصاویری از حدود 108000 ذره ریبوزومی جمع‌آوری و تصاویر cryo-EM را با وضوح 2.7 آنگستروم محاسبه کردیم (شکل‌های تکمیلی 1-3). سپس از تصاویر cryoEM برای مدل‌سازی rRNA، پروتئین ریبوزومی و فاکتور خواب زمستانی Mdf1 مرتبط با ریبوزوم‌های E. cuniculi استفاده کردیم (شکل 1a، b).
الف) ساختار ریبوزوم E. cuniculi در کمپلکس با فاکتور خواب زمستانی Mdf1 (pdb id 7QEP). ب) نقشه فاکتور خواب زمستانی Mdf1 مرتبط با ریبوزوم E. cuniculi. ج) نقشه ساختار ثانویه که rRNA بازیابی شده در گونه‌های میکروسپوریدیایی را با ساختارهای ریبوزومی شناخته شده مقایسه می‌کند. پنل‌ها محل قطعات rRNA تکثیر شده (ES) و جایگاه‌های فعال ریبوزوم، از جمله جایگاه رمزگشایی (DC)، حلقه سارسینیسین (SRL) و مرکز پپتیدیل ترانسفراز (PTC) را نشان می‌دهند. د) چگالی الکترون مربوط به مرکز پپتیدیل ترانسفراز ریبوزوم E. cuniculi نشان می‌دهد که این جایگاه کاتالیزوری ساختار یکسانی در انگل E. cuniculi و میزبان‌های آن، از جمله H. sapiens، دارد. e، f چگالی الکترونی مربوط به مرکز رمزگشایی (e) و ساختار شماتیک مرکز رمزگشایی (f) نشان می‌دهد که E. cuniculi در بسیاری از یوکاریوت‌های دیگر به جای A1491 (شماره‌گذاری E. coli) دارای باقیمانده U1491 است. این تغییر نشان می‌دهد که E. cuniculi ممکن است به آنتی‌بیوتیک‌هایی که این جایگاه فعال را هدف قرار می‌دهند، حساس باشد.
برخلاف ساختارهای قبلاً تثبیت‌شده‌ی ریبوزوم‌های V. necatrix و P. locustae (هر دو ساختار نشان‌دهنده‌ی خانواده‌ی میکروسپوریدیای یکسانی به نام Nosematidae هستند و بسیار شبیه به یکدیگرند)، ریبوزوم‌های E. cuniculi 31،32 تحت فرآیندهای متعدد قطعه قطعه شدن rRNA و پروتئین قرار می‌گیرند. دناتوراسیون بیشتر (شکل‌های تکمیلی 4-6). در rRNA، قابل توجه‌ترین تغییرات شامل از دست دادن کامل قطعه‌ی rRNA 25S تکثیر شده ES12L و تخریب جزئی مارپیچ‌های h39، h41 و H18 بود (شکل 1c، شکل تکمیلی 4). در میان پروتئین‌های ریبوزومی، قابل توجه‌ترین تغییرات شامل از دست دادن کامل پروتئین eS30 و کوتاه شدن پروتئین‌های eL8، eL13، eL18، eL22، eL29، eL40، uS3، uS9، uS14، uS17 و eS7 بود (شکل‌های تکمیلی ۴ و ۵).
بنابراین، کاهش شدید ژنوم گونه‌های Encephalotozoon/Ordospora در ساختار ریبوزوم آنها منعکس می‌شود: ریبوزوم‌های E. cuniculi بیشترین کاهش محتوای پروتئین را در ریبوزوم‌های سیتوپلاسمی یوکاریوتی که مشمول توصیف ساختاری هستند، تجربه می‌کنند و حتی آن قطعات rRNA و پروتئینی را که نه تنها در یوکاریوت‌ها، بلکه در سه حوزه حیات نیز به طور گسترده حفظ شده‌اند، ندارند. ساختار ریبوزوم E. cuniculi اولین مدل مولکولی را برای این تغییرات ارائه می‌دهد و رویدادهای تکاملی را آشکار می‌کند که هم توسط ژنومیک مقایسه‌ای و هم توسط مطالعات ساختار بیومولکولی درون سلولی نادیده گرفته شده‌اند (شکل تکمیلی 7). در زیر، هر یک از این رویدادها را همراه با منشأ تکاملی احتمالی آنها و تأثیر بالقوه آنها بر عملکرد ریبوزوم شرح می‌دهیم.
سپس دریافتیم که علاوه بر برش‌های بزرگ rRNA، ریبوزوم‌های E. cuniculi در یکی از جایگاه‌های فعال خود دارای تغییرات rRNA هستند. اگرچه مرکز پپتیدیل ترانسفراز ریبوزوم E. cuniculi ساختار مشابهی با سایر ریبوزوم‌های یوکاریوتی دارد (شکل 1d)، مرکز رمزگشایی به دلیل تغییر توالی در نوکلئوتید 1491 متفاوت است (شماره‌گذاری E. coli، شکل 1e، f). این مشاهده مهم است زیرا جایگاه رمزگشایی ریبوزوم‌های یوکاریوتی معمولاً حاوی باقیمانده‌های G1408 و A1491 در مقایسه با باقیمانده‌های نوع باکتریایی A1408 و G1491 است. این تغییر، زمینه‌ساز حساسیت متفاوت ریبوزوم‌های باکتریایی و یوکاریوتی به خانواده آمینوگلیکوزیدی آنتی‌بیوتیک‌های ریبوزومی و سایر مولکول‌های کوچک است که جایگاه رمزگشایی را هدف قرار می‌دهند. در محل رمزگشایی ریبوزوم E. cuniculi، باقیمانده A1491 با U1491 جایگزین شده است که به طور بالقوه یک رابط اتصال منحصر به فرد برای مولکول‌های کوچک هدف قرار دهنده این محل فعال ایجاد می‌کند. همین نوع A14901 در سایر میکروسپوریدیاها مانند P. locustae و V. necatrix نیز وجود دارد که نشان می‌دهد در بین گونه‌های میکروسپوریدیا گسترده است (شکل 1f).
از آنجا که نمونه‌های ریبوزوم E. cuniculi ما از اسپورهای غیرفعال متابولیکی جدا شدند، نقشه cryo-EM E. cuniculi را برای اتصال ریبوزوم که قبلاً تحت شرایط استرس یا گرسنگی شرح داده شده بود، آزمایش کردیم. فاکتورهای خواب زمستانی ۳۱، ۳۲، ۳۶، ۳۷، ۳۸. ما ساختار قبلاً ایجاد شده ریبوزوم در حال خواب زمستانی را با نقشه cryo-EM ریبوزوم E. cuniculi مطابقت دادیم. برای اتصال، ریبوزوم‌های S. cerevisiae در کمپلکس با فاکتور خواب زمستانی Stm138، ریبوزوم‌های ملخ در کمپلکس با فاکتور Lso232 و ریبوزوم‌های V. necatrix در کمپلکس با فاکتورهای Mdf1 و Mdf231 استفاده شدند. در همان زمان، چگالی cryo-EM مربوط به فاکتور استراحت Mdf1 را یافتیم. مشابه اتصال Mdf1 به ریبوزوم V. necatrix، Mdf1 نیز به ریبوزوم E. cuniculi متصل می‌شود، جایی که جایگاه E ریبوزوم را مسدود می‌کند، و احتمالاً به در دسترس قرار دادن ریبوزوم‌ها هنگامی که هاگ‌های انگل پس از غیرفعال شدن بدن از نظر متابولیکی غیرفعال می‌شوند، کمک می‌کند (شکل 2).
Mdf1 جایگاه E ریبوزوم را مسدود می‌کند، که به نظر می‌رسد به غیرفعال شدن ریبوزوم در زمانی که هاگ‌های انگل از نظر متابولیکی غیرفعال می‌شوند، کمک می‌کند. در ساختار ریبوزوم E. cuniculi، ما دریافتیم که Mdf1 یک تماس ناشناخته قبلی با ساقه ریبوزوم L1، بخشی از ریبوزوم که آزادسازی tRNA دآسیله شده از ریبوزوم را در طول سنتز پروتئین تسهیل می‌کند، تشکیل می‌دهد. این تماس‌ها نشان می‌دهد که Mdf1 با استفاده از همان مکانیسم tRNA داستیله شده از ریبوزوم جدا می‌شود و توضیحی احتمالی برای چگونگی حذف Mdf1 توسط ریبوزوم برای فعال‌سازی مجدد سنتز پروتئین ارائه می‌دهد.
با این حال، ساختار ما یک تماس ناشناخته بین Mdf1 و پای ریبوزوم L1 (بخشی از ریبوزوم که به آزادسازی tRNA دآسیله شده از ریبوزوم در طول سنتز پروتئین کمک می‌کند) را نشان داد. به طور خاص، Mdf1 از همان تماس‌هایی استفاده می‌کند که بخش آرنج مولکول tRNA دآسیله شده از آن استفاده می‌کند (شکل 2). این مدل‌سازی مولکولی که قبلاً ناشناخته بود، نشان داد که Mdf1 با استفاده از همان مکانیسم tRNA داستیله شده از ریبوزوم جدا می‌شود، که توضیح می‌دهد چگونه ریبوزوم این عامل خواب زمستانی را برای فعال‌سازی مجدد سنتز پروتئین حذف می‌کند.
هنگام ساخت مدل rRNA، متوجه شدیم که ریبوزوم E. cuniculi دارای قطعات rRNA به طور غیرطبیعی تاخورده است که ما آنها را rRNA ادغام‌شده نامیدیم (شکل 3). در ریبوزوم‌هایی که سه حوزه حیات را در بر می‌گیرند، rRNA به ساختارهایی تا می‌خورد که در آنها بیشتر بازهای rRNA یا با یکدیگر جفت می‌شوند و تا می‌خورند یا با پروتئین‌های ریبوزومی تعامل دارند38،39،40. با این حال، در ریبوزوم‌های E. cuniculi، به نظر می‌رسد rRNAها با تبدیل برخی از مارپیچ‌های خود به نواحی rRNA باز نشده، این اصل تاخوردگی را نقض می‌کنند.
ساختار مارپیچ rRNA 25S H18 در S. cerevisiae، V. necatrix و E. cuniculi. معمولاً در ریبوزوم‌هایی که سه حوزه حیاتی را در بر می‌گیرند، این رابط به صورت یک مارپیچ RNA که حاوی ۲۴ تا ۳۴ باقیمانده است، پیچیده می‌شود. در مقابل، در میکروسپوریدیا، این رابط rRNA به تدریج به دو رابط تک رشته‌ای غنی از یوریدین که تنها ۱۲ باقیمانده دارند، کاهش می‌یابد. بیشتر این باقیمانده‌ها در معرض حلال‌ها قرار دارند. شکل نشان می‌دهد که به نظر می‌رسد میکروسپوریدیاهای انگلی اصول کلی تاخوردگی rRNA را نقض می‌کنند، جایی که بازهای rRNA معمولاً به بازهای دیگر متصل می‌شوند یا در برهمکنش‌های rRNA-پروتئین دخیل هستند. در میکروسپوریدیا، برخی از قطعات rRNA تاخوردگی نامطلوبی به خود می‌گیرند، که در آن مارپیچ rRNA قبلی به یک قطعه تک رشته‌ای تبدیل می‌شود که تقریباً در یک خط مستقیم کشیده شده است. وجود این نواحی غیرمعمول به rRNA میکروسپوریدیا اجازه می‌دهد تا با استفاده از حداقل تعداد بازهای RNA به قطعات rRNA دور متصل شود.
بارزترین نمونه این گذار تکاملی را می‌توان در مارپیچ rRNA 25S H18 مشاهده کرد (شکل 3). در گونه‌هایی از E. coli تا انسان، بازهای این مارپیچ rRNA حاوی 24 تا 32 نوکلئوتید هستند که یک مارپیچ کمی نامنظم را تشکیل می‌دهند. در ساختارهای ریبوزومی که قبلاً از V. necatrix و P. locustae شناسایی شده‌اند،31،32 بازهای مارپیچ H18 تا حدی باز نشده‌اند، اما جفت شدن بازهای نوکلئوتیدی حفظ شده است. با این حال، در E. cuniculi این قطعه rRNA به کوتاه‌ترین رابط‌های 228UUUGU232 و 301UUUUUUUUUUU307 تبدیل می‌شود. برخلاف قطعات rRNA معمولی، این رابط‌های غنی از یوریدین پیچ نمی‌خورند یا تماس گسترده‌ای با پروتئین‌های ریبوزومی برقرار نمی‌کنند. در عوض، آنها ساختارهای باز و کاملاً باز شده در حلال را به خود می‌گیرند که در آن رشته‌های rRNA تقریباً مستقیم امتداد می‌یابند. این ترکیب کشیده توضیح می‌دهد که چگونه E. cuniculi تنها از ۱۲ باز RNA برای پر کردن شکاف ۳۳ آنگسترومی بین مارپیچ‌های rRNA H16 و H18 استفاده می‌کند، در حالی که گونه‌های دیگر برای پر کردن این شکاف به حداقل دو برابر باز rRNA نیاز دارند.
بنابراین، می‌توانیم نشان دهیم که میکروسپوریدیاهای انگلی، از طریق تاخوردگی نامطلوب از نظر انرژی، استراتژی‌ای را برای انقباض حتی آن دسته از بخش‌های rRNA که به طور گسترده در بین گونه‌ها در سه حوزه حیات حفظ شده‌اند، توسعه داده‌اند. ظاهراً، با تجمع جهش‌هایی که مارپیچ‌های rRNA را به اتصال‌دهنده‌های کوتاه پلی-U تبدیل می‌کنند، E. cuniculi می‌تواند قطعات rRNA غیرمعمولی را تشکیل دهد که حاوی کمترین تعداد نوکلئوتید ممکن برای اتصال قطعات rRNA دیستال هستند. این به توضیح چگونگی کاهش چشمگیر ساختار مولکولی پایه میکروسپوریدیاها بدون از دست دادن تمامیت ساختاری و عملکردی آنها کمک می‌کند.
یکی دیگر از ویژگی‌های غیرمعمول rRNA در E. cuniculi، ظاهر rRNA بدون ضخیم شدن است (شکل 4). برآمدگی‌ها، نوکلئوتیدهایی بدون جفت باز هستند که به جای پنهان شدن در مارپیچ RNA، از آن بیرون می‌پیچند. اکثر برآمدگی‌های rRNA به عنوان چسب‌های مولکولی عمل می‌کنند و به اتصال پروتئین‌های ریبوزومی مجاور یا سایر قطعات rRNA کمک می‌کنند. برخی از برآمدگی‌ها به عنوان لولا عمل می‌کنند و به مارپیچ rRNA اجازه می‌دهند تا برای سنتز پروتئین مؤثر، به طور بهینه خم و تا شود 41.
الف) یک برآمدگی rRNA (شماره‌گذاری S. cerevisiae) در ساختار ریبوزوم E. cuniculi وجود ندارد، اما در اکثر یوکاریوت‌های دیگر وجود دارد. ب) ریبوزوم‌های داخلی E. coli، S. cerevisiae، H. sapiens و E. cuniculi. انگل‌ها فاقد بسیاری از برآمدگی‌های rRNA باستانی و بسیار حفاظت‌شده هستند. این ضخیم شدن‌ها ساختار ریبوزوم را تثبیت می‌کنند. بنابراین، عدم وجود آنها در میکروسپوریدیا نشان دهنده کاهش پایداری تاخوردگی rRNA در انگل‌های میکروسپوریدیا است. مقایسه با ساقه‌های P (ساقه‌های L7/L12 در باکتری‌ها) نشان می‌دهد که از دست دادن برآمدگی‌های rRNA گاهی اوقات با ظهور برآمدگی‌های جدید در کنار برآمدگی‌های از دست رفته همزمان است. مارپیچ H42 در rRNA 23S/28S دارای یک برآمدگی باستانی (U1206 در Saccharomyces cerevisiae) است که به دلیل محافظت در سه حوزه حیات، حداقل 3.5 میلیارد سال قدمت دارد. در میکروسپوریدیا، این برآمدگی حذف می‌شود. با این حال، یک برآمدگی جدید در کنار برآمدگی از دست رفته ظاهر شد (A1306 در E. cuniculi).
نکته قابل توجه این است که ما دریافتیم ریبوزوم‌های E. cuniculi فاقد بیشتر برآمدگی‌های rRNA موجود در گونه‌های دیگر، از جمله بیش از 30 برآمدگی حفظ شده در سایر یوکاریوت‌ها هستند (شکل 4a). این فقدان، بسیاری از تماس‌های بین زیرواحدهای ریبوزومی و مارپیچ‌های rRNA مجاور را از بین می‌برد و گاهی اوقات حفره‌های توخالی بزرگی را در داخل ریبوزوم ایجاد می‌کند و ریبوزوم E. cuniculi را در مقایسه با ریبوزوم‌های سنتی‌تر متخلخل‌تر می‌کند (شکل 4b). نکته قابل توجه این است که ما دریافتیم که بیشتر این برآمدگی‌ها در ساختارهای ریبوزومی V. necatrix و P. locustae که قبلاً شناسایی شده بودند، نیز از بین رفته‌اند، که در تجزیه و تحلیل‌های ساختاری قبلی نادیده گرفته شده بودند31،32.
گاهی اوقات از دست دادن برآمدگی‌های rRNA با ایجاد برآمدگی‌های جدید در کنار برآمدگی از دست رفته همراه است. به عنوان مثال، ساقه P ریبوزومی حاوی یک برآمدگی U1208 (در ساکارومایسس سرویزیه) است که از E. coli تا انسان باقی مانده و بنابراین تخمین زده می‌شود که 3.5 میلیارد سال قدمت داشته باشد. در طول سنتز پروتئین، این برآمدگی به ساقه P کمک می‌کند تا بین ساختارهای باز و بسته حرکت کند تا ریبوزوم بتواند فاکتورهای ترجمه را جذب کرده و آنها را به محل فعال تحویل دهد. در ریبوزوم‌های E. cuniculi، این ضخیم شدن وجود ندارد. با این حال، یک ضخیم شدن جدید (G883) که فقط در سه جفت باز قرار دارد، می‌تواند به بازیابی انعطاف‌پذیری بهینه ساقه P کمک کند (شکل 4c).
داده‌های ما در مورد rRNA بدون برآمدگی نشان می‌دهد که به حداقل رساندن rRNA محدود به از دست دادن عناصر rRNA روی سطح ریبوزوم نیست، بلکه ممکن است هسته ریبوزوم را نیز درگیر کند و یک نقص مولکولی خاص انگل ایجاد کند که در سلول‌های زنده آزاد توصیف نشده است. گونه‌های زنده مشاهده می‌شوند.
پس از مدل‌سازی پروتئین‌های ریبوزومی متعارف و rRNA، دریافتیم که اجزای ریبوزومی مرسوم نمی‌توانند سه بخش تصویر cryo-EM را توضیح دهند. دو مورد از این قطعات، مولکول‌های کوچکی هستند (شکل 5، شکل تکمیلی 8). قطعه اول بین پروتئین‌های ریبوزومی uL15 و eL18 در موقعیتی قرار گرفته است که معمولاً توسط انتهای C از eL18 اشغال می‌شود، که در E. cuniculi کوتاه شده است. اگرچه نمی‌توانیم هویت این مولکول را تعیین کنیم، اما اندازه و شکل این جزیره چگالی به خوبی با وجود مولکول‌های اسپرمیدین توضیح داده می‌شود. اتصال آن به ریبوزوم توسط جهش‌های اختصاصی میکروسپوریدیا در پروتئین‌های uL15 (Asp51 و Arg56) تثبیت می‌شود، که به نظر می‌رسد میل ترکیبی ریبوزوم را برای این مولکول کوچک افزایش می‌دهد، زیرا به uL15 اجازه می‌دهند تا مولکول کوچک را در یک ساختار ریبوزومی بپیچد. شکل تکمیلی 2). 8، داده‌های اضافی 1، 2).
تصویربرداری Cryo-EM وجود نوکلئوتیدهایی را در خارج از ریبوز متصل به ریبوزوم E. cuniculi نشان می‌دهد. در ریبوزوم E. cuniculi، این نوکلئوتید همان مکانی را اشغال می‌کند که نوکلئوتید 25S rRNA A3186 (شماره‌گذاری ساکارومایسس سرویزیه) در اکثر ریبوزوم‌های یوکاریوتی دیگر اشغال می‌کند. b در ساختار ریبوزومی E. cuniculi، این نوکلئوتید بین پروتئین‌های ریبوزومی uL9 و eL20 قرار دارد و در نتیجه تماس بین دو پروتئین را تثبیت می‌کند. cd تجزیه و تحلیل حفاظت از توالی eL20 در بین گونه‌های میکروسپوریدیا. درخت فیلوژنتیک گونه‌های میکروسپوریدیا (c) و هم‌ترازی چندگانه توالی پروتئین eL20 (d) نشان می‌دهد که باقیمانده‌های اتصال نوکلئوتیدی F170 و K172 در اکثر میکروسپوریدیاهای معمولی، به استثنای S. lophii، حفظ شده‌اند، به استثنای میکروسپوریدیاهای شاخه‌دار اولیه که پسوند rRNA ES39L را حفظ کرده‌اند. e این شکل نشان می‌دهد که باقیمانده‌های اتصال نوکلئوتیدی F170 و K172 فقط در eL20 ژنوم میکروسپوریدیای بسیار کاهش‌یافته وجود دارند، اما در سایر یوکاریوت‌ها وجود ندارند. به طور کلی، این داده‌ها نشان می‌دهند که ریبوزوم‌های میکروسپوریدیا یک جایگاه اتصال نوکلئوتیدی ایجاد کرده‌اند که به نظر می‌رسد مولکول‌های AMP را متصل کرده و از آنها برای تثبیت تعاملات پروتئین-پروتئین در ساختار ریبوزومی استفاده می‌کند. حفاظت بالای این جایگاه اتصال در میکروسپوریدیا و عدم وجود آن در سایر یوکاریوت‌ها نشان می‌دهد که این جایگاه ممکن است یک مزیت بقای انتخابی برای میکروسپوریدیا فراهم کند. بنابراین، به نظر نمی‌رسد که جیب اتصال نوکلئوتیدی در ریبوزوم میکروسپوریدیا یک ویژگی منحط یا شکل نهایی تخریب rRNA باشد، همانطور که قبلاً توضیح داده شد، بلکه یک نوآوری تکاملی مفید است که به ریبوزوم میکروسپوریدیا اجازه می‌دهد تا مستقیماً به مولکول‌های کوچک متصل شود و از آنها به عنوان بلوک‌های سازنده مولکولی استفاده کند. بلوک‌های سازنده برای ریبوزوم‌ها. این کشف، ریبوزوم میکروسپوریدیا را به تنها ریبوزوم شناخته شده‌ای تبدیل می‌کند که از یک نوکلئوتید واحد به عنوان بلوک سازنده ساختاری خود استفاده می‌کند. f مسیر تکاملی فرضی مشتق شده از اتصال نوکلئوتید.
دومین چگالی با وزن مولکولی کم در سطح مشترک بین پروتئین‌های ریبوزومی uL9 و eL30 قرار دارد (شکل 5a). این سطح مشترک قبلاً در ساختار ریبوزوم Saccharomyces cerevisiae به عنوان محل اتصال برای نوکلئوتید 25S از rRNA A3186 (بخشی از پسوند rRNA ES39L)38 توصیف شده است. نشان داده شده است که در ریبوزوم‌های ES39L منحط P. locustae، این سطح مشترک به یک نوکلئوتید واحد ناشناخته 31 متصل می‌شود و فرض بر این است که این نوکلئوتید یک شکل نهایی کاهش یافته از rRNA است که در آن طول rRNA حدود 130-230 باز است. ES39L به یک نوکلئوتید واحد 32.43 کاهش می‌یابد. تصاویر cryo-EM ما از این ایده پشتیبانی می‌کنند که چگالی را می‌توان با نوکلئوتیدها توضیح داد. با این حال، وضوح بالاتر ساختار ما نشان داد که این نوکلئوتید یک مولکول خارج ریبوزومی، احتمالاً AMP است (شکل 5a، b).
سپس پرسیدیم که آیا جایگاه اتصال نوکلئوتیدی در ریبوزوم E. cuniculi ظاهر شده است یا قبلاً وجود داشته است. از آنجایی که اتصال نوکلئوتیدی عمدتاً توسط باقیمانده‌های Phe170 و Lys172 در پروتئین ریبوزومی eL30 انجام می‌شود، ما حفاظت از این باقیمانده‌ها را در 4396 یوکاریوت نماینده ارزیابی کردیم. همانطور که در مورد uL15 در بالا ذکر شد، دریافتیم که باقیمانده‌های Phe170 و Lys172 فقط در میکروسپوریدیاهای معمولی بسیار حفاظت شده هستند، اما در سایر یوکاریوت‌ها، از جمله میکروسپوریدیاهای غیرمعمول Mitosporidium و Amphiamblys، که در آنها قطعه rRNA ES39L کاهش نمی‌یابد، وجود ندارند 44، 45، 46 (شکل 5c). -e).
روی هم رفته، این داده‌ها از این ایده پشتیبانی می‌کنند که E. cuniculi و احتمالاً سایر میکروسپوریدیاهای متعارف، توانایی جذب مؤثر تعداد زیادی از متابولیت‌های کوچک در ساختار ریبوزوم را برای جبران کاهش سطح rRNA و پروتئین، تکامل داده‌اند. با انجام این کار، آنها توانایی منحصر به فردی برای اتصال نوکلئوتیدها به خارج از ریبوزوم ایجاد کرده‌اند که نشان می‌دهد ساختارهای مولکولی انگلی با جذب متابولیت‌های کوچک فراوان و استفاده از آنها به عنوان تقلیدهای ساختاری از قطعات RNA و پروتئین تخریب‌شده، این کمبود را جبران می‌کنند.
بخش سوم شبیه‌سازی نشده نقشه cryo-EM ما، در زیر واحد بزرگ ریبوزومی یافت می‌شود. وضوح نسبتاً بالای (2.6 آنگستروم) نقشه ما نشان می‌دهد که این چگالی متعلق به پروتئین‌هایی با ترکیبات منحصر به فرد از باقیمانده‌های زنجیره جانبی بزرگ است، که به ما اجازه داد این چگالی را به عنوان یک پروتئین ریبوزومی قبلاً ناشناخته که به عنوان msL2 (پروتئین L2 اختصاصی میکروسپوریدیا) شناسایی کردیم، شناسایی کنیم (روش‌ها، شکل 6). جستجوی همولوژی ما نشان داد که msL2 در کلاد میکروسپوریدیا از جنس Encephaliter و Orosporidium حفظ شده است، اما در گونه‌های دیگر، از جمله سایر میکروسپوریدیاها، وجود ندارد. در ساختار ریبوزومی، msL2 شکافی را که با از دست دادن rRNA طولانی ES31L ایجاد شده است، اشغال می‌کند. در این فضای خالی، msL2 به تثبیت تاخوردگی rRNA کمک می‌کند و می‌تواند از دست دادن ES31L را جبران کند (شکل 6).
الف) چگالی الکترونی و مدل پروتئین ریبوزومی اختصاصی میکروسپوریدیا msL2 که در ریبوزوم‌های E. cuniculi یافت می‌شود. ب) اکثر ریبوزوم‌های یوکاریوتی، از جمله ریبوزوم 80S ساکارومایسس سرویزیه، در اکثر گونه‌های میکروسپوریدیا، تکثیر rRNA مربوط به ES19L را از دست داده‌اند. ساختار قبلاً ایجاد شده ریبوزوم میکروسپوریدیا V. necatrix نشان می‌دهد که از دست دادن ES19L در این انگل‌ها با تکامل پروتئین ریبوزومی جدید msL1 جبران می‌شود. در این مطالعه، ما دریافتیم که ریبوزوم E. cuniculi همچنین یک پروتئین تقلیدکننده RNA ریبوزومی اضافی را به عنوان جبران ظاهری برای از دست دادن ES19L ایجاد کرده است. با این حال، msL2 (که در حال حاضر به عنوان پروتئین فرضی ECU06_1135 حاشیه‌نویسی می‌شود) و msL1 منشأ ساختاری و تکاملی متفاوتی دارند. c این کشف در مورد تولید پروتئین‌های ریبوزومی msL1 و msL2 که از نظر تکاملی نامرتبط هستند، نشان می‌دهد که اگر ریبوزوم‌ها جهش‌های مضر را در rRNA خود جمع کنند، می‌توانند به سطوح بی‌سابقه‌ای از تنوع ترکیبی حتی در زیرمجموعه کوچکی از گونه‌های نزدیک به هم دست یابند. این کشف می‌تواند به روشن شدن منشأ و تکامل ریبوزوم میتوکندریایی کمک کند، که به دلیل rRNA بسیار کاهش‌یافته و تنوع غیرطبیعی در ترکیب پروتئین در بین گونه‌ها شناخته شده است.
سپس پروتئین msL2 را با پروتئین msL1 که قبلاً شرح داده شده بود، تنها پروتئین ریبوزومی شناخته شده مخصوص میکروسپوریدیا که در ریبوزوم V. necatrix یافت می‌شود، مقایسه کردیم. ما می‌خواستیم آزمایش کنیم که آیا msL1 و msL2 از نظر تکاملی مرتبط هستند یا خیر. تجزیه و تحلیل ما نشان داد که msL1 و msL2 حفره یکسانی را در ساختار ریبوزومی اشغال می‌کنند، اما ساختارهای اولیه و ثالثیه متفاوتی دارند که نشان دهنده منشأ تکاملی مستقل آنها است (شکل 6). بنابراین، کشف ما از msL2 شواهدی را ارائه می‌دهد که گروه‌هایی از گونه‌های یوکاریوتی فشرده می‌توانند به طور مستقل پروتئین‌های ریبوزومی از نظر ساختاری متمایز را برای جبران از دست دادن قطعات rRNA تکامل دهند. این یافته از این نظر قابل توجه است که اکثر ریبوزوم‌های یوکاریوتی سیتوپلاسمی حاوی یک پروتئین ثابت، از جمله همان خانواده 81 پروتئین ریبوزومی هستند. ظهور msL1 و msL2 در کلادهای مختلف میکروسپوریدیا در پاسخ به از دست دادن بخش‌های rRNA طولانی نشان می‌دهد که تخریب معماری مولکولی انگل باعث می‌شود انگل‌ها به دنبال جهش‌های جبرانی باشند که در نهایت ممکن است منجر به اکتساب آنها در جمعیت‌های مختلف انگل شود.
در نهایت، وقتی مدل ما تکمیل شد، ترکیب ریبوزوم E. cuniculi را با ترکیب پیش‌بینی‌شده از توالی ژنوم مقایسه کردیم. پیش از این تصور می‌شد که چندین پروتئین ریبوزومی، از جمله eL14، eL38، eL41 و eS30، به دلیل عدم وجود همولوگ‌هایشان در ژنوم E. cuniculi، از ژنوم E. cuniculi حذف شده‌اند. از دست دادن بسیاری از پروتئین‌های ریبوزومی در اکثر انگل‌های درون سلولی و اندوسیمبیونت‌های بسیار کاهش‌یافته دیگر نیز پیش‌بینی می‌شود. به عنوان مثال، اگرچه اکثر باکتری‌های آزادزی حاوی خانواده یکسانی از 54 پروتئین ریبوزومی هستند، اما تنها 11 مورد از این خانواده‌های پروتئینی در هر ژنوم تجزیه و تحلیل‌شده از باکتری‌های محدود به میزبان، همولوگ‌های قابل تشخیص دارند. در تأیید این مفهوم، از دست دادن پروتئین‌های ریبوزومی به صورت تجربی در V. necatrix و P. locustae microsporidia مشاهده شده است که فاقد پروتئین‌های eL38 و eL4131,32 هستند.
با این حال، ساختارهای ما نشان می‌دهند که فقط eL38، eL41 و eS30 در ریبوزوم E. cuniculi از بین رفته‌اند. پروتئین eL14 حفظ شده بود و ساختار ما نشان داد که چرا این پروتئین در جستجوی همولوژی یافت نشد (شکل 7). در ریبوزوم‌های E. cuniculi، بیشتر جایگاه اتصال eL14 به دلیل تخریب ES39L تکثیر شده با rRNA از بین رفته است. در غیاب ES39L، eL14 بیشتر ساختار ثانویه خود را از دست داد و تنها 18٪ از توالی eL14 در E. cuniculi و S. cerevisiae یکسان بود. این حفظ ضعیف توالی قابل توجه است زیرا حتی Saccharomyces cerevisiae و Homo sapiens - ارگانیسم‌هایی که 1.5 میلیارد سال از هم فاصله دارند - بیش از 51٪ از باقیمانده‌های مشابه را در eL14 به اشتراک می‌گذارند. این فقدان غیرعادیِ حفاظت‌شدگی، توضیح می‌دهد که چرا پروتئین eL14 در E. cuniculi در حال حاضر به عنوان پروتئین احتمالی M970_061160 و نه به عنوان پروتئین ریبوزومی eL1427 معرفی می‌شود.
و ریبوزوم میکروسپوریدیا، پسوند rRNA مربوط به ES39L را از دست داد که تا حدی محل اتصال پروتئین ریبوزومی eL14 را حذف کرد. در غیاب ES39L، پروتئین میکروسپور eL14 دچار از دست دادن ساختار ثانویه می‌شود، که در آن مارپیچ آلفای متصل شونده به rRNA قبلی به یک حلقه با حداقل طول تبدیل می‌شود. ب. هم‌ترازی چندگانه توالی نشان می‌دهد که پروتئین eL14 در گونه‌های یوکاریوتی بسیار حفاظت‌شده است (57٪ شباهت توالی بین همولوگ‌های مخمر و انسان)، اما در میکروسپوریدیا (که در آن بیش از 24٪ از باقیمانده‌ها با همولوگ eL14 یکسان نیستند) از S. cerevisiae یا H. sapiens، حفاظت ضعیف و واگرا است. این حفاظت ضعیف توالی و تنوع ساختار ثانویه توضیح می‌دهد که چرا همولوگ eL14 هرگز در E. cuniculi یافت نشده است و چرا تصور می‌شود که این پروتئین در E. cuniculi از بین رفته است. در مقابل، E. cuniculi eL14 قبلاً به عنوان یک پروتئین M970_061160 فرضی معرفی شده بود. این مشاهده نشان می‌دهد که تنوع ژنوم میکروسپوریدیا در حال حاضر بیش از حد تخمین زده می‌شود: برخی از ژن‌هایی که در حال حاضر تصور می‌شود در میکروسپوریدیا از بین رفته‌اند، در واقع حفظ شده‌اند، البته به اشکال بسیار متمایز؛ در عوض، تصور می‌شود برخی از آنها ژن‌های میکروسپوریدیا را برای پروتئین‌های اختصاصی کرم (مثلاً پروتئین فرضی M970_061160) کد می‌کنند که در واقع پروتئین‌های بسیار متنوعی را که در سایر یوکاریوت‌ها یافت می‌شوند، کد می‌کنند.
این یافته نشان می‌دهد که دناتوراسیون rRNA می‌تواند منجر به از دست رفتن چشمگیر حفاظت توالی در پروتئین‌های ریبوزومی مجاور شود و این پروتئین‌ها را برای جستجوهای همولوژی غیرقابل تشخیص کند. بنابراین، ممکن است درجه واقعی تخریب مولکولی را در ارگانیسم‌های ژنوم کوچک بیش از حد تخمین بزنیم، زیرا برخی از پروتئین‌هایی که تصور می‌شود از بین رفته‌اند، در واقع باقی می‌مانند، البته به اشکال بسیار تغییر یافته.
چگونه انگل‌ها می‌توانند عملکرد ماشین‌های مولکولی خود را در شرایط کاهش شدید ژنوم حفظ کنند؟ مطالعه ما با توصیف ساختار مولکولی پیچیده (ریبوزوم) E. cuniculi، ارگانیسمی با یکی از کوچکترین ژنوم‌های یوکاریوتی، به این سوال پاسخ می‌دهد.
تقریباً دو دهه است که مشخص شده است مولکول‌های پروتئین و RNA در انگل‌های میکروبی اغلب با مولکول‌های همولوگ خود در گونه‌های آزادزی متفاوت هستند، زیرا فاقد مراکز کنترل کیفیت هستند، در میکروب‌های آزادزی به 50٪ اندازه خود کاهش می‌یابند و غیره. بسیاری از جهش‌های ناتوان‌کننده که تاخوردگی و عملکرد را مختل می‌کنند. به عنوان مثال، انتظار می‌رود ریبوزوم‌های موجودات زنده با ژنوم کوچک، از جمله بسیاری از انگل‌های درون سلولی و اندوسیمبیونت‌ها، در مقایسه با گونه‌های آزادزی، فاقد چندین پروتئین ریبوزومی و تا یک سوم نوکلئوتیدهای rRNA باشند 27، 29، 30، 49. با این حال، نحوه عملکرد این مولکول‌ها در انگل تا حد زیادی یک راز باقی مانده است که عمدتاً از طریق ژنومیک مقایسه‌ای مورد مطالعه قرار می‌گیرد.
مطالعه ما نشان می‌دهد که ساختار ماکرومولکول‌ها می‌تواند جنبه‌های بسیاری از تکامل را آشکار کند که استخراج آنها از مطالعات ژنومی مقایسه‌ای سنتی انگل‌های درون سلولی و سایر موجودات محدود به میزبان دشوار است (شکل تکمیلی 7). به عنوان مثال، مثال پروتئین eL14 نشان می‌دهد که می‌توانیم درجه واقعی تخریب دستگاه مولکولی را در گونه‌های انگلی بیش از حد تخمین بزنیم. اکنون اعتقاد بر این است که انگل‌های آنسفالیتی صدها ژن اختصاصی میکروسپوریدیا دارند. با این حال، نتایج ما نشان می‌دهد که برخی از این ژن‌های به ظاهر خاص در واقع فقط انواع بسیار متفاوتی از ژن‌هایی هستند که در سایر یوکاریوت‌ها رایج هستند. علاوه بر این، مثال پروتئین msL2 نشان می‌دهد که چگونه ما پروتئین‌های ریبوزومی جدید را نادیده می‌گیریم و محتوای ماشین‌های مولکولی انگلی را دست کم می‌گیریم. مثال مولکول‌های کوچک نشان می‌دهد که چگونه می‌توانیم از ابتکاری‌ترین نوآوری‌ها در ساختارهای مولکولی انگلی که می‌توانند به آنها فعالیت بیولوژیکی جدیدی بدهند، چشم‌پوشی کنیم.
روی هم رفته، این نتایج درک ما را از تفاوت‌های بین ساختارهای مولکولی موجودات زنده‌ی محدود به میزبان و همتایان آنها در موجودات زنده‌ی آزاد بهبود می‌بخشد. ما نشان می‌دهیم که ماشین‌های مولکولی، که مدت‌ها تصور می‌شد کاهش یافته، منحط شده و در معرض جهش‌های ناتوان‌کننده‌ی مختلف هستند، در عوض مجموعه‌ای از ویژگی‌های ساختاری غیرمعمول دارند که به طور سیستماتیک نادیده گرفته می‌شوند.
از سوی دیگر، قطعات rRNA غیرحجیم و قطعات ادغام‌شده‌ای که در ریبوزوم‌های E. cuniculi یافتیم، نشان می‌دهد که کاهش ژنوم می‌تواند حتی آن بخش‌هایی از ماشین مولکولی پایه را که در سه حوزه حیات حفظ شده‌اند - پس از تقریباً ۳.۵ میلیارد سال - تغییر دهد. تکامل مستقل گونه‌ها.
قطعات rRNA بدون برآمدگی و متصل در ریبوزوم‌های E. cuniculi با توجه به مطالعات قبلی مولکول‌های RNA در باکتری‌های درون‌همزیست مورد توجه ویژه قرار گرفته‌اند. به عنوان مثال، در درون‌همزیست شته Buchnera aphidicola، نشان داده شده است که مولکول‌های rRNA و tRNA به دلیل سوگیری ترکیب A+T و نسبت بالای جفت بازهای غیر متعارف، ساختارهای حساس به دما دارند20،50. اکنون تصور می‌شود که این تغییرات در RNA، و همچنین تغییرات در مولکول‌های پروتئین، مسئول وابستگی بیش از حد درون‌همزیست‌ها به شرکا و ناتوانی درون‌همزیست‌ها در انتقال گرما هستند21،23. اگرچه rRNA میکروسپوریدیا انگلی تغییرات ساختاری متمایزی دارد، ماهیت این تغییرات نشان می‌دهد که کاهش پایداری حرارتی و وابستگی بیشتر به پروتئین‌های چاپرون ممکن است از ویژگی‌های مشترک مولکول‌های RNA در موجوداتی با ژنوم کاهش یافته باشد.
از سوی دیگر، ساختارهای ما نشان می‌دهند که میکروسپوریدیاهای انگلی توانایی منحصر به فردی برای مقاومت در برابر قطعات rRNA و پروتئین‌های به طور گسترده حفظ شده، تکامل یافته‌اند و توانایی استفاده از متابولیت‌های کوچک فراوان و در دسترس را به عنوان تقلیدهای ساختاری از قطعات rRNA و پروتئین‌های منحط، توسعه می‌دهند. تخریب ساختار مولکولی. این نظر با این واقعیت پشتیبانی می‌شود که مولکول‌های کوچکی که از دست دادن قطعات پروتئینی در rRNA و ریبوزوم‌های E. cuniculi را جبران می‌کنند، به باقیمانده‌های اختصاصی میکروسپوریدیا در پروتئین‌های uL15 و eL30 متصل می‌شوند. این نشان می‌دهد که اتصال مولکول‌های کوچک به ریبوزوم‌ها ممکن است محصول انتخاب مثبت باشد، که در آن جهش‌های اختصاصی میکروسپوریدیا در پروتئین‌های ریبوزومی به دلیل توانایی آنها در افزایش میل ترکیبی ریبوزوم‌ها برای مولکول‌های کوچک انتخاب شده‌اند، که ممکن است منجر به ارگانیسم‌های ریبوزومی کارآمدتر شود. این کشف، نوآوری هوشمندانه‌ای را در ساختار مولکولی انگل‌های میکروبی آشکار می‌کند و درک بهتری از چگونگی حفظ عملکرد ساختارهای مولکولی انگل با وجود تکامل تقلیلی به ما می‌دهد.
در حال حاضر، شناسایی این مولکول‌های کوچک هنوز مشخص نیست. مشخص نیست که چرا ظاهر این مولکول‌های کوچک در ساختار ریبوزومی بین گونه‌های میکروسپوریدیا متفاوت است. به طور خاص، مشخص نیست که چرا اتصال نوکلئوتیدی در ریبوزوم‌های E. cuniculi و P. locustae مشاهده می‌شود و در ریبوزوم‌های V. necatrix وجود ندارد، با وجود وجود باقیمانده F170 در پروتئین‌های eL20 و K172 V. necatrix. این حذف ممکن است ناشی از باقیمانده 43 uL6 (واقع در مجاورت جیب اتصال نوکلئوتیدی) باشد که در V. necatrix تیروزین است و در E. cuniculi و P. locustae ترئونین نیست. زنجیره جانبی آروماتیک حجیم Tyr43 می‌تواند به دلیل همپوشانی فضایی در اتصال نوکلئوتیدی اختلال ایجاد کند. از طرف دیگر، حذف آشکار نوکلئوتید ممکن است به دلیل وضوح پایین تصویربرداری cryo-EM باشد که مانع مدل‌سازی قطعات ریبوزومی V. necatrix می‌شود.
از سوی دیگر، کار ما نشان می‌دهد که فرآیند فروپاشی ژنوم ممکن است یک نیروی مبتکرانه باشد. به طور خاص، ساختار ریبوزوم E. cuniculi نشان می‌دهد که از دست دادن rRNA و قطعات پروتئینی در ریبوزوم میکروسپوریدیا، فشار تکاملی ایجاد می‌کند که باعث ایجاد تغییرات در ساختار ریبوزوم می‌شود. این گونه‌ها در فاصله‌ای دور از محل فعال ریبوزوم رخ می‌دهند و به نظر می‌رسد به حفظ (یا بازیابی) مونتاژ بهینه ریبوزوم کمک می‌کنند که در غیر این صورت با کاهش rRNA مختل می‌شد. این نشان می‌دهد که به نظر می‌رسد نوآوری عمده ریبوزوم میکروسپوریدیا به نیاز به بافر کردن رانش ژن تبدیل شده است.
شاید این موضوع به بهترین شکل با اتصال نوکلئوتیدی نشان داده شود، که تاکنون در موجودات دیگر مشاهده نشده است. این واقعیت که بقایای اتصال نوکلئوتیدی در میکروسپوریدیاهای معمولی وجود دارند، اما در سایر یوکاریوت‌ها وجود ندارند، نشان می‌دهد که جایگاه‌های اتصال نوکلئوتیدی فقط بقایایی نیستند که منتظر ناپدید شدن باشند، یا جایگاه نهایی برای بازیابی rRNA به شکل نوکلئوتیدهای منفرد. در عوض، این جایگاه به نظر می‌رسد یک ویژگی مفید است که می‌توانسته طی چندین دور انتخاب مثبت تکامل یافته باشد. جایگاه‌های اتصال نوکلئوتیدی ممکن است محصول جانبی انتخاب طبیعی باشند: پس از تخریب ES39L، میکروسپوریدیاها مجبور می‌شوند در غیاب ES39L به دنبال جبران برای بازیابی بیوژنز ریبوزوم بهینه باشند. از آنجایی که این نوکلئوتید می‌تواند تماس‌های مولکولی نوکلئوتید A3186 را در ES39L تقلید کند، مولکول نوکلئوتید به یک بلوک سازنده ریبوزوم تبدیل می‌شود که اتصال آن با جهش توالی eL30 بیشتر بهبود می‌یابد.
با توجه به تکامل مولکولی انگل‌های درون سلولی، مطالعه ما نشان می‌دهد که نیروهای انتخاب طبیعی داروینی و رانش ژنتیکی تجزیه ژنوم به صورت موازی عمل نمی‌کنند، بلکه نوسان می‌کنند. اولاً، رانش ژنتیکی ویژگی‌های مهم مولکول‌های زیستی را حذف می‌کند و جبران را به شدت مورد نیاز می‌کند. تنها زمانی که انگل‌ها این نیاز را از طریق انتخاب طبیعی داروینی برآورده کنند، ماکرومولکول‌های آنها فرصتی برای توسعه چشمگیرترین و نوآورانه‌ترین ویژگی‌های خود خواهند داشت. نکته مهم این است که تکامل جایگاه‌های اتصال نوکلئوتیدی در ریبوزوم E. cuniculi نشان می‌دهد که این الگوی از دست دادن به دست آوردن تکامل مولکولی نه تنها جهش‌های مضر را مستهلک می‌کند، بلکه گاهی اوقات عملکردهای کاملاً جدیدی به ماکرومولکول‌های انگلی می‌دهد.
این ایده با نظریه تعادل متحرک سوئل رایت سازگار است، که بیان می‌کند یک سیستم سختگیرانه انتخاب طبیعی، توانایی ارگانیسم‌ها را برای نوآوری محدود می‌کند51،52،53. با این حال، اگر رانش ژنتیکی انتخاب طبیعی را مختل کند، این رانش‌ها می‌توانند تغییراتی ایجاد کنند که به خودی خود سازگار (یا حتی مضر) نیستند، اما منجر به تغییرات بیشتری می‌شوند که تناسب اندام بالاتر یا فعالیت بیولوژیکی جدیدی را فراهم می‌کنند. چارچوب ما با نشان دادن اینکه همان نوع جهشی که تاخوردگی و عملکرد یک زیست‌مولکول را کاهش می‌دهد، به نظر می‌رسد محرک اصلی بهبود آن باشد، از این ایده پشتیبانی می‌کند. مطابق با مدل تکاملی برد-برد، مطالعه ما نشان می‌دهد که فروپاشی ژنوم، که به طور سنتی به عنوان یک فرآیند تخریبی در نظر گرفته می‌شود، همچنین محرک اصلی نوآوری است، و گاهی اوقات و شاید حتی اغلب به ماکرومولکول‌ها اجازه می‌دهد فعالیت‌های انگلی جدیدی کسب کنند. می‌توانند از آنها استفاده کنند.