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미생물 기생충의 진화는 기생충의 기능 향상을 유도하는 자연 선택과, 유전자 소실 및 유해 돌연변이 축적을 유발하는 유전적 부동 사이의 상호작용을 포함합니다. 본 연구에서는 이러한 상호작용이 단일 거대 분자 수준에서 어떻게 발생하는지 이해하기 위해, 자연계에서 가장 작은 게놈을 가진 진핵생물 중 하나인 엔세팔리토존 쿠니쿨리(Encephalitozoon cuniculi)의 리보솜 극저온 전자현미경 구조를 분석했습니다. E. cuniculi 리보솜에서 rRNA의 극단적인 감소는 이전에 알려지지 않았던 융합된 rRNA 링커 및 돌출부가 없는 rRNA와 같은 전례 없는 구조적 변화를 동반합니다. 또한, E. cuniculi 리보솜은 분해된 rRNA 조각 및 단백질의 구조적 모방체로서 작은 분자를 이용하는 능력을 개발함으로써 rRNA 조각 및 단백질 손실에도 불구하고 생존했습니다. 전반적으로, 우리는 오랫동안 축소되고 퇴화되었으며 심각한 돌연변이에 취약하다고 여겨졌던 분자 구조들이 극심한 분자 수축에도 불구하고 활성을 유지하는 여러 보상 메커니즘을 가지고 있음을 보여줍니다.
대부분의 미생물 기생충 그룹은 숙주를 이용하기 위한 고유한 분자적 도구를 가지고 있기 때문에, 우리는 종종 기생충 그룹마다 다른 치료법을 개발해야 합니다.^1,2 그러나 새로운 증거에 따르면 기생충 진화의 일부 측면은 수렴적이며 대체로 예측 가능하여 미생물 기생충에 대한 광범위한 치료적 개입의 잠재적 기반을 제시합니다.^{3,4,5,6,7,8,9}
이전 연구에서는 미생물 기생충에서 흔히 나타나는 진화적 경향인 게놈 축소 또는 게놈 붕괴를 밝혀냈습니다.10,11,12,13 최근 연구에 따르면 미생물이 자유 생활을 포기하고 세포 내 기생충(또는 내공생체)이 되면 게놈은 수백만 년에 걸쳐 느리지만 놀라운 변화를 겪습니다.9,11 게놈 붕괴라고 알려진 이 과정에서 미생물 기생충은 유해한 돌연변이를 축적하여 이전에 중요했던 많은 유전자를 위유전자로 만들고, 이는 점진적인 유전자 소실과 돌연변이 붕괴로 이어집니다.14,15 이러한 붕괴는 가장 오래된 세포 내 기생충의 경우 가까운 자유 생활 종에 비해 최대 95%의 유전자를 파괴할 수 있습니다. 따라서 세포 내 기생충의 진화는 두 가지 상반된 힘, 즉 기생충의 개선을 이끄는 다윈의 자연 선택과 기생충을 소멸로 이끄는 게놈 붕괴 사이의 줄다리기와 같습니다. 기생충이 어떻게 이러한 힘겨루기에서 살아남아 분자 구조의 활성을 유지할 수 있었는지는 여전히 불분명하다.
유전체 퇴화의 메커니즘은 완전히 밝혀지지 않았지만, 주로 빈번한 유전적 부동(genetic drift) 때문인 것으로 보인다. 기생충은 소규모의 무성생식 개체군으로 유전적으로 제한적인 환경에서 살기 때문에 DNA 복제 과정에서 발생하는 유해 돌연변이를 효과적으로 제거할 수 없다. 이는 유해 돌연변이의 비가역적인 축적과 기생충 유전체의 축소로 이어진다. 결과적으로 기생충은 세포 내 환경에서 생존에 더 이상 필요하지 않은 유전자를 잃을 뿐만 아니라, 기생충 개체군이 산발적으로 발생하는 유해 돌연변이를 효과적으로 제거하지 못하는 한계로 인해 가장 중요한 유전자를 포함한 유전체 전체에 돌연변이가 축적된다.
현재 우리가 이해하는 유전체 축소 현상은 대부분 유전체 서열 비교에만 기반하고 있으며, 세포 내 필수 기능을 수행하고 잠재적인 약물 표적이 될 수 있는 분자들의 변화에는 상대적으로 관심이 적습니다. 비교 연구에 따르면, 유해한 세포 내 미생물 돌연변이의 부담은 단백질과 핵산의 잘못된 접힘과 응집을 유발하여, 샤페론 의존성을 높이고 열에 과민하게 만드는 것으로 나타났습니다.19,20,21,22,23 또한, 다양한 기생충들은 (때로는 25억 년이라는 긴 시간 간격을 두고 독립적으로 진화해 온) 단백질 합성5,6 및 DNA 복구 메커니즘24에서 유사한 품질 관리 기능 상실을 경험했습니다. 그러나 세포 내 생활 방식이 세포 거대 분자의 다른 모든 특성, 특히 유해한 돌연변이 부담 증가에 대한 분자적 적응에 미치는 영향에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다.
본 연구에서는 세포 내 미생물의 단백질과 핵산의 진화를 더 잘 이해하기 위해 세포 내 기생 미생물인 Encephalitozoon cuniculi의 리보솜 구조를 규명했습니다. E. cuniculi는 진균류와 유사한 생물로, 특이하게 작은 진핵생물 게놈을 가진 기생성 미포자충류에 속하며, 따라서 게놈 퇴화 연구의 모델 생물로 사용됩니다.25,26,27,28,29,30 최근에는 미포자충류인 Paranosema locustae와 Vairimorpha necatrix(~3.2 Mb 게놈)의 게놈이 중간 정도로 축소된 극저온 전자현미경(cryo-EM)을 이용하여 리보솜 구조가 규명되었습니다.31,32 이러한 구조들은 rRNA 증폭의 일부 손실이 인접한 리보솜 단백질 사이의 새로운 접촉 형성이나 새로운 msL131,32 리보솜 단백질의 획득을 통해 보상된다는 것을 시사합니다. 엔세팔리토존(Encephalitozoon, 게놈 크기 약 250만 bp) 종은 가장 가까운 근연종인 오르도스포라(Ordospora) 종과 함께 진핵생물에서 게놈 축소의 극치를 보여줍니다. 이들은 2000개 미만의 단백질 코딩 유전자를 가지고 있으며, 리보솜에는 rRNA 확장 단편(진핵생물 리보솜과 세균 리보솜을 구별하는 rRNA 단편)이 없을 뿐만 아니라, E. cuniculi 게놈에 상동체가 없기 때문에 4개의 리보솜 단백질만 존재할 것으로 예상됩니다.26,27,28 따라서 우리는 E. cuniculi 리보솜이 게놈 퇴화에 대한 분자적 적응을 위한 이전에 알려지지 않은 전략을 밝혀낼 수 있다고 결론지었습니다.
우리가 밝혀낸 극저온 전자현미경 구조는 지금까지 규명된 진핵세포 세포질 리보솜 중 가장 작은 크기를 나타내며, 궁극적인 게놈 축소 정도가 세포에 필수적인 분자 기계의 구조, 조립 및 진화에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 통찰력을 제공합니다. 우리는 E. cuniculi 리보솜이 RNA 접힘 및 리보솜 조립에 관한 널리 보존된 원칙들을 많이 위반한다는 것을 발견했으며, 이전에 알려지지 않았던 새로운 리보솜 단백질을 발견했습니다. 매우 예상치 못하게, 우리는 미포자충 리보솜이 작은 분자를 결합하는 능력을 진화시켜 왔다는 것을 보여주고, rRNA와 단백질의 절단이 궁극적으로 리보솜에 유용한 특성을 부여할 수 있는 진화적 혁신을 촉발했을 것이라는 가설을 제시합니다.
세포 내 기생 미생물의 단백질 및 핵산 진화에 대한 이해를 높이기 위해, 감염된 포유류 세포 배양액에서 장내포자충(E. cuniculi) 포자를 분리하여 리보솜을 정제하고 그 구조를 규명하기로 했습니다. 미세포자충은 영양 배지에서 배양할 수 없기 때문에 대량으로 확보하기 어렵습니다. 미세포자충은 숙주 세포 내에서만 성장하고 증식합니다. 따라서 리보솜 정제를 위한 장내포자충 생체량을 얻기 위해 포유류 신장 세포주인 RK13에 장내포자충 포자를 감염시키고, 장내포자충이 충분히 성장하고 증식할 수 있도록 수주간 배양했습니다. 약 0.5제곱미터 크기의 감염 세포 단층을 이용하여 약 300mg의 미세포자충 포자를 정제하고 이를 이용하여 리보솜을 분리할 수 있었습니다. 정제된 포자를 유리 비드로 파쇄한 후, 용해물을 단계적으로 폴리에틸렌 글리콜로 분획하여 조 리보솜을 분리했습니다. 이를 통해 구조 분석을 위한 약 300 µg의 미처리 E. cuniculi 리보솜을 얻을 수 있었습니다.
그 후, 얻어진 리보솜 샘플을 이용하여 극저온 전자현미경(cryo-EM) 이미지를 수집하고, 대형 리보솜 소단위체, 소형 소단위체 머리 부분, 그리고 소형 소단위체에 해당하는 마스크를 사용하여 이 이미지들을 처리했습니다. 이 과정에서 약 108,000개의 리보솜 입자 이미지를 수집하고 2.7 Å 해상도의 cryo-EM 이미지를 계산했습니다(보충 그림 1-3). 그런 다음, cryo-EM 이미지를 사용하여 E. cuniculi 리보솜과 관련된 rRNA, 리보솜 단백질, 그리고 동면 인자 Mdf1을 모델링했습니다(그림 1a, b).
a. 동면 인자 Mdf1과 복합체를 이룬 E. cuniculi 리보솜 구조(pdb ID 7QEP). b. E. cuniculi 리보솜과 연관된 동면 인자 Mdf1의 위치 지도. c. 미포자충류에서 회수한 rRNA와 알려진 리보솜 구조를 비교한 2차 구조 지도. 각 패널은 증폭된 rRNA 단편(ES)과 해독 부위(DC), 사르시니신 루프(SRL), 펩티딜 전이효소 중심(PTC)을 포함한 리보솜 활성 부위의 위치를 ​​보여준다. d. E. cuniculi 리보솜의 펩티딜 전이효소 중심에 해당하는 전자 밀도는 이 촉매 부위가 E. cuniculi 기생충과 숙주(H. sapiens 포함)에서 동일한 구조를 가지고 있음을 시사한다. e, f 해독 중심의 해당 전자 밀도(e)와 해독 중심의 개략적인 구조(f)는 E. cuniculi가 다른 많은 진핵생물의 A1491(E. coli 번호 매기기 기준) 대신 U1491 잔기를 가지고 있음을 보여줍니다. 이러한 변화는 E. cuniculi가 이 활성 부위를 표적으로 하는 항생제에 민감할 수 있음을 시사합니다.
이전에 확립된 V. necatrix 및 P. locustae 리보솜 구조(두 구조 모두 동일한 미포자충과인 Nosematidae에 속하며 서로 매우 유사함)와는 대조적으로, 31,32 E. cuniculi 리보솜은 rRNA 및 단백질의 단편화 및 변성 과정을 다수 겪습니다(보충 그림 4-6). rRNA에서 가장 두드러진 변화는 증폭된 25S rRNA 단편 ES12L의 완전한 소실과 h39, h41, H18 나선의 부분적인 변성입니다(그림 1c, 보충 그림 4). 리보솜 단백질 중에서 가장 두드러진 변화는 eS30 단백질의 완전한 소실과 eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17, eS7 단백질의 단축입니다(보충 그림 4, 5).
따라서, 엔세팔로토존/오르도스포라 종의 게놈 크기가 극도로 감소한 것은 리보솜 구조에도 반영됩니다. E. cuniculi의 리보솜은 구조적 특성이 규명된 진핵세포 세포질 리보솜 중에서 단백질 함량이 가장 급격하게 감소했으며, 진핵생물뿐 아니라 생명체의 세 영역 모두에서 널리 보존되어 있는 rRNA 및 단백질 조각조차 존재하지 않습니다. E. cuniculi 리보솜 구조는 이러한 변화에 대한 최초의 분자 모델을 제공하며, 비교 유전체학 및 세포 내 생체 분자 구조 연구에서 간과되었던 진화적 사건들을 밝혀냅니다(보충 그림 7). 아래에서는 이러한 각 사건과 그 진화적 기원, 그리고 리보솜 기능에 미치는 잠재적 영향에 대해 설명합니다.
우리는 대규모 rRNA 절단 외에도 E. cuniculi 리보솜이 활성 부위 중 한 곳에서 rRNA 변이를 나타낸다는 것을 발견했습니다. E. cuniculi 리보솜의 펩티딜 전이효소 중심은 다른 진핵생물 리보솜과 동일한 구조를 가지고 있지만(그림 1d), 해독 중심은 1491번 뉴클레오티드(E. coli 번호 매기기 기준, 그림 1e, f)의 서열 변이로 인해 차이가 있습니다. 이 관찰은 중요한데, 진핵생물 리보솜의 해독 부위는 일반적으로 G1408과 A1491 잔기를 포함하는 반면, 세균형 리보솜은 A1408과 G1491 잔기를 포함하기 때문입니다. 이러한 변이는 세균과 진핵생물 리보솜이 아미노글리코사이드 계열의 리보솜 항생제 및 해독 부위를 표적으로 하는 다른 소분자 화합물에 대해 서로 다른 민감도를 보이는 근본적인 이유입니다. E. cuniculi 리보솜의 해독 부위에서 A1491 잔기가 U1491로 치환되어 이 활성 부위를 표적으로 하는 소분자에 대한 고유한 결합 인터페이스를 생성할 가능성이 있습니다. 동일한 A14901 변이체는 P. locustae 및 V. necatrix와 같은 다른 미세포자충류에서도 발견되어 미세포자충류 종들 사이에 널리 퍼져 있음을 시사합니다(그림 1f).
E. cuniculi 리보솜 샘플은 대사적으로 비활성인 포자에서 분리되었기 때문에, 스트레스 또는 기아 조건 하에서 이전에 보고된 리보솜 결합에 대해 E. cuniculi의 극저온 전자현미경(cryo-EM) 지도를 분석했습니다. 휴면 인자 31, 32, 36, 37, 38을 사용했습니다. 기존에 확립된 휴면 리보솜 구조를 E. cuniculi 리보솜의 cryo-EM 지도와 비교했습니다. 도킹을 위해 S. cerevisiae 리보솜은 휴면 인자 Stm138과 복합체를, 메뚜기 리보솜은 Lso232 인자와 복합체를, V. necatrix 리보솜은 Mdf1 및 Mdf231 인자와 복합체를 사용하여 사용했습니다. 동시에, 휴면 인자 Mdf1에 해당하는 cryo-EM 밀도를 확인했습니다. V. necatrix 리보솜에 Mdf1이 결합하는 것과 유사하게, Mdf1은 E. cuniculi 리보솜에도 결합하여 리보솜의 E 부위를 차단함으로써 기생충 포자가 체내 비활성화로 인해 대사적으로 비활성화될 때 리보솜을 사용할 수 있도록 돕는 것으로 추정된다(그림 2).
Mdf1은 리보솜의 E 부위를 차단하여 기생충 포자가 대사적으로 비활성화될 때 리보솜을 불활성화하는 데 도움을 주는 것으로 보입니다. E. cuniculi 리보솜 구조 분석에서, 우리는 Mdf1이 단백질 합성 과정에서 탈아세틸화된 tRNA의 방출을 촉진하는 리보솜의 L1 줄기 부분과 이전에 알려지지 않았던 접촉을 형성한다는 것을 발견했습니다. 이러한 접촉은 Mdf1이 탈아세틸화된 tRNA와 동일한 메커니즘을 사용하여 리보솜에서 분리된다는 것을 시사하며, 리보솜이 Mdf1을 제거하여 단백질 합성을 재활성화하는 방식에 대한 가능한 설명을 제공합니다.
그러나 우리의 구조 분석 결과, Mdf1과 L1 리보솜 다리(단백질 합성 과정에서 탈아실화된 tRNA를 리보솜에서 분리하는 데 도움을 주는 부분) 사이에 알려지지 않은 접촉 부위가 발견되었습니다. 특히, Mdf1은 탈아실화된 tRNA 분자의 팔꿈치 부분과 동일한 접촉 부위를 이용합니다(그림 2). 이전에는 알려지지 않았던 이 분자 모델링은 Mdf1이 탈아세틸화된 tRNA와 동일한 메커니즘을 사용하여 리보솜에서 분리된다는 것을 보여주며, 이는 리보솜이 단백질 합성을 재활성화하기 위해 이 휴면 인자를 제거하는 방식을 설명합니다.
rRNA 모델을 구축하는 과정에서 우리는 E. cuniculi 리보솜에 비정상적으로 접힌 rRNA 조각들이 존재함을 발견했으며, 이를 융합 rRNA라고 명명했습니다(그림 3). 생명체의 세 영역에 걸쳐 존재하는 리보솜에서 rRNA는 대부분의 염기가 서로 염기쌍을 이루어 접히거나 리보솜 단백질과 상호작용하는 구조로 접힙니다.38,39,40 그러나 E. cuniculi 리보솜에서는 rRNA가 일부 나선 구조를 펼쳐진 rRNA 영역으로 변환함으로써 이러한 접힘 원칙을 위반하는 것으로 보입니다.
S. cerevisiae, V. necatrix 및 E. cuniculi의 H18 25S rRNA 나선 구조. 일반적으로 세 가지 생명 영역에 걸쳐 있는 리보솜에서 이 연결 부위는 24~34개의 아미노산 잔기를 포함하는 RNA 나선으로 감겨 있습니다. 그러나 미세포자충류에서는 이 rRNA 연결 부위가 점차 축소되어 12개의 아미노산 잔기만 포함하는 두 개의 단일 가닥 유리딘이 풍부한 연결 부위로 나뉩니다. 이 아미노산 잔기 대부분은 용매에 노출되어 있습니다. 이 그림은 기생성 미세포자충류가 rRNA 접힘의 일반적인 원칙을 위반하는 것처럼 보인다는 것을 보여줍니다. 일반적인 rRNA 접힘에서 rRNA 염기는 다른 염기와 결합하거나 rRNA-단백질 상호작용에 관여합니다. 미세포자충류에서는 일부 rRNA 단편이 바람직하지 않은 접힘 구조를 가지는데, 이 경우 이전의 rRNA 나선은 거의 직선으로 늘어난 단일 가닥 단편이 됩니다. 이러한 특이한 영역의 존재는 미포자충 rRNA가 최소한의 RNA 염기쌍을 사용하여 멀리 떨어진 rRNA 조각과 결합할 수 있도록 합니다.
이러한 진화적 전환의 가장 두드러진 예는 H18 25S rRNA 나선에서 관찰할 수 있습니다(그림 3). 대장균에서 인간에 이르기까지 이 rRNA 나선의 염기는 24~32개의 뉴클레오티드로 구성되어 약간 불규칙한 나선 구조를 이룹니다. 이전에 확인된 V. necatrix와 P. locustae의 리보솜 구조31,32에서는 H18 나선의 염기가 부분적으로 풀려 있지만 뉴클레오티드 염기쌍은 유지됩니다. 그러나 E. cuniculi에서는 이 rRNA 단편이 가장 짧은 연결체인 228UUUGU232와 301UUUUUUUUU307이 됩니다. 일반적인 rRNA 단편과는 달리, 이 유리딘이 풍부한 연결체는 꼬이지 않거나 리보솜 단백질과 광범위하게 접촉하지 않습니다. 대신, 용매에 개방되어 있고 완전히 펼쳐진 구조를 가지며, 이 구조에서 rRNA 가닥은 거의 직선으로 뻗어 있습니다. 이러한 늘어난 형태는 E. cuniculi가 H16과 H18 rRNA 나선 사이의 33Å 간격을 채우는 데 단 12개의 RNA 염기만 사용하는 반면, 다른 종들은 이 간격을 채우는 데 최소 두 배 이상의 rRNA 염기가 필요한 이유를 설명합니다.
따라서 우리는 기생성 미세포자충이 에너지적으로 불리한 접힘을 통해 생명체의 세 영역에 걸쳐 광범위하게 보존되어 있는 rRNA 부분조차도 축소하는 전략을 개발했음을 입증할 수 있습니다. E. cuniculi는 rRNA 나선을 짧은 폴리-U 링커로 변형시키는 돌연변이를 축적함으로써, 원위 rRNA 단편의 연결에 필요한 최소한의 뉴클레오티드를 포함하는 특이한 rRNA 단편을 형성할 수 있습니다. 이는 미세포자충이 구조적, 기능적 완전성을 잃지 않고 기본적인 분자 구조를 극적으로 축소한 방법을 설명하는 데 도움이 됩니다.
E. cuniculi rRNA의 또 다른 특이한 특징은 두꺼워진 부분이 없는 rRNA의 출현입니다(그림 4). 돌출부는 염기쌍이 없는 뉴클레오티드로, RNA 나선 내부에 숨어 있는 대신 나선 밖으로 비틀어져 나옵니다. 대부분의 rRNA 돌출부는 분자 접착제 역할을 하여 인접한 리보솜 단백질이나 다른 rRNA 조각을 결합하는 데 도움을 줍니다. 일부 돌출부는 경첩 역할을 하여 rRNA 나선이 효율적으로 단백질 합성을 위해 최적으로 구부러지고 접힐 수 있도록 합니다. 41
a rRNA 돌출부(S. cerevisiae 번호 매기기 기준)는 E. cuniculi 리보솜 구조에는 없지만, 다른 대부분의 진핵생물에는 존재합니다. b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens 및 E. cuniculi의 내부 리보솜. 기생충은 고대부터 고도로 보존되어 온 rRNA 돌출부의 상당 부분을 결여하고 있습니다. 이러한 돌출부는 리보솜 구조를 안정화시키므로, 미세포자충에서 이러한 돌출부가 없다는 것은 미세포자충 기생충의 rRNA 접힘 안정성이 감소했음을 나타냅니다. P 줄기(세균의 L7/L12 줄기)와의 비교를 통해 rRNA 돌출부의 소실이 때때로 소실된 돌출부 옆에 새로운 돌출부가 나타나는 것과 일치함을 알 수 있습니다. 23S/28S rRNA의 H42 나선 구조에는 생명체의 세 가지 영역에서 보호되어 온 덕분에 최소 35억 년 전에 형성된 것으로 추정되는 고대 돌출부(사카로미세스 세레비지애의 U1206)가 있습니다. 미포자충류에서는 이 돌출부가 사라졌지만, 사라진 돌출부 옆에 새로운 돌출부(에피네프린 쿠니쿨리의 A1306)가 나타났습니다.
놀랍게도, 우리는 E. cuniculi 리보솜에서 다른 종에서 발견되는 대부분의 rRNA 돌출부가 결여되어 있음을 발견했는데, 여기에는 다른 진핵생물에서 보존된 30개 이상의 돌출부가 포함됩니다(그림 4a). 이러한 소실로 인해 리보솜 소단위와 인접한 rRNA 나선 사이의 접촉이 많이 사라지고, 때로는 리보솜 내부에 큰 빈 공간이 생겨 E. cuniculi 리보솜이 기존의 리보솜에 비해 더 다공성이 됩니다(그림 4b). 특히, 우리는 이러한 돌출부 대부분이 이전에 확인된 V. necatrix 및 P. locustae 리보솜 구조에서도 소실되었음을 발견했는데, 이는 이전의 구조 분석에서 간과되었던 부분입니다.31,32
때때로 rRNA 돌출부의 소실은 소실된 돌출부 옆에 새로운 돌출부의 형성을 동반합니다. 예를 들어, 리보솜 P-줄기에는 대장균에서 인간에 이르기까지 보존되어 온 U1208 돌출부(사카로미세스 세레비지애)가 있으며, 이는 약 35억 년 전에 형성된 것으로 추정됩니다. 단백질 합성 과정에서 이 돌출부는 P-줄기가 열린 형태와 닫힌 형태 사이를 이동할 수 있도록 도와 리보솜이 번역 인자를 모집하여 활성 부위로 전달할 수 있게 합니다. 대장균(E. cuniculi) 리보솜에는 이러한 두꺼워진 부분이 없지만, 단 세 개의 염기쌍에 위치한 새로운 두꺼워진 부분(G883)이 P-줄기의 최적 유연성을 회복하는 데 기여할 수 있습니다(그림 4c).
돌출부가 없는 rRNA에 대한 우리의 데이터는 rRNA 최소화가 리보솜 표면의 rRNA 요소 손실에만 국한되지 않고 리보솜 핵까지 포함할 수 있으며, 이는 자유 생활 세포에서는 관찰되지 않은 기생충 특이적인 분자적 결함을 생성할 수 있음을 시사합니다.
정규 리보솜 단백질과 rRNA를 모델링한 결과, 기존의 리보솜 구성 요소로는 극저온 전자현미경 이미지의 세 부분을 설명할 수 없다는 것을 발견했습니다. 이 조각들 중 두 개는 작은 분자 크기입니다(그림 5, 보충 그림 8). 첫 번째 부분은 리보솜 단백질 uL15와 eL18 사이에 위치하며, 일반적으로 eL18의 C-말단이 차지하는 위치에 있습니다. 이 C-말단은 E. cuniculi에서 단축되어 있습니다. 이 분자의 정체를 확인할 수는 없지만, 이 밀도 영역의 크기와 모양은 스페르미딘 분자의 존재로 잘 설명됩니다. 이 분자의 리보솜 결합은 uL15 단백질의 미포자충 특이적 돌연변이(Asp51 및 Arg56)에 의해 안정화되는데, 이 돌연변이는 uL15가 이 작은 분자를 리보솜 구조로 감싸도록 하여 리보솜과 이 작은 분자 사이의 친화도를 증가시키는 것으로 보입니다(보충 그림 2). 그림 8, 추가 데이터 1, 2).
극저온 전자현미경(Cryo-EM) 이미지는 E. cuniculi 리보솜에 결합된 리보스 외부에 존재하는 뉴클레오티드를 보여줍니다. E. cuniculi 리보솜에서 이 뉴클레오티드는 다른 대부분의 진핵생물 리보솜에서 25S rRNA A3186 뉴클레오티드(Saccharomyces cerevisiae 번호 기준)와 동일한 위치를 차지합니다. b E. cuniculi의 리보솜 구조에서 이 뉴클레오티드는 리보솜 단백질 uL9와 eL20 사이에 위치하여 두 단백질 사이의 접촉을 안정화합니다. cd 미포자충 종들 간의 eL20 서열 보존 분석. 미세포자충류 종의 계통수(c)와 eL20 단백질의 다중 서열 정렬(d)은 뉴클레오티드 결합 잔기 F170과 K172가 S. lophii를 제외한 대부분의 전형적인 미세포자충류에서 보존되어 있음을 보여줍니다. S. lophii는 ES39L rRNA 확장을 유지하고 있습니다. 이 그림은 뉴클레오티드 결합 잔기 F170과 K172가 고도로 축소된 미세포자충류 게놈의 eL20에만 존재하고 다른 진핵생물에는 존재하지 않음을 보여줍니다. 이러한 데이터는 미세포자충류 리보솜이 AMP 분자와 결합하여 리보솜 구조 내 단백질-단백질 상호작용을 안정화하는 데 사용하는 뉴클레오티드 결합 부위를 발달시켰음을 시사합니다. 미세포자충류에서 이 결합 부위의 높은 보존성과 다른 진핵생물에서의 부재는 이 부위가 미세포자충류에게 선택적 생존 이점을 제공할 수 있음을 시사합니다. 따라서, 미세포자충 리보솜의 뉴클레오티드 결합 포켓은 이전에 설명되었던 것처럼 퇴화된 특징이나 rRNA 분해의 최종 형태가 아니라, 미세포자충 리보솜이 작은 분자들을 직접 결합시켜 분자 구성 요소로 사용할 수 있게 해주는 유용한 진화적 혁신으로 보인다. 이 발견으로 미세포자충 리보솜은 단일 뉴클레오티드를 구조적 구성 요소로 사용하는 것으로 알려진 유일한 리보솜이 되었다. (그림은 뉴클레오티드 결합에서 파생된 가상의 진화 경로이다.)
두 번째 저분자량 밀도 영역은 리보솜 단백질 uL9와 eL30 사이의 경계면에 위치합니다(그림 5a). 이 경계면은 이전에 Saccharomyces cerevisiae 리보솜 구조에서 rRNA A3186(ES39L rRNA 확장 부분의 일부)의 25S 뉴클레오티드 결합 부위로 설명되었습니다.38 퇴화된 P. locustae ES39L 리보솜에서는 이 경계면에 알려지지 않은 단일 뉴클레오티드가 결합하는 것으로 나타났으며,31 이 뉴클레오티드는 rRNA의 최종 형태 중 길이가 약 130~230개 염기인 축소된 형태일 것으로 추정됩니다. ES39L은 단일 뉴클레오티드로 축소됩니다.32,43 우리의 극저온 전자현미경 이미지는 이 밀도 영역이 뉴클레오티드로 설명될 수 있다는 생각을 뒷받침합니다. 그러나 더 높은 해상도의 구조 분석 결과, 이 뉴클레오티드는 리보솜 외부에 존재하는 분자, 아마도 항균 펩타이드(AMP)일 가능성이 있음을 보여줍니다(그림 5a, b).
다음으로 우리는 뉴클레오티드 결합 부위가 E. cuniculi 리보솜에 새로 나타난 것인지, 아니면 이전에 존재했던 것인지를 조사했습니다. 뉴클레오티드 결합은 주로 eL30 리보솜 단백질의 Phe170 및 Lys172 잔기에 의해 매개되므로, 4396개의 대표적인 진핵생물에서 이들 잔기의 보존성을 평가했습니다. 앞서 언급한 uL15의 경우와 마찬가지로, Phe170 및 Lys172 잔기는 전형적인 미포자충류에서만 고도로 보존되어 있고, ES39L rRNA 단편이 환원되지 않은 비전형적인 미포자충류인 Mitosporidium 및 Amphiamblys를 포함한 다른 진핵생물에서는 존재하지 않는다는 것을 발견했습니다. 44, 45, 46 (그림 5c-e).
이러한 데이터들을 종합해 보면, E. cuniculi와 다른 전형적인 미세포자충류는 rRNA와 단백질 수준의 감소를 보완하기 위해 리보솜 구조 내에서 다량의 작은 대사산물을 효율적으로 포착하는 능력을 진화시켜 왔다는 가설을 뒷받침합니다. 이러한 과정을 통해 이들은 리보솜 외부에서 뉴클레오티드를 결합하는 독특한 능력을 개발했으며, 이는 기생 분자 구조가 풍부한 작은 대사산물을 포착하고 이를 분해된 RNA 및 단백질 조각의 구조적 모방체로 활용함으로써 보상 작용을 한다는 것을 보여줍니다.
극저온 전자현미경(cryo-EM) 지도의 세 번째 시뮬레이션되지 않은 부분은 큰 리보솜 소단위체에서 발견되었습니다. 이 지도의 비교적 높은 해상도(2.6 Å)는 이 밀도가 큰 측쇄 잔기의 독특한 조합을 가진 단백질에 속한다는 것을 시사하며, 이를 통해 우리는 이 밀도를 이전에 알려지지 않은 리보솜 단백질로 식별하고 msL2(Microsporidia-specific protein L2)로 명명했습니다(방법, 그림 6). 상동성 검색 결과 msL2는 Encephaliter 및 Orosporidium 속의 Microsporidia 계통군에서 보존되어 있지만 다른 Microsporidia를 포함한 다른 종에서는 존재하지 않는 것으로 나타났습니다. 리보솜 구조에서 msL2는 확장된 ES31L rRNA의 소실로 인해 형성된 빈 공간을 차지합니다. 이 빈 공간에서 msL2는 rRNA 접힘을 안정화하고 ES31L의 손실을 보완할 수 있습니다(그림 6).
a. E. cuniculi 리보솜에서 발견되는 미포자충 특이적 리보솜 단백질 msL2의 전자 밀도 및 모델. b. 사카로미세스 세레비지애의 80S 리보솜을 포함한 대부분의 진핵생물 리보솜은 대부분의 미포자충 종에서 ES19L rRNA 증폭이 소실되었다. 이전에 확립된 V. necatrix 미포자충 리보솜 구조는 이러한 기생충에서 ES19L의 소실이 새로운 msL1 리보솜 단백질의 진화로 보상된다는 것을 시사한다. 본 연구에서 우리는 E. cuniculi 리보솜 또한 ES19L의 소실을 보상하기 위해 추가적인 리보솜 RNA 모방 단백질을 발달시켰음을 발견했다. 그러나 msL2(현재 가상의 ECU06_1135 단백질로 주석됨)와 msL1은 구조적 및 진화적 기원이 다르다. 진화적으로 관련이 없는 msL1 및 msL2 리보솜 단백질의 생성에 대한 이번 발견은 리보솜의 rRNA에 유해한 돌연변이가 축적될 경우, 밀접하게 관련된 소수 종에서도 전례 없는 수준의 구성적 다양성을 달성할 수 있음을 시사합니다. 이 발견은 rRNA가 매우 축소되어 있고 종간에 단백질 구성에 비정상적인 변이가 있는 것으로 알려진 미토콘드리아 리보솜의 기원과 진화를 규명하는 데 도움이 될 수 있습니다.
우리는 msL2 단백질을 이전에 보고된 msL1 단백질(V. necatrix 리보솜에서 발견된 유일한 미포자충 특이적 리보솜 단백질)과 비교했습니다. msL1과 msL2가 진화적으로 관련이 있는지 확인하고자 했습니다. 분석 결과, msL1과 msL2는 리보솜 구조에서 동일한 공간을 차지하지만, 1차 및 3차 구조가 서로 다르다는 것을 알 수 있었으며, 이는 두 단백질이 독립적으로 진화했음을 시사합니다(그림 6). 따라서 msL2의 발견은 여러 종류의 진핵생물 종들이 rRNA 단편 손실을 보완하기 위해 구조적으로 구별되는 리보솜 단백질을 독립적으로 진화시킬 수 있다는 증거를 제공합니다. 이 발견은 대부분의 세포질 진핵생물 리보솜이 81개의 리보솜 단백질 패밀리를 포함하여 불변 단백질을 함유하고 있다는 점에서 주목할 만합니다. 확장된 rRNA 부분의 손실에 대한 반응으로 다양한 미포자충류 계통에서 msL1과 msL2가 나타나는 것은 기생충의 분자 구조의 퇴화가 기생충으로 하여금 보상적 돌연변이를 찾도록 유도하며, 이는 궁극적으로 다양한 기생충 개체군에서 해당 구조를 획득하게 할 수 있음을 시사합니다.
마지막으로, 모델 구축이 완료된 후, 우리는 E. cuniculi 리보솜의 구성과 게놈 서열로부터 예측된 구성을 비교했습니다. eL14, eL38, eL41, eS30을 포함한 여러 리보솜 단백질은 E. cuniculi 게놈에서 상동 단백질이 발견되지 않아 이전에는 E. cuniculi 게놈에 존재하지 않는 것으로 여겨졌습니다. 다른 고도로 축소된 세포내 기생충과 내공생체에서도 많은 리보솜 단백질의 소실이 예측됩니다. 예를 들어, 대부분의 자유생활 세균은 동일한 54개의 리보솜 단백질 패밀리를 가지고 있지만, 숙주에 기생하는 세균의 분석된 각 게놈에서 상동 단백질이 검출되는 단백질 패밀리는 이들 중 11개뿐입니다. 이러한 주장을 뒷받침하는 증거로, eL38과 eL41 단백질이 결핍된 V. necatrix와 P. locustae 미포자충에서 리보솜 단백질의 소실이 실험적으로 관찰되었습니다.
그러나 우리의 구조 분석 결과는 E. cuniculi 리보솜에서 실제로 소실된 것은 eL38, eL41, eS30뿐임을 보여줍니다. eL14 단백질은 보존되었으며, 우리의 구조 분석은 상동성 검색에서 이 단백질이 발견되지 않은 이유를 설명합니다(그림 7). E. cuniculi 리보솜에서는 rRNA에 의해 증폭된 ES39L의 분해로 인해 eL14 결합 부위의 대부분이 소실됩니다. ES39L이 없을 경우, eL14는 대부분의 2차 구조를 잃게 되며, E. cuniculi와 S. cerevisiae에서 eL14 서열의 18%만이 동일합니다. 이처럼 낮은 서열 보존율은 주목할 만한데, 15억 년의 시간 차이를 두고 진화한 Saccharomyces cerevisiae와 Homo sapiens조차도 eL14에서 51% 이상의 잔기를 공유하기 때문입니다. 이러한 비정상적인 보존 손실은 E. cuniculi eL14가 현재 eL1427 리보솜 단백질이 아닌 M970_061160 단백질로 주석 처리되는 이유를 설명합니다.
미포자충 리보솜은 ES39L rRNA 확장 부분을 잃어버렸고, 이로 인해 eL14 리보솜 단백질 결합 부위가 부분적으로 사라졌습니다. ES39L이 없으면 eL14 미포자 단백질은 이차 구조의 손실을 겪는데, 이전의 rRNA 결합 α-나선 구조가 최소 길이의 루프로 퇴화합니다. b 다중 서열 정렬 결과, eL14 단백질은 진핵생물에서는 높은 보존성을 보이지만(효모와 인간 동족체 간 서열 일치율 57%), 미포자충에서는 보존성이 낮고 다양합니다(미포자충에서는 eL14 동족체와 동일한 아미노산 잔기가 24%를 넘지 않습니다). 이러한 낮은 서열 보존성과 이차 구조의 다양성은 eL14 동족체가 E. cuniculi에서 발견되지 않은 이유와 이 단백질이 E. cuniculi에서 소실된 것으로 여겨지는 이유를 설명합니다. 반면, E. cuniculi eL14는 이전에 M970_061160 단백질로 추정되는 유전자로 주석이 달렸습니다. 이러한 관찰은 미세포자충의 게놈 다양성이 현재 과대평가되고 있음을 시사합니다. 현재 미세포자충에서 소실된 것으로 여겨지는 일부 유전자는 실제로 고도로 분화된 형태로 보존되어 있으며, 반대로 일부는 미세포자충 특이적 단백질을 코딩하는 것으로 생각되지만(예: 가상의 단백질 M970_061160은 실제로는 다른 진핵생물에서 발견되는 매우 다양한 단백질을 코딩함) 실제로는 다른 진핵생물에서 발견되는 매우 다양한 단백질을 코딩하는 것으로 추정됩니다.
이 연구 결과는 rRNA 변성이 인접한 리보솜 단백질의 서열 보존성을 극적으로 손실시켜 상동성 검색에서 해당 단백질을 검출할 수 없게 만들 수 있음을 시사합니다. 따라서, 소실된 것으로 생각되는 일부 단백질이 실제로는 매우 변형된 형태로 남아 있기 때문에, 우리는 작은 게놈을 가진 생물체에서 분자 분해의 실제 정도를 과대평가할 수 있습니다.
기생충은 극도로 축소된 유전체 환경에서도 어떻게 분자 기계의 기능을 유지할 수 있을까요? 본 연구는 가장 작은 진핵생물 유전체 중 하나를 가진 생물체인 E. cuniculi의 복잡한 분자 구조(리보솜)를 분석함으로써 이 질문에 대한 답을 제시합니다.
미생물 기생충의 단백질 및 RNA 분자는 품질 관리 센터가 부족하고, 자유 생활 미생물에 비해 크기가 50%로 축소되는 등 자유 생활 종의 상동 분자와 ​​종종 다르며, 접힘과 기능을 저해하는 여러 심각한 돌연변이가 존재한다는 사실은 거의 20년 전부터 알려져 왔습니다. 예를 들어, 많은 세포 내 기생충과 공생 미생물을 포함한 소형 게놈 유기체의 리보솜은 자유 생활 종에 비해 여러 리보솜 단백질이 부족하고 rRNA 뉴클레오티드의 최대 3분의 1이 부족할 것으로 예상됩니다. 27, 29, 30, 49 그러나 이러한 분자들이 기생충에서 어떻게 기능하는지는 여전히 대부분 미스터리로 남아 있으며, 주로 비교 유전체학을 통해 연구되고 있습니다.
본 연구는 거대 분자의 구조가 세포 내 기생충 및 기타 숙주 특이적 생물체의 전통적인 비교 유전체 연구에서는 파악하기 어려운 진화의 여러 측면을 드러낼 수 있음을 보여줍니다(보충 그림 7). 예를 들어, eL14 단백질의 사례는 기생종에서 분자 장치의 실제 퇴화 정도를 과대평가할 수 있음을 보여줍니다. 현재 뇌염 기생충은 수백 개의 미세포자충 특이적 유전자를 가지고 있는 것으로 알려져 있습니다. 그러나 본 연구 결과는 이러한 특이적 유전자 중 일부가 실제로는 다른 진핵생물에서 흔히 발견되는 유전자의 매우 다른 변형체에 불과함을 보여줍니다. 또한, msL2 단백질의 사례는 우리가 새로운 리보솜 단백질을 간과하고 기생 분자 기계의 구성 요소를 과소평가할 수 있음을 보여줍니다. 소분자의 사례는 기생충 분자 구조에서 새로운 생물학적 활성을 부여할 수 있는 가장 독창적인 혁신을 간과할 수 있음을 보여줍니다.
이러한 결과들을 종합해 보면, 숙주에 국한된 유기체와 자유생활을 하는 유기체의 분자 구조 차이에 대한 이해가 향상됩니다. 오랫동안 축소되고 퇴화하며 다양한 기능 저하 돌연변이에 취약하다고 여겨졌던 분자 기계들이 사실은 체계적으로 간과되어 온 특이한 구조적 특징들을 가지고 있음을 보여줍니다.
반면에, 우리가 E. cuniculi의 리보솜에서 발견한 부피가 작은 rRNA 조각과 융합된 조각들은 게놈 축소가 거의 35억 년에 걸친 종의 독립적인 진화 이후에도 생명의 세 영역에서 보존되어 온 기본적인 분자 기계의 일부조차도 변화시킬 수 있음을 시사합니다.
E. cuniculi 리보솜에서 발견되는 돌출부가 없는 융합 rRNA 단편은 내공생 세균의 RNA 분자에 대한 이전 연구들을 고려할 때 특히 흥미롭습니다. 예를 들어, 진딧물 내공생균인 Buchnera aphidicola에서는 rRNA와 tRNA 분자가 A+T 조성 편향과 비정규 염기쌍의 높은 비율로 인해 온도에 민감한 구조를 갖는 것으로 나타났습니다.20,50 이러한 RNA의 변화뿐만 아니라 단백질 분자의 변화도 내공생균이 파트너에 과도하게 의존하고 열을 전달할 수 없는 원인으로 여겨지고 있습니다.21, 23 기생성 미포자충의 rRNA는 구조적으로 뚜렷한 변화를 보이지만, 이러한 변화의 특성은 열 안정성 감소와 샤페론 단백질에 대한 높은 의존성이 게놈 크기가 축소된 유기체의 RNA 분자에서 공통적으로 나타나는 특징일 수 있음을 시사합니다.
한편, 우리의 구조 분석 결과는 기생 미생물인 미세포자충이 광범위하게 보존된 rRNA 및 단백질 조각에 저항하는 독특한 능력을 진화시켜, 풍부하고 쉽게 구할 수 있는 작은 대사산물을 퇴화된 rRNA 및 단백질 조각의 구조적 모방체로 활용하는 능력을 개발했음을 보여줍니다. 분자 구조 분해. 이러한 견해는 E. cuniculi의 rRNA와 리보솜에서 단백질 조각 손실을 보상하는 작은 분자들이 uL15 및 eL30 단백질의 미세포자충 특이적 잔기에 결합한다는 사실에 의해 뒷받침됩니다. 이는 작은 분자가 리보솜에 결합하는 것이 양성 선택의 결과일 수 있음을 시사합니다. 즉, 리보솜 단백질에서 미세포자충 특이적 돌연변이가 리보솜과 작은 분자 사이의 친화도를 증가시키는 능력에 대해 선택되어, 더 효율적인 리보솜 유기체로 이어졌을 수 있다는 것입니다. 이 발견은 미생물 기생충의 분자 구조에서 뛰어난 혁신을 보여주고, 환원 진화에도 불구하고 기생충 분자 구조가 어떻게 기능을 유지하는지에 대한 더 나은 이해를 제공합니다.
현재 이러한 소분자들의 정확한 정체는 불분명합니다. 리보솜 구조에서 이러한 소분자들이 나타나는 양상이 미포자충 종마다 다른 이유도 명확하지 않습니다. 특히, V. necatrix의 eL20 및 K172 단백질에 F170 잔기가 존재함에도 불구하고, E. cuniculi와 P. locustae의 리보솜에서는 뉴클레오티드 결합이 관찰되는 반면, V. necatrix의 리보솜에서는 관찰되지 않는 이유가 불분명합니다. 이러한 결실은 V. necatrix에서는 티로신인 uL6의 43번 잔기(뉴클레오티드 결합 포켓에 인접)가 E. cuniculi와 P. locustae에서는 트레오닌이 아니기 때문에 발생했을 가능성이 있습니다. Tyr43의 부피가 큰 방향족 측쇄는 입체적 중첩으로 인해 뉴클레오티드 결합을 방해할 수 있습니다. 또는, 극저온 전자현미경 영상의 해상도가 낮아 V. necatrix 리보솜 단편 모델링이 어렵기 때문에 뉴클레오티드 결실이 나타난 것일 수도 있습니다.
한편, 우리의 연구는 게놈 퇴화 과정이 오히려 창의적인 원동력이 될 수 있음을 시사합니다. 특히, E. cuniculi 리보솜의 구조는 미세포자충 리보솜에서 rRNA와 단백질 조각이 소실되는 것이 리보솜 구조 변화를 촉진하는 진화적 압력을 발생시킨다는 것을 보여줍니다. 이러한 변형은 리보솜 활성 부위에서 멀리 떨어진 곳에서 발생하며, rRNA 감소로 인해 파괴될 수 있는 최적의 리보솜 조립을 유지(또는 복원)하는 데 도움을 주는 것으로 보입니다. 이는 미세포자충 리보솜의 주요 혁신이 유전자 변이를 완충하기 위한 필요성에서 진화해 온 것임을 시사합니다.
아마도 이는 다른 생물체에서는 아직 관찰되지 않은 뉴클레오티드 결합을 통해 가장 잘 설명될 수 있을 것입니다. 전형적인 미세포자충에는 뉴클레오티드 결합 잔기가 존재하지만 다른 진핵생물에는 존재하지 않는다는 사실은 뉴클레오티드 결합 부위가 단순히 사라지기를 기다리는 유물이나 rRNA가 개별 뉴클레오티드 형태로 복원되는 최종 부위가 아님을 시사합니다. 오히려 이 부위는 여러 차례의 양성 선택을 거쳐 진화했을 가능성이 있는 유용한 특징으로 보입니다. 뉴클레오티드 결합 부위는 자연 선택의 부산물일 수 있습니다. ES39L이 분해되면 미세포자충은 ES39L이 없는 상태에서 최적의 리보솜 생합성을 복원하기 위한 보상 기제를 찾아야 합니다. 이 뉴클레오티드는 ES39L의 A3186 뉴클레오티드의 분자 접촉을 모방할 수 있으므로, 이 뉴클레오티드 분자는 리보솜의 구성 요소가 되며, eL30 서열의 돌연변이에 의해 결합력이 더욱 향상됩니다.
세포 내 기생충의 분자 진화와 관련하여, 본 연구는 다윈의 자연 선택과 유전체 퇴화에 의한 유전적 부동이라는 힘이 병렬적으로 작용하는 것이 아니라 진동적으로 작용한다는 것을 보여줍니다. 먼저, 유전적 부동은 생체 분자의 중요한 특징들을 제거하므로, 이에 대한 보상이 절실히 필요합니다. 기생충이 다윈의 자연 선택을 통해 이러한 보상을 얻을 때 비로소 그들의 거대 분자는 가장 인상적이고 혁신적인 특성을 발달시킬 기회를 갖게 됩니다. 특히, E. cuniculi 리보솜의 뉴클레오티드 결합 부위 진화는 이러한 손실-획득 패턴의 분자 진화가 해로운 돌연변이를 상쇄할 뿐만 아니라 때로는 기생 거대 분자에 완전히 새로운 기능을 부여한다는 것을 시사합니다.
이러한 아이디어는 엄격한 자연 선택 시스템이 유기체의 혁신 능력을 제한한다는 Sewell Wright의 이동 평형 이론과 일치합니다.51,52,53 그러나 유전적 부동이 자연 선택을 방해하는 경우, 이러한 부동은 그 자체로는 적응적이지 않거나 심지어 해로운 변화를 일으킬 수 있지만, 더 높은 적합성이나 새로운 생물학적 활성을 제공하는 추가적인 변화로 이어질 수 있습니다. 우리의 프레임워크는 생체 분자의 접힘과 기능을 감소시키는 동일한 유형의 돌연변이가 그 개선의 주요 촉발 요인으로 작용하는 것을 보여줌으로써 이러한 아이디어를 뒷받침합니다. 상호 이익이 되는 진화 모델에 따라, 우리의 연구는 전통적으로 퇴행성 과정으로 여겨져 온 게놈 퇴화가 혁신의 주요 동인이기도 하며, 때로는 그리고 어쩌면 자주 거대 분자가 새로운 기생 활성을 획득할 수 있도록 한다는 것을 보여줍니다.