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미생물 기생충의 진화는 기생충의 진화를 촉진하는 자연선택과 기생충의 유전자 손실을 유발하고 유해한 돌연변이를 축적하는 유전적 부동 사이의 반작용을 수반합니다. 본 연구에서는 이러한 반작용이 단일 거대분자 규모에서 어떻게 발생하는지 이해하기 위해, 자연계에서 가장 작은 유전체 중 하나를 가진 진핵생물인 Encephalitozoon cuniculi의 리보솜의 극저온 전자현미경(cryo-EM) 구조를 기술합니다. E. cuniculi 리보솜에서 rRNA의 극심한 감소는 이전에 알려지지 않았던 융합된 rRNA 링커와 돌출부가 없는 rRNA의 진화와 같은 전례 없는 구조적 변화를 동반합니다. 또한, E. cuniculi 리보솜은 분해된 rRNA 조각과 단백질의 구조적 모방체로 소분자를 사용하는 능력을 발달시킴으로써 rRNA 조각과 단백질의 손실에도 불구하고 생존했습니다. 전반적으로, 우리는 오랫동안 감소하고, 퇴화되고, 약화시키는 돌연변이를 겪는다고 여겨졌던 분자 구조가 극심한 분자 수축에도 불구하고 그 구조를 활성 상태로 유지하는 여러 가지 보상 메커니즘을 가지고 있음을 보여줍니다.
대부분의 미생물 기생충 집단은 숙주를 이용하는 고유한 분자적 도구를 가지고 있기 때문에, 우리는 종종 각 기생충 집단에 대해 서로 다른 치료법을 개발해야 합니다.1,2 그러나 새로운 증거는 기생충 진화의 일부 측면이 수렴적이고 대체로 예측 가능하다는 것을 시사하며, 이는 미생물 기생충에 대한 광범위한 치료적 개입의 잠재적 기반을 시사합니다.3,4,5,6,7,8,9
이전 연구에서는 미생물 기생충에서 유전체 감소 또는 유전체 붕괴라고 불리는 공통적인 진화적 경향을 확인했습니다.10,11,12,13. 최근 연구에 따르면 미생물이 자유생활을 포기하고 세포 내 기생충(또는 세포 내 공생체)이 되면 유전체는 수백만 년에 걸쳐 느리지만 놀라운 변태를 겪습니다.9,11. 유전체 붕괴라고 알려진 과정에서 미생물 기생충은 유해한 돌연변이를 축적하여 이전에 중요했던 많은 유전자를 유사유전자로 전환시키고, 이는 점진적인 유전자 손실과 돌연변이 붕괴로 이어집니다.14,15. 이러한 붕괴는 가까운 자유생활 종에 비해 가장 오래된 세포 내 생물의 유전자를 최대 95%까지 파괴할 수 있습니다. 따라서 세포 내 기생충의 진화는 두 가지 상반된 힘 사이의 줄다리기입니다. 기생충의 개량으로 이어지는 다윈의 자연선택과 기생충을 멸종으로 이끄는 유전체의 붕괴입니다. 기생충이 어떻게 이런 줄다리기에서 벗어나 분자 구조의 활동을 유지할 수 있었는지는 아직 불분명하다.
게놈 붕괴의 메커니즘은 완전히 밝혀지지 않았지만, 주로 빈번한 유전자 부동(genetic drift)으로 인해 발생하는 것으로 보입니다. 기생충은 작고 무성생식이며 유전적으로 제한된 개체군에 서식하기 때문에 DNA 복제 과정에서 발생하는 유해한 돌연변이를 효과적으로 제거할 수 없습니다. 이로 인해 유해한 돌연변이가 비가역적으로 축적되고 기생충 게놈이 감소합니다. 결과적으로 기생충은 세포 내 환경에서 생존에 더 이상 필요하지 않은 유전자를 잃을 뿐만 아니라, 기생충 개체군이 산발적인 유해한 돌연변이를 효과적으로 제거할 수 없기 때문에 이러한 돌연변이가 가장 중요한 유전자를 포함한 게놈 전체에 축적됩니다.
유전체 감소에 대한 현재 우리의 이해는 대부분 유전체 서열 비교에만 기반하며, 하우스키핑 기능을 수행하고 잠재적인 약물 표적으로 작용하는 실제 분자의 변화에는 크게 주목하지 않습니다. 비교 연구에 따르면, 유해한 세포 내 미생물 돌연변이는 단백질과 핵산을 잘못 접히고 응집시키는 경향이 있어, 샤페론 의존성을 높이고 열에 과민하게 반응하게 만드는 것으로 나타났습니다.19,20,21,22,23 또한, 때로는 최대 25억 년의 시간 차이를 두고 독립적으로 진화한 다양한 기생충은 단백질 합성5,6과 DNA 복구 메커니즘24에서 유사한 품질 관리 센터 손실을 경험했습니다. 그러나 세포 내 생활 방식이 세포 거대분자의 다른 모든 특성, 특히 증가하는 유해 돌연변이 부담에 대한 분자적 적응에 미치는 영향에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다.
본 연구에서는 세포 내 미생물의 단백질과 핵산 진화를 더 잘 이해하기 위해 세포 내 기생충인 Encephalitozoon cuniculi의 리보솜 구조를 규명했습니다. E. cuniculi는 기생성 미포자충류(microsporidia)에 속하는 균류 유사 생물로, 진핵생물 유전체 크기가 매우 작아 유전체 붕괴 연구의 모델 생물로 사용됩니다. 최근, 미포자충류(Microsporidia), Paranosema locustae, Vairimorpha necatrix의 유전체 크기(약 3.2 Mb)가 저온 전자 현미경(cryo-EM)으로 리보솜 구조가 규명되었습니다. 이러한 구조는 rRNA 증폭 손실이 이웃 리보솜 단백질 간의 새로운 접촉이나 새로운 msL131,32 리보솜 단백질의 획득을 통해 일부 상쇄됨을 시사합니다. Encephalitozoon(게놈 약 250만 bp)과 가장 가까운 친척인 Ordospora는 진핵생물에서 극한의 유전체 감소를 ​​보입니다. 이들은 단백질 암호화 유전자가 2,000개 미만이며, 이들의 리보솜에는 rRNA 확장 단편(진핵생물과 세균 리보솜을 구분하는 rRNA 단편)이 없을 뿐만 아니라, E. cuniculi 유전체에 상동 단백질이 없기 때문에 네 개의 리보솜 단백질을 가지고 있을 것으로 예상됩니다.26,27,28 따라서, 본 연구에서는 E. cuniculi 리보솜이 유전체 붕괴에 대한 분자적 적응을 위한 이전에는 알려지지 않았던 전략을 제시할 수 있다고 결론지었습니다.
본 연구의 극저온 전자현미경(cryo-EM) 구조는 진핵생물의 세포질 리보솜 중 가장 작은 크기를 나타내며, 유전체 감소의 궁극적인 정도가 세포에 필수적인 분자 기계의 구조, 조립, 그리고 진화에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 통찰력을 제공합니다. E. cuniculi 리보솜이 널리 알려진 RNA 접힘 및 리보솜 조립 원리 중 많은 부분을 위반한다는 사실을 발견했으며, 이전에는 알려지지 않았던 새로운 리보솜 단백질을 발견했습니다. 예상치 못하게도, 미포자충 리보솜이 소분자를 결합하는 능력을 진화시켰음을 보여주었으며, rRNA와 단백질의 절단이 리보솜에 궁극적으로 유용한 특성을 부여할 수 있는 진화적 혁신을 촉발할 것이라는 가설을 세웠습니다.
세포 내 생물체에서 단백질과 핵산의 진화에 대한 이해를 높이기 위해, 감염된 포유류 세포 배양액에서 E. cuniculi 포자를 분리하여 리보솜을 정제하고 구조를 규명하기로 했습니다. 기생성 미포자충은 영양 배지에서 배양할 수 없기 때문에 대량의 미포자충을 얻는 것은 어렵습니다. 미포자충은 숙주 세포 내에서만 생장하고 번식합니다. 따라서 리보솜 정제를 위한 E. cuniculi 바이오매스를 얻기 위해, 포유류 신장 세포주 RK13에 E. cuniculi 포자를 감염시키고, 감염된 세포를 수주 동안 배양하여 E. cuniculi가 생장하고 증식하도록 했습니다. 약 0.5제곱미터 크기의 감염된 세포 단층을 사용하여 약 300mg의 미포자충 포자를 정제하고, 이를 이용하여 리보솜을 분리했습니다. 그런 다음 정제된 포자를 유리 비드로 파쇄하고, 용해물의 단계적 폴리에틸렌 글리콜 분획법을 사용하여 조 리보솜을 분리했습니다. 이를 통해 구조 분석을 위해 약 300µg의 E. cuniculi 리보솜을 얻을 수 있었습니다.
그 후, 생성된 리보솜 샘플을 이용하여 극저온 전자현미경(cryo-EM) 이미지를 수집하고, 큰 리보솜 소단위체, 작은 소단위체 머리, 그리고 작은 소단위체에 해당하는 마스크를 사용하여 이미지를 처리했습니다. 이 과정에서 약 108,000개의 리보솜 입자 이미지를 수집하고 2.7 Å의 해상도로 극저온 전자현미경 이미지를 계산했습니다(보충 그림 1-3). 그런 다음, 극저온 전자현미경 이미지를 이용하여 E. cuniculi 리보솜과 관련된 rRNA, 리보솜 단백질, 그리고 동면 인자 Mdf1을 모델링했습니다(그림 1a, b).
a 동면 인자 Mdf1과 복합체를 이루는 E. cuniculi 리보솜의 구조(pdb id 7QEP). b E. cuniculi 리보솜과 연관된 동면 인자 Mdf1의 지도. c 미포자충류에서 회수된 rRNA를 알려진 리보솜 구조와 비교한 이차 구조 지도. 패널은 증폭된 rRNA 단편(ES)과 해독 부위(DC), 사르시니신 루프(SRL), 펩티딜 전이효소 중심(PTC)을 포함한 리보솜 활성 부위의 위치를 ​​보여줍니다. d E. cuniculi 리보솜의 펩티딜 전이효소 중심에 해당하는 전자 밀도는 이 촉매 부위가 E. cuniculi 기생충과 H. sapiens를 포함한 숙주에서 동일한 구조를 가지고 있음을 시사합니다. e, f 디코딩 센터(e)의 해당 전자 밀도와 디코딩 센터(f)의 도식적 구조는 E. cuniculi가 다른 많은 진핵생물에서 A1491(대장균 번호 매기기) 대신 U1491 잔기를 가지고 있음을 시사합니다. 이러한 변화는 E. cuniculi가 이 활성 부위를 표적으로 하는 항생제에 민감할 수 있음을 시사합니다.
이전에 확립된 V. necatrix 및 P. locustae 리보솜의 구조(두 구조 모두 동일한 미포자충류과 Nosematidae를 나타내며 서로 매우 유사함)와 대조적으로, 31,32 E. cuniculi 리보솜은 rRNA 및 단백질 단편화의 수많은 과정을 거칩니다.추가 변성(보충 그림 4-6). rRNA에서 가장 두드러진 변화에는 증폭된 25S rRNA 단편 ES12L의 완전한 손실과 h39, h41 및 H18 나선의 부분적 변성이 포함되었습니다(그림 1c, 보충 그림 4). 리보솜 단백질 중에서 가장 두드러진 변화에는 eS30 단백질의 완전한 손실과 eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 및 eS7 단백질의 단축이 포함되었습니다(보충 그림 4, 5).
따라서 Encephalotozoon/Ordospora 종의 유전체가 극심하게 감소한 것은 리보솜 구조에 반영됩니다. E. cuniculi 리보솜은 구조적 특성 분석이 필요한 진핵생물의 세포질 리보솜에서 가장 극적인 단백질 함량 손실을 경험하며, 진핵생물뿐만 아니라 생명의 세 영역에서 널리 보존되는 rRNA와 단백질 단편조차 가지고 있지 않습니다. E. cuniculi 리보솜의 구조는 이러한 변화에 대한 최초의 분자 모델을 제공하며, 비교 유전체학과 세포 내 생체 분자 구조 연구에서 간과되었던 진화적 사건들을 드러냅니다(보충 그림 7). 아래에서는 이러한 각 사건과 그 진화적 기원, 그리고 리보솜 기능에 미치는 잠재적 영향에 대해 설명합니다.
그 후, 우리는 큰 rRNA 절단 외에도 E. cuniculi 리보솜의 활성 부위 중 하나에서 rRNA 변이가 있음을 발견했습니다. E. cuniculi 리보솜의 펩티딜 전이효소 중심은 다른 진핵생물 리보솜과 동일한 구조를 가지고 있지만(그림 1d), 해독 중심은 뉴클레오타이드 1491의 서열 변이로 인해 다릅니다(E. coli 번호 매기기, 그림 1e, f). 이 관찰은 진핵생물 리보솜의 해독 부위가 일반적으로 G1408과 A1491 잔기를 포함하는 반면, 박테리아 유형의 잔기 A1408과 G1491은 포함하기 때문에 중요합니다. 이러한 변이는 해독 부위를 표적으로 하는 리보솜 항생제의 아미노글리코사이드 계열 및 기타 소분자에 대한 박테리아 및 진핵생물 리보솜의 민감도 차이를 뒷받침합니다. E. cuniculi 리보솜의 해독 부위에서 A1491 잔기가 U1491로 치환되어 이 활성 부위를 표적으로 하는 소분자를 위한 독특한 결합 계면을 형성할 가능성이 있습니다. 동일한 A14901 변이체는 P. locustae와 V. necatrix와 같은 다른 미포자충류에서도 발견되는데, 이는 미포자충류 종에 널리 분포되어 있음을 시사합니다(그림 1f).
E. cuniculi 리보솜 시료는 대사적으로 비활성인 포자에서 분리되었기 때문에, 스트레스 또는 기아 조건에서 이전에 보고된 E. cuniculi의 극저온 전자현미경(cryo-EM) 지도를 이용하여 리보솜 결합을 분석했습니다. 동면 인자 31, 32, 36, 37, 38. 동면 리보솜의 기존 구조와 E. cuniculi 리보솜의 극저온 전자현미경 지도를 비교했습니다. 도킹을 위해, S. cerevisiae 리보솜은 동면 인자 Stm138과, 로커스트 리보솜은 Lso232와, V. necatrix 리보솜은 Mdf1 및 Mdf231과 복합체를 이루도록 사용했습니다. 동시에, 휴지 인자 Mdf1에 상응하는 극저온 전자현미경 밀도를 확인했습니다. Mdf1이 V. necatrix 리보솜에 결합하는 것과 유사하게 Mdf1은 E. cuniculi 리보솜에도 결합하여 리보솜의 E 부위를 차단하여 기생충 포자가 신체 불활성화로 인해 대사적으로 불활성화될 때 리보솜을 사용할 수 있도록 돕는 것으로 추정됩니다(그림 2).
Mdf1은 리보솜의 E 부위를 차단하는데, 이는 기생충 포자가 대사적으로 불활성화될 때 리보솜을 불활성화하는 데 도움을 주는 것으로 보입니다. E. cuniculi 리보솜의 구조에서, Mdf1이 단백질 합성 과정에서 리보솜으로부터 탈아실화된 tRNA의 방출을 촉진하는 리보솜의 일부인 L1 리보솜 줄기와 이전에 알려지지 않은 접촉을 형성한다는 것을 발견했습니다. 이러한 접촉은 Mdf1이 탈아세틸화된 tRNA와 동일한 메커니즘을 사용하여 리보솜에서 분리됨을 시사하며, 이는 리보솜이 Mdf1을 제거하여 단백질 합성을 재활성화하는 방식에 대한 가능한 설명을 제공합니다.
그러나 본 연구에서는 Mdf1과 L1 리보솜 다리(단백질 합성 과정에서 탈아실화된 tRNA를 리보솜에서 방출하는 데 도움을 주는 리보솜 부분) 사이에 미지의 접촉이 존재한다는 것을 밝혀냈습니다. 특히, Mdf1은 탈아실화된 tRNA 분자의 엘보우 부분과 동일한 접촉을 사용합니다(그림 2). 이전에 알려지지 않았던 이 분자 모델링은 Mdf1이 탈아세틸화된 tRNA와 동일한 메커니즘을 사용하여 리보솜에서 분리됨을 보여주었으며, 이는 리보솜이 이 동면 인자를 제거하여 단백질 합성을 재활성화하는 방식을 설명합니다.
rRNA 모델을 구축하는 과정에서, E. cuniculi 리보솜에 비정상적으로 접힌 rRNA 단편이 존재함을 발견했는데, 이를 융합 rRNA(fused rRNA)라고 명명했습니다(그림 3). 생명체의 세 영역에 걸쳐 있는 리보솜에서 rRNA는 대부분의 rRNA 염기가 서로 염기쌍을 이루어 접히거나 리보솜 단백질과 상호작용하는 구조로 접힙니다.38,39,40 그러나 E. cuniculi 리보솜에서는 rRNA가 나선 구조의 일부를 접히지 않은 rRNA 영역으로 전환함으로써 이러한 접힘 원리를 위반하는 것으로 보입니다.
S. cerevisiae, V. necatrix, E. cuniculi의 H18 25S rRNA 나선 구조. 일반적으로 세 가지 생명 영역을 아우르는 리보솜에서 이 링커는 24~34개의 잔기를 포함하는 RNA 나선으로 감겨 있습니다. 이와 대조적으로 미포자충(Microsporidia)에서는 이 rRNA 링커가 점차 줄어들어 12개의 잔기만 포함하는 두 개의 단일 가닥 유리딘 풍부 링커로 변합니다. 이러한 잔기의 대부분은 용매에 노출됩니다. 이 그림은 기생성 미포자충이 rRNA 염기가 일반적으로 다른 염기와 결합하거나 rRNA-단백질 상호작용에 관여하는 rRNA 접힘의 일반적인 원리를 위반하는 것으로 보임을 보여줍니다. 미포자충에서 일부 rRNA 단편은 불리한 접힘을 보이는데, 이 경우 이전 rRNA 나선은 거의 직선으로 길어진 단일 가닥 단편이 됩니다. 이러한 특이한 영역의 존재로 인해 미포자충 rRNA는 최소한의 RNA 염기를 사용하여 멀리 떨어진 rRNA 조각에 결합할 수 있습니다.
이러한 진화적 전이의 가장 두드러진 예는 H18 25S rRNA 나선에서 관찰할 수 있습니다(그림 3). 대장균에서 인간에 이르기까지, 이 rRNA 나선의 염기는 24~32개의 뉴클레오타이드를 포함하고 있어 약간 불규칙한 나선을 형성합니다. 이전에 확인된 V. necatrix와 P. locustae의 리보솜 구조31,32에서는 H18 나선의 염기가 부분적으로 풀려 있지만, 뉴클레오타이드 염기쌍은 보존되어 있습니다. 그러나 E. cuniculi에서는 이 rRNA 단편이 가장 짧은 링커인 228UUUGU232와 301UUUUUUUU307이 됩니다. 일반적인 rRNA 단편과 달리, 이 유리딘이 풍부한 링커는 꼬이거나 리보솜 단백질과 광범위하게 접촉하지 않습니다. 대신, rRNA 가닥이 거의 직선으로 뻗어 있는 용매 개방형 및 완전히 펼쳐진 구조를 취합니다. 이렇게 늘어난 구조는 E. cuniculi가 H16과 H18 rRNA 나선 사이의 33Å 간격을 채우는 데 단 12개의 RNA 염기만 사용하는 반면, 다른 종은 이 간격을 채우는 데 최소한 두 배 더 많은 rRNA 염기가 필요하다는 것을 설명합니다.
따라서 기생성 미포자충은 에너지적으로 불리한 접힘을 통해 생명의 세 영역에서 종 간에 광범위하게 보존되어 있는 rRNA 분절까지도 수축시키는 전략을 개발했음을 입증할 수 있습니다. E. cuniculi는 rRNA 나선을 짧은 폴리-U 링커로 변형시키는 돌연변이를 축적함으로써, 먼쪽 rRNA 분절의 연결을 위해 가능한 한 적은 뉴클레오타이드를 포함하는 특이한 rRNA 분절을 형성할 수 있는 것으로 보입니다. 이는 미포자충이 구조적 및 기능적 온전성을 잃지 않으면서도 기본적인 분자 구조를 극적으로 감소시킨 이유를 설명하는 데 도움이 됩니다.
E. cuniculi rRNA의 또 다른 특이한 특징은 두꺼워지지 않은 rRNA의 모습(그림 4)입니다. 돌출부는 염기쌍이 없는 뉴클레오타이드로, RNA 나선 안에 숨어 있는 대신 나선 밖으로 튀어나옵니다. 대부분의 rRNA 돌출부는 분자 접착제 역할을 하여 인접한 리보솜 단백질이나 다른 rRNA 단편을 결합하는 데 도움을 줍니다. 일부 돌출부는 경첩 역할을 하여 rRNA 나선이 최적의 상태로 구부러지고 접혀 생산적인 단백질 합성을 가능하게 합니다.
a rRNA 돌출부(S. cerevisiae 번호 매기기)는 E. cuniculi 리보솜 구조에는 없지만, 다른 대부분의 진핵생물에는 존재합니다. b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens, 그리고 E. cuniculi의 내부 리보솜. 기생충은 고대의 고도로 보존된 rRNA 돌출부가 많이 없습니다. 이러한 두꺼워진 부분은 리보솜 구조를 안정화시킵니다. 따라서 미포자충류에서 이러한 돌출부가 없다는 것은 미포자충류 기생충의 rRNA 접힘 안정성이 감소했음을 나타냅니다. P 줄기(박테리아의 L7/L12 줄기)와 비교했을 때, rRNA 돌출부의 소실과 함께 새로운 돌출부가 나타나는 경우가 있음을 보여줍니다. 23S/28S rRNA의 H42 나선에는 세 가지 생명 영역을 보호하는 역할을 하는 것으로 추정되는 최소 35억 년 전의 오래된 돌출부(Saccharomyces cerevisiae의 U1206)가 있습니다. 미포자충(microsporidia)에서는 이 돌출부가 제거됩니다. 그러나 사라진 돌출부(E. cuniculi의 A1306) 옆에 새로운 돌출부가 나타났습니다.
놀랍게도, E. cuniculi 리보솜에는 다른 종에서 발견되는 rRNA 돌출부(bulge)의 대부분이 존재하지 않으며, 여기에는 다른 진핵생물에 보존된 30개 이상의 돌출부도 포함됩니다(그림 4a). 이러한 손실은 리보솜 소단위체와 인접한 rRNA 나선 사이의 많은 접촉을 없애고, 때로는 리보솜 내에 크고 빈 공간을 만들어 E. cuniculi 리보솜을 전통적인 리보솜에 비해 더 다공성으로 만듭니다(그림 4b). 주목할 점은 이러한 돌출부의 대부분이 이전에 확인된 V. necatrix와 P. locustae 리보솜 구조에서도 사라졌다는 것입니다. 이는 이전 구조 분석에서는 간과되었던 부분입니다31,32.
때때로 rRNA 돌출부의 소실은 소실된 돌출부 옆에 새로운 돌출부의 발생을 동반합니다. 예를 들어, 리보솜 P-스템에는 대장균에서 인간까지 생존한 U1208 돌출부(사카로미세스 세레비시아에 존재)가 있으며, 따라서 이 돌출부의 나이는 35억 년으로 추정됩니다. 단백질 합성 과정에서 이 돌출부는 P-스템이 열린 형태와 닫힌 형태 사이를 이동하도록 도와 리보솜이 번역 인자를 모집하여 활성 부위로 전달할 수 있도록 합니다. E. cuniculi 리보솜에는 이러한 비후가 없습니다. 그러나 세 염기쌍에만 위치한 새로운 비후부(G883)는 P-스템의 최적 유연성을 회복하는 데 기여할 수 있습니다(그림 4c).
돌출부가 없는 rRNA에 대한 우리의 데이터는 rRNA 최소화가 리보솜 표면에서 rRNA 요소의 손실에 국한되지 않고 리보솜 핵에도 영향을 미쳐 자유 생활 세포에서는 보고되지 않은 기생충 특이적 분자 결함을 생성할 수 있음을 시사합니다. 살아있는 종이 관찰되었습니다.
표준 리보솜 단백질과 rRNA를 모델링한 후, 기존의 리보솜 구성 요소만으로는 cryo-EM 이미지의 세 부분을 설명할 수 없음을 발견했습니다. 이 단편 중 두 개는 크기가 작은 분자입니다(그림 5, 보충 그림 8). 첫 번째 부분은 리보솜 단백질 uL15와 eL18 사이에 끼어 있는데, 이 위치는 일반적으로 E. cuniculi에서 단축되는 eL18의 C-말단이 차지하는 위치입니다. 이 분자의 정체를 확인할 수는 없지만, 이 밀도 섬의 크기와 모양은 스페르미딘 분자의 존재로 잘 설명됩니다. 리보솜과의 결합은 uL15 단백질의 미포자충 특이적 돌연변이(Asp51과 Arg56)에 의해 안정화되는데, 이 돌연변이는 uL15가 이 소분자를 리보솜 구조로 감쌀 수 있도록 하여 리보솜과 이 소분자의 친화도를 증가시키는 것으로 보입니다. 보충 그림 2). 8, 추가 자료 1, 2).
E. cuniculi 리보솜에 결합된 리보스 외부에 존재하는 뉴클레오타이드를 보여주는 저온 전자 현미경(Cryo-EM) 영상. E. cuniculi 리보솜에서 이 뉴클레오타이드는 대부분의 다른 진핵생물 리보솜에서 25S rRNA A3186 뉴클레오타이드(Saccharomyces cerevisiae 번호 매기기)와 같은 위치를 차지합니다. b E. cuniculi의 리보솜 구조에서 이 뉴클레오타이드는 리보솜 단백질 uL9와 eL20 사이에 위치하여 두 단백질 사이의 접촉을 안정화합니다. cd 미포자충류 종에서 eL20 서열 보존 분석. Microsporidia 종의 계통수(c)와 eL20 단백질의 다중 서열 정렬(d)은 뉴클레오타이드 결합 잔기 F170과 K172가 S. lophii를 제외하고, ES39L rRNA 확장을 유지한 초기 분지 Microsporidia를 제외하고 대부분의 전형적인 Microsporidia에서 보존됨을 보여줍니다.e 이 그림은 뉴클레오타이드 결합 잔기 F170과 K172가 고도로 축소된 Microsporidia 게놈의 eL20에만 존재하고 다른 진핵생물에는 존재하지 않음을 보여줍니다.전반적으로, 이 데이터는 Microsporidia 리보솜이 AMP 분자를 결합하고 리보솜 구조에서 단백질-단백질 상호작용을 안정화하는 데 사용하는 것으로 보이는 뉴클레오타이드 결합 부위를 개발했음을 시사합니다.Microsporidia에서 이 결합 부위의 높은 보존성과 다른 진핵생물에서는 없는 것은 이 부위가 Microsporidia에 선택적 생존 이점을 제공할 수 있음을 시사합니다. 따라서 미포자충 리보솜의 뉴클레오타이드 결합 포켓은 이전에 기술된 바와 같이 rRNA 분해의 퇴화적 특징이나 최종 형태가 아니라, 미포자충 리보솜이 소분자를 직접 결합하여 이를 분자적 구성 요소로 사용할 수 있도록 하는 유용한 진화적 혁신으로 보인다. 이 발견으로 미포자충 리보솜은 구조적 구성 요소로 단일 뉴클레오타이드를 사용하는 것으로 알려진 유일한 리보솜이 되었다. f 뉴클레오타이드 결합에서 유래된 가상 진화 경로.
두 번째 저분자량 밀도는 리보솜 단백질 uL9와 eL30 사이의 계면에 위치합니다(그림 5a). 이 계면은 이전에 Saccharomyces cerevisiae 리보솜 구조에서 rRNA A3186(ES39L rRNA 연장부의 일부)의 25S 뉴클레오티드에 대한 결합 부위로 설명되었습니다.38 변성된 P. locustae ES39L 리보솜에서 이 계면은 알려지지 않은 단일 뉴클레오티드와 결합하는 것으로 나타났으며,31 이 뉴클레오티드는 rRNA의 길이가 약 130-230개 염기인 환원된 최종 형태의 rRNA라고 추정됩니다. ES39L은 단일 뉴클레오티드 32.43으로 환원됩니다. 저희의 cryo-EM 이미지는 밀도가 뉴클레오티드로 설명될 수 있다는 생각을 뒷받침합니다. 그러나 저희 구조의 더 높은 해상도는 이 뉴클레오티드가 리보솜 외부 분자, 아마도 AMP(그림 5a, b)임을 보여주었습니다.
그런 다음 뉴클레오타이드 결합 부위가 E. cuniculi 리보솜에 나타나는지, 아니면 이전에 존재했는지 알아보았습니다. 뉴클레오타이드 결합은 주로 eL30 리보솜 단백질의 Phe170과 Lys172 잔기에 의해 매개되므로, 4,396개의 대표적인 진핵생물에서 이 잔기의 보존성을 평가했습니다. 위의 uL15의 경우와 마찬가지로, Phe170과 Lys172 잔기는 전형적인 미포자충류(Mitosporidium)에서만 고도로 보존되어 있으며, ES39L rRNA 단편이 환원되지 않는 비정형 미포자충류(Mitosporidium)와 암피아블리스(Amphiamblys)를 포함한 다른 진핵생물에서는 존재하지 않는다는 것을 발견했습니다(그림 5c). -e).
이러한 데이터를 종합해 볼 때, E. cuniculi와 아마도 다른 정형 미포자충류(canonical microsporidia)가 rRNA와 단백질 수치 감소를 상쇄하기 위해 리보솜 구조 내 다수의 작은 대사산물을 효율적으로 포획하는 능력을 진화시켰다는 가설을 뒷받침합니다. 이를 통해 이들은 리보솜 외부의 뉴클레오타이드에 결합하는 독특한 능력을 발달시켰는데, 이는 기생 분자 구조가 풍부한 작은 대사산물을 포획하여 분해된 RNA와 단백질 조각의 구조적 모방체로 사용함으로써 이러한 감소를 상쇄한다는 것을 보여줍니다.
우리의 cryo-EM 지도의 세 번째 시뮬레이션되지 않은 부분은 큰 리보솜 소단위체에서 발견되었습니다.우리 지도의 비교적 높은 해상도(2.6 Å)는 이 밀도가 큰 측쇄 잔기의 독특한 조합을 가진 단백질에 속함을 시사하며, 이를 통해 우리는 이 밀도가 이전에 알려지지 않은 리보솜 단백질임을 확인할 수 있었습니다.우리는 이것을 msL2(Microsporidia-specific protein L2)로 명명했습니다(방법, 그림 6).우리의 상동성 검색은 msL2가 Encephaliter와 Orosporidium 속의 Microsporidia 분기군에서 보존되지만 다른 Microsporidia를 포함한 다른 종에서는 존재하지 않는다는 것을 보여주었습니다.리보솜 구조에서 msL2는 확장된 ES31L rRNA의 손실로 형성된 틈을 차지합니다.이 빈 공간에서 msL2는 rRNA 접힘을 안정화하는 데 도움이 되고 ES31L의 손실을 보상할 수 있습니다(그림 6).
a E. cuniculi 리보솜에서 발견되는 미포자충 특이 리보솜 단백질 msL2의 전자 밀도 및 모델. b Saccharomyces cerevisiae의 80S 리보솜을 포함한 대부분의 진핵생물 리보솜은 대부분의 미포자충 종에서 ES19L rRNA 증폭이 소실됩니다. V. necatrix 미포자충 리보솜의 기존 구조는 이러한 기생충에서 ES19L의 소실이 새로운 msL1 리보솜 단백질의 진화에 의해 보상되었음을 시사합니다. 본 연구에서는 E. cuniculi 리보솜이 ES19L 소실에 대한 명백한 보상으로 추가적인 리보솜 RNA 모방 단백질을 발달시켰음을 발견했습니다. 그러나 msL2(현재 가상 단백질인 ECU06_1135로 주석 처리됨)와 msL1은 구조적, 진화적 기원이 서로 다릅니다. c 진화적으로 무관한 msL1과 msL2 리보솜 단백질 생성에 대한 이번 발견은 리보솜이 rRNA에 해로운 돌연변이를 축적할 경우, 근연종 중에서도 소수의 종에서만 전례 없는 수준의 구성적 다양성을 달성할 수 있음을 시사합니다. 이 발견은 rRNA의 매우 낮은 수준과 종 간 단백질 구성의 비정상적인 다양성으로 알려진 미토콘드리아 리보솜의 기원과 진화를 규명하는 데 도움이 될 수 있습니다.
그 후, msL2 단백질을 V. necatrix 리보솜에서 발견되는 유일하게 알려진 미포자충 특이 리보솜 단백질인 이전에 보고된 msL1 단백질과 비교했습니다. msL1과 msL2가 진화적으로 연관되어 있는지 검증하고자 했습니다. 분석 결과, msL1과 msL2는 리보솜 구조에서 동일한 공간을 차지하지만, 1차 및 3차 구조가 서로 달라 서로 독립적인 진화적 기원을 가짐을 확인했습니다(그림 6). 따라서 msL2의 발견은 치밀한 진핵생물 종들이 rRNA 단편의 손실을 보상하기 위해 구조적으로 구별되는 리보솜 단백질을 독립적으로 진화시킬 수 있다는 증거를 제공합니다. 이 발견은 대부분의 세포질 진핵생물 리보솜이 81개의 동일한 리보솜 단백질 군을 포함하여 불변 단백질을 포함하고 있다는 점에서 주목할 만합니다. 확장된 rRNA 세그먼트의 손실에 대한 반응으로 다양한 미포자충류 분기군에서 msL1과 msL2가 나타나는 것은 기생충의 분자 구조의 저하로 인해 기생충이 보상 돌연변이를 추구하게 되고, 결국 다른 기생충 집단에서 이러한 돌연변이가 획득될 수 있음을 시사합니다.
마지막으로, 모델이 완성되었을 때, E. cuniculi 리보솜의 구성을 유전체 서열에서 예측된 구성과 비교했습니다. eL14, eL38, eL41, eS30을 포함한 여러 리보솜 단백질은 E. cuniculi 유전체에 상동 단백질이 없는 것으로 나타나 E. cuniculi 유전체에서 발견되지 않는 것으로 여겨졌습니다. 대부분의 다른 고도로 축소된 세포내 기생충과 내공생체에서도 많은 리보솜 단백질의 손실이 예측됩니다. 예를 들어, 대부분의 자유 생활 세균은 54개의 동일한 리보솜 단백질 패밀리를 가지고 있지만, 숙주 제한 세균의 분석된 각 유전체에서 검출 가능한 상동 단백질을 가진 단백질 패밀리는 이 중 11개에 불과합니다. 이러한 가설을 뒷받침하기 위해, eL38과 eL4131,32 단백질이 없는 V. necatrix와 P. locustae microsporidia에서 리보솜 단백질의 손실이 실험적으로 관찰되었습니다.
그러나 우리의 구조는 E. cuniculi 리보솜에서 실제로 eL38, eL41, eS30만이 소실되었음을 보여줍니다. eL14 단백질은 보존되었으며, 우리의 구조는 이 단백질이 상동성 검색에서 발견될 수 없는 이유를 보여주었습니다(그림 7). E. cuniculi 리보솜에서 대부분의 eL14 결합 부위는 rRNA로 증폭된 ES39L의 분해로 인해 소실됩니다. ES39L이 없는 경우, eL14는 대부분의 이차 구조를 잃었고, E. cuniculi와 S. cerevisiae에서 eL14 서열의 18%만이 동일했습니다. 이러한 낮은 서열 보존은 주목할 만한데, 15억 년의 차이를 두고 진화한 생물인 Saccharomyces cerevisiae와 Homo sapiens조차도 eL14에서 51% 이상의 동일한 잔기를 공유하기 때문입니다. 이러한 비정상적인 보존 손실은 E. cuniculi eL14가 현재 추정 M970_061160 단백질로 주석이 달려 있고 eL1427 리보솜 단백질로 주석이 달려 있지 않은 이유를 설명합니다.
그리고 미포자충 리보솜은 ES39L rRNA 연장을 잃었고, 이로 인해 eL14 리보솜 단백질 결합 부위가 부분적으로 제거되었습니다. ES39L이 없는 경우, eL14 미포자충 단백질은 2차 구조의 손실을 겪으며, 이전 rRNA 결합 α-나선이 최소 길이의 루프로 변성됩니다. b 다중 서열 정렬은 eL14 단백질이 진핵생물 종에서는 고도로 보존되어 있지만(효모와 인간 상동체 간 서열 동일성 57%), 미포자충에서는 보존이 잘 되지 않고 발산됨을 보여줍니다(잔기의 24% 이하만이 eL14 상동체와 동일함). S. cerevisiae 또는 H. sapiens에서 유래). 이러한 낮은 서열 보존성과 2차 구조 가변성은 eL14 상동체가 E. cuniculi에서 발견되지 않은 이유와 이 단백질이 E. cuniculi에서 소실된 것으로 여겨지는 이유를 설명합니다. 이와 대조적으로, E. cuniculi eL14는 이전에 추정 M970_061160 단백질로 주석 처리되었습니다. 이러한 관찰 결과는 미포자충류의 유전체 다양성이 현재 과대평가되었음을 시사합니다. 현재 미포자충류에서 소실된 것으로 여겨지는 일부 유전자는 비록 고도로 분화된 형태이기는 하지만 실제로는 보존되어 있습니다. 반면, 일부 유전자는 기생충 특이 단백질(예: 가상 단백질 M970_061160)에 대한 미포자충류 유전자를 암호화하는 것으로 여겨지지만, 실제로는 다른 진핵생물에서 발견되는 매우 다양한 단백질을 암호화합니다.
이 발견은 rRNA 변성이 인접 리보솜 단백질의 서열 보존성을 크게 손상시켜 상동성 검색에서 이러한 단백질을 검출할 수 없게 만들 수 있음을 시사합니다. 따라서 소실된 것으로 여겨지는 일부 단백질이 심하게 변형된 형태이기는 하지만 실제로는 존속하기 때문에, 소형 유전체 생물에서 분자 분해의 실제 정도를 과대평가할 수 있습니다.
기생충은 극심한 유전체 감소 환경에서도 분자 기계의 기능을 어떻게 유지할 수 있을까요? 본 연구는 진핵생물 중 가장 작은 유전체를 가진 생물 중 하나인 E. cuniculi의 복잡한 분자 구조(리보솜)를 설명함으로써 이 질문에 대한 답을 제시합니다.
미생물 기생충의 단백질과 RNA 분자는 품질 관리 센터가 없고, 자유 생활 미생물에서는 크기가 50%로 줄어드는 등 자유 생활 미생물의 상동 분자와 ​​종종 차이가 있다는 사실은 거의 20년 동안 알려져 왔습니다. 또한, 접힘과 기능을 저해하는 여러 가지 심각한 돌연변이가 있습니다. 예를 들어, 많은 세포 내 기생충과 세포 내 공생체를 포함한 소형 유전체 생물의 리보솜은 자유 생활 종에 비해 여러 리보솜 단백질과 최대 3분의 1의 rRNA 뉴클레오타이드가 부족할 것으로 예상됩니다. 27, 29, 30, 49 그러나 기생충에서 이러한 분자들이 기능하는 방식은 여전히 ​​미스터리로 남아 있으며, 주로 비교 유전체학을 통해 연구되고 있습니다.
본 연구는 거대분자의 구조가 세포 내 기생충 및 기타 숙주 제한 생물에 대한 전통적인 비교 유전체 연구에서는 도출하기 어려웠던 진화의 여러 측면을 드러낼 수 있음을 보여줍니다(보충 그림 7). 예를 들어, eL14 단백질의 예는 기생충 종에서 분자 장치의 실제 분해 정도를 과대평가할 수 있음을 보여줍니다. 뇌염 기생충은 현재 수백 개의 미포자충 특이 유전자를 가지고 있는 것으로 알려져 있습니다. 그러나 본 연구 결과는 이러한 특이적으로 보이는 유전자 중 일부가 실제로는 다른 진핵생물에서 흔히 발견되는 유전자의 매우 다른 변이체일 뿐임을 보여줍니다. 더욱이, msL2 단백질의 예는 우리가 새로운 리보솜 단백질을 간과하고 기생 분자 기계의 내용을 과소평가하는 방식을 보여줍니다. 소분자의 예는 기생충 분자 구조에서 새로운 생물학적 활성을 부여할 수 있는 가장 독창적인 혁신을 간과할 수 있음을 보여줍니다.
이러한 결과를 종합해 볼 때, 숙주 제한 생물과 자유 생활 생물의 분자 구조 차이에 대한 우리의 이해를 증진시킵니다. 오랫동안 축소되고, 퇴화되고, 다양한 쇠약하게 만드는 돌연변이에 취약하다고 여겨져 온 분자 기계가, 체계적으로 간과되어 온 일련의 특이한 구조적 특징을 가지고 있음을 보여줍니다.
반면, E. cuniculi의 리보솜에서 발견된 부피가 크지 않은 rRNA 조각과 융합된 조각은 게놈 감소가 종의 독립적인 진화가 거의 35억 년이 지난 후에도 생명의 세 영역에 보존된 기본 분자 기계의 일부까지도 변화시킬 수 있음을 시사합니다.
E. cuniculi 리보솜의 돌출부가 없고 융합된 rRNA 단편은 내생공생 박테리아의 RNA 분자에 대한 이전 연구에 비추어 특히 흥미롭습니다.예를 들어, 진딧물 내생공생체 Buchnera aphidicola에서 rRNA와 tRNA 분자는 A+T 구성 편향과 높은 비율의 비정형 염기쌍으로 인해 온도에 민감한 구조를 갖는 것으로 나타났습니다.이러한 RNA의 변화와 단백질 분자의 변화는 이제 내생공생체가 파트너에 지나치게 의존하고 내생공생체가 열을 전달하지 못하는 데 책임이 있는 것으로 생각됩니다.21, 23. 기생성 미포자충 rRNA는 구조적으로 뚜렷한 변화를 보이지만, 이러한 변화의 특성은 열 안정성이 감소하고 샤페론 단백질에 대한 의존도가 높아지는 것이 유전체가 감소된 생물체의 RNA 분자에서 공통적으로 나타나는 특징일 수 있음을 시사합니다.
반면에, 우리의 구조는 기생충 미포자충이 널리 보존된 rRNA와 단백질 단편에 저항하는 독특한 능력을 진화시켜, 풍부하고 쉽게 이용 가능한 작은 대사산물을 변성된 rRNA와 단백질 단편의 구조적 모방체로 사용하는 능력을 발달시켰음을 보여줍니다. 분자 구조 분해. 이러한 견해는 E. cuniculi의 rRNA와 리보솜에서 단백질 단편 손실을 보상하는 소분자가 uL15와 eL30 단백질의 미포자충 특이적 잔류물에 결합한다는 사실에 의해 뒷받침됩니다. 이는 소분자가 리보솜에 결합하는 것이 양성 선택의 산물일 수 있음을 시사하는데, 이는 리보솜 단백질의 미포자충 특이적 돌연변이가 소분자에 대한 리보솜의 친화도를 증가시키는 능력 때문에 선택되었기 때문이며, 이는 더욱 효율적인 리보솜 생물로 이어질 수 있습니다. 이 발견은 미생물 기생충의 분자 구조에 있어 획기적인 혁신을 보여주며, 환원적 진화에도 불구하고 기생충 분자 구조가 어떻게 기능을 유지하는지에 대한 더 나은 이해를 제공합니다.
현재 이러한 소분자들의 동정은 불분명합니다. 미포자충류 종 간에 리보솜 구조에서 이러한 소분자들의 발현 양상이 다른 이유는 명확하지 않습니다. 특히, V. necatrix의 eL20 및 K172 단백질에 F170 잔기가 존재함에도 불구하고, E. cuniculi와 P. locustae의 리보솜에서는 뉴클레오타이드 결합이 관찰되고 V. necatrix의 리보솜에서는 관찰되지 않는 이유는 명확하지 않습니다. 이러한 결손은 뉴클레오타이드 결합 포켓에 인접한 43 uL6 잔기에 의해 발생할 수 있는데, 이는 V. necatrix에서는 티로신이고 E. cuniculi와 P. locustae에서는 트레오닌이 아닙니다. Tyr43의 부피가 큰 방향족 측쇄는 입체 구조적 중첩으로 인해 뉴클레오타이드 결합을 방해할 수 있습니다. 또는, 이러한 뉴클레오타이드 결손은 V. necatrix 리보솜 단편의 모델링을 방해하는 저온 전자 현미경(cryo-EM) 이미징의 낮은 해상도 때문일 수 있습니다.
반면에, 저희 연구는 유전체 붕괴 과정이 창의적인 원동력이 될 수 있음을 시사합니다. 특히, E. cuniculi 리보솜의 구조는 미포자충 리보솜에서 rRNA와 단백질 단편의 손실이 리보솜 구조의 변화를 촉진하는 진화적 압력을 생성함을 시사합니다. 이러한 변이는 리보솜의 활성 부위에서 멀리 떨어진 곳에서 발생하며, 감소된 rRNA에 의해 방해받을 수 있는 최적의 리보솜 조립을 유지(또는 회복)하는 데 도움을 주는 것으로 보입니다. 이는 미포자충 리보솜의 주요 혁신이 유전자 표류를 완충하는 필요성으로 진화했음을 시사합니다.
아마도 이는 다른 생물체에서는 지금까지 관찰된 적이 없는 뉴클레오타이드 결합에 의해 가장 잘 설명될 것입니다. 뉴클레오타이드 결합 잔기가 일반적인 미포자충류에는 존재하지만 다른 진핵생물에는 존재하지 않는다는 사실은 뉴클레오타이드 결합 부위가 단순히 사라지기를 기다리는 유물이나 rRNA가 개별 뉴클레오타이드 형태로 복원되는 최종 장소가 아님을 시사합니다. 오히려, 이 부위는 여러 차례의 양성 선택을 통해 진화했을 수 있는 유용한 특징으로 보입니다. 뉴클레오타이드 결합 부위는 자연 선택의 부산물일 수 있습니다. ES39L이 분해되면 미포자충류는 ES39L이 없는 상황에서 최적의 리보솜 생합성을 회복하기 위해 보상을 추구해야 합니다. 이 뉴클레오타이드는 ES39L의 A3186 뉴클레오타이드의 분자적 접촉을 모방할 수 있기 때문에, 이 뉴클레오타이드 분자는 리보솜의 구성 요소가 되며, eL30 서열의 돌연변이를 통해 결합이 더욱 향상됩니다.
세포 내 기생충의 분자 진화와 관련하여, 본 연구는 다윈의 자연선택과 유전체 붕괴의 유전적 부동이 동시에 작용하는 것이 아니라 진동한다는 것을 보여줍니다. 첫째, 유전적 부동은 생체분자의 중요한 특징을 제거하여 보상이 절실히 필요하게 만듭니다. 기생충이 다윈의 자연선택을 통해 이러한 필요를 충족할 때에만 그들의 거대분자는 가장 인상적이고 혁신적인 특성을 발달시킬 기회를 얻게 됩니다. 중요한 것은, E. cuniculi 리보솜의 뉴클레오타이드 결합 부위의 진화가 이러한 손실-이득 분자 진화 패턴이 유해한 돌연변이를 상쇄할 뿐만 아니라, 때로는 기생 거대분자에 완전히 새로운 기능을 부여한다는 것을 시사한다는 것입니다.
이 아이디어는 엄격한 자연선택 시스템이 유기체의 혁신 능력을 제한한다고 주장하는 세웰 라이트의 이동 평형 이론과 일치합니다.51,52,53. 그러나 유전적 부동이 자연선택을 방해한다면, 이러한 부동은 그 자체로는 적응적이지 않거나 심지어 해롭지 않은 변화를 초래할 수 있지만, 더 높은 적합도나 새로운 생물학적 활동을 제공하는 추가적인 변화로 이어질 수 있습니다. 본 프레임워크는 생체분자의 접힘과 기능을 감소시키는 동일한 유형의 돌연변이가 그 개선의 주요 원인으로 보인다는 점을 보여줌으로써 이러한 아이디어를 뒷받침합니다. 윈윈 진화 모델에 따라, 본 연구는 전통적으로 퇴행적 과정으로 여겨져 온 유전체 붕괴가 혁신의 주요 동인이며, 때로는 거대분자가 새로운 기생 활동을 획득할 수 있도록 허용한다는 것을 보여줍니다. 이러한 메커니즘을 활용할 수 있습니다.