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A evolução dos parasitas microbianos envolve uma contração entre a seleção natural, que faz com que os parasitas melhorem, e a deriva genética, que faz com que os parasitas percam genes e acumulem mutações deletérias. Aqui, a fim de entender como essa contração ocorre na escala de uma única macromolécula, descrevemos a estrutura crio-EM do ribossoma de Encephalitozoon cuniculi, um organismo eucariótico com um dos menores genomas da natureza. A redução extrema de rRNA nos ribossomas de E. cuniculi é acompanhada por mudanças estruturais sem precedentes, como a evolução de ligantes de rRNA fundidos previamente desconhecidos e rRNA sem protuberâncias. Além disso, o ribossoma de E. cuniculi sobreviveu à perda de fragmentos de rRNA e proteínas, desenvolvendo a capacidade de usar pequenas moléculas como imitadores estruturais de fragmentos de rRNA e proteínas degradados. No geral, mostramos que estruturas moleculares que por muito tempo foram consideradas reduzidas, degeneradas e sujeitas a mutações debilitantes têm uma série de mecanismos compensatórios que as mantêm ativas apesar das contrações moleculares extremas.
Como a maioria dos grupos de parasitas microbianos possui ferramentas moleculares únicas para explorar seus hospedeiros, frequentemente precisamos desenvolver diferentes terapias para diferentes grupos de parasitas1,2. No entanto, novas evidências sugerem que alguns aspectos da evolução dos parasitas são convergentes e amplamente previsíveis, indicando uma base potencial para intervenções terapêuticas amplas em parasitas microbianos3,4,5,6,7,8,9.
Trabalhos anteriores identificaram uma tendência evolutiva comum em parasitas microbianos chamada redução do genoma ou decaimento do genoma10,11,12,13. Pesquisas atuais mostram que, quando os microrganismos abandonam seu estilo de vida livre e se tornam parasitas intracelulares (ou endossimbiontes), seus genomas passam por metamorfoses lentas, mas surpreendentes, ao longo de milhões de anos9,11. Em um processo conhecido como decaimento do genoma, os parasitas microbianos acumulam mutações deletérias que transformam muitos genes anteriormente importantes em pseudogenes, levando à perda gradual de genes e ao colapso mutacional14,15. Esse colapso pode destruir até 95% dos genes nos organismos intracelulares mais antigos, em comparação com espécies de vida livre intimamente relacionadas. Assim, a evolução dos parasitas intracelulares é um cabo de guerra entre duas forças opostas: a seleção natural darwiniana, que leva ao aprimoramento dos parasitas, e o colapso do genoma, lançando os parasitas no esquecimento. Como o parasita conseguiu emergir desse cabo de guerra e manter a atividade de sua estrutura molecular permanece obscuro.
Embora o mecanismo de decaimento do genoma não seja totalmente compreendido, ele parece ocorrer principalmente devido à deriva genética frequente. Como os parasitas vivem em populações pequenas, assexuadas e geneticamente limitadas, eles não conseguem eliminar eficazmente as mutações deletérias que às vezes ocorrem durante a replicação do DNA. Isso leva ao acúmulo irreversível de mutações prejudiciais e à redução do genoma do parasita. Como resultado, o parasita não apenas perde genes que não são mais necessários para sua sobrevivência no ambiente intracelular. É a incapacidade das populações de parasitas de eliminar eficazmente mutações deletérias esporádicas que faz com que essas mutações se acumulem por todo o genoma, incluindo seus genes mais importantes.
Grande parte da nossa compreensão atual da redução do genoma baseia-se exclusivamente em comparações de sequências genômicas, com menos atenção às mudanças em moléculas reais que desempenham funções de manutenção e servem como potenciais alvos para fármacos. Estudos comparativos demonstraram que a carga de mutações microbianas intracelulares deletérias parece predispor proteínas e ácidos nucleicos a se dobrarem incorretamente e se agregarem, tornando-os mais dependentes de chaperonas e hipersensíveis ao calor19,20,21,22,23. Além disso, vários parasitas — evolução independente, às vezes separada por até 2,5 bilhões de anos — experimentaram uma perda semelhante de centros de controle de qualidade em seus mecanismos de síntese proteica5,6 e reparo de DNA24. No entanto, pouco se sabe sobre o impacto do estilo de vida intracelular em todas as outras propriedades das macromoléculas celulares, incluindo a adaptação molecular a uma carga crescente de mutações deletérias.
Neste trabalho, a fim de melhor compreender a evolução de proteínas e ácidos nucleicos de microrganismos intracelulares, determinamos a estrutura dos ribossomos do parasita intracelular Encephalitozoon cuniculi. E. cuniculi é um organismo semelhante a um fungo pertencente a um grupo de microsporídios parasitas que possuem genomas eucarióticos anormalmente pequenos e, portanto, são usados ​​como organismos modelo para estudar a degradação do genoma25,26,27,28,29,30. Recentemente, a estrutura do ribossomo por crio-EM foi determinada para genomas moderadamente reduzidos de Microsporídios, Paranosema locustae e Vairimorpha necatrix31,32 (~3,2 Mb de genoma). Essas estruturas sugerem que alguma perda de amplificação de rRNA é compensada pelo desenvolvimento de novos contatos entre proteínas ribossomais vizinhas ou pela aquisição de novas proteínas ribossomais msL131,32. A espécie Encephalitozoon (genoma ~2,5 milhões de pb), juntamente com seu parente mais próximo, Ordospora, demonstra o grau máximo de redução genômica em eucariotos – eles possuem menos de 2.000 genes codificadores de proteínas, e espera-se que seus ribossomos não sejam apenas desprovidos de fragmentos de expansão de rRNA (fragmentos de rRNA que distinguem os ribossomos eucarióticos dos ribossomos bacterianos), mas também possuam quatro proteínas ribossomais devido à ausência de homólogos no genoma de E. cuniculi26,27,28. Portanto, concluímos que o ribossomo de E. cuniculi pode revelar estratégias até então desconhecidas para adaptação molecular à degradação do genoma.
Nossa estrutura de crio-ME representa o menor ribossomo citoplasmático eucariótico a ser caracterizado e fornece insights sobre como o grau máximo de redução do genoma afeta a estrutura, a montagem e a evolução da maquinaria molecular que é parte integrante da célula. Descobrimos que o ribossomo de E. cuniculi viola muitos dos princípios amplamente conservados de dobramento de RNA e montagem de ribossomos, e descobrimos uma nova proteína ribossomal até então desconhecida. De forma bastante inesperada, mostramos que os ribossomos de microsporídios desenvolveram a capacidade de se ligar a pequenas moléculas e levantamos a hipótese de que truncamentos em rRNA e proteínas desencadeiam inovações evolutivas que podem, em última análise, conferir qualidades úteis ao ribossomo.
Para aprimorar nossa compreensão da evolução de proteínas e ácidos nucleicos em organismos intracelulares, decidimos isolar esporos de E. cuniculi de culturas de células de mamíferos infectadas, a fim de purificar seus ribossomos e determinar a estrutura desses ribossomos. É difícil obter um grande número de microsporídios parasitas, pois eles não podem ser cultivados em meio nutriente. Em vez disso, eles crescem e se reproduzem apenas dentro da célula hospedeira. Portanto, para obter biomassa de E. cuniculi para purificação de ribossomos, infectamos a linhagem celular renal de mamíferos RK13 com esporos de E. cuniculi e cultivamos essas células infectadas por várias semanas para permitir que E. cuniculi crescesse e se multiplicasse. Utilizando uma monocamada de células infectadas de cerca de meio metro quadrado, conseguimos purificar cerca de 300 mg de esporos de Microsporídios e usá-los para isolar ribossomos. Em seguida, rompemos os esporos purificados com esferas de vidro e isolamos os ribossomos brutos usando fracionamento gradual dos lisados ​​com polietilenoglicol. Isso nos permitiu obter aproximadamente 300 µg de ribossomos brutos de E. cuniculi para análise estrutural.
Em seguida, coletamos imagens de crio-EM usando as amostras de ribossomos resultantes e processamos essas imagens usando máscaras correspondentes à subunidade ribossômica grande, à cabeça da subunidade pequena e à subunidade pequena. Durante esse processo, coletamos imagens de cerca de 108.000 partículas ribossômicas e computamos imagens de crio-EM com resolução de 2,7 Å (Figuras Suplementares 1-3). Em seguida, utilizamos imagens de crio-EM para modelar o rRNA, a proteína ribossômica e o fator de hibernação Mdf1 associados aos ribossomos de E. cuniculi (Fig. 1a, b).
a Estrutura do ribossomo de E. cuniculi em complexo com o fator de hibernação Mdf1 (pdb id 7QEP). b Mapa do fator de hibernação Mdf1 associado ao ribossomo de E. cuniculi. c Mapa da estrutura secundária comparando o rRNA recuperado em espécies de Microsporídeos com estruturas ribossomais conhecidas. Os painéis mostram a localização dos fragmentos de rRNA amplificados (ES) e os sítios ativos do ribossomo, incluindo o sítio de decodificação (DC), a alça da sarcinicina (SRL) e o centro da peptidil transferase (PTC). d A densidade eletrônica correspondente ao centro da peptidil transferase do ribossomo de E. cuniculi sugere que este sítio catalítico tem a mesma estrutura no parasita E. cuniculi e seus hospedeiros, incluindo H. sapiens. e, f A densidade eletrônica correspondente do centro de decodificação (e) e a estrutura esquemática do centro de decodificação (f) indicam que E. cuniculi possui resíduos U1491 em vez de A1491 (numeração de E. coli) em muitos outros eucariotos. Essa alteração sugere que E. cuniculi pode ser sensível a antibióticos que têm como alvo esse sítio ativo.
Em contraste com as estruturas previamente estabelecidas dos ribossomos de V. necatrix e P. locustae (ambas as estruturas representam a mesma família de microsporídios, Nosematidae, e são muito semelhantes entre si), 31,32 os ribossomos de E. cuniculi passam por numerosos processos de fragmentação de rRNA e proteínas. Além disso, ocorre desnaturação (Figuras Suplementares 4-6). No rRNA, as alterações mais marcantes incluíram a perda completa do fragmento ES12L do rRNA 25S amplificado e a degeneração parcial das hélices h39, h41 e H18 (Fig. 1c, Fig. Suplementar 4). Entre as proteínas ribossômicas, as alterações mais marcantes incluíram a perda completa da proteína eS30 e o encurtamento das proteínas eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 e eS7 (Figuras Suplementares 4, 5).
Assim, a redução extrema dos genomas das espécies de Encephalotozoon/Ordospora se reflete na estrutura de seus ribossomos: os ribossomos de E. cuniculi apresentam a perda mais drástica de conteúdo proteico em ribossomos citoplasmáticos eucarióticos sujeitos à caracterização estrutural, e não possuem sequer aqueles fragmentos de rRNA e proteínas amplamente conservados não apenas em eucariotos, mas também nos três domínios da vida. A estrutura do ribossomo de E. cuniculi fornece o primeiro modelo molecular para essas mudanças e revela eventos evolutivos que foram negligenciados tanto pela genômica comparativa quanto por estudos da estrutura biomolecular intracelular (Fig. Suplementar 7). A seguir, descrevemos cada um desses eventos, juntamente com suas prováveis ​​origens evolutivas e seu potencial impacto na função do ribossomo.
Descobrimos então que, além de grandes truncamentos de rRNA, os ribossomos de E. cuniculi apresentam variações de rRNA em um de seus sítios ativos. Embora o centro da peptidil transferase do ribossomo de E. cuniculi tenha a mesma estrutura de outros ribossomos eucarióticos (Fig. 1d), o centro de decodificação difere devido à variação da sequência no nucleotídeo 1491 (numeração de E. coli, Fig. 1e, f). Essa observação é importante porque o sítio de decodificação dos ribossomos eucarióticos tipicamente contém os resíduos G1408 e A1491, em comparação com os resíduos A1408 e G1491 do tipo bacteriano. Essa variação fundamenta a diferente sensibilidade dos ribossomos bacterianos e eucarióticos à família dos aminoglicosídeos de antibióticos ribossômicos e outras moléculas pequenas que têm como alvo o sítio de decodificação. No sítio de decodificação do ribossomo de E. cuniculi, o resíduo A1491 foi substituído por U1491, potencialmente criando uma interface de ligação única para pequenas moléculas que têm como alvo esse sítio ativo. A mesma variante A14901 também está presente em outros microsporídios, como P. locustae e V. necatrix, sugerindo sua ampla distribuição entre as espécies de microsporídios (Fig. 1f).
Como nossas amostras de ribossomos de E. cuniculi foram isoladas de esporos metabolicamente inativos, testamos o mapa de crio-EM de E. cuniculi para a ligação de ribossomos previamente descrita sob condições de estresse ou inanição. Fatores de hibernação 31, 32, 36, 37, 38. Combinamos a estrutura previamente estabelecida do ribossomo hibernante com o mapa de crio-EM do ribossomo de E. cuniculi. Para ancoragem, ribossomos de S. cerevisiae foram usados ​​em complexo com o fator de hibernação Stm138, ribossomos de gafanhoto em complexo com o fator Lso232 e ribossomos de V. necatrix em complexo com os fatores Mdf1 e Mdf231. Ao mesmo tempo, encontramos a densidade de crio-EM correspondente ao fator de repouso Mdf1. Semelhante à ligação do Mdf1 ao ribossomo do V. necatrix, o Mdf1 também se liga ao ribossomo do E. cuniculi, onde bloqueia o sítio E do ribossomo, possivelmente ajudando a tornar os ribossomos disponíveis quando os esporos do parasita se tornam metabolicamente inativos após a inativação do corpo (Figura 2). ).
O Mdf1 bloqueia o sítio E do ribossomo, o que parece ajudar a inativar o ribossomo quando os esporos do parasita se tornam metabolicamente inativos. Na estrutura do ribossomo de E. cuniculi, descobrimos que o Mdf1 forma um contato até então desconhecido com a haste L1 do ribossomo, a parte do ribossomo que facilita a liberação de tRNA desacetilado do ribossomo durante a síntese proteica. Esses contatos sugerem que o Mdf1 se dissocia do ribossomo usando o mesmo mecanismo que o tRNA desacetilado, fornecendo uma possível explicação para como o ribossomo remove o Mdf1 para reativar a síntese proteica.
No entanto, nossa estrutura revelou um contato desconhecido entre Mdf1 e a perna L1 do ribossomo (a parte do ribossomo que ajuda a liberar o tRNA desacetilado do ribossomo durante a síntese proteica). Em particular, Mdf1 usa os mesmos contatos que o segmento cotovelo da molécula de tRNA desacetilado (Fig. 2). Essa modelagem molecular, até então desconhecida, mostrou que Mdf1 se dissocia do ribossomo usando o mesmo mecanismo que o tRNA desacetilado, o que explica como o ribossomo remove esse fator de hibernação para reativar a síntese proteica.
Ao construir o modelo de rRNA, descobrimos que o ribossomo de E. cuniculi possui fragmentos de rRNA anormalmente dobrados, que chamamos de rRNA fundido (Fig. 3). Em ribossomos que abrangem os três domínios da vida, o rRNA se dobra em estruturas nas quais a maioria das bases de rRNA formam pares de bases e se dobram entre si ou interagem com proteínas ribossomais38,39,40. No entanto, nos ribossomos de E. cuniculi, os rRNAs parecem violar esse princípio de dobramento, convertendo algumas de suas hélices em regiões de rRNA não dobradas.
Estrutura da hélice H18 25S rRNA em S. cerevisiae, V. necatrix e E. cuniculi. Tipicamente, em ribossomos que abrangem os três domínios vitais, este ligante se enrola em uma hélice de RNA que contém de 24 a 34 resíduos. Em Microsporidia, em contraste, este ligante rRNA é gradualmente reduzido a dois ligantes ricos em uridina de fita simples contendo apenas 12 resíduos. A maioria desses resíduos é exposta a solventes. A figura mostra que microsporidia parasitas parecem violar os princípios gerais do enovelamento de rRNA, onde as bases de rRNA são geralmente acopladas a outras bases ou envolvidas em interações rRNA-proteína. Em microsporidia, alguns fragmentos de rRNA assumem um enovelamento desfavorável, no qual a antiga hélice de rRNA se torna um fragmento de fita simples alongado quase em linha reta. A presença dessas regiões incomuns permite que o rRNA de microsporídios se ligue a fragmentos de rRNA distantes usando um número mínimo de bases de RNA.
O exemplo mais marcante dessa transição evolutiva pode ser observado na hélice H18 25S do rRNA (Fig. 3). Em espécies que vão de E. coli a humanos, as bases dessa hélice de rRNA contêm de 24 a 32 nucleotídeos, formando uma hélice ligeiramente irregular. Em estruturas ribossômicas previamente identificadas de V. necatrix e P. locustae,31,32 as bases da hélice H18 são parcialmente desenroladas, mas o pareamento de bases de nucleotídeos é preservado. No entanto, em E. cuniculi, esse fragmento de rRNA se torna os ligantes mais curtos 228UUUGU232 e 301UUUUUUUU307. Ao contrário dos fragmentos típicos de rRNA, esses ligantes ricos em uridina não se enrolam nem fazem contato extenso com proteínas ribossômicas. Em vez disso, eles adotam estruturas abertas ao solvente e totalmente desdobradas, nas quais as fitas de rRNA são estendidas quase em linha reta. Essa conformação esticada explica como E. cuniculi usa apenas 12 bases de RNA para preencher a lacuna de 33 Å entre as hélices de rRNA H16 e H18, enquanto outras espécies requerem pelo menos o dobro de bases de rRNA para preencher a lacuna.
Assim, podemos demonstrar que, por meio de dobramento energeticamente desfavorável, microsporídios parasitas desenvolveram uma estratégia para contrair até mesmo aqueles segmentos de rRNA que permanecem amplamente conservados entre as espécies nos três domínios da vida. Aparentemente, ao acumular mutações que transformam hélices de rRNA em ligantes poli-U curtos, E. cuniculi pode formar fragmentos incomuns de rRNA contendo o mínimo possível de nucleotídeos para a ligação de fragmentos distais de rRNA. Isso ajuda a explicar como os microsporídios alcançaram uma redução drástica em sua estrutura molecular básica sem perder sua integridade estrutural e funcional.
Outra característica incomum do rRNA de E. cuniculi é a ausência de espessamentos (Fig. 4). Protuberâncias são nucleotídeos sem pares de bases que se torcem para fora da hélice do RNA em vez de se esconderem nela. A maioria das protuberâncias do rRNA atua como adesivos moleculares, ajudando a ligar proteínas ribossomais adjacentes ou outros fragmentos de rRNA. Algumas das protuberâncias atuam como dobradiças, permitindo que a hélice do rRNA se flexione e se dobre de forma ideal para a síntese proteica produtiva 41 .
a Uma protrusão de rRNA (numeração de S. cerevisiae) está ausente da estrutura do ribossoma de E. cuniculi, mas presente na maioria dos outros eucariotos b Ribossomos internos de E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens e E. cuniculi. Os parasitas não possuem muitas das antigas protuberâncias de rRNA altamente conservadas. Esses espessamentos estabilizam a estrutura do ribossoma; portanto, sua ausência em microsporídios indica uma estabilidade reduzida do dobramento de rRNA em parasitas de microsporídios. A comparação com hastes P (hastes L7/L12 em bactérias) mostra que a perda de protuberâncias de rRNA às vezes coincide com o aparecimento de novas protuberâncias próximas às protuberâncias perdidas. A hélice H42 no rRNA 23S/28S tem uma protuberância antiga (U1206 em Saccharomyces cerevisiae) estimada em pelo menos 3,5 bilhões de anos devido à sua proteção em três domínios da vida. Em microsporídios, essa protuberância é eliminada. No entanto, uma nova protuberância surgiu ao lado da protuberância perdida (A1306 em E. cuniculi).
Surpreendentemente, descobrimos que os ribossomos de E. cuniculi não apresentam a maioria das protuberâncias de rRNA encontradas em outras espécies, incluindo mais de 30 protuberâncias conservadas em outros eucariotos (Fig. 4a). Essa perda elimina muitos contatos entre as subunidades ribossômicas e as hélices de rRNA adjacentes, às vezes criando grandes vazios ocos dentro do ribossomo, tornando o ribossomo de E. cuniculi mais poroso em comparação com os ribossomos mais tradicionais (Fig. 4b). Notavelmente, descobrimos que a maioria dessas protuberâncias também foi perdida nas estruturas ribossomais de V. necatrix e P. locustae previamente identificadas, que foram ignoradas em análises estruturais anteriores31,32.
Às vezes, a perda de protuberâncias de rRNA é acompanhada pelo desenvolvimento de novas protuberâncias próximas à protuberância perdida. Por exemplo, a haste P ribossomal contém uma protuberância U1208 (em Saccharomyces cerevisiae) que sobreviveu da E. coli para os humanos e, portanto, estima-se que tenha 3,5 bilhões de anos. Durante a síntese proteica, essa protuberância auxilia a haste P a se mover entre as conformações aberta e fechada, permitindo que o ribossomo recrute fatores de tradução e os entregue ao sítio ativo. Nos ribossomos de E. cuniculi, esse espessamento está ausente; no entanto, um novo espessamento (G883), localizado apenas em três pares de bases, pode contribuir para a restauração da flexibilidade ideal da haste P (Fig. 4c).
Nossos dados sobre rRNA sem protuberâncias sugerem que a minimização do rRNA não se limita à perda de elementos de rRNA na superfície do ribossomo, mas também pode envolver o núcleo do ribossomo, criando um defeito molecular específico do parasita que não foi descrito em células de vida livre. espécies vivas são observadas.
Após modelar proteínas ribossomais canônicas e rRNA, descobrimos que os componentes ribossomais convencionais não conseguem explicar as três partes da imagem de crio-EM. Dois desses fragmentos são moléculas pequenas (Fig. 5, Fig. Suplementar 8). O primeiro segmento está intercalado entre as proteínas ribossomais uL15 e eL18, em uma posição geralmente ocupada pelo terminal C de eL18, que é encurtado em E. cuniculi. Embora não possamos determinar a identidade dessa molécula, o tamanho e a forma dessa ilha de densidade são bem explicados pela presença de moléculas de espermidina. Sua ligação ao ribossoma é estabilizada por mutações específicas de microsporídios nas proteínas uL15 (Asp51 e Arg56), que parecem aumentar a afinidade do ribossoma por essa pequena molécula, pois permitem que a uL15 a envolva em uma estrutura ribossômica. Figura Suplementar 2). 8, dados adicionais 1, 2).
Imagem de crio-EM mostrando a presença de nucleotídeos fora da ribose ligada ao ribossomo de E. cuniculi. No ribossomo de E. cuniculi, esse nucleotídeo ocupa o mesmo lugar que o nucleotídeo 25S rRNA A3186 (numeração de Saccharomyces cerevisiae) na maioria dos outros ribossomos eucarióticos. b Na estrutura ribossômica de E. cuniculi, esse nucleotídeo está localizado entre as proteínas ribossômicas uL9 e eL20, estabilizando assim o contato entre as duas proteínas. cd Análise de conservação da sequência eL20 entre espécies de microsporídios. A árvore filogenética das espécies de Microsporidia (c) e o alinhamento de múltiplas sequências da proteína eL20 (d) mostram que os resíduos de ligação a nucleotídeos F170 e K172 são conservados na maioria dos Microsporidia típicos, com exceção de S. lophii, com exceção dos Microsporidia de ramificação inicial, que mantiveram a extensão ES39L rRNA. e Esta figura mostra que os resíduos de ligação a nucleotídeos F170 e K172 estão presentes apenas em eL20 do genoma altamente reduzido de Microsporidia, mas não em outros eucariotos. No geral, esses dados sugerem que os ribossomos de Microsporidia desenvolveram um sítio de ligação a nucleotídeos que parece se ligar a moléculas de AMP e usá-las para estabilizar interações proteína-proteína na estrutura ribossômica. A alta conservação desse sítio de ligação em Microsporidia e sua ausência em outros eucariotos sugere que esse sítio pode fornecer uma vantagem de sobrevivência seletiva para Microsporidia. Assim, a cavidade de ligação de nucleotídeos no ribossomo dos microsporídios não parece ser uma característica degenerada ou forma final de degradação do rRNA, como descrito anteriormente, mas sim uma inovação evolutiva útil que permite ao ribossomo dos microsporídios ligar-se diretamente a pequenas moléculas, utilizando-as como blocos de construção moleculares. Blocos de construção para ribossomos. Essa descoberta torna o ribossomo dos microsporídios o único ribossomo conhecido a utilizar um único nucleotídeo como bloco de construção estrutural. f Via evolutiva hipotética derivada da ligação de nucleotídeos.
A segunda densidade de baixo peso molecular está localizada na interface entre as proteínas ribossômicas uL9 e eL30 (Fig. 5a). Essa interface foi previamente descrita na estrutura do ribossoma de Saccharomyces cerevisiae como um sítio de ligação para o nucleotídeo 25S do rRNA A3186 (parte da extensão do rRNA ES39L)38. Foi demonstrado que, em ribossomos ES39L degenerados de P. locustae, essa interface se liga a um único nucleotídeo desconhecido, 31, e presume-se que esse nucleotídeo seja uma forma final reduzida de rRNA, na qual o comprimento do rRNA é de aproximadamente 130-230 bases. O ES39L é reduzido a um único nucleotídeo, 32,43. Nossas imagens de crio-EM corroboram a ideia de que a densidade pode ser explicada por nucleotídeos. No entanto, a maior resolução de nossa estrutura mostrou que esse nucleotídeo é uma molécula extrarribossômica, possivelmente AMP (Fig. 5a, b).
Em seguida, perguntamos se o sítio de ligação do nucleotídeo aparecia no ribossomo de E. cuniculi ou se já existia anteriormente. Como a ligação do nucleotídeo é mediada principalmente pelos resíduos Phe170 e Lys172 na proteína ribossomal eL30, avaliamos a conservação desses resíduos em 4.396 eucariotos representativos. Como no caso de uL15 acima, descobrimos que os resíduos Phe170 e Lys172 são altamente conservados apenas em Microsporídios típicos, mas ausentes em outros eucariotos, incluindo Microsporídios atípicos Mitosporidium e Amphiamblys, nos quais o fragmento de rRNA ES39L não é reduzido 44, 45, 46 (Fig. 5c).
Em conjunto, esses dados corroboram a ideia de que E. cuniculi e possivelmente outros microsporídios canônicos desenvolveram a capacidade de capturar com eficiência um grande número de pequenos metabólitos na estrutura do ribossomo para compensar o declínio nos níveis de rRNA e proteína. Ao fazer isso, eles desenvolveram uma capacidade única de se ligar a nucleotídeos fora do ribossomo, demonstrando que as estruturas moleculares parasitas compensam capturando pequenos metabólitos abundantes e os utilizando como imitadores estruturais de fragmentos de RNA e proteína degradados.
A terceira parte não simulada do nosso mapa de crio-EM, encontrada na grande subunidade ribossômica. A resolução relativamente alta (2,6 Å) do nosso mapa sugere que essa densidade pertence a proteínas com combinações únicas de grandes resíduos de cadeia lateral, o que nos permitiu identificar essa densidade como uma proteína ribossômica previamente desconhecida, que identificamos como msL2 (proteína L2 específica de Microsporidia) (métodos, figura 6). Nossa busca por homologia mostrou que a msL2 é conservada no clado Microsporidia dos gêneros Encephaliter e Orosporidium, mas ausente em outras espécies, incluindo outros Microsporidia. Na estrutura ribossômica, a msL2 ocupa uma lacuna formada pela perda do rRNA ES31L estendido. Nesse vazio, a msL2 ajuda a estabilizar o dobramento do rRNA e pode compensar a perda de ES31L (Figura 6).
a Densidade eletrônica e modelo da proteína ribossômica específica de Microsporídios, msL2, encontrada em ribossomos de E. cuniculi. b A maioria dos ribossomos eucarióticos, incluindo o ribossomo 80S de Saccharomyces cerevisiae, apresenta perda da amplificação do rRNA ES19L na maioria das espécies de Microsporídios. A estrutura previamente estabelecida do ribossomo de microsporídios de V. necatrix sugere que a perda de ES19L nesses parasitas é compensada pela evolução da nova proteína ribossômica msL1. Neste estudo, descobrimos que o ribossomo de E. cuniculi também desenvolveu uma proteína adicional mimetizadora de RNA ribossômico como uma aparente compensação pela perda de ES19L. No entanto, msL2 (atualmente anotada como a proteína hipotética ECU06_1135) e msL1 têm origens estruturais e evolutivas diferentes. c Esta descoberta da geração de proteínas ribossomais msL1 e msL2 evolutivamente não relacionadas sugere que, se os ribossomos acumularem mutações prejudiciais em seu rRNA, podem atingir níveis sem precedentes de diversidade composicional, mesmo em um pequeno subconjunto de espécies intimamente relacionadas. Esta descoberta pode ajudar a esclarecer a origem e a evolução do ribossomo mitocondrial, conhecido por seu rRNA altamente reduzido e pela variabilidade anormal na composição proteica entre as espécies.
Em seguida, comparamos a proteína msL2 com a proteína msL1 descrita anteriormente, a única proteína ribossomal específica de microsporídios conhecida encontrada no ribossomo de V. necatrix. Queríamos testar se msL1 e msL2 são evolutivamente relacionadas. Nossa análise mostrou que msL1 e msL2 ocupam a mesma cavidade na estrutura ribossômica, mas possuem estruturas primárias e terciárias diferentes, o que indica sua origem evolutiva independente (Fig. 6). Assim, nossa descoberta de msL2 fornece evidências de que grupos de espécies eucarióticas compactas podem desenvolver independentemente proteínas ribossômicas estruturalmente distintas para compensar a perda de fragmentos de rRNA. Essa descoberta é notável, pois a maioria dos ribossomos eucarióticos citoplasmáticos contém uma proteína invariante, incluindo a mesma família de 81 proteínas ribossômicas. O aparecimento de msL1 e msL2 em vários clados de microsporídios em resposta à perda de segmentos estendidos de rRNA sugere que a degradação da arquitetura molecular do parasita faz com que os parasitas busquem mutações compensatórias, o que pode eventualmente levar à sua aquisição em diferentes populações de parasitas. estruturas.
Finalmente, quando nosso modelo foi concluído, comparamos a composição do ribossoma de E. cuniculi com a prevista a partir da sequência do genoma. Várias proteínas ribossômicas, incluindo eL14, eL38, eL41 e eS30, eram anteriormente consideradas ausentes do genoma de E. cuniculi devido à aparente ausência de seus homólogos no genoma de E. cuniculi. A perda de muitas proteínas ribossômicas também é prevista na maioria dos outros parasitas intracelulares e endossimbiontes altamente reduzidos. Por exemplo, embora a maioria das bactérias de vida livre contenha a mesma família de 54 proteínas ribossômicas, apenas 11 dessas famílias de proteínas têm homólogos detectáveis ​​em cada genoma analisado de bactérias restritas ao hospedeiro. Em apoio a essa noção, uma perda de proteínas ribossômicas foi observada experimentalmente em microsporídios de V. necatrix e P. locustae, que não possuem as proteínas eL38 e eL4131,32.
No entanto, nossas estruturas mostram que apenas eL38, eL41 e eS30 estão realmente perdidos no ribossomo de E. cuniculi. A proteína eL14 foi conservada e nossa estrutura mostrou por que essa proteína não pôde ser encontrada na busca por homologia (Fig. 7). Nos ribossomos de E. cuniculi, a maior parte do sítio de ligação de eL14 é perdida devido à degradação do ES39L amplificado por rRNA. Na ausência de ES39L, eL14 perdeu a maior parte de sua estrutura secundária, e apenas 18% da sequência de eL14 era idêntica em E. cuniculi e S. cerevisiae. Essa má preservação da sequência é notável porque mesmo Saccharomyces cerevisiae e Homo sapiens — organismos que evoluíram com 1,5 bilhão de anos de diferença — compartilham mais de 51% dos mesmos resíduos em eL14. Essa perda anômala de conservação explica por que E. cuniculi eL14 é atualmente anotado como a suposta proteína M970_061160 e não como a proteína ribossômica eL1427.
e O ribossoma de Microsporidia perdeu a extensão ES39L rRNA, que eliminou parcialmente o sítio de ligação da proteína ribossomal eL14. Na ausência de ES39L, a proteína eL14 do micrósporo sofre uma perda de estrutura secundária, na qual a antiga α-hélice de ligação ao rRNA degenera em um loop de comprimento mínimo. b O alinhamento de múltiplas sequências mostra que a proteína eL14 é altamente conservada em espécies eucarióticas (57% de identidade de sequência entre homólogos de levedura e humanos), mas mal conservada e divergente em microsporídios (nos quais não mais do que 24% dos resíduos são idênticos ao homólogo de eL14). de S. cerevisiae ou H. sapiens). Essa má conservação de sequência e variabilidade da estrutura secundária explicam por que o homólogo de eL14 nunca foi encontrado em E. cuniculi e por que se acredita que essa proteína tenha sido perdida em E. cuniculi. Em contraste, a eL14 de E. cuniculi foi anteriormente anotada como uma suposta proteína M970_061160. Essa observação sugere que a diversidade do genoma de microsporídios está atualmente superestimada: alguns genes que se acreditava estarem perdidos em microsporídios estão, na verdade, preservados, embora em formas altamente diferenciadas; em vez disso, acredita-se que alguns codifiquem genes de microsporídios para proteínas específicas de vermes (por exemplo, a proteína hipotética M970_061160), que na verdade codifica proteínas muito diversas encontradas em outros eucariotos.
Essa descoberta sugere que a desnaturação do rRNA pode levar a uma perda drástica da conservação da sequência em proteínas ribossomais adjacentes, tornando-as indetectáveis ​​para pesquisas de homologia. Assim, podemos superestimar o grau real de degradação molecular em organismos com genomas pequenos, uma vez que algumas proteínas que se pensava estarem perdidas na verdade persistem, embora em formas altamente alteradas.
Como os parasitas podem manter a função de suas máquinas moleculares em condições de extrema redução genômica? Nosso estudo responde a essa pergunta descrevendo a complexa estrutura molecular (ribossomo) de E. cuniculi, um organismo com um dos menores genomas eucarióticos.
Sabe-se há quase duas décadas que as moléculas de proteína e RNA em parasitas microbianos frequentemente diferem de suas moléculas homólogas em espécies de vida livre por não possuírem centros de controle de qualidade, serem reduzidas a 50% de seu tamanho em micróbios de vida livre, etc., e por muitas mutações debilitantes que prejudicam o dobramento e a função. Por exemplo, espera-se que os ribossomos de organismos com genoma pequeno, incluindo muitos parasitas intracelulares e endossimbiontes, não possuam diversas proteínas ribossomais e até um terço dos nucleotídeos de rRNA em comparação com espécies de vida livre [27, 29, 30, 49]. No entanto, o funcionamento dessas moléculas em parasitas permanece em grande parte um mistério, estudado principalmente por meio da genômica comparativa.
Nosso estudo mostra que a estrutura de macromoléculas pode revelar muitos aspectos da evolução que são difíceis de extrair de estudos genômicos comparativos tradicionais de parasitas intracelulares e outros organismos restritos ao hospedeiro (Fig. Suplementar 7). Por exemplo, o exemplo da proteína eL14 mostra que podemos superestimar o grau real de degradação do aparato molecular em espécies parasitárias. Acredita-se agora que parasitas encefalíticos tenham centenas de genes específicos de microsporídios. No entanto, nossos resultados mostram que alguns desses genes aparentemente específicos são, na verdade, apenas variantes muito diferentes de genes comuns em outros eucariotos. Além disso, o exemplo da proteína msL2 mostra como ignoramos novas proteínas ribossômicas e subestimamos o conteúdo das máquinas moleculares parasitárias. O exemplo de pequenas moléculas mostra como podemos ignorar as inovações mais engenhosas em estruturas moleculares parasitárias que podem lhes conferir nova atividade biológica.
Em conjunto, esses resultados aprimoram nossa compreensão das diferenças entre as estruturas moleculares de organismos com hospedeiros restritos e suas contrapartes em organismos de vida livre. Mostramos que máquinas moleculares, há muito tempo consideradas reduzidas, degeneradas e sujeitas a diversas mutações debilitantes, apresentam, na verdade, um conjunto de características estruturais incomuns sistematicamente ignoradas.
Por outro lado, os fragmentos não volumosos de rRNA e os fragmentos fundidos que encontramos nos ribossomos de E. cuniculi sugerem que a redução do genoma pode mudar até mesmo aquelas partes da maquinaria molecular básica que são preservadas nos três domínios da vida — após quase 3,5 bilhões de anos de evolução independente das espécies.
Os fragmentos de rRNA fundidos e livres de protuberâncias nos ribossomos de E. cuniculi são de particular interesse à luz de estudos anteriores de moléculas de RNA em bactérias endossimbióticas. Por exemplo, no endossimbionte afídeo Buchnera aphidicola, as moléculas de rRNA e tRNA demonstraram ter estruturas sensíveis à temperatura devido ao viés de composição A+T e uma alta proporção de pares de bases não canônicos20,50. Essas mudanças no RNA, bem como mudanças nas moléculas de proteína, são agora consideradas responsáveis ​​pela dependência excessiva dos endossimbiontes em parceiros e pela incapacidade dos endossimbiontes de transferir calor21,23. Embora o rRNA de microsporídios parasitas tenha mudanças estruturalmente distintas, a natureza dessas mudanças sugere que a estabilidade térmica reduzida e a maior dependência de proteínas chaperonas podem ser características comuns de moléculas de RNA em organismos com genomas reduzidos.
Por outro lado, nossas estruturas mostram que os microsporídios parasitas desenvolveram uma capacidade única de resistir a fragmentos de rRNA e proteínas amplamente conservados, desenvolvendo a capacidade de usar pequenos metabólitos abundantes e prontamente disponíveis como imitadores estruturais de fragmentos de rRNA e proteínas degenerados. Degradação da estrutura molecular. . Essa opinião é apoiada pelo fato de que pequenas moléculas que compensam a perda de fragmentos de proteínas no rRNA e nos ribossomos de E. cuniculi se ligam a resíduos específicos de microsporídios nas proteínas uL15 e eL30. Isso sugere que a ligação de pequenas moléculas aos ribossomos pode ser um produto da seleção positiva, na qual mutações específicas de microsporídios em proteínas ribossômicas foram selecionadas por sua capacidade de aumentar a afinidade dos ribossomos por pequenas moléculas, o que pode levar a organismos ribossômicos mais eficientes. A descoberta revela uma inovação inteligente na estrutura molecular dos parasitas microbianos e nos dá uma melhor compreensão de como as estruturas moleculares dos parasitas mantêm sua função apesar da evolução reducionista.
Atualmente, a identificação dessas pequenas moléculas permanece obscura. Não está claro por que a aparência dessas pequenas moléculas na estrutura ribossômica difere entre as espécies de microsporídios. Em particular, não está claro por que a ligação de nucleotídeos é observada nos ribossomos de E. cuniculi e P. locustae, e não nos ribossomos de V. necatrix, apesar da presença do resíduo F170 nas proteínas eL20 e K172 de V. necatrix. Essa deleção pode ser causada pelo resíduo 43 uL6 (localizado adjacente à cavidade de ligação de nucleotídeos), que é tirosina em V. necatrix e não treonina em E. cuniculi e P. locustae. A volumosa cadeia lateral aromática de Tyr43 pode interferir na ligação de nucleotídeos devido à sobreposição estérica. Alternativamente, a aparente deleção de nucleotídeos pode ser devido à baixa resolução da imagem de crio-EM, o que dificulta a modelagem de fragmentos ribossômicos de V. necatrix.
Por outro lado, nosso trabalho sugere que o processo de decaimento do genoma pode ser uma força inventiva. Em particular, a estrutura do ribossomo de E. cuniculi sugere que a perda de rRNA e fragmentos de proteína no ribossomo dos microsporídios cria uma pressão evolutiva que promove alterações na estrutura do ribossomo. Essas variantes ocorrem longe do sítio ativo do ribossomo e parecem ajudar a manter (ou restaurar) a montagem ideal do ribossomo, que de outra forma seria interrompida pela redução do rRNA. Isso sugere que uma grande inovação do ribossomo dos microsporídios parece ter evoluído para a necessidade de amortecer a deriva gênica.
Talvez isso seja melhor ilustrado pela ligação de nucleotídeos, que nunca foi observada em outros organismos até agora. O fato de resíduos de ligação de nucleotídeos estarem presentes em microsporídios típicos, mas não em outros eucariotos, sugere que os sítios de ligação de nucleotídeos não são apenas relíquias esperando para desaparecer, ou o sítio final para o rRNA ser restaurado à forma de nucleotídeos individuais. Em vez disso, esse sítio parece ser uma característica útil que pode ter evoluído ao longo de várias rodadas de seleção positiva. Os sítios de ligação de nucleotídeos podem ser um subproduto da seleção natural: uma vez que o ES39L é degradado, os microsporídios são forçados a buscar compensação para restaurar a biogênese ideal do ribossoma na ausência de ES39L. Como esse nucleotídeo pode imitar os contatos moleculares do nucleotídeo A3186 no ES39L, a molécula de nucleotídeo se torna um bloco de construção do ribossoma, cuja ligação é ainda mais aprimorada pela mutação da sequência eL30.
No que diz respeito à evolução molecular de parasitas intracelulares, nosso estudo mostra que as forças da seleção natural darwiniana e a deriva genética da degradação do genoma não operam em paralelo, mas sim oscilam. Primeiro, a deriva genética elimina características importantes das biomoléculas, tornando a compensação extremamente necessária. Somente quando os parasitas satisfizerem essa necessidade por meio da seleção natural darwiniana, suas macromoléculas terão a chance de desenvolver suas características mais impressionantes e inovadoras. Importantemente, a evolução dos sítios de ligação de nucleotídeos no ribossoma de E. cuniculi sugere que esse padrão de perda-ganho da evolução molecular não apenas amortiza mutações deletérias, mas às vezes confere funções inteiramente novas às macromoléculas parasitárias.
Essa ideia é consistente com a teoria do equilíbrio móvel de Sewell Wright, que afirma que um sistema estrito de seleção natural limita a capacidade dos organismos de inovar51,52,53. No entanto, se a deriva genética interrompe a seleção natural, essas derivas podem produzir mudanças que não são em si adaptativas (ou mesmo prejudiciais), mas levam a novas mudanças que proporcionam maior aptidão ou nova atividade biológica. Nossa estrutura corrobora essa ideia ao ilustrar que o mesmo tipo de mutação que reduz a dobra e a função de uma biomolécula parece ser o principal gatilho para seu aprimoramento. Em consonância com o modelo evolucionário ganha-ganha, nosso estudo mostra que a decadência do genoma, tradicionalmente vista como um processo degenerativo, também é um importante impulsionador da inovação, às vezes, e talvez até mesmo com frequência, permitindo que macromoléculas adquiram novas atividades parasitárias.