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A evolução de parasitas microbianos envolve uma contraposição entre a seleção natural, que leva ao aprimoramento dos parasitas, e a deriva genética, que causa a perda de genes e o acúmulo de mutações deletérias. Aqui, para entender como essa contraposição ocorre na escala de uma única macromolécula, descrevemos a estrutura do ribossomo de Encephalitozoon cuniculi, um organismo eucariótico com um dos menores genomas da natureza, obtida por criomicroscopia eletrônica (criomicroscopia eletrônica). A redução extrema do rRNA nos ribossomos de E. cuniculi é acompanhada por mudanças estruturais sem precedentes, como a evolução de ligantes de rRNA fundidos, até então desconhecidos, e rRNA sem protuberâncias. Além disso, o ribossomo de E. cuniculi sobreviveu à perda de fragmentos de rRNA e proteínas desenvolvendo a capacidade de usar pequenas moléculas como mimetizadores estruturais de fragmentos de rRNA e proteínas degradados. Em suma, mostramos que estruturas moleculares, antes consideradas reduzidas, degeneradas e sujeitas a mutações debilitantes, possuem diversos mecanismos compensatórios que as mantêm ativas apesar das contrações moleculares extremas.
Como a maioria dos grupos de parasitas microbianos possui ferramentas moleculares únicas para explorar seus hospedeiros, muitas vezes precisamos desenvolver terapias diferentes para diferentes grupos de parasitas1,2. No entanto, novas evidências sugerem que alguns aspectos da evolução dos parasitas são convergentes e amplamente previsíveis, indicando uma base potencial para amplas intervenções terapêuticas em parasitas microbianos3,4,5,6,7,8,9.
Estudos anteriores identificaram uma tendência evolutiva comum em parasitas microbianos chamada redução ou degradação genômica^10,11,12,13. Pesquisas atuais mostram que, quando os microrganismos abandonam seu estilo de vida livre e se tornam parasitas intracelulares (ou endossimbiontes), seus genomas sofrem metamorfoses lentas, porém surpreendentes, ao longo de milhões de anos^9,11. Em um processo conhecido como degradação genômica, os parasitas microbianos acumulam mutações deletérias que transformam muitos genes anteriormente importantes em pseudogenes, levando à perda gradual de genes e ao colapso mutacional^14,15. Esse colapso pode destruir até 95% dos genes nos organismos intracelulares mais antigos, em comparação com espécies de vida livre intimamente relacionadas. Assim, a evolução dos parasitas intracelulares é uma disputa entre duas forças opostas: a seleção natural darwiniana, que leva ao aprimoramento dos parasitas, e o colapso do genoma, que os relega ao esquecimento. Como o parasita conseguiu emergir dessa disputa e manter a atividade de sua estrutura molecular permanece um mistério.
Embora o mecanismo de degradação do genoma não seja totalmente compreendido, parece ocorrer principalmente devido à deriva genética frequente. Como os parasitas vivem em populações pequenas, assexuadas e geneticamente limitadas, eles não conseguem eliminar eficazmente as mutações deletérias que às vezes ocorrem durante a replicação do DNA. Isso leva ao acúmulo irreversível de mutações prejudiciais e à redução do genoma do parasita. Como resultado, o parasita não apenas perde genes que não são mais necessários para sua sobrevivência no ambiente intracelular, mas também sofre com a incapacidade das populações de parasitas de eliminar eficazmente mutações deletérias esporádicas, o que faz com que essas mutações se acumulem por todo o genoma, incluindo seus genes mais importantes.
Grande parte da nossa compreensão atual sobre a redução do genoma baseia-se unicamente em comparações de sequências genômicas, com menos atenção às alterações em moléculas reais que desempenham funções de manutenção celular e servem como potenciais alvos terapêuticos. Estudos comparativos demonstraram que a carga de mutações microbianas intracelulares deletérias parece predispor proteínas e ácidos nucleicos ao dobramento incorreto e à agregação, tornando-os mais dependentes de chaperonas e hipersensíveis ao calor^{19,20,21,22,23}. Além disso, diversos parasitas — cuja evolução independente foi, por vezes, separada por até 2,5 bilhões de anos — sofreram uma perda semelhante de centros de controle de qualidade em seus mecanismos de síntese proteica^5,6 e reparo de DNA²⁴. Contudo, pouco se sabe sobre o impacto do estilo de vida intracelular em todas as outras propriedades das macromoléculas celulares, incluindo a adaptação molecular a uma carga crescente de mutações deletérias.
Neste trabalho, com o objetivo de compreender melhor a evolução de proteínas e ácidos nucleicos de microrganismos intracelulares, determinamos a estrutura dos ribossomos do parasita intracelular Encephalitozoon cuniculi. E. cuniculi é um organismo semelhante a um fungo, pertencente a um grupo de microsporídios parasitas que possuem genomas eucarióticos excepcionalmente pequenos e, portanto, são utilizados como organismos modelo para o estudo da degradação genômica25,26,27,28,29,30. Recentemente, a estrutura dos ribossomos por criomicroscopia eletrônica (criomicroscopia eletrônica) foi determinada para genomas moderadamente reduzidos de Microsporidia, Paranosema locustae e Vairimorpha necatrix31,32 (genoma de ~3,2 Mb). Essas estruturas sugerem que alguma perda na amplificação do rRNA é compensada pelo desenvolvimento de novos contatos entre proteínas ribossômicas vizinhas ou pela aquisição de novas proteínas ribossômicas msL131,32. A espécie Encephalitozoon (genoma de aproximadamente 2,5 milhões de pares de bases), juntamente com seu parente mais próximo, Ordospora, demonstra o grau máximo de redução genômica em eucariotos – possui menos de 2000 genes codificadores de proteínas, e espera-se que seus ribossomos não apenas sejam desprovidos de fragmentos de expansão de rRNA (fragmentos de rRNA que distinguem os ribossomos eucarióticos dos bacterianos), como também possuam quatro proteínas ribossômicas devido à ausência de homólogos no genoma de E. cuniculi26,27,28. Portanto, concluímos que o ribossomo de E. cuniculi pode revelar estratégias até então desconhecidas de adaptação molecular à degradação genômica.
Nossa estrutura obtida por criomicroscopia eletrônica representa o menor ribossomo citoplasmático eucariótico já caracterizado e fornece informações sobre como o grau máximo de redução do genoma afeta a estrutura, a montagem e a evolução da maquinaria molecular que é essencial para a célula. Descobrimos que o ribossomo de *E. cuniculi* viola muitos dos princípios amplamente conservados de dobramento do RNA e montagem do ribossomo, e descobrimos uma nova proteína ribossômica, até então desconhecida. De forma bastante inesperada, mostramos que os ribossomos de microsporídios desenvolveram a capacidade de se ligar a pequenas moléculas e levantamos a hipótese de que truncamentos no rRNA e em proteínas desencadeiam inovações evolutivas que podem, em última análise, conferir qualidades úteis ao ribossomo.
Para aprimorar nossa compreensão da evolução de proteínas e ácidos nucleicos em organismos intracelulares, decidimos isolar esporos de *E. cuniculi* de culturas de células de mamíferos infectadas, a fim de purificar seus ribossomos e determinar a estrutura destes. É difícil obter um grande número de microsporídios parasitas, pois estes não podem ser cultivados em meio de cultura. Em vez disso, crescem e se reproduzem apenas dentro da célula hospedeira. Portanto, para obter biomassa de *E. cuniculi* para purificação de ribossomos, infectamos a linhagem celular renal de mamífero RK13 com esporos de *E. cuniculi* e cultivamos essas células infectadas por várias semanas para permitir o crescimento e a multiplicação de *E. cuniculi*. Utilizando uma monocamada de células infectadas de aproximadamente meio metro quadrado, conseguimos purificar cerca de 300 mg de esporos de *Microsporidia* e utilizá-los para isolar ribossomos. Em seguida, rompemos os esporos purificados com esferas de vidro e isolamos os ribossomos brutos utilizando fracionamento gradual dos lisados ​​com polietilenoglicol. Isso nos permitiu obter aproximadamente 300 µg de ribossomos brutos de E. cuniculi para análise estrutural.
Em seguida, coletamos imagens de crio-microscopia eletrônica (crio-ME) usando as amostras de ribossomos resultantes e processamos essas imagens usando máscaras correspondentes à subunidade ribossômica maior, à cabeça da subunidade menor e à subunidade menor. Durante esse processo, coletamos imagens de cerca de 108.000 partículas ribossômicas e computamos imagens de crio-ME com uma resolução de 2,7 Å (Figuras Suplementares 1-3). Utilizamos então as imagens de crio-ME para modelar o rRNA, a proteína ribossômica e o fator de hibernação Mdf1 associados aos ribossomos de E. cuniculi (Fig. 1a, b).
a) Estrutura do ribossomo de E. cuniculi em complexo com o fator de hibernação Mdf1 (ID pdb 7QEP). b) Mapa do fator de hibernação Mdf1 associado ao ribossomo de E. cuniculi. c) Mapa da estrutura secundária comparando o rRNA recuperado em espécies de Microsporidium com estruturas ribossômicas conhecidas. Os painéis mostram a localização dos fragmentos de rRNA amplificados (ES) e dos sítios ativos do ribossomo, incluindo o sítio de decodificação (DC), a alça da sarcinicina (SRL) e o centro peptidil transferase (PTC). d) A densidade eletrônica correspondente ao centro peptidil transferase do ribossomo de E. cuniculi sugere que esse sítio catalítico possui a mesma estrutura no parasita E. cuniculi e em seus hospedeiros, incluindo H. sapiens. e, f A densidade eletrônica correspondente do centro de decodificação (e) e a estrutura esquemática do centro de decodificação (f) indicam que E. cuniculi possui resíduos U1491 em vez de A1491 (numeração de E. coli) em muitos outros eucariotos. Essa mudança sugere que E. cuniculi pode ser sensível a antibióticos que têm como alvo esse sítio ativo.
Em contraste com as estruturas previamente estabelecidas dos ribossomos de V. necatrix e P. locustae (ambas as estruturas representam a mesma família de microsporídios, Nosematidae, e são muito semelhantes entre si), 31,32 os ribossomos de E. cuniculi sofrem numerosos processos de fragmentação de rRNA e proteínas. Além disso, ocorre desnaturação (Figuras Suplementares 4-6). No rRNA, as mudanças mais marcantes incluíram a perda completa do fragmento amplificado de rRNA 25S, ES12L, e a degeneração parcial das hélices h39, h41 e H18 (Fig. 1c, Fig. Suplementar 4). Entre as proteínas ribossômicas, as mudanças mais marcantes incluíram a perda completa da proteína eS30 e o encurtamento das proteínas eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 e eS7 (Figuras Suplementares 4, 5).
Assim, a redução extrema dos genomas das espécies de Encephalotozoon/Ordospora se reflete na estrutura de seus ribossomos: os ribossomos de E. cuniculi apresentam a perda mais drástica de conteúdo proteico entre os ribossomos citoplasmáticos eucarióticos sujeitos à caracterização estrutural, e sequer possuem os fragmentos de rRNA e proteínas amplamente conservados não apenas em eucariotos, mas também nos três domínios da vida. A estrutura do ribossomo de E. cuniculi fornece o primeiro modelo molecular para essas mudanças e revela eventos evolutivos que foram negligenciados tanto pela genômica comparativa quanto por estudos da estrutura biomolecular intracelular (Figura Suplementar 7). A seguir, descrevemos cada um desses eventos, juntamente com suas prováveis ​​origens evolutivas e seu potencial impacto na função ribossômica.
Descobrimos então que, além de grandes truncamentos no rRNA, os ribossomos de *E. cuniculi* apresentam variações no rRNA em um de seus sítios ativos. Embora o centro peptidil transferase do ribossomo de *E. cuniculi* tenha a mesma estrutura que outros ribossomos eucarióticos (Fig. 1d), o centro de decodificação difere devido à variação na sequência do nucleotídeo 1491 (numeração de *E. coli*, Fig. 1e, f). Essa observação é importante porque o sítio de decodificação dos ribossomos eucarióticos tipicamente contém os resíduos G1408 e A1491, em comparação com os resíduos A1408 e G1491 do tipo bacteriano. Essa variação explica a diferente sensibilidade dos ribossomos bacterianos e eucarióticos à família dos aminoglicosídeos, antibióticos ribossômicos, e a outras pequenas moléculas que têm como alvo o sítio de decodificação. No sítio de decodificação do ribossomo de E. cuniculi, o resíduo A1491 foi substituído por U1491, potencialmente criando uma interface de ligação única para pequenas moléculas que têm como alvo esse sítio ativo. A mesma variante A14901 também está presente em outros microsporídios, como P. locustae e V. necatrix, sugerindo que ela é amplamente distribuída entre as espécies de microsporídios (Fig. 1f).
Como nossas amostras de ribossomos de *E. cuniculi* foram isoladas de esporos metabolicamente inativos, testamos o mapa de criomicroscopia eletrônica (criomicroscopia eletrônica) de *E. cuniculi* para verificar a ligação de ribossomos previamente descrita sob condições de estresse ou privação de nutrientes. Os fatores de hibernação 31, 32, 36, 37 e 38 foram comparados com o mapa de criomicroscopia eletrônica do ribossomo de *E. cuniculi*. Para o acoplamento molecular, ribossomos de *S. cerevisiae* foram utilizados em complexo com o fator de hibernação Stm138, ribossomos de gafanhoto em complexo com o fator Lso232 e ribossomos de *V. necatrix* em complexo com os fatores Mdf1 e Mdf231. Simultaneamente, identificamos a densidade de criomicroscopia eletrônica correspondente ao fator de repouso Mdf1. Semelhante à ligação de Mdf1 ao ribossomo de V. necatrix, Mdf1 também se liga ao ribossomo de E. cuniculi, onde bloqueia o sítio E do ribossomo, possivelmente ajudando a disponibilizar ribossomos quando os esporos do parasita se tornam metabolicamente inativos após a inativação do corpo (Figura 2).
A proteína Mdf1 bloqueia o sítio E do ribossomo, o que parece contribuir para a inativação do ribossomo quando os esporos do parasita se tornam metabolicamente inativos. Na estrutura do ribossomo de *E. cuniculi*, descobrimos que a Mdf1 forma um contato até então desconhecido com a haste ribossômica L1, a parte do ribossomo que facilita a liberação do tRNA desacetilado durante a síntese proteica. Esses contatos sugerem que a Mdf1 se dissocia do ribossomo utilizando o mesmo mecanismo que o tRNA desacetilado, fornecendo uma possível explicação de como o ribossomo remove a Mdf1 para reativar a síntese proteica.
No entanto, nossa estrutura revelou um contato desconhecido entre Mdf1 e a perna ribossômica L1 (a parte do ribossomo que auxilia na liberação do tRNA desacilado durante a síntese proteica). Em particular, Mdf1 utiliza os mesmos contatos que o segmento do cotovelo da molécula de tRNA desacilado (Fig. 2). Essa modelagem molecular, até então desconhecida, demonstrou que Mdf1 se dissocia do ribossomo utilizando o mesmo mecanismo que o tRNA desacetilado, o que explica como o ribossomo remove esse fator de hibernação para reativar a síntese proteica.
Ao construir o modelo de rRNA, descobrimos que o ribossomo de E. cuniculi possui fragmentos de rRNA com dobramento anormal, que denominamos rRNA fundido (Fig. 3). Em ribossomos que abrangem os três domínios da vida, o rRNA se dobra em estruturas nas quais a maioria das bases do rRNA se emparelha e se dobra entre si ou interage com proteínas ribossômicas38,39,40. No entanto, nos ribossomos de E. cuniculi, os rRNAs parecem violar esse princípio de dobramento, convertendo algumas de suas hélices em regiões de rRNA não dobradas.
Estrutura da hélice do rRNA 25S H18 em *S. cerevisiae*, *V. necatrix* e *E. cuniculi*. Tipicamente, em ribossomos que abrangem os três domínios da vida, esse conector se enrola em uma hélice de RNA contendo de 24 a 34 resíduos. Em *Microsporidia*, em contraste, esse conector do rRNA é gradualmente reduzido a dois conectores ricos em uridina de fita simples, contendo apenas 12 resíduos. A maioria desses resíduos está exposta a solventes. A figura mostra que os microsporídios parasitas parecem violar os princípios gerais de dobramento do rRNA, onde as bases do rRNA geralmente estão acopladas a outras bases ou envolvidas em interações rRNA-proteína. Em microsporídios, alguns fragmentos de rRNA assumem um dobramento desfavorável, no qual a antiga hélice do rRNA se torna um fragmento de fita simples alongado quase em linha reta. A presença dessas regiões incomuns permite que o rRNA dos microsporídios se ligue a fragmentos de rRNA distantes usando um número mínimo de bases de RNA.
O exemplo mais marcante dessa transição evolutiva pode ser observado na hélice H18 do rRNA 25S (Fig. 3). Em espécies que vão de *E. coli* a humanos, as bases dessa hélice de rRNA contêm de 24 a 32 nucleotídeos, formando uma hélice ligeiramente irregular. Em estruturas ribossômicas previamente identificadas de *V. necatrix* e *P. locustae*,^31,32 as bases da hélice H18 estão parcialmente desenroladas, mas o pareamento de bases nucleotídicas é preservado. No entanto, em *E. cuniculi*, esse fragmento de rRNA se transforma nos conectores mais curtos 228UUUGU232 e 301UUUUUUUUU307. Ao contrário dos fragmentos típicos de rRNA, esses conectores ricos em uridina não se enrolam nem fazem contato extenso com proteínas ribossômicas. Em vez disso, adotam estruturas abertas ao solvente e totalmente desenroladas, nas quais as cadeias de rRNA são estendidas quase retas. Essa conformação alongada explica como a E. cuniculi usa apenas 12 bases de RNA para preencher a lacuna de 33 Å entre as hélices de rRNA H16 e H18, enquanto outras espécies requerem pelo menos o dobro de bases de rRNA para preencher essa lacuna.
Assim, podemos demonstrar que, por meio de dobramento energeticamente desfavorável, os microsporídios parasitas desenvolveram uma estratégia para contrair até mesmo os segmentos de rRNA que permanecem amplamente conservados entre as espécies nos três domínios da vida. Aparentemente, ao acumular mutações que transformam as hélices de rRNA em curtos ligantes poli-U, o *E. cuniculi* consegue formar fragmentos de rRNA incomuns, contendo o mínimo de nucleotídeos possível para a ligação de fragmentos de rRNA distais. Isso ajuda a explicar como os microsporídios alcançaram uma redução drástica em sua estrutura molecular básica sem perder sua integridade estrutural e funcional.
Outra característica incomum do rRNA de E. cuniculi é a aparência do rRNA sem espessamentos (Fig. 4). As protuberâncias são nucleotídeos sem pares de bases que se torcem para fora da hélice do RNA em vez de se esconderem nela. A maioria das protuberâncias do rRNA atua como adesivos moleculares, ajudando a ligar proteínas ribossômicas adjacentes ou outros fragmentos de rRNA. Algumas das protuberâncias atuam como dobradiças, permitindo que a hélice do rRNA se flexione e se dobre de forma otimizada para a síntese produtiva de proteínas 41 .
a Uma protrusão do rRNA (numeração de S. cerevisiae) está ausente na estrutura do ribossomo de E. cuniculi, mas presente na maioria dos outros eucariotos b Ribossomos internos de E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens e E. cuniculi. Os parasitas carecem de muitas das protuberâncias antigas e altamente conservadas do rRNA. Esses espessamentos estabilizam a estrutura do ribossomo; portanto, sua ausência em microsporídios indica uma estabilidade reduzida do dobramento do rRNA nesses parasitas. A comparação com as hastes P (hastes L7/L12 em bactérias) mostra que a perda das protuberâncias do rRNA às vezes coincide com o aparecimento de novas protuberâncias próximas às perdidas. A hélice H42 no rRNA 23S/28S possui uma protuberância antiga (U1206 em Saccharomyces cerevisiae) estimada em pelo menos 3,5 bilhões de anos devido à sua proteção em três domínios da vida. Nos microsporídios, essa protuberância é eliminada. No entanto, uma nova protuberância apareceu ao lado da protuberância perdida (A1306 em E. cuniculi).
Surpreendentemente, descobrimos que os ribossomos de E. cuniculi não possuem a maioria das protuberâncias de rRNA encontradas em outras espécies, incluindo mais de 30 protuberâncias conservadas em outros eucariotos (Fig. 4a). Essa perda elimina muitos contatos entre as subunidades ribossômicas e as hélices de rRNA adjacentes, criando, por vezes, grandes vazios ocos dentro do ribossomo, tornando o ribossomo de E. cuniculi mais poroso em comparação com ribossomos mais tradicionais (Fig. 4b). Notavelmente, descobrimos que a maioria dessas protuberâncias também estava ausente nas estruturas ribossômicas de V. necatrix e P. locustae previamente identificadas, que foram negligenciadas por análises estruturais anteriores31,32.
Às vezes, a perda de protuberâncias no rRNA é acompanhada pelo desenvolvimento de novas protuberâncias próximas à protuberância perdida. Por exemplo, a haste P ribossômica contém uma protuberância U1208 (em Saccharomyces cerevisiae) que sobreviveu de E. coli até humanos e, portanto, estima-se que tenha 3,5 bilhões de anos. Durante a síntese proteica, essa protuberância auxilia a haste P a transitar entre conformações abertas e fechadas, permitindo que o ribossomo recrute fatores de tradução e os entregue ao sítio ativo. Nos ribossomos de E. cuniculi, esse espessamento está ausente; no entanto, um novo espessamento (G883), localizado em apenas três pares de bases, pode contribuir para a restauração da flexibilidade ideal da haste P (Fig. 4c).
Nossos dados sobre rRNA sem protuberâncias sugerem que a minimização do rRNA não se limita à perda de elementos do rRNA na superfície do ribossomo, mas também pode envolver o núcleo do ribossomo, criando um defeito molecular específico do parasita que não foi descrito em células de vida livre.
Após a modelagem de proteínas ribossômicas canônicas e rRNA, descobrimos que os componentes ribossômicos convencionais não explicam as três partes da imagem de crio-microscopia eletrônica (crio-ME). Dois desses fragmentos são moléculas pequenas (Fig. 5, Fig. Suplementar 8). O primeiro segmento está intercalado entre as proteínas ribossômicas uL15 e eL18 em uma posição geralmente ocupada pela extremidade C-terminal de eL18, que é encurtada em E. cuniculi. Embora não possamos determinar a identidade dessa molécula, o tamanho e a forma dessa ilha de densidade são bem explicados pela presença de moléculas de espermidina. Sua ligação ao ribossomo é estabilizada por mutações específicas de microsporídios nas proteínas uL15 (Asp51 e Arg56), que parecem aumentar a afinidade do ribossomo por essa pequena molécula, permitindo que uL15 a envolva em uma estrutura ribossômica (Fig. Suplementar 2). 8, dados adicionais 1, 2).
Imagens de criomicroscopia eletrônica (crio-ME) mostrando a presença de nucleotídeos fora da ribose ligada ao ribossomo de *E. cuniculi*. No ribossomo de *E. cuniculi*, esse nucleotídeo ocupa o mesmo lugar que o nucleotídeo A3186 do rRNA 25S (numeração de *Saccharomyces cerevisiae*) na maioria dos outros ribossomos eucarióticos. b Na estrutura ribossômica de *E. cuniculi*, esse nucleotídeo está localizado entre as proteínas ribossômicas uL9 e eL20, estabilizando assim o contato entre as duas proteínas. cd Análise de conservação da sequência de eL20 entre espécies de microsporídios. A árvore filogenética das espécies de Microsporidia (c) e o alinhamento de múltiplas sequências da proteína eL20 (d) mostram que os resíduos de ligação a nucleotídeos F170 e K172 são conservados na maioria das Microsporidia típicas, com exceção de S. lophii, e com exceção das Microsporidia de ramificação inicial, que retiveram a extensão do rRNA ES39L. e Esta figura mostra que os resíduos de ligação a nucleotídeos F170 e K172 estão presentes apenas na eL20 do genoma altamente reduzido das Microsporidia, mas não em outros eucariotos. No geral, esses dados sugerem que os ribossomos das Microsporidia desenvolveram um sítio de ligação a nucleotídeos que parece se ligar a moléculas de AMP e usá-las para estabilizar interações proteína-proteína na estrutura ribossômica. A alta conservação desse sítio de ligação nas Microsporidia e sua ausência em outros eucariotos sugerem que esse sítio pode conferir uma vantagem seletiva de sobrevivência às Microsporidia. Assim, o sítio de ligação de nucleotídeos no ribossomo da microsporídia não parece ser uma característica degenerada ou uma forma final de degradação do rRNA, como descrito anteriormente, mas sim uma inovação evolutiva útil que permite ao ribossomo da microsporídia ligar-se diretamente a pequenas moléculas, utilizando-as como blocos de construção moleculares para os ribossomos. Essa descoberta torna o ribossomo da microsporídia o único ribossomo conhecido por utilizar um único nucleotídeo como seu bloco de construção estrutural. f Caminho evolutivo hipotético derivado da ligação de nucleotídeos.
A segunda densidade de baixo peso molecular está localizada na interface entre as proteínas ribossômicas uL9 e eL30 (Fig. 5a). Essa interface foi previamente descrita na estrutura do ribossomo de Saccharomyces cerevisiae como um sítio de ligação para o nucleotídeo 25S do rRNA A3186 (parte da extensão do rRNA ES39L)38. Foi demonstrado que, em ribossomos degenerados de P. locustae ES39L, essa interface se liga a um único nucleotídeo desconhecido31, e presume-se que esse nucleotídeo seja uma forma final reduzida do rRNA, cujo comprimento é de aproximadamente 130-230 bases. O ES39L é reduzido a um único nucleotídeo32,43. Nossas imagens de crio-EM corroboram a ideia de que a densidade pode ser explicada por nucleotídeos. No entanto, a maior resolução da nossa estrutura mostrou que esse nucleotídeo é uma molécula extrarribossômica, possivelmente um AMP (Fig. 5a, b).
Em seguida, questionamos se o sítio de ligação de nucleotídeos aparecia no ribossomo de E. cuniculi ou se já existia anteriormente. Como a ligação de nucleotídeos é mediada principalmente pelos resíduos Phe170 e Lys172 na proteína ribossômica eL30, avaliamos a conservação desses resíduos em 4396 eucariotos representativos. Assim como no caso de uL15 acima, descobrimos que os resíduos Phe170 e Lys172 são altamente conservados apenas em Microsporidia típicos, mas estão ausentes em outros eucariotos, incluindo os Microsporidia atípicos Mitosporidium e Amphiamblys, nos quais o fragmento de rRNA ES39L não é reduzido 44, 45, 46 (Fig. 5c). -e).
Em conjunto, esses dados corroboram a ideia de que E. cuniculi e possivelmente outros microsporídios canônicos desenvolveram a capacidade de capturar eficientemente um grande número de pequenos metabólitos na estrutura do ribossomo para compensar a redução nos níveis de rRNA e proteínas. Ao fazer isso, desenvolveram uma capacidade única de se ligar a nucleotídeos fora do ribossomo, demonstrando que as estruturas moleculares parasitárias compensam capturando abundantes pequenos metabólitos e utilizando-os como mimetizadores estruturais de fragmentos degradados de RNA e proteínas.
A terceira parte não simulada do nosso mapa de crio-EM, encontrada na subunidade ribossômica maior. A resolução relativamente alta (2,6 Å) do nosso mapa sugere que essa densidade pertence a proteínas com combinações únicas de resíduos de cadeia lateral grandes, o que nos permitiu identificar essa densidade como uma proteína ribossômica previamente desconhecida, que denominamos msL2 (proteína L2 específica de Microsporidia) (métodos, figura 6). Nossa busca por homologia mostrou que msL2 é conservada no clado Microsporidia dos gêneros Encephaliter e Orosporidium, mas está ausente em outras espécies, incluindo outros Microsporidia. Na estrutura ribossômica, msL2 ocupa uma lacuna formada pela perda do rRNA estendido ES31L. Nesse vazio, msL2 ajuda a estabilizar o dobramento do rRNA e pode compensar a perda de ES31L (Figura 6).
a Densidade eletrônica e modelo da proteína ribossômica msL2 específica de Microsporidia encontrada em ribossomos de E. cuniculi. b A maioria dos ribossomos eucarióticos, incluindo o ribossomo 80S de Saccharomyces cerevisiae, apresenta perda da amplificação do rRNA ES19L na maioria das espécies de Microsporidia. A estrutura previamente estabelecida do ribossomo de V. necatrix sugere que a perda de ES19L nesses parasitas é compensada pela evolução da nova proteína ribossômica msL1. Neste estudo, descobrimos que o ribossomo de E. cuniculi também desenvolveu uma proteína adicional que mimetiza o RNA ribossômico como uma aparente compensação pela perda de ES19L. No entanto, msL2 (atualmente anotada como a hipotética proteína ECU06_1135) e msL1 têm origens estruturais e evolutivas diferentes. Essa descoberta da geração de proteínas ribossômicas msL1 e msL2 evolutivamente não relacionadas sugere que, se os ribossomos acumularem mutações prejudiciais em seu rRNA, eles podem atingir níveis sem precedentes de diversidade composicional mesmo em um pequeno subconjunto de espécies intimamente relacionadas. Essa descoberta pode ajudar a esclarecer a origem e a evolução do ribossomo mitocondrial, conhecido por seu rRNA altamente reduzido e variabilidade anormal na composição proteica entre as espécies.
Em seguida, comparamos a proteína msL2 com a proteína msL1, previamente descrita, a única proteína ribossômica específica de microsporídios conhecida, encontrada no ribossomo de *V. necatrix*. Nosso objetivo era testar se msL1 e msL2 são relacionadas evolutivamente. Nossa análise mostrou que msL1 e msL2 ocupam a mesma cavidade na estrutura ribossômica, mas possuem estruturas primárias e terciárias diferentes, o que indica sua origem evolutiva independente (Fig. 6). Assim, nossa descoberta da msL2 fornece evidências de que grupos de espécies eucarióticas compactas podem evoluir independentemente proteínas ribossômicas estruturalmente distintas para compensar a perda de fragmentos de rRNA. Essa descoberta é notável, visto que a maioria dos ribossomos citoplasmáticos eucarióticos contém uma proteína invariante, incluindo a mesma família de 81 proteínas ribossômicas. O aparecimento de msL1 e msL2 em vários clados de microsporídios em resposta à perda de segmentos estendidos de rRNA sugere que a degradação da arquitetura molecular do parasita faz com que ele busque mutações compensatórias, o que pode eventualmente levar à sua aquisição em diferentes populações de parasitas.
Finalmente, após a conclusão do nosso modelo, comparamos a composição do ribossomo de *E. cuniculi* com a prevista a partir da sequência do genoma. Diversas proteínas ribossômicas, incluindo eL14, eL38, eL41 e eS30, eram anteriormente consideradas ausentes no genoma de *E. cuniculi* devido à aparente ausência de seus homólogos. A perda de muitas proteínas ribossômicas também é prevista na maioria dos outros parasitas intracelulares e endossimbiontes altamente reduzidos. Por exemplo, embora a maioria das bactérias de vida livre contenha a mesma família de 54 proteínas ribossômicas, apenas 11 dessas famílias de proteínas possuem homólogos detectáveis ​​em cada genoma analisado de bactérias restritas ao hospedeiro. Em apoio a essa noção, a perda de proteínas ribossômicas foi observada experimentalmente em microsporídios de *V. necatrix* e *P. locustae*, que não possuem as proteínas eL38 e eL41.
No entanto, nossas estruturas mostram que apenas eL38, eL41 e eS30 são de fato perdidos no ribossomo de E. cuniculi. A proteína eL14 estava conservada e nossa estrutura mostrou por que essa proteína não pôde ser encontrada na busca por homologia (Fig. 7). Nos ribossomos de E. cuniculi, a maior parte do sítio de ligação de eL14 é perdida devido à degradação do ES39L amplificado pelo rRNA. Na ausência de ES39L, eL14 perdeu a maior parte de sua estrutura secundária e apenas 18% da sequência de eL14 era idêntica em E. cuniculi e S. cerevisiae. Essa baixa preservação da sequência é notável porque mesmo Saccharomyces cerevisiae e Homo sapiens — organismos que evoluíram com 1,5 bilhão de anos de diferença — compartilham mais de 51% dos mesmos resíduos em eL14. Essa perda anômala de conservação explica por que a proteína eL14 de E. cuniculi está atualmente anotada como a proteína putativa M970_061160 e não como a proteína ribossômica eL1427.
O ribossomo de Microsporidia perdeu a extensão de rRNA ES39L, o que eliminou parcialmente o sítio de ligação da proteína ribossômica eL14. Na ausência de ES39L, a proteína eL14 do micrósporo sofre uma perda de estrutura secundária, na qual a antiga α-hélice de ligação ao rRNA degenera em uma alça de comprimento mínimo. b O alinhamento de múltiplas sequências mostra que a proteína eL14 é altamente conservada em espécies eucarióticas (57% de identidade de sequência entre homólogos de levedura e humanos), mas pouco conservada e divergente em microsporidia (na qual não mais que 24% dos resíduos são idênticos ao homólogo eL14). de S. cerevisiae ou H. sapiens). Essa baixa conservação de sequência e variabilidade de estrutura secundária explicam por que o homólogo eL14 nunca foi encontrado em E. cuniculi e por que se acredita que essa proteína tenha sido perdida em E. cuniculi. Em contraste, E. cuniculi eL14 foi previamente anotado como uma possível proteína M970_061160. Essa observação sugere que a diversidade do genoma dos microsporídios está atualmente superestimada: alguns genes que se acredita estarem perdidos nos microsporídios são, na verdade, preservados, embora em formas altamente diferenciadas; em vez disso, alguns genes que se acredita codificarem proteínas específicas de vermes (por exemplo, a hipotética proteína M970_061160) codificam, na realidade, proteínas muito diversas encontradas em outros eucariotos.
Essa descoberta sugere que a desnaturação do rRNA pode levar a uma perda drástica de conservação de sequência em proteínas ribossômicas adjacentes, tornando essas proteínas indetectáveis ​​em buscas por homologia. Assim, podemos estar superestimando o grau real de degradação molecular em organismos com genomas pequenos, uma vez que algumas proteínas consideradas perdidas na verdade persistem, embora em formas altamente alteradas.
Como os parasitas conseguem manter a função de suas máquinas moleculares em condições de extrema redução do genoma? Nosso estudo responde a essa pergunta descrevendo a complexa estrutura molecular (ribossomo) de E. cuniculi, um organismo com um dos menores genomas eucarióticos.
Sabe-se há quase duas décadas que as moléculas de proteína e RNA em parasitas microbianos frequentemente diferem de suas moléculas homólogas em espécies de vida livre porque carecem de centros de controle de qualidade, têm seu tamanho reduzido a 50% em comparação com micróbios de vida livre, etc., e apresentam muitas mutações debilitantes que comprometem o dobramento e a função. Por exemplo, espera-se que os ribossomos de organismos com genomas pequenos, incluindo muitos parasitas intracelulares e endossimbiontes, apresentem deficiência em diversas proteínas ribossômicas e em até um terço dos nucleotídeos de rRNA em comparação com espécies de vida livre 27, 29, 30, 49. No entanto, o modo como essas moléculas funcionam em parasitas permanece em grande parte um mistério, estudado principalmente por meio da genômica comparativa.
Nosso estudo demonstra que a estrutura de macromoléculas pode revelar muitos aspectos da evolução que são difíceis de extrair de estudos genômicos comparativos tradicionais de parasitas intracelulares e outros organismos restritos a hospedeiros (Figura Suplementar 7). Por exemplo, o caso da proteína eL14 mostra que podemos superestimar o grau real de degradação do aparato molecular em espécies parasitárias. Acredita-se que os parasitas encefalíticos possuam centenas de genes específicos de microsporídios. No entanto, nossos resultados mostram que alguns desses genes aparentemente específicos são, na verdade, apenas variantes muito diferentes de genes comuns em outros eucariotos. Além disso, o exemplo da proteína msL2 mostra como negligenciamos novas proteínas ribossômicas e subestimamos o conteúdo das máquinas moleculares parasitárias. O exemplo de pequenas moléculas mostra como podemos ignorar as inovações mais engenhosas nas estruturas moleculares parasitárias, que podem conferir-lhes novas atividades biológicas.
Em conjunto, esses resultados aprimoram nossa compreensão das diferenças entre as estruturas moleculares de organismos restritos a hospedeiros e suas contrapartes em organismos de vida livre. Demonstramos que as máquinas moleculares, há muito consideradas reduzidas, degeneradas e sujeitas a diversas mutações debilitantes, na verdade possuem um conjunto de características estruturais incomuns sistematicamente negligenciadas.
Por outro lado, os fragmentos de rRNA não volumosos e os fragmentos fundidos que encontramos nos ribossomos de E. cuniculi sugerem que a redução do genoma pode alterar até mesmo as partes da maquinaria molecular básica que são preservadas nos três domínios da vida – após quase 3,5 bilhões de anos de evolução independente das espécies.
Os fragmentos de rRNA sem protuberância e fundidos nos ribossomos de E. cuniculi são de particular interesse à luz de estudos anteriores de moléculas de RNA em bactérias endossimbiontes. Por exemplo, no endossimbionte do pulgão Buchnera aphidicola, moléculas de rRNA e tRNA demonstraram ter estruturas sensíveis à temperatura devido ao viés de composição A+T e a uma alta proporção de pares de bases não canônicos20,50. Acredita-se que essas alterações no RNA, bem como alterações nas moléculas de proteína, sejam responsáveis ​​pela dependência excessiva dos endossimbiontes em relação aos parceiros e pela incapacidade dos endossimbiontes de transferir calor21,23. Embora o rRNA de microsporídios parasitas apresente alterações estruturais distintas, a natureza dessas alterações sugere que a estabilidade térmica reduzida e a maior dependência de proteínas chaperonas podem ser características comuns de moléculas de RNA em organismos com genomas reduzidos.
Por outro lado, nossas estruturas mostram que os microsporídios parasitas desenvolveram uma capacidade única de resistir a fragmentos de rRNA e proteínas amplamente conservados, adquirindo a habilidade de usar pequenos metabólitos abundantes e prontamente disponíveis como mimetizadores estruturais de fragmentos degenerados de rRNA e proteínas. Essa hipótese é corroborada pelo fato de que pequenas moléculas que compensam a perda de fragmentos de proteínas no rRNA e nos ribossomos de *E. cuniculi* se ligam a resíduos específicos de microsporídios nas proteínas uL15 e eL30. Isso sugere que a ligação de pequenas moléculas aos ribossomos pode ser um produto da seleção positiva, na qual mutações específicas de *Microsporidia* em proteínas ribossômicas foram selecionadas por sua capacidade de aumentar a afinidade dos ribossomos por pequenas moléculas, o que pode levar a organismos ribossômicos mais eficientes. A descoberta revela uma inovação inteligente na estrutura molecular de parasitas microbianos e nos proporciona uma melhor compreensão de como as estruturas moleculares dos parasitas mantêm sua função apesar da evolução redutiva.
Atualmente, a identificação dessas pequenas moléculas permanece incerta. Não está claro por que a aparência dessas pequenas moléculas na estrutura ribossômica difere entre as espécies de microsporídios. Em particular, não está claro por que a ligação de nucleotídeos é observada nos ribossomos de *E. cuniculi* e *P. locustae*, e não nos ribossomos de *V. necatrix*, apesar da presença do resíduo F170 nas proteínas eL20 e K172 de *V. necatrix*. Essa deleção pode ser causada pelo resíduo 43 uL6 (localizado adjacente ao sítio de ligação de nucleotídeos), que é tirosina em *V. necatrix* e não treonina em *E. cuniculi* e *P. locustae*. A volumosa cadeia lateral aromática da Tyr43 pode interferir na ligação de nucleotídeos devido ao impedimento estérico. Alternativamente, a aparente deleção de nucleotídeos pode ser devida à baixa resolução da criomicroscopia eletrônica (criomicroscopia eletrônica), que dificulta a modelagem dos fragmentos ribossômicos de *V. necatrix*.
Por outro lado, nosso trabalho sugere que o processo de degradação do genoma pode ser uma força inventiva. Em particular, a estrutura do ribossomo de *E. cuniculi* sugere que a perda de fragmentos de rRNA e proteínas no ribossomo da microsporídia cria uma pressão evolutiva que promove mudanças na estrutura do ribossomo. Essas variantes ocorrem longe do sítio ativo do ribossomo e parecem ajudar a manter (ou restaurar) a montagem ideal do ribossomo, que de outra forma seria interrompida pela redução do rRNA. Isso sugere que uma importante inovação do ribossomo da microsporídia parece ter evoluído em resposta à necessidade de amortecer a deriva genética.
Talvez isso seja melhor ilustrado pela ligação de nucleotídeos, que nunca foi observada em outros organismos até o momento. O fato de resíduos de ligação a nucleotídeos estarem presentes em microsporídios típicos, mas não em outros eucariotos, sugere que os sítios de ligação a nucleotídeos não são apenas relíquias à espera de desaparecer, ou o local final para o rRNA ser restaurado à forma de nucleotídeos individuais. Em vez disso, esse sítio parece ser uma característica útil que pode ter evoluído ao longo de várias rodadas de seleção positiva. Os sítios de ligação a nucleotídeos podem ser um subproduto da seleção natural: uma vez que o ES39L é degradado, os microsporídios são forçados a buscar compensação para restaurar a biogênese ribossômica ideal na ausência do ES39L. Como esse nucleotídeo pode mimetizar os contatos moleculares do nucleotídeo A3186 no ES39L, a molécula de nucleotídeo torna-se um bloco de construção do ribossomo, cuja ligação é ainda mais aprimorada pela mutação da sequência eL30.
Com relação à evolução molecular de parasitas intracelulares, nosso estudo demonstra que as forças da seleção natural darwiniana e da deriva genética, ou seja, a degradação do genoma, não operam em paralelo, mas oscilam. Primeiramente, a deriva genética elimina características importantes das biomoléculas, tornando a compensação extremamente necessária. Somente quando os parasitas satisfazem essa necessidade por meio da seleção natural darwiniana é que suas macromoléculas têm a chance de desenvolver suas características mais impressionantes e inovadoras. É importante ressaltar que a evolução dos sítios de ligação de nucleotídeos no ribossomo de *E. cuniculi* sugere que esse padrão de perda para ganho na evolução molecular não apenas amortiza mutações deletérias, mas, por vezes, confere funções inteiramente novas às macromoléculas parasitárias.
Essa ideia é consistente com a teoria do equilíbrio móvel de Sewell Wright, que afirma que um sistema rígido de seleção natural limita a capacidade dos organismos de inovar51,52,53. No entanto, se a deriva genética interromper a seleção natural, essas derivações podem produzir mudanças que não são em si adaptativas (ou até mesmo prejudiciais), mas levam a outras mudanças que proporcionam maior aptidão ou nova atividade biológica. Nossa estrutura apoia essa ideia, ilustrando que o mesmo tipo de mutação que reduz o dobramento e a função de uma biomolécula parece ser o principal gatilho para seu aprimoramento. Em consonância com o modelo evolutivo ganha-ganha, nosso estudo mostra que a degradação do genoma, tradicionalmente vista como um processo degenerativo, também é um importante motor de inovação, às vezes e talvez até frequentemente permitindo que macromoléculas adquiram novas atividades parasitárias.