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L'evoluzione dei parassiti microbici implica una controazione tra la selezione naturale, che determina il miglioramento dei parassiti, e la deriva genetica, che causa la perdita di geni e l'accumulo di mutazioni deleterie nei parassiti. In questo articolo, per comprendere come questa controazione si verifichi a livello di singola macromolecola, descriviamo la struttura crio-EM del ribosoma di Encephalitozoon cuniculi, un organismo eucariotico con uno dei genomi più piccoli in natura. L'estrema riduzione di rRNA nei ribosomi di E. cuniculi è accompagnata da cambiamenti strutturali senza precedenti, come l'evoluzione di linker di rRNA fusi precedentemente sconosciuti e di rRNA senza rigonfiamenti. Inoltre, il ribosoma di E. cuniculi è sopravvissuto alla perdita di frammenti di rRNA e proteine ​​sviluppando la capacità di utilizzare piccole molecole come imitatori strutturali di frammenti di rRNA e proteine ​​degradati. Nel complesso, dimostriamo che le strutture molecolari a lungo ritenute ridotte, degenerate e soggette a mutazioni debilitanti presentano una serie di meccanismi compensatori che le mantengono attive nonostante le contrazioni molecolari estreme.
Poiché la maggior parte dei gruppi di parassiti microbici possiede strumenti molecolari unici per sfruttare i propri ospiti, spesso dobbiamo sviluppare terapie diverse per diversi gruppi di parassiti1,2. Tuttavia, nuove evidenze suggeriscono che alcuni aspetti dell'evoluzione dei parassiti siano convergenti e ampiamente prevedibili, indicando una potenziale base per interventi terapeutici ad ampio spettro nei parassiti microbici3,4,5,6,7,8,9.
Precedenti lavori hanno identificato una tendenza evolutiva comune nei parassiti microbici chiamata riduzione del genoma o decadimento del genoma10,11,12,13. Le ricerche attuali mostrano che quando i microrganismi abbandonano il loro stile di vita libero e diventano parassiti intracellulari (o endosimbionti), i loro genomi subiscono lente ma straordinarie metamorfosi nel corso di milioni di anni9,11. In un processo noto come decadimento del genoma, i parassiti microbici accumulano mutazioni deleterie che trasformano molti geni precedentemente importanti in pseudogeni, portando a una graduale perdita genica e al collasso mutazionale14,15. Questo collasso può distruggere fino al 95% dei geni negli organismi intracellulari più antichi rispetto alle specie a vita libera strettamente correlate. Pertanto, l'evoluzione dei parassiti intracellulari è un tiro alla fune tra due forze opposte: la selezione naturale darwiniana, che porta al miglioramento dei parassiti, e il collasso del genoma, che getta i parassiti nell'oblio. Non è ancora chiaro come il parassita sia riuscito a uscire da questo tira e molla e a mantenere l'attività della sua struttura molecolare.
Sebbene il meccanismo del decadimento del genoma non sia completamente compreso, sembra che si verifichi principalmente a causa della frequente deriva genetica. Poiché i parassiti vivono in popolazioni piccole, asessuate e geneticamente limitate, non possono eliminare efficacemente le mutazioni deleterie che a volte si verificano durante la replicazione del DNA. Ciò porta all'accumulo irreversibile di mutazioni dannose e alla riduzione del genoma del parassita. Di conseguenza, il parassita non solo perde geni che non sono più necessari per la sua sopravvivenza nell'ambiente intracellulare. È l'incapacità delle popolazioni di parassiti di eliminare efficacemente le mutazioni deleterie sporadiche che causa l'accumulo di queste mutazioni in tutto il genoma, compresi i geni più importanti.
Gran parte della nostra attuale comprensione della riduzione del genoma si basa esclusivamente sul confronto delle sequenze genomiche, con scarsa attenzione ai cambiamenti nelle molecole effettive che svolgono funzioni di housekeeping e fungono da potenziali bersagli farmacologici. Studi comparativi hanno dimostrato che il carico di mutazioni microbiche intracellulari deleterie sembra predisporre proteine ​​e acidi nucleici a ripiegarsi e aggregarsi in modo anomalo, rendendoli più dipendenti dagli chaperoni e ipersensibili al calore19,20,21,22,23. Inoltre, vari parassiti – la cui evoluzione indipendente a volte è separata da 2,5 miliardi di anni – hanno subito una simile perdita di centri di controllo della qualità nella sintesi proteica5,6 e nei meccanismi di riparazione del DNA24. Tuttavia, si sa poco sull'impatto dello stile di vita intracellulare su tutte le altre proprietà delle macromolecole cellulari, incluso l'adattamento molecolare a un carico crescente di mutazioni deleterie.
In questo lavoro, al fine di comprendere meglio l'evoluzione delle proteine ​​e degli acidi nucleici dei microrganismi intracellulari, abbiamo determinato la struttura dei ribosomi del parassita intracellulare Encephalitozoon cuniculi. E. cuniculi è un organismo fungino appartenente a un gruppo di microsporidi parassiti dotati di genomi eucariotici insolitamente piccoli e pertanto utilizzati come organismi modello per lo studio del decadimento genomico25,26,27,28,29,30. Recentemente, è stata determinata la struttura dei ribosomi mediante crio-EM per genomi moderatamente ridotti di Microsporidi, Paranosema locustae e Vairimorpha necatrix31,32 (genoma di circa 3,2 Mb). Queste strutture suggeriscono che una parte della perdita di amplificazione dell'rRNA sia compensata dallo sviluppo di nuovi contatti tra proteine ​​ribosomiali adiacenti o dall'acquisizione di nuove proteine ​​ribosomiali msL131,32. La specie Encephalitozoon (genoma ~2,5 milioni di bp), insieme al suo parente più prossimo Ordospora, dimostra il grado massimo di riduzione del genoma negli eucarioti: hanno meno di 2000 geni codificanti proteine ​​e si prevede che i loro ribosomi non solo siano privi di frammenti di espansione di rRNA (frammenti di rRNA che distinguono i ribosomi eucariotici dai ribosomi batterici) ma abbiano anche quattro proteine ​​ribosomiali a causa della loro mancanza di omologhi nel genoma di E. cuniculi26,27,28. Pertanto, abbiamo concluso che il ribosoma di E. cuniculi può rivelare strategie precedentemente sconosciute per l'adattamento molecolare al decadimento del genoma.
La nostra struttura crio-EM rappresenta il più piccolo ribosoma citoplasmatico eucariotico mai caratterizzato e fornisce informazioni su come il grado massimo di riduzione del genoma influenzi la struttura, l'assemblaggio e l'evoluzione del macchinario molecolare che è parte integrante della cellula. Abbiamo scoperto che il ribosoma di E. cuniculi viola molti dei principi ampiamente conservati del ripiegamento dell'RNA e dell'assemblaggio dei ribosomi, e abbiamo scoperto una nuova proteina ribosomiale precedentemente sconosciuta. In modo del tutto inaspettato, dimostriamo che i ribosomi dei microsporidi hanno evoluto la capacità di legare piccole molecole e ipotizziamo che le troncature nell'rRNA e nelle proteine ​​inneschino innovazioni evolutive che potrebbero in definitiva conferire qualità utili al ribosoma.
Per migliorare la nostra comprensione dell'evoluzione di proteine ​​e acidi nucleici negli organismi intracellulari, abbiamo deciso di isolare spore di E. cuniculi da colture di cellule di mammifero infette per purificarne i ribosomi e determinarne la struttura. È difficile ottenere un gran numero di microsporidi parassiti perché questi non possono essere coltivati ​​in un terreno nutritivo. Crescono e si riproducono solo all'interno della cellula ospite. Pertanto, per ottenere biomassa di E. cuniculi per la purificazione dei ribosomi, abbiamo infettato la linea cellulare renale di mammifero RK13 con spore di E. cuniculi e le abbiamo coltivate per diverse settimane per consentire a E. cuniculi di crescere e moltiplicarsi. Utilizzando un monostrato di cellule infette di circa mezzo metro quadrato, siamo stati in grado di purificare circa 300 mg di spore di Microsporidia e di utilizzarle per isolare i ribosomi. Abbiamo quindi disgregato le spore purificate con biglie di vetro e isolato i ribosomi grezzi mediante frazionamento graduale dei lisati con polietilenglicole. Questo ci ha permesso di ottenere circa 300 µg di ribosomi grezzi di E. cuniculi per l'analisi strutturale.
Abbiamo quindi raccolto immagini crio-EM utilizzando i campioni di ribosomi risultanti e le abbiamo elaborate utilizzando maschere corrispondenti alla subunità ribosomiale maggiore, alla testa della subunità minore e alla subunità minore. Durante questo processo, abbiamo raccolto immagini di circa 108.000 particelle ribosomiali e calcolato le immagini crio-EM con una risoluzione di 2,7 Å (Figure supplementari 1-3). Abbiamo quindi utilizzato le immagini crio-EM per modellare l'rRNA, la proteina ribosomiale e il fattore di ibernazione Mdf1 associati ai ribosomi di E. cuniculi (Fig. 1a, b).
a Struttura del ribosoma di E. cuniculi in complesso con il fattore di ibernazione Mdf1 (pdb id 7QEP). b Mappa del fattore di ibernazione Mdf1 associato al ribosoma di E. cuniculi. c Mappa della struttura secondaria che confronta l'rRNA recuperato nelle specie di Microsporidi con le strutture ribosomiali note. I pannelli mostrano la posizione dei frammenti di rRNA amplificati (ES) e dei siti attivi del ribosoma, inclusi il sito di decodifica (DC), l'ansa della sarcinicina (SRL) e il centro peptidil transferasi (PTC). d La densità elettronica corrispondente al centro peptidil transferasi del ribosoma di E. cuniculi suggerisce che questo sito catalitico abbia la stessa struttura nel parassita E. cuniculi e nei suoi ospiti, incluso H. sapiens. e, f La corrispondente densità elettronica del centro di decodifica (e) e la struttura schematica del centro di decodifica (f) indicano che E. cuniculi presenta residui U1491 invece di A1491 (numerazione di E. coli) in molti altri eucarioti. Questa variazione suggerisce che E. cuniculi potrebbe essere sensibile agli antibiotici che hanno come bersaglio questo sito attivo.
Contrariamente alle strutture precedentemente stabilite dei ribosomi di V. necatrix e P. locustae (entrambe le strutture rappresentano la stessa famiglia di microsporidi Nosematidae e sono molto simili tra loro), i ribosomi di E. cuniculi31,32 subiscono numerosi processi di frammentazione di rRNA e proteine, con ulteriore denaturazione (Figure supplementari 4-6). Nell'rRNA, i cambiamenti più evidenti includevano la perdita completa del frammento amplificato di rRNA 25S ES12L e la degenerazione parziale delle eliche h39, h41 e H18 (Fig. 1c, Figura supplementare 4). Tra le proteine ​​ribosomiali, i cambiamenti più eclatanti comprendevano la perdita completa della proteina eS30 e l'accorciamento delle proteine ​​eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 ed eS7 (Figure supplementari 4, 5).
Pertanto, l'estrema riduzione dei genomi delle specie di Encephalotozoon/Ordospora si riflette nella struttura dei loro ribosomi: i ribosomi di E. cuniculi subiscono la perdita più drammatica di contenuto proteico nei ribosomi citoplasmatici eucariotici soggetti a caratterizzazione strutturale, e non presentano nemmeno quei frammenti di rRNA e proteine ​​che sono ampiamente conservati non solo negli eucarioti, ma anche nei tre domini della vita. La struttura del ribosoma di E. cuniculi fornisce il primo modello molecolare per questi cambiamenti e rivela eventi evolutivi che sono stati trascurati sia dalla genomica comparata che dagli studi sulla struttura biomolecolare intracellulare (Fig. 7 supplementare). Di seguito, descriviamo ciascuno di questi eventi insieme alle loro probabili origini evolutive e al loro potenziale impatto sulla funzione dei ribosomi.
Abbiamo poi scoperto che, oltre alle ampie troncature dell'rRNA, i ribosomi di E. cuniculi presentano variazioni dell'rRNA in uno dei loro siti attivi. Sebbene il centro peptidil transferasi del ribosoma di E. cuniculi abbia la stessa struttura di altri ribosomi eucariotici (Fig. 1d), il centro di decodifica differisce a causa della variazione di sequenza al nucleotide 1491 (numerazione di E. coli, Fig. 1e, f). Questa osservazione è importante perché il sito di decodifica dei ribosomi eucariotici contiene tipicamente i residui G1408 e A1491, rispetto ai residui di tipo batterico A1408 e G1491. Questa variazione è alla base della diversa sensibilità dei ribosomi batterici ed eucariotici alla famiglia degli aminoglicosidi degli antibiotici ribosomiali e ad altre piccole molecole che hanno come bersaglio il sito di decodifica. Nel sito di decodifica del ribosoma di E. cuniculi, il residuo A1491 è stato sostituito con U1491, creando potenzialmente un'interfaccia di legame unica per piccole molecole che hanno come bersaglio questo sito attivo. La stessa variante A14901 è presente anche in altri microsporidi come P. locustae e V. necatrix, suggerendo una sua diffusione tra le specie di microsporidi (Fig. 1f).
Poiché i nostri campioni di ribosomi di E. cuniculi sono stati isolati da spore metabolicamente inattive, abbiamo testato la mappa crio-EM di E. cuniculi per il legame con i ribosomi precedentemente descritto in condizioni di stress o di denutrizione. Fattori di ibernazione 31, 32, 36, 37, 38. Abbiamo confrontato la struttura precedentemente stabilita del ribosoma in ibernazione con la mappa crio-EM del ribosoma di E. cuniculi. Per il docking, sono stati utilizzati ribosomi di S. cerevisiae in complesso con il fattore di ibernazione Stm138, ribosomi di locusta in complesso con il fattore Lso232 e ribosomi di V. necatrix in complesso con i fattori Mdf1 e Mdf231. Allo stesso tempo, abbiamo trovato la densità crio-EM corrispondente al fattore di riposo Mdf1. Similmente al legame di Mdf1 al ribosoma di V. necatrix, Mdf1 si lega anche al ribosoma di E. cuniculi, dove blocca il sito E del ribosoma, contribuendo probabilmente a rendere disponibili i ribosomi quando le spore del parassita diventano metabolicamente inattive a seguito dell'inattivazione da parte dell'organismo (Figura 2). ).
Mdf1 blocca il sito E del ribosoma, il che sembra contribuire a inattivarlo quando le spore del parassita diventano metabolicamente inattive. Nella struttura del ribosoma di E. cuniculi, abbiamo scoperto che Mdf1 forma un contatto precedentemente sconosciuto con il peduncolo ribosomiale L1, la parte del ribosoma che facilita il rilascio del tRNA deacetilato dal ribosoma durante la sintesi proteica. Questi contatti suggeriscono che Mdf1 si dissoci dal ribosoma utilizzando lo stesso meccanismo del tRNA deacetilato, fornendo una possibile spiegazione di come il ribosoma rimuova Mdf1 per riattivare la sintesi proteica.
Tuttavia, la nostra struttura ha rivelato un contatto sconosciuto tra Mdf1 e la gamba ribosomiale L1 (la parte del ribosoma che contribuisce al rilascio del tRNA deacilato dal ribosoma durante la sintesi proteica). In particolare, Mdf1 utilizza gli stessi contatti del segmento a gomito della molecola di tRNA deacilato (Fig. 2). Questa modellazione molecolare precedentemente sconosciuta ha mostrato che Mdf1 si dissocia dal ribosoma utilizzando lo stesso meccanismo del tRNA deacetilato, il che spiega come il ribosoma rimuova questo fattore di ibernazione per riattivare la sintesi proteica.
Durante la costruzione del modello di rRNA, abbiamo scoperto che il ribosoma di E. cuniculi presenta frammenti di rRNA ripiegati in modo anomalo, che abbiamo chiamato rRNA fuso (Fig. 3). Nei ribosomi che abbracciano i tre domini della vita, l'rRNA si ripiega in strutture in cui la maggior parte delle basi di rRNA si appaia e si ripiega tra loro o interagisce con le proteine ​​ribosomiali38,39,40. Tuttavia, nei ribosomi di E. cuniculi, gli rRNA sembrano violare questo principio di ripiegamento convertendo alcune delle loro eliche in regioni di rRNA non ripiegate.
Struttura dell'elica 25S dell'rRNA H18 in S. cerevisiae, V. necatrix ed E. cuniculi. Tipicamente, nei ribosomi che abbracciano i tre domini vitali, questo linker si avvolge in un'elica di RNA che contiene da 24 a 34 residui. Nei Microsporidi, al contrario, questo linker di rRNA si riduce gradualmente a due linker a singolo filamento ricchi di uridina contenenti solo 12 residui. La maggior parte di questi residui è esposta a solventi. La figura mostra che i microsporidi parassiti sembrano violare i principi generali del ripiegamento dell'rRNA, dove le basi dell'rRNA sono solitamente accoppiate ad altre basi o coinvolte in interazioni rRNA-proteina. Nei Microsporidi, alcuni frammenti di rRNA assumono una piega sfavorevole, in cui la precedente elica di rRNA diventa un frammento a singolo filamento allungato quasi in linea retta. La presenza di queste regioni insolite consente all'rRNA dei microsporidi di legarsi a frammenti di rRNA distanti utilizzando un numero minimo di basi di RNA.
L'esempio più eclatante di questa transizione evolutiva può essere osservato nell'elica 25S dell'rRNA H18 (Fig. 3). Nelle specie da E. coli all'uomo, le basi di questa elica dell'rRNA contengono 24-32 nucleotidi, formando un'elica leggermente irregolare. In strutture ribosomiali precedentemente identificate in V. necatrix e P. locustae,31,32 le basi dell'elica H18 sono parzialmente srotolate, ma l'appaiamento delle basi nucleotidiche è preservato. Tuttavia, in E. cuniculi questo frammento di rRNA diventa i linker più corti 228UUUGU232 e 301UUUUUUUUU307. A differenza dei tipici frammenti di rRNA, questi linker ricchi di uridina non si avvolgono né stabiliscono un contatto esteso con le proteine ​​ribosomiali. Invece, adottano strutture completamente dispiegate e aperte al solvente in cui i filamenti di rRNA sono estesi quasi dritti. Questa conformazione allungata spiega come l'E. cuniculi utilizzi solo 12 basi di RNA per riempire lo spazio di 33 Å tra le eliche dell'rRNA H16 e H18, mentre altre specie necessitano di almeno il doppio delle basi di rRNA per colmare lo spazio.
Possiamo quindi dimostrare che, attraverso un ripiegamento energeticamente sfavorevole, i microsporidi parassiti hanno sviluppato una strategia per contrarre anche quei segmenti di rRNA che rimangono ampiamente conservati nelle specie nei tre domini della vita. Apparentemente, accumulando mutazioni che trasformano le eliche di rRNA in brevi linker poli-U, E. cuniculi può formare frammenti di rRNA inusuali contenenti il ​​minor numero possibile di nucleotidi per la legatura dei frammenti distali di rRNA. Questo aiuta a spiegare come i microsporidi abbiano ottenuto una drastica riduzione della loro struttura molecolare di base senza perdere la loro integrità strutturale e funzionale.
Un'altra caratteristica insolita dell'rRNA di E. cuniculi è l'aspetto dell'rRNA senza ispessimenti (Fig. 4). I rigonfiamenti sono nucleotidi senza coppie di basi che si attorcigliano fuori dall'elica dell'rRNA invece di nascondersi al suo interno. La maggior parte delle protrusioni dell'rRNA agisce come adesivi molecolari, contribuendo a legare le proteine ​​ribosomiali adiacenti o altri frammenti di rRNA. Alcuni dei rigonfiamenti agiscono come cerniere, consentendo all'elica dell'rRNA di flettersi e ripiegarsi in modo ottimale per una sintesi proteica produttiva 41 .
a Una protrusione di rRNA (numerazione di S. cerevisiae) è assente dalla struttura ribosomiale di E. cuniculi, ma presente nella maggior parte degli altri eucarioti b Ribosomi interni di E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens ed E. cuniculi. I parassiti sono privi di molti degli antichi rigonfiamenti di rRNA altamente conservati. Questi ispessimenti stabilizzano la struttura ribosomiale; pertanto, la loro assenza nei microsporidi indica una ridotta stabilità del ripiegamento dell'rRNA nei parassiti microsporidi. Il confronto con i rami P (rami L7/L12 nei batteri) mostra che la perdita di rigonfiamenti di rRNA a volte coincide con la comparsa di nuovi rigonfiamenti accanto a quelli persi. L'elica H42 nell'rRNA 23S/28S presenta un rigonfiamento antico (U1206 in Saccharomyces cerevisiae) che si stima abbia almeno 3,5 miliardi di anni grazie alla sua protezione in tre domini della vita. Nei microsporidi, questo rigonfiamento viene eliminato. Tuttavia, un nuovo rigonfiamento è apparso accanto a quello perso (A1306 in E. cuniculi).
Sorprendentemente, abbiamo scoperto che i ribosomi di E. cuniculi sono privi della maggior parte dei rigonfiamenti di rRNA presenti in altre specie, inclusi oltre 30 rigonfiamenti conservati in altri eucarioti (Fig. 4a). Questa perdita elimina molti contatti tra le subunità ribosomiali e le eliche di rRNA adiacenti, creando talvolta ampie cavità all'interno del ribosoma, rendendo il ribosoma di E. cuniculi più poroso rispetto ai ribosomi più tradizionali (Fig. 4b). In particolare, abbiamo scoperto che la maggior parte di questi rigonfiamenti era persa anche nelle strutture ribosomiali di V. necatrix e P. locustae precedentemente identificate, che erano state trascurate da precedenti analisi strutturali31,32.
Talvolta la perdita di rigonfiamenti di rRNA è accompagnata dallo sviluppo di nuovi rigonfiamenti accanto a quello perso. Ad esempio, il ribosoma P-stem contiene un rigonfiamento U1208 (in Saccharomyces cerevisiae) che è sopravvissuto dall'Escherichia coli all'uomo e si stima quindi che abbia 3,5 miliardi di anni. Durante la sintesi proteica, questo rigonfiamento aiuta il ribosoma P a muoversi tra conformazioni aperte e chiuse in modo che il ribosoma possa reclutare fattori di traduzione e trasportarli al sito attivo. Nei ribosomi di E. cuniculi, questo ispessimento è assente; tuttavia, un nuovo ispessimento (G883) localizzato solo in tre coppie di basi può contribuire al ripristino della flessibilità ottimale del ribosoma P-stem (Fig. 4c).
I nostri dati sull'rRNA senza rigonfiamenti suggeriscono che la minimizzazione dell'rRNA non si limita alla perdita di elementi di rRNA sulla superficie del ribosoma, ma può coinvolgere anche il nucleo del ribosoma, creando un difetto molecolare specifico del parassita che non è stato descritto nelle cellule viventi libere. Sono state osservate specie viventi.
Dopo aver modellato le proteine ​​ribosomiali canoniche e l'rRNA, abbiamo scoperto che i componenti ribosomiali convenzionali non sono in grado di spiegare le tre parti dell'immagine crio-EM. Due di questi frammenti sono molecole di piccole dimensioni (Fig. 5, Figura 8 supplementare). Il primo segmento è racchiuso tra le proteine ​​ribosomiali uL15 ed eL18 in una posizione solitamente occupata dal C-terminale di eL18, che è accorciato in E. cuniculi. Sebbene non possiamo determinare l'identità di questa molecola, le dimensioni e la forma di quest'isola di densità sono ben spiegate dalla presenza di molecole di spermidina. Il suo legame al ribosoma è stabilizzato da mutazioni specifiche dei microsporidi nelle proteine ​​uL15 (Asp51 e Arg56), che sembrano aumentare l'affinità del ribosoma per questa piccola molecola, consentendo a uL15 di avvolgerla in una struttura ribosomiale. Figura 2 supplementare). 8, dati aggiuntivi 1, 2).
Imaging crio-EM che mostra la presenza di nucleotidi al di fuori del ribosio legato al ribosoma di E. cuniculi. Nel ribosoma di E. cuniculi, questo nucleotide occupa la stessa posizione del nucleotide A3186 dell'rRNA 25S (numerazione di Saccharomyces cerevisiae) nella maggior parte degli altri ribosomi eucariotici. b Nella struttura ribosomiale di E. cuniculi, questo nucleotide si trova tra le proteine ​​ribosomiali uL9 ed eL20, stabilizzando così il contatto tra le due proteine. cd Analisi della conservazione della sequenza di eL20 tra specie di microsporidi. L'albero filogenetico delle specie di Microsporidi (c) e l'allineamento multiplo di sequenza della proteina eL20 (d) mostrano che i residui di legame nucleotidico F170 e K172 sono conservati nella maggior parte dei Microsporidi tipici, ad eccezione di S. lophii, e dei Microsporidi a ramificazione precoce, che hanno mantenuto l'estensione dell'rRNA ES39L. e Questa figura mostra che i residui di legame nucleotidico F170 e K172 sono presenti solo in eL20 del genoma altamente ridotto dei Microsporidi, ma non in altri eucarioti. Nel complesso, questi dati suggeriscono che i ribosomi dei Microsporidi abbiano sviluppato un sito di legame nucleotidico che sembra legare le molecole di AMP e utilizzarle per stabilizzare le interazioni proteina-proteina nella struttura ribosomiale. L'elevata conservazione di questo sito di legame nei Microsporidi e la sua assenza in altri eucarioti suggeriscono che questo sito possa fornire un vantaggio selettivo in termini di sopravvivenza per i Microsporidi. Pertanto, la tasca di legame dei nucleotidi nel ribosoma dei microsporidi non sembra essere una caratteristica degenerata o una forma terminale della degradazione dell'rRNA come precedentemente descritto, ma piuttosto un'utile innovazione evolutiva che consente al ribosoma dei microsporidi di legare direttamente piccole molecole, utilizzandole come elementi costitutivi molecolari. Elementi costitutivi per i ribosomi. Questa scoperta rende il ribosoma dei microsporidi l'unico ribosoma noto ad utilizzare un singolo nucleotide come elemento costitutivo strutturale. f Ipotetico percorso evolutivo derivato dal legame dei nucleotidi.
La seconda densità a basso peso molecolare si trova all'interfaccia tra le proteine ​​ribosomiali uL9 ed eL30 (Fig. 5a). Questa interfaccia è stata precedentemente descritta nella struttura del ribosoma di Saccharomyces cerevisiae come sito di legame per il nucleotide 25S dell'rRNA A3186 (parte dell'estensione dell'rRNA ES39L)38. È stato dimostrato che nei ribosomi degenerati ES39L di P. locustae, questa interfaccia lega un singolo nucleotide sconosciuto, il 31, e si presume che questo nucleotide sia una forma finale ridotta di rRNA, la cui lunghezza è di circa 130-230 basi. ES39L è ridotto al singolo nucleotide 32,43. Le nostre immagini crio-EM supportano l'idea che la densità possa essere spiegata dai nucleotidi. Tuttavia, la maggiore risoluzione della nostra struttura ha mostrato che questo nucleotide è una molecola extraribosomiale, probabilmente AMP (Fig. 5a, b).
Abbiamo quindi chiesto se il sito di legame nucleotidico apparisse nel ribosoma di E. cuniculi o se esistesse in precedenza. Poiché il legame nucleotidico è mediato principalmente dai residui Phe170 e Lys172 nella proteina ribosomiale eL30, abbiamo valutato la conservazione di questi residui in 4396 eucarioti rappresentativi. Come nel caso di uL15 sopra, abbiamo scoperto che i residui Phe170 e Lys172 sono altamente conservati solo nei Microsporidi tipici, ma assenti in altri eucarioti, inclusi i Microsporidi atipici Mitosporidium e Amphiamblys, in cui il frammento di rRNA ES39L non è ridotto 44, 45, 46 (Fig. 5c - e).
Nel complesso, questi dati supportano l'idea che E. cuniculi e probabilmente altri microsporidi canonici abbiano sviluppato la capacità di catturare efficacemente un gran numero di piccoli metaboliti nella struttura ribosomiale per compensare il calo dei livelli di rRNA e proteine. In tal modo, hanno sviluppato una capacità unica di legare nucleotidi all'esterno del ribosoma, dimostrando che le strutture molecolari parassite compensano catturando abbondanti piccoli metaboliti e utilizzandoli come imitatori strutturali di frammenti di RNA e proteine ​​degradati.
La terza parte non simulata della nostra mappa crio-EM, trovata nella grande subunità ribosomiale. La risoluzione relativamente alta (2,6 Å) della nostra mappa suggerisce che questa densità appartenga a proteine ​​con combinazioni uniche di grandi residui di catena laterale, il che ci ha permesso di identificare questa densità come una proteina ribosomiale precedentemente sconosciuta che abbiamo identificato come msL2 (proteina L2 specifica per i Microsporidi) (metodi, figura 6). La nostra ricerca di omologia ha mostrato che msL2 è conservata nel clade Microsporidia dei generi Encephaliter e Orosporidium, ma assente in altre specie, inclusi altri Microsporidi. Nella struttura ribosomiale, msL2 occupa uno spazio vuoto formato dalla perdita dell'rRNA ES31L esteso. In questo spazio vuoto, msL2 aiuta a stabilizzare il ripiegamento dell'rRNA e può compensare la perdita di ES31L (Figura 6).
a Densità elettronica e modello della proteina ribosomiale specifica dei Microsporidi msL2 presente nei ribosomi di E. cuniculi. b La maggior parte dei ribosomi eucariotici, incluso il ribosoma 80S di Saccharomyces cerevisiae, presenta una perdita di amplificazione dell'rRNA ES19L nella maggior parte delle specie di Microsporidi. La struttura precedentemente stabilita del ribosoma dei microsporidi di V. necatrix suggerisce che la perdita di ES19L in questi parassiti sia compensata dall'evoluzione della nuova proteina ribosomiale msL1. In questo studio, abbiamo scoperto che il ribosoma di E. cuniculi ha anche sviluppato un'ulteriore proteina mimica dell'RNA ribosomiale come apparente compensazione per la perdita di ES19L. Tuttavia, msL2 (attualmente annotata come ipotetica proteina ECU06_1135) e msL1 hanno origini strutturali ed evolutive diverse. Questa scoperta della generazione di proteine ​​ribosomiali msL1 e msL2 evolutivamente non correlate suggerisce che, se i ribosomi accumulano mutazioni dannose nel loro rRNA, possono raggiungere livelli di diversità compositiva senza precedenti anche in un piccolo sottoinsieme di specie strettamente correlate. Questa scoperta potrebbe aiutare a chiarire l'origine e l'evoluzione del ribosoma mitocondriale, noto per il suo rRNA altamente ridotto e l'anomala variabilità nella composizione proteica tra le specie.
Abbiamo quindi confrontato la proteina msL2 con la proteina msL1, precedentemente descritta, l'unica proteina ribosomiale specifica dei microsporidi nota presente nel ribosoma di V. necatrix. Volevamo verificare se msL1 e msL2 fossero evolutivamente correlate. La nostra analisi ha mostrato che msL1 e msL2 occupano la stessa cavità nella struttura ribosomiale, ma hanno strutture primarie e terziarie diverse, il che indica la loro origine evolutiva indipendente (Fig. 6). Pertanto, la nostra scoperta di msL2 fornisce la prova che gruppi di specie eucariotiche compatte possono evolvere indipendentemente proteine ​​ribosomiali strutturalmente distinte per compensare la perdita di frammenti di rRNA. Questa scoperta è degna di nota in quanto la maggior parte dei ribosomi eucariotici citoplasmatici contiene una proteina invariante, inclusa la stessa famiglia di 81 proteine ​​ribosomiali. La comparsa di msL1 e msL2 in vari cladi di microsporidi in risposta alla perdita di segmenti estesi di rRNA suggerisce che la degradazione dell'architettura molecolare del parassita induce i parassiti a cercare mutazioni compensatorie, che potrebbero infine portare alla loro acquisizione in diverse popolazioni di parassiti. strutture.
Infine, una volta completato il nostro modello, abbiamo confrontato la composizione del ribosoma di E. cuniculi con quella prevista dalla sequenza del genoma. Diverse proteine ​​ribosomiali, tra cui eL14, eL38, eL41 ed eS30, erano precedentemente ritenute mancanti dal genoma di E. cuniculi a causa dell'apparente assenza dei loro omologhi. La perdita di molte proteine ​​ribosomiali è prevista anche nella maggior parte degli altri parassiti intracellulari e degli endosimbionti a elevata riduzione. Ad esempio, sebbene la maggior parte dei batteri a vita libera contenga la stessa famiglia di 54 proteine ​​ribosomiali, solo 11 di queste famiglie proteiche presentano omologhi rilevabili in ciascun genoma analizzato di batteri ristretti all'ospite. A sostegno di questa ipotesi, è stata osservata sperimentalmente una perdita di proteine ​​ribosomiali nei microsporidi di V. necatrix e P. locustae, che sono privi delle proteine ​​eL38 ed eL4131,32.
Tuttavia, le nostre strutture mostrano che solo eL38, eL41 ed eS30 sono effettivamente persi nel ribosoma di E. cuniculi. La proteina eL14 era conservata e la nostra struttura ha mostrato perché questa proteina non è stata trovata nella ricerca di omologia (Fig. 7). Nei ribosomi di E. cuniculi, la maggior parte del sito di legame di eL14 è persa a causa della degradazione di ES39L amplificato dall'rRNA. In assenza di ES39L, eL14 ha perso gran parte della sua struttura secondaria e solo il 18% della sequenza di eL14 era identico in E. cuniculi e S. cerevisiae. Questa scarsa conservazione della sequenza è notevole perché persino Saccharomyces cerevisiae e Homo sapiens – organismi che si sono evoluti a 1,5 miliardi di anni di distanza – condividono oltre il 51% degli stessi residui in eL14. Questa anomala perdita di conservazione spiega perché la proteina eL14 di E. cuniculi è attualmente annotata come la presunta proteina M970_061160 e non come la proteina ribosomiale eL1427.
e Il ribosoma dei Microsporidi ha perso l'estensione dell'rRNA ES39L, che ha parzialmente eliminato il sito di legame della proteina ribosomiale eL14. In assenza di ES39L, la proteina della microspora eL14 subisce una perdita di struttura secondaria, in cui l'α-elica che legava l'rRNA degenera in un'ansa di lunghezza minima. b L'allineamento multiplo di sequenze mostra che la proteina eL14 è altamente conservata nelle specie eucariotiche (57% di identità di sequenza tra omologhi di lievito e umani), ma scarsamente conservata e divergente nei Microsporidi (in cui non più del 24% dei residui è identico all'omologo di eL14). da S. cerevisiae o H. sapiens). Questa scarsa conservazione della sequenza e variabilità della struttura secondaria spiega perché l'omologo di eL14 non è mai stato trovato in E. cuniculi e perché si pensa che questa proteina sia andata perduta in E. cuniculi. Al contrario, eL14 di E. cuniculi era precedentemente annotata come una potenziale proteina M970_061160. Questa osservazione suggerisce che la diversità del genoma dei microsporidi sia attualmente sovrastimata: alcuni geni che si ritiene siano andati perduti nei microsporidi sono in realtà conservati, sebbene in forme altamente differenziate; invece, si ritiene che alcuni codifichino geni dei microsporidi per proteine ​​specifiche dei vermi (ad esempio, l'ipotetica proteina M970_061160) in realtà codificano per le proteine ​​molto diverse presenti in altri eucarioti.
Questa scoperta suggerisce che la denaturazione dell'rRNA può portare a una drastica perdita di conservazione della sequenza nelle proteine ​​ribosomiali adiacenti, rendendole non rilevabili per le ricerche di omologia. Pertanto, potremmo sovrastimare il grado effettivo di degradazione molecolare negli organismi con genomi di piccole dimensioni, poiché alcune proteine ​​che si ritiene siano andate perdute in realtà persistono, sebbene in forme altamente alterate.
Come possono i parassiti mantenere la funzionalità delle loro macchine molecolari in condizioni di estrema riduzione del genoma? Il nostro studio risponde a questa domanda descrivendo la complessa struttura molecolare (ribosoma) di E. cuniculi, un organismo con uno dei genomi eucariotici più piccoli.
È noto da quasi due decenni che le molecole di proteine ​​e RNA nei parassiti microbici spesso differiscono dalle loro molecole omologhe nelle specie a vita libera perché mancano di centri di controllo qualità, sono ridotte al 50% delle loro dimensioni nei microbi a vita libera, ecc. e molte mutazioni debilitanti che ne compromettono il ripiegamento e la funzionalità. Ad esempio, si prevede che i ribosomi degli organismi con genoma piccolo, inclusi molti parassiti intracellulari ed endosimbionti, siano privi di diverse proteine ​​ribosomiali e fino a un terzo dei nucleotidi di rRNA rispetto alle specie a vita libera 27, 29, 30, 49. Tuttavia, il modo in cui queste molecole funzionano nei parassiti rimane in gran parte un mistero, studiato principalmente attraverso la genomica comparativa.
Il nostro studio dimostra che la struttura delle macromolecole può rivelare molti aspetti dell'evoluzione difficili da estrarre dai tradizionali studi genomici comparativi di parassiti intracellulari e altri organismi con una ristretta attività ospite (Fig. 7 supplementare). Ad esempio, l'esempio della proteina eL14 mostra come possiamo sovrastimare il grado effettivo di degradazione dell'apparato molecolare nelle specie parassite. Si ritiene ora che i parassiti encefalitici abbiano centinaia di geni specifici dei microsporidi. Tuttavia, i nostri risultati mostrano che alcuni di questi geni apparentemente specifici sono in realtà solo varianti molto diverse di geni comuni in altri eucarioti. Inoltre, l'esempio della proteina msL2 mostra come trascuriamo le nuove proteine ​​ribosomiali e sottovalutiamo il contenuto delle macchine molecolari parassite. L'esempio delle piccole molecole mostra come possiamo trascurare le innovazioni più ingegnose nelle strutture molecolari parassite che possono conferire loro una nuova attività biologica.
Nel complesso, questi risultati migliorano la nostra comprensione delle differenze tra le strutture molecolari degli organismi ristretti all'ospite e le loro controparti negli organismi a vita libera. Dimostriamo che le macchine molecolari, a lungo considerate ridotte, degenerate e soggette a varie mutazioni debilitanti, presentano invece una serie di caratteristiche strutturali insolite sistematicamente trascurate.
D'altro canto, i frammenti di rRNA non voluminosi e i frammenti fusi che abbiamo trovato nei ribosomi di E. cuniculi suggeriscono che la riduzione del genoma può modificare anche quelle parti del macchinario molecolare di base che sono conservate nei tre domini della vita, dopo quasi 3,5 miliardi di anni di evoluzione indipendente delle specie.
I frammenti di rRNA fusi e privi di rigonfiamento nei ribosomi di E. cuniculi sono di particolare interesse alla luce di precedenti studi sulle molecole di RNA nei batteri endosimbiontici. Ad esempio, nell'endosimbionte afide Buchnera aphidicola, è stato dimostrato che le molecole di rRNA e tRNA hanno strutture sensibili alla temperatura a causa di un bias di composizione A+T e di un'elevata proporzione di coppie di basi non canoniche20,50. Si ritiene ora che questi cambiamenti nell'RNA, così come i cambiamenti nelle molecole proteiche, siano responsabili dell'eccessiva dipendenza degli endosimbionti dai partner e dell'incapacità degli endosimbionti di trasferire calore21, 23. Sebbene l'rRNA dei microsporidi parassiti presenti cambiamenti strutturalmente distinti, la natura di questi cambiamenti suggerisce che una ridotta stabilità termica e una maggiore dipendenza dalle proteine ​​chaperone possano essere caratteristiche comuni delle molecole di RNA negli organismi con genomi ridotti.
D'altra parte, le nostre strutture mostrano che i microsporidi parassiti hanno sviluppato una capacità unica di resistere a frammenti di rRNA e proteine ​​ampiamente conservati, sviluppando la capacità di utilizzare piccoli metaboliti abbondanti e facilmente disponibili come imitatori strutturali di frammenti di rRNA e proteine ​​degenerati. Degradazione della struttura molecolare. Questa opinione è supportata dal fatto che le piccole molecole che compensano la perdita di frammenti proteici nell'rRNA e nei ribosomi di E. cuniculi si legano a residui specifici dei microsporidi nelle proteine ​​uL15 ed eL30. Ciò suggerisce che il legame di piccole molecole ai ribosomi potrebbe essere un prodotto di selezione positiva, in cui mutazioni specifiche dei microsporidi nelle proteine ​​ribosomiali sono state selezionate per la loro capacità di aumentare l'affinità dei ribosomi per le piccole molecole, il che potrebbe portare a organismi ribosomiali più efficienti. La scoperta rivela un'innovazione intelligente nella struttura molecolare dei parassiti microbici e ci offre una migliore comprensione di come le strutture molecolari dei parassiti mantengano la loro funzione nonostante l'evoluzione riduttiva.
Attualmente, l'identificazione di queste piccole molecole rimane poco chiara. Non è chiaro perché l'aspetto di queste piccole molecole nella struttura ribosomiale differisca tra le specie di microsporidi. In particolare, non è chiaro perché il legame nucleotidico sia osservato nei ribosomi di E. cuniculi e P. locustae, e non nei ribosomi di V. necatrix, nonostante la presenza del residuo F170 nelle proteine ​​eL20 e K172 di V. necatrix. Questa delezione potrebbe essere causata dal residuo 43 uL6 (situato adiacente alla tasca di legame nucleotidica), che è tirosina in V. necatrix e non treonina in E. cuniculi e P. locustae. La voluminosa catena laterale aromatica di Tyr43 può interferire con il legame nucleotidico a causa della sovrapposizione sterica. In alternativa, l'apparente delezione del nucleotide potrebbe essere dovuta alla bassa risoluzione dell'imaging crio-EM, che ostacola la modellazione dei frammenti ribosomiali di V. necatrix.
D'altra parte, il nostro lavoro suggerisce che il processo di decadimento del genoma possa essere una forza inventiva. In particolare, la struttura del ribosoma di E. cuniculi suggerisce che la perdita di frammenti di rRNA e proteine ​​nel ribosoma dei microsporidi crei una pressione evolutiva che promuove cambiamenti nella struttura del ribosoma. Queste varianti si verificano lontano dal sito attivo del ribosoma e sembrano contribuire a mantenere (o ripristinare) un assemblaggio ribosomiale ottimale che altrimenti verrebbe compromesso dalla riduzione di rRNA. Ciò suggerisce che un'importante innovazione del ribosoma dei microsporidi sembra essersi evoluta nella necessità di tamponare la deriva genica.
Forse questo è meglio illustrato dal legame nucleotidico, che non è mai stato osservato finora in altri organismi. Il fatto che i residui di legame nucleotidico siano presenti nei microsporidi tipici, ma non in altri eucarioti, suggerisce che i siti di legame nucleotidico non siano solo relitti in attesa di scomparire, o il sito finale per l'rRNA da ripristinare nella forma di singoli nucleotidi. Piuttosto, questo sito sembra una caratteristica utile che potrebbe essersi evoluta nel corso di diversi cicli di selezione positiva. I siti di legame nucleotidico potrebbero essere un sottoprodotto della selezione naturale: una volta degradato ES39L, i microsporidi sono costretti a cercare una compensazione per ripristinare una biogenesi ribosomiale ottimale in assenza di ES39L. Poiché questo nucleotide può imitare i contatti molecolari del nucleotide A3186 in ES39L, la molecola di nucleotide diventa un elemento costitutivo del ribosoma, il cui legame è ulteriormente migliorato dalla mutazione della sequenza eL30.
Per quanto riguarda l'evoluzione molecolare dei parassiti intracellulari, il nostro studio dimostra che le forze della selezione naturale darwiniana e della deriva genetica del decadimento del genoma non operano in parallelo, ma oscillano. In primo luogo, la deriva genetica elimina caratteristiche importanti delle biomolecole, rendendo la compensazione assolutamente necessaria. Solo quando i parassiti soddisfano questa esigenza attraverso la selezione naturale darwiniana, le loro macromolecole avranno la possibilità di sviluppare i loro tratti più impressionanti e innovativi. È importante notare che l'evoluzione dei siti di legame dei nucleotidi nel ribosoma di E. cuniculi suggerisce che questo modello di evoluzione molecolare "perdita-guadagno" non solo ammortizza le mutazioni deleterie, ma talvolta conferisce funzioni completamente nuove alle macromolecole parassite.
Questa idea è coerente con la teoria dell'equilibrio mobile di Sewell Wright, che afferma che un rigido sistema di selezione naturale limita la capacità degli organismi di innovare51,52,53. Tuttavia, se la deriva genetica interrompe la selezione naturale, queste derive possono produrre cambiamenti che non sono di per sé adattivi (o addirittura dannosi), ma portano a ulteriori cambiamenti che forniscono una maggiore fitness o una nuova attività biologica. Il nostro modello supporta questa idea illustrando che lo stesso tipo di mutazione che riduce la ripiegatura e la funzione di una biomolecola sembra essere il principale fattore scatenante del suo miglioramento. In linea con il modello evolutivo win-win, il nostro studio dimostra che il decadimento del genoma, tradizionalmente considerato un processo degenerativo, è anche un importante motore di innovazione, consentendo talvolta e forse anche spesso alle macromolecole di acquisire nuove attività parassite.