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L'evoluzione dei parassiti microbici implica una controreazione tra la selezione naturale, che porta i parassiti a migliorare, e la deriva genetica, che causa la perdita di geni e l'accumulo di mutazioni deleterie. In questo studio, per comprendere come questa controreazione si verifichi a livello di singola macromolecola, descriviamo la struttura crioelettronica del ribosoma di Encephalitozoon cuniculi, un organismo eucariote con uno dei genomi più piccoli in natura. L'estrema riduzione dell'rRNA nei ribosomi di E. cuniculi è accompagnata da cambiamenti strutturali senza precedenti, come l'evoluzione di linker di rRNA fusi e di rRNA privo di rigonfiamenti, precedentemente sconosciuti. Inoltre, il ribosoma di E. cuniculi è sopravvissuto alla perdita di frammenti di rRNA e proteine ​​sviluppando la capacità di utilizzare piccole molecole come mimetici strutturali dei frammenti di rRNA e delle proteine ​​degradate. Nel complesso, dimostriamo che le strutture molecolari a lungo considerate ridotte, degenerate e soggette a mutazioni debilitanti possiedono una serie di meccanismi compensatori che le mantengono attive nonostante le estreme contrazioni molecolari.
Poiché la maggior parte dei gruppi di parassiti microbici possiede strumenti molecolari unici per sfruttare i propri ospiti, spesso dobbiamo sviluppare terapie diverse per gruppi di parassiti diversi1,2. Tuttavia, nuove evidenze suggeriscono che alcuni aspetti dell'evoluzione dei parassiti sono convergenti e ampiamente prevedibili, indicando una potenziale base per interventi terapeutici su vasta scala nei parassiti microbici3,4,5,6,7,8,9.
Studi precedenti hanno identificato una tendenza evolutiva comune nei parassiti microbici chiamata riduzione del genoma o decadimento del genoma10,11,12,13. La ricerca attuale mostra che quando i microrganismi abbandonano il loro stile di vita libero e diventano parassiti intracellulari (o endosimbionti), i loro genomi subiscono metamorfosi lente ma sorprendenti nel corso di milioni di anni9,11. In un processo noto come decadimento del genoma, i parassiti microbici accumulano mutazioni deleterie che trasformano molti geni precedentemente importanti in pseudogeni, portando a una graduale perdita genica e al collasso mutazionale14,15. Questo collasso può distruggere fino al 95% dei geni negli organismi intracellulari più antichi rispetto alle specie a vita libera strettamente correlate. Pertanto, l'evoluzione dei parassiti intracellulari è un tiro alla fune tra due forze opposte: la selezione naturale darwiniana, che porta al miglioramento dei parassiti, e il collasso del genoma, che getta i parassiti nell'oblio. Non è ancora chiaro come il parassita sia riuscito a emergere da questa lotta e a conservare l'attività della sua struttura molecolare.
Sebbene il meccanismo del decadimento del genoma non sia del tutto compreso, sembra che si verifichi principalmente a causa della frequente deriva genetica. Poiché i parassiti vivono in popolazioni piccole, asessuate e geneticamente limitate, non sono in grado di eliminare efficacemente le mutazioni deleterie che talvolta si verificano durante la replicazione del DNA. Ciò porta a un accumulo irreversibile di mutazioni dannose e alla riduzione del genoma del parassita. Di conseguenza, il parassita non solo perde i geni che non sono più necessari per la sua sopravvivenza nell'ambiente intracellulare. È l'incapacità delle popolazioni di parassiti di eliminare efficacemente le mutazioni deleterie sporadiche che causa l'accumulo di queste mutazioni in tutto il genoma, compresi i geni più importanti.
Gran parte della nostra attuale comprensione della riduzione del genoma si basa esclusivamente sul confronto delle sequenze genomiche, con minore attenzione ai cambiamenti nelle molecole effettive che svolgono funzioni di mantenimento e fungono da potenziali bersagli farmacologici. Studi comparativi hanno dimostrato che il carico di mutazioni microbiche intracellulari dannose sembra predisporre proteine ​​e acidi nucleici a ripiegarsi in modo errato e ad aggregarsi, rendendoli più dipendenti dalle chaperonine e ipersensibili al calore19,20,21,22,23. Inoltre, diversi parassiti – la cui evoluzione indipendente è talvolta separata da ben 2,5 miliardi di anni – hanno subito una simile perdita di centri di controllo qualità nella loro sintesi proteica5,6 e nei meccanismi di riparazione del DNA24. Tuttavia, si sa poco sull'impatto dello stile di vita intracellulare su tutte le altre proprietà delle macromolecole cellulari, compreso l'adattamento molecolare a un carico crescente di mutazioni dannose.
In questo lavoro, al fine di comprendere meglio l'evoluzione delle proteine ​​e degli acidi nucleici dei microrganismi intracellulari, abbiamo determinato la struttura dei ribosomi del parassita intracellulare Encephalitozoon cuniculi. E. cuniculi è un organismo simile a un fungo appartenente a un gruppo di microsporidi parassiti che possiedono genomi eucariotici insolitamente piccoli e sono quindi utilizzati come organismi modello per studiare il decadimento del genoma25,26,27,28,29,30. Recentemente, la struttura dei ribosomi tramite crio-microscopia elettronica è stata determinata per genomi moderatamente ridotti di Microsporidia, Paranosema locustae e Vairimorpha necatrix31,32 (genoma di circa 3,2 Mb). Queste strutture suggeriscono che una certa perdita di amplificazione dell'rRNA sia compensata dallo sviluppo di nuovi contatti tra proteine ​​ribosomiali vicine o dall'acquisizione di nuove proteine ​​ribosomiali msL131,32. La specie Encephalitozoon (genoma di circa 2,5 milioni di bp), insieme al suo parente più stretto Ordospora, dimostra il grado estremo di riduzione del genoma negli eucarioti: possiede meno di 2000 geni codificanti proteine ​​e si prevede che i suoi ribosomi non solo siano privi di frammenti di espansione dell'rRNA (frammenti di rRNA che distinguono i ribosomi eucariotici da quelli batterici), ma abbiano anche quattro proteine ​​ribosomiali a causa della mancanza di omologhi nel genoma di E. cuniculi26,27,28. Pertanto, abbiamo concluso che il ribosoma di E. cuniculi può rivelare strategie finora sconosciute di adattamento molecolare al decadimento del genoma.
La nostra struttura ottenuta tramite crio-microscopia elettronica rappresenta il più piccolo ribosoma citoplasmatico eucariotico mai caratterizzato e fornisce informazioni su come il grado di riduzione del genoma influenzi la struttura, l'assemblaggio e l'evoluzione del macchinario molecolare essenziale per la cellula. Abbiamo scoperto che il ribosoma di E. cuniculi viola molti dei principi ampiamente conservati del ripiegamento dell'RNA e dell'assemblaggio del ribosoma, e abbiamo individuato una nuova proteina ribosomiale precedentemente sconosciuta. In modo del tutto inaspettato, dimostriamo che i ribosomi dei microsporidi hanno sviluppato la capacità di legare piccole molecole e ipotizziamo che le troncature nell'rRNA e nelle proteine ​​inneschino innovazioni evolutive che potrebbero in definitiva conferire al ribosoma qualità utili.
Per migliorare la nostra comprensione dell'evoluzione delle proteine ​​e degli acidi nucleici negli organismi intracellulari, abbiamo deciso di isolare le spore di E. cuniculi da colture di cellule di mammifero infette al fine di purificarne i ribosomi e determinarne la struttura. È difficile ottenere un gran numero di microsporidi parassiti perché questi non possono essere coltivati ​​in un terreno di coltura. Crescono e si riproducono solo all'interno della cellula ospite. Pertanto, per ottenere biomassa di E. cuniculi per la purificazione dei ribosomi, abbiamo infettato la linea cellulare renale di mammifero RK13 con spore di E. cuniculi e coltivato queste cellule infette per diverse settimane per consentire a E. cuniculi di crescere e moltiplicarsi. Utilizzando un monostrato di cellule infette di circa mezzo metro quadrato, siamo stati in grado di purificare circa 300 mg di spore di microsporidi e utilizzarle per isolare i ribosomi. Abbiamo quindi disgregato le spore purificate con microsfere di vetro e isolato i ribosomi grezzi mediante frazionamento graduale dei lisati con polietilenglicole. Ciò ci ha permesso di ottenere circa 300 µg di ribosomi grezzi di E. cuniculi per l'analisi strutturale.
Abbiamo quindi raccolto immagini di crio-EM utilizzando i campioni di ribosomi risultanti e le abbiamo elaborate utilizzando maschere corrispondenti alla subunità ribosomiale grande, alla testa della subunità piccola e alla subunità piccola. Durante questo processo, abbiamo raccolto immagini di circa 108.000 particelle ribosomiali e calcolato immagini di crio-EM con una risoluzione di 2,7 Å (Figure supplementari 1-3). Abbiamo quindi utilizzato le immagini di crio-EM per modellare l'rRNA, le proteine ​​ribosomiali e il fattore di ibernazione Mdf1 associati ai ribosomi di E. cuniculi (Fig. 1a, b).
a Struttura del ribosoma di E. cuniculi in complesso con il fattore di ibernazione Mdf1 (pdb id 7QEP). b Mappa del fattore di ibernazione Mdf1 associato al ribosoma di E. cuniculi. c Mappa della struttura secondaria che confronta l'rRNA recuperato nelle specie di Microsporidi con le strutture ribosomiali note. I pannelli mostrano la posizione dei frammenti di rRNA amplificati (ES) e dei siti attivi del ribosoma, inclusi il sito di decodifica (DC), l'ansa della sarcinicina (SRL) e il centro della peptidil transferasi (PTC). d La densità elettronica corrispondente al centro della peptidil transferasi del ribosoma di E. cuniculi suggerisce che questo sito catalitico abbia la stessa struttura nel parassita E. cuniculi e nei suoi ospiti, incluso H. sapiens. e, f La corrispondente densità elettronica del centro di decodifica (e) e la struttura schematica del centro di decodifica (f) indicano che E. cuniculi presenta residui U1491 invece di A1491 (numerazione di E. coli) presenti in molti altri eucarioti. Questa modifica suggerisce che E. cuniculi potrebbe essere sensibile agli antibiotici che agiscono su questo sito attivo.
A differenza delle strutture precedentemente stabilite dei ribosomi di V. necatrix e P. locustae (entrambe le strutture rappresentano la stessa famiglia di microsporidi Nosematidae e sono molto simili tra loro), 31,32 i ribosomi di E. cuniculi subiscono numerosi processi di frammentazione dell'rRNA e delle proteine. Ulteriore denaturazione (Figure supplementari 4-6). Nell'rRNA, i cambiamenti più evidenti includono la perdita completa del frammento amplificato di rRNA 25S ES12L e la degenerazione parziale delle eliche h39, h41 e H18 (Fig. 1c, Figura supplementare 4). Tra le proteine ​​ribosomiali, i cambiamenti più evidenti hanno incluso la perdita completa della proteina eS30 e l'accorciamento delle proteine ​​eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 ed eS7 (Figure supplementari 4, 5).
Pertanto, l'estrema riduzione dei genomi delle specie di Encephalotozoon/Ordospora si riflette nella struttura dei loro ribosomi: i ribosomi di E. cuniculi subiscono la più drastica perdita di contenuto proteico tra i ribosomi citoplasmatici eucariotici sottoposti a caratterizzazione strutturale, e non possiedono nemmeno quei frammenti di rRNA e proteine ​​ampiamente conservati non solo negli eucarioti, ma anche nei tre domini della vita. La struttura del ribosoma di E. cuniculi fornisce il primo modello molecolare per questi cambiamenti e rivela eventi evolutivi che sono stati trascurati sia dalla genomica comparativa che dagli studi sulla struttura biomolecolare intracellulare (Figura supplementare 7). Di seguito, descriviamo ciascuno di questi eventi insieme alle loro probabili origini evolutive e al loro potenziale impatto sulla funzione del ribosoma.
Abbiamo quindi scoperto che, oltre alle grandi troncature dell'rRNA, i ribosomi di E. cuniculi presentano variazioni dell'rRNA in uno dei loro siti attivi. Sebbene il centro della peptidil transferasi del ribosoma di E. cuniculi abbia la stessa struttura di altri ribosomi eucariotici (Fig. 1d), il centro di decodifica differisce a causa di una variazione di sequenza al nucleotide 1491 (numerazione di E. coli, Fig. 1e, f). Questa osservazione è importante perché il sito di decodifica dei ribosomi eucariotici contiene tipicamente i residui G1408 e A1491, a differenza dei residui A1408 e G1491 presenti nei ribosomi batterici. Questa variazione è alla base della diversa sensibilità dei ribosomi batterici ed eucariotici alla famiglia degli aminoglicosidi, antibiotici ribosomiali, e ad altre piccole molecole che agiscono sul sito di decodifica. Nel sito di decodifica del ribosoma di E. cuniculi, il residuo A1491 è stato sostituito con U1491, creando potenzialmente un'interfaccia di legame unica per piccole molecole che prendono di mira questo sito attivo. La stessa variante A14901 è presente anche in altri microsporidi come P. locustae e V. necatrix, suggerendo che sia diffusa tra le specie di microsporidi (Fig. 1f).
Poiché i nostri campioni di ribosomi di E. cuniculi sono stati isolati da spore metabolicamente inattive, abbiamo testato la mappa cryo-EM di E. cuniculi per il legame ribosomiale precedentemente descritto in condizioni di stress o carenza di nutrienti. Fattori di ibernazione 31,32,36,37, 38. Abbiamo confrontato la struttura precedentemente stabilita del ribosoma in ibernazione con la mappa cryo-EM del ribosoma di E. cuniculi. Per il docking, sono stati utilizzati ribosomi di S. cerevisiae in complesso con il fattore di ibernazione Stm138, ribosomi di locusta in complesso con il fattore Lso232 e ribosomi di V. necatrix in complesso con i fattori Mdf1 e Mdf231. Allo stesso tempo, abbiamo trovato la densità cryo-EM corrispondente al fattore di riposo Mdf1. Analogamente al legame di Mdf1 al ribosoma di V. necatrix, Mdf1 si lega anche al ribosoma di E. cuniculi, dove blocca il sito E del ribosoma, contribuendo probabilmente a rendere i ribosomi disponibili quando le spore del parassita diventano metabolicamente inattive in seguito all'inattivazione del corpo (Figura 2).
Mdf1 blocca il sito E del ribosoma, il che sembra contribuire all'inattivazione del ribosoma quando le spore del parassita diventano metabolicamente inattive. Nella struttura del ribosoma di E. cuniculi, abbiamo scoperto che Mdf1 forma un contatto precedentemente sconosciuto con lo stelo ribosomiale L1, la parte del ribosoma che facilita il rilascio del tRNA deacetilato dal ribosoma durante la sintesi proteica. Questi contatti suggeriscono che Mdf1 si dissocia dal ribosoma utilizzando lo stesso meccanismo del tRNA deacetilato, fornendo una possibile spiegazione di come il ribosoma rimuova Mdf1 per riattivare la sintesi proteica.
Tuttavia, la nostra struttura ha rivelato un contatto sconosciuto tra Mdf1 e la gamba L1 del ribosoma (la parte del ribosoma che aiuta a rilasciare il tRNA deacetilato dal ribosoma durante la sintesi proteica). In particolare, Mdf1 utilizza gli stessi contatti del segmento del gomito della molecola di tRNA deacetilato (Fig. 2). Questa modellazione molecolare, precedentemente sconosciuta, ha mostrato che Mdf1 si dissocia dal ribosoma utilizzando lo stesso meccanismo del tRNA deacetilato, il che spiega come il ribosoma rimuova questo fattore di ibernazione per riattivare la sintesi proteica.
Durante la costruzione del modello di rRNA, abbiamo scoperto che il ribosoma di E. cuniculi presenta frammenti di rRNA ripiegati in modo anomalo, che abbiamo chiamato rRNA fuso (Fig. 3). Nei ribosomi che attraversano i tre domini della vita, l'rRNA si ripiega in strutture in cui la maggior parte delle basi dell'rRNA si appaiano e si ripiegano tra loro oppure interagiscono con le proteine ​​ribosomiali38,39,40. Tuttavia, nei ribosomi di E. cuniculi, gli rRNA sembrano violare questo principio di ripiegamento convertendo alcune delle loro eliche in regioni di rRNA non ripiegate.
Struttura dell'elica dell'rRNA 25S H18 in S. cerevisiae, V. necatrix ed E. cuniculi. Tipicamente, nei ribosomi che attraversano i tre domini vitali, questo linker si avvolge a formare un'elica di RNA contenente da 24 a 34 residui. Nei microsporidi, al contrario, questo linker dell'rRNA si riduce gradualmente a due linker a singolo filamento ricchi di uridina, contenenti solo 12 residui. La maggior parte di questi residui è esposta ai solventi. La figura mostra che i microsporidi parassiti sembrano violare i principi generali del ripiegamento dell'rRNA, dove le basi dell'rRNA sono solitamente accoppiate ad altre basi o coinvolte in interazioni rRNA-proteine. Nei microsporidi, alcuni frammenti di rRNA assumono una conformazione sfavorevole, in cui l'ex elica di rRNA diventa un frammento a singolo filamento allungato quasi in linea retta. La presenza di queste regioni insolite permette all'rRNA dei microsporidi di legarsi a frammenti di rRNA distanti utilizzando un numero minimo di basi di RNA.
L'esempio più eclatante di questa transizione evolutiva può essere osservato nell'elica H18 dell'rRNA 25S (Fig. 3). Nelle specie che vanno da E. coli all'uomo, le basi di questa elica di rRNA contengono 24-32 nucleotidi, formando un'elica leggermente irregolare. Nelle strutture ribosomiali precedentemente identificate in V. necatrix e P. locustae,31,32 le basi dell'elica H18 sono parzialmente svolte, ma l'appaiamento delle basi nucleotidiche è preservato. Tuttavia, in E. cuniculi questo frammento di rRNA diventa i linker più corti 228UUUGU232 e 301UUUUUUUUU307. A differenza dei tipici frammenti di rRNA, questi linker ricchi di uridina non si avvolgono né entrano in contatto esteso con le proteine ​​ribosomiali. Al contrario, adottano strutture aperte al solvente e completamente dispiegate in cui i filamenti di rRNA sono estesi quasi rettilinei. Questa conformazione allungata spiega come E. cuniculi utilizzi solo 12 basi di RNA per riempire lo spazio di 33 Å tra le eliche di rRNA H16 e H18, mentre altre specie richiedono almeno il doppio delle basi di rRNA per riempire tale spazio.
Possiamo quindi dimostrare che, attraverso un ripiegamento energeticamente sfavorevole, i microsporidi parassiti hanno sviluppato una strategia per contrarre anche quei segmenti di rRNA che rimangono ampiamente conservati tra le specie nei tre domini della vita. Apparentemente, accumulando mutazioni che trasformano le eliche di rRNA in brevi linker di poli-U, E. cuniculi può formare frammenti di rRNA insoliti contenenti il ​​minor numero possibile di nucleotidi per la ligazione dei frammenti di rRNA distali. Ciò contribuisce a spiegare come i microsporidi abbiano ottenuto una drastica riduzione della loro struttura molecolare di base senza perdere la loro integrità strutturale e funzionale.
Un'altra caratteristica insolita dell'rRNA di E. cuniculi è l'aspetto dell'rRNA senza ispessimenti (Fig. 4). I rigonfiamenti sono nucleotidi senza coppie di basi che si attorcigliano fuori dall'elica dell'RNA invece di nascondersi al suo interno. La maggior parte delle protrusioni dell'rRNA agisce come adesivo molecolare, contribuendo a legare le proteine ​​ribosomiali adiacenti o altri frammenti di rRNA. Alcuni dei rigonfiamenti agiscono come cerniere, consentendo all'elica dell'rRNA di flettersi e ripiegarsi in modo ottimale per una sintesi proteica produttiva 41.
a Una protrusione dell'rRNA (numerazione di S. cerevisiae) è assente nella struttura ribosomiale di E. cuniculi, ma presente nella maggior parte degli altri eucarioti b Ribosomi interni di E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens ed E. cuniculi. I parassiti mancano di molte delle antiche e altamente conservate protuberanze dell'rRNA. Questi ispessimenti stabilizzano la struttura ribosomiale; pertanto, la loro assenza nei microsporidi indica una ridotta stabilità del ripiegamento dell'rRNA nei parassiti microsporidi. Il confronto con gli steli P (steli L7/L12 nei batteri) mostra che la perdita delle protuberanze dell'rRNA a volte coincide con la comparsa di nuove protuberanze accanto a quelle perse. L'elica H42 nell'rRNA 23S/28S ha un'antica protuberanza (U1206 in Saccharomyces cerevisiae) stimata avere almeno 3,5 miliardi di anni grazie alla sua protezione in tre domini della vita. Nei microsporidi, questa protuberanza viene eliminata. Tuttavia, una nuova protuberanza è apparsa accanto a quella scomparsa (A1306 in E. cuniculi).
Sorprendentemente, abbiamo scoperto che i ribosomi di E. cuniculi sono privi della maggior parte delle protuberanze dell'rRNA presenti in altre specie, incluse più di 30 protuberanze conservate in altri eucarioti (Fig. 4a). Questa perdita elimina molti contatti tra le subunità ribosomiali e le eliche di rRNA adiacenti, creando talvolta grandi cavità all'interno del ribosoma, rendendo il ribosoma di E. cuniculi più poroso rispetto ai ribosomi più tradizionali (Fig. 4b). In particolare, abbiamo scoperto che la maggior parte di queste protuberanze erano assenti anche nelle strutture ribosomiali di V. necatrix e P. locustae precedentemente identificate, che erano state trascurate dalle precedenti analisi strutturali31,32.
Talvolta la perdita delle protuberanze dell'rRNA è accompagnata dallo sviluppo di nuove protuberanze in prossimità di quella persa. Ad esempio, lo stelo P ribosomiale contiene una protuberanza U1208 (in Saccharomyces cerevisiae) che è sopravvissuta da E. coli all'uomo e si stima quindi che abbia 3,5 miliardi di anni. Durante la sintesi proteica, questa protuberanza aiuta lo stelo P a passare da una conformazione aperta a una chiusa, in modo che il ribosoma possa reclutare i fattori di traduzione e trasportarli al sito attivo. Nei ribosomi di E. cuniculi, questo ispessimento è assente; tuttavia, un nuovo ispessimento (G883) localizzato in sole tre coppie di basi può contribuire al ripristino della flessibilità ottimale dello stelo P (Fig. 4c).
I nostri dati sull'rRNA senza rigonfiamenti suggeriscono che la minimizzazione dell'rRNA non si limita alla perdita di elementi di rRNA sulla superficie del ribosoma, ma può coinvolgere anche il nucleo del ribosoma, creando un difetto molecolare specifico del parassita che non è stato descritto nelle cellule a vita libera.
Dopo aver modellato le proteine ​​ribosomiali canoniche e l'rRNA, abbiamo scoperto che i componenti ribosomiali convenzionali non possono spiegare le tre parti dell'immagine crioelettronica. Due di questi frammenti sono molecole di piccole dimensioni (Fig. 5, Figura supplementare 8). Il primo segmento è interposto tra le proteine ​​ribosomiali uL15 ed eL18 in una posizione solitamente occupata dal C-terminale di eL18, che è accorciato in E. cuniculi. Sebbene non possiamo determinare l'identità di questa molecola, le dimensioni e la forma di quest'isola di densità sono ben spiegate dalla presenza di molecole di spermidina. Il suo legame al ribosoma è stabilizzato da mutazioni specifiche dei microsporidi nelle proteine ​​uL15 (Asp51 e Arg56), che sembrano aumentare l'affinità del ribosoma per questa piccola molecola, poiché consentono a uL15 di avvolgere la piccola molecola in una struttura ribosomiale. Figura supplementare 2). 8, dati aggiuntivi 1, 2).
Immagini di crio-microscopia elettronica che mostrano la presenza di nucleotidi al di fuori del ribosio legato al ribosoma di E. cuniculi. Nel ribosoma di E. cuniculi, questo nucleotide occupa la stessa posizione del nucleotide A3186 dell'rRNA 25S (numerazione di Saccharomyces cerevisiae) nella maggior parte degli altri ribosomi eucariotici. b Nella struttura ribosomiale di E. cuniculi, questo nucleotide si trova tra le proteine ​​ribosomiali uL9 ed eL20, stabilizzando così il contatto tra le due proteine. cd Analisi della conservazione della sequenza di eL20 tra le specie di microsporidi. L'albero filogenetico delle specie di Microsporidia (c) e l'allineamento multiplo di sequenze della proteina eL20 (d) mostrano che i residui di legame ai nucleotidi F170 e K172 sono conservati nella maggior parte dei Microsporidia tipici, con l'eccezione di S. lophii, con l'eccezione dei Microsporidia a ramificazione precoce, che hanno mantenuto l'estensione dell'rRNA ES39L. e Questa figura mostra che i residui di legame ai nucleotidi F170 e K172 sono presenti solo in eL20 del genoma dei microsporidi altamente ridotto, ma non in altri eucarioti. Nel complesso, questi dati suggeriscono che i ribosomi dei Microsporidia hanno sviluppato un sito di legame ai nucleotidi che sembra legare le molecole AMP e usarle per stabilizzare le interazioni proteina-proteina nella struttura ribosomiale. L'elevata conservazione di questo sito di legame nei Microsporidia e la sua assenza in altri eucarioti suggeriscono che questo sito possa fornire un vantaggio selettivo di sopravvivenza per i Microsporidia. Pertanto, la tasca di legame dei nucleotidi nel ribosoma dei microsporidi non sembra essere una caratteristica degenerata o una forma terminale di degradazione dell'rRNA come precedentemente descritto, ma piuttosto un'utile innovazione evolutiva che consente al ribosoma dei microsporidi di legare direttamente piccole molecole, utilizzandole come elementi costitutivi molecolari. Questa scoperta rende il ribosoma dei microsporidi l'unico ribosoma noto a utilizzare un singolo nucleotide come elemento strutturale. f Percorso evolutivo ipotetico derivato dal legame dei nucleotidi.
La seconda densità a basso peso molecolare si trova all'interfaccia tra le proteine ​​ribosomiali uL9 ed eL30 (Fig. 5a). Questa interfaccia è stata precedentemente descritta nella struttura del ribosoma di Saccharomyces cerevisiae come sito di legame per il nucleotide 25S dell'rRNA A3186 (parte dell'estensione rRNA ES39L)38. È stato dimostrato che nei ribosomi degenerati ES39L di P. locustae, questa interfaccia lega un singolo nucleotide sconosciuto31, e si presume che questo nucleotide sia una forma finale ridotta di rRNA, in cui la lunghezza dell'rRNA è di circa 130-230 basi. ES39L è ridotto a un singolo nucleotide32.43. Le nostre immagini di crio-EM supportano l'idea che la densità possa essere spiegata dai nucleotidi. Tuttavia, la maggiore risoluzione della nostra struttura ha mostrato che questo nucleotide è una molecola extraribosomiale, probabilmente AMP (Fig. 5a, b).
Abbiamo quindi chiesto se il sito di legame del nucleotide fosse presente nel ribosoma di E. cuniculi o se esistesse già in precedenza. Poiché il legame del nucleotide è mediato principalmente dai residui Phe170 e Lys172 nella proteina ribosomiale eL30, abbiamo valutato la conservazione di questi residui in 4396 eucarioti rappresentativi. Come nel caso di uL15 sopra, abbiamo scoperto che i residui Phe170 e Lys172 sono altamente conservati solo nei Microsporidi tipici, ma assenti in altri eucarioti, inclusi i Microsporidi atipici Mitosporidium e Amphiamblys, nei quali il frammento di rRNA ES39L non è ridotto 44, 45, 46 (Fig. 5c). -e).
Nel loro insieme, questi dati supportano l'idea che E. cuniculi e probabilmente altri microsporidi canonici abbiano sviluppato la capacità di catturare in modo efficiente un gran numero di piccoli metaboliti nella struttura ribosomiale per compensare il declino dei livelli di rRNA e proteine. In tal modo, hanno sviluppato una capacità unica di legare i nucleotidi all'esterno del ribosoma, dimostrando che le strutture molecolari parassitarie compensano catturando abbondanti piccoli metaboliti e utilizzandoli come imitatori strutturali di frammenti di RNA e proteine ​​degradati.
La terza parte non simulata della nostra mappa di crio-EM, trovata nella grande subunità ribosomiale. La risoluzione relativamente alta (2,6 Å) della nostra mappa suggerisce che questa densità appartiene a proteine ​​con combinazioni uniche di grandi residui di catena laterale, che ci hanno permesso di identificare questa densità come una proteina ribosomiale precedentemente sconosciuta che abbiamo identificato come msL2 (proteina L2 specifica dei Microsporidi) (metodi, figura 6). La nostra ricerca di omologia ha mostrato che msL2 è conservata nel clade dei Microsporidi dei generi Encephaliter e Orosporidium, ma assente in altre specie, inclusi altri Microsporidi. Nella struttura ribosomiale, msL2 occupa uno spazio vuoto formato dalla perdita dell'rRNA esteso ES31L. In questo spazio vuoto, msL2 aiuta a stabilizzare il ripiegamento dell'rRNA e può compensare la perdita di ES31L (Figura 6).
a Densità elettronica e modello della proteina ribosomiale msL2, specifica dei Microsporidi, presente nei ribosomi di E. cuniculi. b La maggior parte dei ribosomi eucariotici, incluso il ribosoma 80S di Saccharomyces cerevisiae, presenta l'amplificazione dell'rRNA ES19L, persa nella maggior parte delle specie di Microsporidi. La struttura precedentemente stabilita del ribosoma del microsporidio V. necatrix suggerisce che la perdita di ES19L in questi parassiti sia compensata dall'evoluzione della nuova proteina ribosomiale msL1. In questo studio, abbiamo scoperto che anche il ribosoma di E. cuniculi ha sviluppato un'ulteriore proteina mimetica dell'RNA ribosomiale come apparente compensazione per la perdita di ES19L. Tuttavia, msL2 (attualmente annotata come la proteina ipotetica ECU06_1135) e msL1 hanno origini strutturali ed evolutive diverse. c Questa scoperta della generazione di proteine ​​ribosomiali msL1 e msL2 evolutivamente non correlate suggerisce che, se i ribosomi accumulano mutazioni dannose nel loro rRNA, possono raggiungere livelli di diversità compositiva senza precedenti anche in un piccolo sottoinsieme di specie strettamente correlate. Questa scoperta potrebbe contribuire a chiarire l'origine e l'evoluzione del ribosoma mitocondriale, noto per il suo rRNA altamente ridotto e l'anomala variabilità nella composizione proteica tra le specie.
Abbiamo quindi confrontato la proteina msL2 con la proteina msL1 precedentemente descritta, l'unica proteina ribosomiale specifica dei microsporidi nota e presente nel ribosoma di V. necatrix. Volevamo verificare se msL1 e msL2 fossero evolutivamente correlate. La nostra analisi ha mostrato che msL1 e msL2 occupano la stessa cavità nella struttura ribosomiale, ma presentano strutture primaria e terziaria differenti, il che indica una loro origine evolutiva indipendente (Fig. 6). Pertanto, la nostra scoperta di msL2 fornisce la prova che gruppi di specie eucariotiche compatte possono evolvere indipendentemente proteine ​​ribosomiali strutturalmente distinte per compensare la perdita di frammenti di rRNA. Questa scoperta è degna di nota in quanto la maggior parte dei ribosomi eucariotici citoplasmatici contiene una proteina invariante, inclusa la stessa famiglia di 81 proteine ​​ribosomiali. La comparsa di msL1 e msL2 in vari cladi di microsporidi in risposta alla perdita di segmenti estesi di rRNA suggerisce che la degradazione dell'architettura molecolare del parassita induca i parassiti a cercare mutazioni compensatorie, che possono eventualmente portare alla loro acquisizione in diverse popolazioni di parassiti. strutture.
Infine, una volta completato il nostro modello, abbiamo confrontato la composizione del ribosoma di E. cuniculi con quella prevista dalla sequenza genomica. Si riteneva che diverse proteine ​​ribosomiali, tra cui eL14, eL38, eL41 ed eS30, fossero assenti dal genoma di E. cuniculi a causa dell'apparente assenza dei loro omologhi. La perdita di molte proteine ​​ribosomiali è prevista anche nella maggior parte degli altri parassiti e endosimbionti intracellulari altamente ridotti. Ad esempio, sebbene la maggior parte dei batteri a vita libera contenga la stessa famiglia di 54 proteine ​​ribosomiali, solo 11 di queste famiglie proteiche presentano omologhi rilevabili in ciascun genoma analizzato di batteri con un ospite specifico. A sostegno di questa ipotesi, è stata osservata sperimentalmente una perdita di proteine ​​ribosomiali nei microsporidi di V. necatrix e P. locustae, che sono privi delle proteine ​​eL38 e eL4131,32.
Tuttavia, le nostre strutture mostrano che solo eL38, eL41 ed eS30 vengono effettivamente persi nel ribosoma di E. cuniculi. La proteina eL14 è stata conservata e la nostra struttura ha mostrato perché questa proteina non è stata trovata nella ricerca di omologia (Fig. 7). Nei ribosomi di E. cuniculi, la maggior parte del sito di legame di eL14 viene persa a causa della degradazione dell'rRNA amplificato ES39L. In assenza di ES39L, eL14 ha perso la maggior parte della sua struttura secondaria e solo il 18% della sequenza di eL14 era identica in E. cuniculi e S. cerevisiae. Questa scarsa conservazione della sequenza è notevole perché persino Saccharomyces cerevisiae e Homo sapiens, organismi che si sono evoluti a 1,5 miliardi di anni di distanza, condividono più del 51% degli stessi residui in eL14. Questa anomala perdita di conservazione spiega perché E. cuniculi eL14 è attualmente annotata come la presunta proteina M970_061160 e non come la proteina ribosomiale eL1427.
e Il ribosoma dei microsporidi ha perso l'estensione rRNA ES39L, che ha parzialmente eliminato il sito di legame della proteina ribosomiale eL14. In assenza di ES39L, la proteina microspora eL14 subisce una perdita di struttura secondaria, in cui la precedente α-elica di legame all'rRNA degenera in un anello di lunghezza minima. b L'allineamento multiplo di sequenze mostra che la proteina eL14 è altamente conservata nelle specie eucariotiche (57% di identità di sequenza tra gli omologhi di lievito e umani), ma scarsamente conservata e divergente nei microsporidi (in cui non più del 24% dei residui sono identici all'omologo eL14). da S. cerevisiae o H. sapiens). Questa scarsa conservazione della sequenza e la variabilità della struttura secondaria spiegano perché l'omologo eL14 non è mai stato trovato in E. cuniculi e perché si pensa che questa proteina sia andata persa in E. cuniculi. Al contrario, E. cuniculi eL14 era stato precedentemente annotato come una presunta proteina M970_061160. Questa osservazione suggerisce che la diversità del genoma dei microsporidi sia attualmente sovrastimata: alcuni geni che si pensa siano andati persi nei microsporidi sono in realtà conservati, sebbene in forme altamente differenziate; invece, alcuni geni che si pensa codifichino per proteine ​​specifiche dei microsporidi (ad esempio, la proteina ipotetica M970_061160) in realtà codificano per le diverse proteine ​​che si trovano in altri eucarioti.
Questo risultato suggerisce che la denaturazione dell'rRNA può portare a una drastica perdita di conservazione della sequenza nelle proteine ​​ribosomiali adiacenti, rendendo queste proteine ​​non rilevabili tramite ricerche di omologia. Pertanto, potremmo sovrastimare il reale grado di degradazione molecolare negli organismi con genoma piccolo, poiché alcune proteine ​​che si pensava fossero andate perdute in realtà persistono, seppur in forme altamente alterate.
Come fanno i parassiti a mantenere la funzionalità delle loro macchine molecolari in condizioni di estrema riduzione del genoma? Il nostro studio risponde a questa domanda descrivendo la complessa struttura molecolare (ribosoma) di E. cuniculi, un organismo con uno dei genomi eucariotici più piccoli.
È noto da quasi due decenni che le molecole proteiche e di RNA nei parassiti microbici spesso differiscono dalle loro molecole omologhe nelle specie a vita libera perché mancano di centri di controllo qualità, sono ridotte al 50% delle loro dimensioni nei microbi a vita libera, ecc., e presentano molte mutazioni debilitanti che compromettono il ripiegamento e la funzione. Ad esempio, si prevede che i ribosomi degli organismi con genoma piccolo, inclusi molti parassiti intracellulari ed endosimbionti, siano privi di diverse proteine ​​ribosomiali e fino a un terzo dei nucleotidi di rRNA rispetto alle specie a vita libera 27, 29, 30, 49. Tuttavia, il modo in cui queste molecole funzionano nei parassiti rimane in gran parte un mistero, studiato principalmente attraverso la genomica comparativa.
Il nostro studio dimostra che la struttura delle macromolecole può rivelare molti aspetti dell'evoluzione difficili da estrarre dai tradizionali studi di genomica comparativa sui parassiti intracellulari e altri organismi con un ospite specifico (Figura supplementare 7). Ad esempio, l'esempio della proteina eL14 mostra come possiamo sovrastimare il reale grado di degradazione dell'apparato molecolare nelle specie parassite. Si ritiene che i parassiti encefalitici possiedano centinaia di geni specifici per i microsporidi. Tuttavia, i nostri risultati mostrano che alcuni di questi geni apparentemente specifici sono in realtà solo varianti molto diverse di geni comuni in altri eucarioti. Inoltre, l'esempio della proteina msL2 mostra come trascuriamo nuove proteine ​​ribosomiali e sottovalutiamo il contenuto delle macchine molecolari parassitarie. L'esempio delle piccole molecole mostra come possiamo trascurare le innovazioni più ingegnose nelle strutture molecolari parassitarie, che possono conferire loro una nuova attività biologica.
Nel loro insieme, questi risultati migliorano la nostra comprensione delle differenze tra le strutture molecolari degli organismi confinati a un ospite specifico e le loro controparti negli organismi a vita libera. Dimostriamo che le macchine molecolari, a lungo considerate ridotte, degenerate e soggette a varie mutazioni debilitanti, possiedono invece una serie di caratteristiche strutturali insolite sistematicamente trascurate.
D'altra parte, i frammenti di rRNA non voluminosi e i frammenti fusi che abbiamo trovato nei ribosomi di E. cuniculi suggeriscono che la riduzione del genoma può modificare anche quelle parti del macchinario molecolare di base che si sono conservate nei tre domini della vita, dopo quasi 3,5 miliardi di anni di evoluzione indipendente delle specie.
I frammenti di rRNA privi di rigonfiamenti e fusi nei ribosomi di E. cuniculi sono di particolare interesse alla luce di precedenti studi sulle molecole di RNA nei batteri endosimbionti. Ad esempio, nell'endosimbionte degli afidi Buchnera aphidicola, è stato dimostrato che le molecole di rRNA e tRNA presentano strutture termosensibili a causa della distorsione nella composizione A+T e di un'elevata proporzione di coppie di basi non canoniche20,50. Si ritiene ora che questi cambiamenti nell'RNA, così come i cambiamenti nelle molecole proteiche, siano responsabili dell'eccessiva dipendenza degli endosimbionti dai partner e dell'incapacità degli endosimbionti di trasferire calore21, 23. Sebbene l'rRNA dei microsporidi parassiti presenti cambiamenti strutturalmente distinti, la natura di questi cambiamenti suggerisce che la ridotta stabilità termica e la maggiore dipendenza dalle proteine ​​chaperon possano essere caratteristiche comuni delle molecole di RNA negli organismi con genomi ridotti.
D'altra parte, le nostre strutture mostrano che i microsporidi parassiti hanno sviluppato una capacità unica di resistere a frammenti di rRNA e proteine ​​ampiamente conservati, acquisendo la capacità di utilizzare piccoli metaboliti abbondanti e facilmente disponibili come mimetici strutturali di frammenti di rRNA e proteine ​​degenerati. Degradazione della struttura molecolare. Questa opinione è supportata dal fatto che piccole molecole che compensano la perdita di frammenti proteici nell'rRNA e nei ribosomi di E. cuniculi si legano a residui specifici dei microsporidi nelle proteine ​​uL15 ed eL30. Ciò suggerisce che il legame di piccole molecole ai ribosomi potrebbe essere il prodotto di una selezione positiva, in cui mutazioni specifiche dei microsporidi nelle proteine ​​ribosomiali sono state selezionate per la loro capacità di aumentare l'affinità dei ribosomi per le piccole molecole, il che potrebbe portare a organismi ribosomiali più efficienti. La scoperta rivela un'ingegnosa innovazione nella struttura molecolare dei parassiti microbici e ci fornisce una migliore comprensione di come le strutture molecolari dei parassiti mantengano la loro funzione nonostante l'evoluzione riduttiva.
Attualmente, l'identificazione di queste piccole molecole rimane incerta. Non è chiaro perché la presenza di queste piccole molecole nella struttura ribosomiale differisca tra le specie di microsporidi. In particolare, non è chiaro perché il legame con i nucleotidi sia osservato nei ribosomi di E. cuniculi e P. locustae, ma non in quelli di V. necatrix, nonostante la presenza del residuo F170 nelle proteine ​​eL20 e K172 di V. necatrix. Questa delezione potrebbe essere causata dal residuo 43 uL6 (situato adiacente alla tasca di legame del nucleotide), che è tirosina in V. necatrix e non treonina in E. cuniculi e P. locustae. La voluminosa catena laterale aromatica di Tyr43 può interferire con il legame del nucleotide a causa dell'ingombro sterico. In alternativa, l'apparente delezione del nucleotide potrebbe essere dovuta alla bassa risoluzione delle immagini di crio-microscopia elettronica, che ostacola la modellazione dei frammenti ribosomiali di V. necatrix.
D'altro canto, il nostro lavoro suggerisce che il processo di degradazione del genoma possa rappresentare una forza inventiva. In particolare, la struttura del ribosoma di E. cuniculi suggerisce che la perdita di frammenti di rRNA e proteine ​​nel ribosoma dei microsporidi crei una pressione evolutiva che promuove cambiamenti nella struttura del ribosoma. Queste varianti si verificano lontano dal sito attivo del ribosoma e sembrano contribuire a mantenere (o ripristinare) un assemblaggio ribosomiale ottimale che altrimenti verrebbe compromesso dalla riduzione dell'rRNA. Ciò suggerisce che una delle principali innovazioni del ribosoma dei microsporidi si sia evoluta nella necessità di compensare la deriva genetica.
Forse questo concetto è meglio illustrato dal legame con i nucleotidi, che finora non è mai stato osservato in altri organismi. Il fatto che i residui leganti i nucleotidi siano presenti nei microsporidi tipici, ma non in altri eucarioti, suggerisce che i siti di legame per i nucleotidi non siano semplici reliquie destinate a scomparire, o il sito finale in cui l'rRNA viene ripristinato nella forma di singoli nucleotidi. Piuttosto, questo sito sembra essere una caratteristica utile che potrebbe essersi evoluta nel corso di diversi cicli di selezione positiva. I siti di legame per i nucleotidi potrebbero essere un sottoprodotto della selezione naturale: una volta che ES39L viene degradato, i microsporidi sono costretti a cercare una compensazione per ripristinare la biogenesi ribosomiale ottimale in assenza di ES39L. Poiché questo nucleotide può mimare i contatti molecolari del nucleotide A3186 in ES39L, la molecola di nucleotide diventa un elemento costitutivo del ribosoma, il cui legame viene ulteriormente migliorato dalla mutazione della sequenza eL30.
Per quanto riguarda l'evoluzione molecolare dei parassiti intracellulari, il nostro studio dimostra che le forze della selezione naturale darwiniana e della deriva genetica del decadimento del genoma non operano in parallelo, ma oscillano. In primo luogo, la deriva genetica elimina importanti caratteristiche delle biomolecole, rendendo urgente la necessità di compensazione. Solo quando i parassiti soddisfano questa esigenza attraverso la selezione naturale darwiniana, le loro macromolecole avranno la possibilità di sviluppare i loro tratti più impressionanti e innovativi. È importante sottolineare che l'evoluzione dei siti di legame dei nucleotidi nel ribosoma di E. cuniculi suggerisce che questo modello di evoluzione molecolare, basato sulla perdita e sul guadagno, non solo ammortizza le mutazioni deleterie, ma a volte conferisce funzioni completamente nuove alle macromolecole parassitarie.
Questa idea è coerente con la teoria dell'equilibrio mobile di Sewell Wright, che afferma che un sistema rigoroso di selezione naturale limita la capacità degli organismi di innovare51,52,53. Tuttavia, se la deriva genetica interrompe la selezione naturale, queste derive possono produrre cambiamenti che non sono di per sé adattativi (o addirittura dannosi) ma portano a ulteriori cambiamenti che forniscono una maggiore fitness o una nuova attività biologica. Il nostro quadro teorico supporta questa idea illustrando che lo stesso tipo di mutazione che riduce la struttura e la funzione di una biomolecola sembra essere il principale fattore scatenante del suo miglioramento. In linea con il modello evolutivo win-win, il nostro studio mostra che il decadimento del genoma, tradizionalmente visto come un processo degenerativo, è anche un importante motore di innovazione, a volte e forse anche spesso consentendo alle macromolecole di acquisire nuove attività parassitarie.