Takk for at du besøker Nature.com. Nettleserversjonen du bruker har begrenset CSS-støtte. For best mulig opplevelse anbefaler vi at du bruker en oppdatert nettleser (eller deaktiverer kompatibilitetsmodus i Internet Explorer). I mellomtiden, for å sikre fortsatt støtte, vil vi gjengi nettstedet uten stiler og JavaScript.
Utviklingen av mikrobielle parasitter innebærer en motvirkning mellom naturlig seleksjon, som fører til at parasitter forbedres, og genetisk drift, som fører til at parasitter mister gener og akkumulerer skadelige mutasjoner. For å forstå hvordan denne motvirkningen skjer på skalaen til et enkelt makromolekyl, beskriver vi her kryo-EM-strukturen til ribosomet til Encephalitozoon cuniculi, en eukaryot organisme med et av de minste genomene i naturen. Den ekstreme reduksjonen av rRNA i E. cuniculi-ribosomer er ledsaget av enestående strukturelle endringer, slik som utviklingen av tidligere ukjente fusjonerte rRNA-linkere og rRNA uten utbulinger. I tillegg overlevde E. cuniculi-ribosomet tapet av rRNA-fragmenter og proteiner ved å utvikle evnen til å bruke små molekyler som strukturelle etterligninger av degraderte rRNA-fragmenter og proteiner. Samlet sett viser vi at molekylære strukturer som lenge har vært antatt å være reduserte, degenererte og utsatt for svekkende mutasjoner, har en rekke kompensasjonsmekanismer som holder dem aktive til tross for ekstreme molekylære sammentrekninger.
Fordi de fleste grupper av mikrobielle parasitter har unike molekylære verktøy for å utnytte vertene sine, må vi ofte utvikle forskjellige terapeutiske midler for forskjellige grupper av parasitter1,2. Nye bevis tyder imidlertid på at noen aspekter ved parasittens evolusjon er konvergente og i stor grad forutsigbare, noe som indikerer et potensielt grunnlag for brede terapeutiske intervensjoner i mikrobielle parasitter3,4,5,6,7,8,9.
Tidligere arbeid har identifisert en vanlig evolusjonær trend i mikrobielle parasitter kalt genomreduksjon eller genomforfall10,11,12,13. Nåværende forskning viser at når mikroorganismer gir opp sin frittlevende livsstil og blir intracellulære parasitter (eller endosymbionter), gjennomgår genomene deres langsomme, men fantastiske metamorfoser over millioner av år9,11. I en prosess kjent som genomforfall, akkumulerer mikrobielle parasitter skadelige mutasjoner som gjør mange tidligere viktige gener om til pseudogener, noe som fører til gradvis gentap og mutasjonskollaps14,15. Denne kollapsen kan ødelegge opptil 95 % av genene i de eldste intracellulære organismene sammenlignet med nært beslektede frittlevende arter. Dermed er utviklingen av intracellulære parasitter en tautrekking mellom to motstridende krefter: darwinistisk naturlig seleksjon, som fører til forbedring av parasitter, og genomets kollaps, som kaster parasitter i glemselen. Hvordan parasitten klarte å komme seg ut av denne tautrekkingen og beholde aktiviteten til sin molekylære struktur, er fortsatt uklart.
Selv om mekanismen bak genomforfall ikke er fullt ut forstått, ser det ut til å forekomme hovedsakelig på grunn av hyppig genetisk drift. Fordi parasitter lever i små, aseksuelle og genetisk begrensede populasjoner, kan de ikke effektivt eliminere skadelige mutasjoner som noen ganger oppstår under DNA-replikasjon. Dette fører til irreversibel akkumulering av skadelige mutasjoner og reduksjon av parasittens genom. Som et resultat mister parasitten ikke bare gener som ikke lenger er nødvendige for dens overlevelse i det intracellulære miljøet. Det er parasittpopulasjonenes manglende evne til effektivt å eliminere sporadiske skadelige mutasjoner som fører til at disse mutasjonene akkumuleres i hele genomet, inkludert deres viktigste gener.
Mye av vår nåværende forståelse av genomreduksjon er utelukkende basert på sammenligninger av genomsekvenser, med mindre oppmerksomhet på endringer i faktiske molekyler som utfører husholdningsfunksjoner og fungerer som potensielle legemiddelmål. Sammenlignende studier har vist at byrden av skadelige intracellulære mikrobielle mutasjoner ser ut til å predisponere proteiner og nukleinsyrer for feilfolding og aggregering, noe som gjør dem mer chaperoneavhengige og overfølsomme for varme19,20,21,22,23. I tillegg opplevde forskjellige parasitter – uavhengig evolusjon noen ganger atskilt med så mye som 2,5 milliarder år – et lignende tap av kvalitetskontrollsentre i proteinsyntesen5,6 og DNA-reparasjonsmekanismer24. Imidlertid er lite kjent om virkningen av intracellulær livsstil på alle andre egenskaper ved cellulære makromolekyler, inkludert molekylær tilpasning til en økende byrde av skadelige mutasjoner.
I dette arbeidet, for å bedre forstå utviklingen av proteiner og nukleinsyrer i intracellulære mikroorganismer, bestemte vi strukturen til ribosomer til den intracellulære parasitten Encephalitozoon cuniculi. E. cuniculi er en sopplignende organisme som tilhører en gruppe parasittiske mikrosporidier som har uvanlig små eukaryote genomer og derfor brukes som modellorganismer for å studere genomforfall25,26,27,28,29,30. Nylig ble cryo-EM ribosomstruktur bestemt for moderat reduserte genomer av Microsporidia, Paranosema locustae og Vairimorpha necatrix31,32 (~3,2 Mb genom). Disse strukturene antyder at noe tap av rRNA-amplifisering kompenseres av utviklingen av nye kontakter mellom nærliggende ribosomale proteiner eller tilegnelse av nye msL131,32 ribosomale proteiner. Arten Encephalitozoon (genom ~2,5 millioner bp), sammen med sin nærmeste slektning Ordospora, viser den ultimate graden av genomreduksjon i eukaryoter – de har færre enn 2000 proteinkodende gener, og det forventes at ribosomene deres ikke bare mangler rRNA-ekspansjonsfragmenter (rRNA-fragmenter som skiller eukaryote ribosomer fra bakterielle ribosomer), men også har fire ribosomale proteiner på grunn av mangelen på homologer i E. cuniculi-genomet 26, 27, 28. Derfor konkluderte vi med at E. cuniculi-ribosomet kan avsløre tidligere ukjente strategier for molekylær tilpasning til genomforfall.
Vår kryo-EM-struktur representerer det minste eukaryote cytoplasmatiske ribosomet som er karakterisert, og gir innsikt i hvordan den ultimate graden av genomreduksjon påvirker strukturen, sammensetningen og utviklingen av det molekylære maskineriet som er integrert i cellen. Vi fant at E. cuniculi-ribosomet bryter med mange av de vidt konserverte prinsippene for RNA-folding og ribosom-sammensetning, og oppdaget et nytt, tidligere ukjent ribosomalt protein. Ganske uventet viser vi at mikrosporidia-ribosomer har utviklet evnen til å binde små molekyler, og antar at avkortninger i rRNA og proteiner utløser evolusjonære innovasjoner som til slutt kan gi nyttige egenskaper til ribosomet.
For å forbedre vår forståelse av utviklingen av proteiner og nukleinsyrer i intracellulære organismer, bestemte vi oss for å isolere E. cuniculi-sporer fra kulturer av infiserte pattedyrceller for å rense ribosomene deres og bestemme strukturen til disse ribosomene. Det er vanskelig å få tak i et stort antall parasittiske mikrosporidier fordi mikrosporidier ikke kan dyrkes i et næringsmedium. I stedet vokser og reproduserer de seg bare inne i vertscellen. For å få tak i E. cuniculi-biomasse for ribosomrensing infiserte vi derfor pattedyrnyrecellelinjen RK13 med E. cuniculi-sporer og dyrket disse infiserte cellene i flere uker for å la E. cuniculi vokse og formere seg. Ved å bruke et infisert cellemonolag på omtrent en halv kvadratmeter, var vi i stand til å rense omtrent 300 mg Microsporidia-sporer og bruke dem til å isolere ribosomer. Vi ødela deretter de rensede sporene med glasskuler og isolerte de rå ribosomene ved hjelp av trinnvis polyetylenglykolfraksjonering av lysatene. Dette tillot oss å få omtrent 300 µg rå E. cuniculi-ribosomer for strukturanalyse.
Deretter samlet vi inn kryo-EM-bilder ved hjelp av de resulterende ribosomprøvene og behandlet disse bildene ved hjelp av masker som tilsvarer den store ribosomale subenheten, den lille subenhetshodet og den lille subenheten. I løpet av denne prosessen samlet vi inn bilder av omtrent 108 000 ribosomale partikler og beregnet kryo-EM-bilder med en oppløsning på 2,7 Å (tilleggsfigurer 1-3). Deretter brukte vi kryoEM-bilder til å modellere rRNA, ribosomalt protein og hibernasjonsfaktor Mdf1 assosiert med E. cuniculi-ribosomer (fig. 1a, b).
a Strukturen til E. cuniculi-ribosomet i kompleks med dvalefaktoren Mdf1 (pdb-id 7QEP). b Kart over dvalefaktoren Mdf1 assosiert med E. cuniculi-ribosomet. c Kart over sekundærstrukturen som sammenligner gjenvunnet rRNA i mikrosporidiske arter med kjente ribosomale strukturer. Panelene viser plasseringen av de amplifiserte rRNA-fragmentene (ES) og ribosomaktive steder, inkludert dekodingsstedet (DC), sarcinicinløkken (SRL) og peptidyltransferasesenteret (PTC). d Elektrontettheten som tilsvarer peptidyltransferasesenteret til E. cuniculi-ribosomet antyder at dette katalytiske stedet har samme struktur i E. cuniculi-parasitten og dens verter, inkludert H. sapiens. e, f Den tilsvarende elektrontettheten til dekodingssenteret (e) og den skjematiske strukturen til dekodingssenteret (f) indikerer at E. cuniculi har aminosyrerestene U1491 i stedet for A1491 (E. coli-nummerering) i mange andre eukaryoter. Denne endringen antyder at E. cuniculi kan være følsom for antibiotika som retter seg mot dette aktive stedet.
I motsetning til de tidligere etablerte strukturene til V. necatrix- og P. locustae-ribosomer (begge strukturene representerer den samme microsporidia-familien Nosematidae og er svært like hverandre), gjennomgår 31,32 E. cuniculi-ribosomer en rekke prosesser med rRNA- og proteinfragmentering. Ytterligere denaturering (tilleggsfigurer 4-6). I rRNA inkluderte de mest slående endringene fullstendig tap av det amplifiserte 25S rRNA-fragmentet ES12L og delvis degenerasjon av h39-, h41- og H18-heliksene (figur 1c, tilleggsfigur 4). Blant ribosomale proteiner inkluderte de mest slående endringene fullstendig tap av eS30-proteinet og forkorting av proteinene eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 og eS7 (tilleggsfigurer 4, 5).
Dermed gjenspeiles den ekstreme reduksjonen av genomene til Encephalotozoon/Ordospora-arter i deres ribosomstruktur: E. cuniculi-ribosomer opplever det mest dramatiske tapet av proteininnhold i eukaryote cytoplasmatiske ribosomer som er gjenstand for strukturell karakterisering, og de har ikke engang de rRNA- og proteinfragmentene som er vidt konservert, ikke bare i eukaryoter, men også i livets tre domener. Strukturen til E. cuniculi-ribosomet gir den første molekylære modellen for disse endringene og avslører evolusjonære hendelser som har blitt oversett av både komparativ genomikk og studier av intracellulær biomolekylær struktur (tilleggsfigur 7). Nedenfor beskriver vi hver av disse hendelsene sammen med deres sannsynlige evolusjonære opprinnelse og deres potensielle innvirkning på ribosomfunksjonen.
Vi fant deretter at E. cuniculi-ribosomer, i tillegg til store rRNA-avkortninger, har rRNA-variasjoner på et av sine aktive steder. Selv om peptidyltransferasesenteret til E. cuniculi-ribosomet har samme struktur som andre eukaryote ribosomer (fig. 1d), er dekodingssenteret forskjellig på grunn av sekvensvariasjon ved nukleotid 1491 (E. coli-nummerering, fig. 1e, f). Denne observasjonen er viktig fordi dekodingsstedet til eukaryote ribosomer vanligvis inneholder restene G1408 og A1491 sammenlignet med bakterietyperestene A1408 og G1491. Denne variasjonen ligger til grunn for den forskjellige følsomheten til bakterielle og eukaryote ribosomer for aminoglykosidfamilien av ribosomale antibiotika og andre små molekyler som er rettet mot dekodingsstedet. På dekodingsstedet til E. cuniculi-ribosomet ble rest A1491 erstattet med U1491, noe som potensielt skapte et unikt bindingsgrensesnitt for små molekyler som er rettet mot dette aktive stedet. Den samme A14901-varianten finnes også i andre mikrosporidier som P. locustae og V. necatrix, noe som tyder på at den er utbredt blant mikrosporidiearter (fig. 1f).
Fordi våre E. cuniculi-ribosomprøver ble isolert fra metabolsk inaktive sporer, testet vi kryo-EM-kartet til E. cuniculi for tidligere beskrevet ribosombinding under stress- eller sultforhold. Dvalefaktorer 31, 32, 36, 37, 38. Vi matchet den tidligere etablerte strukturen til det dvalelignende ribosomet med kryo-EM-kartet til E. cuniculi-ribosomet. For docking ble S. cerevisiae-ribosomer brukt i kompleks med dvalefaktor Stm138, johannesbrødsribosomer i kompleks med Lso232-faktor, og V. necatrix-ribosomer i kompleks med Mdf1- og Mdf231-faktorene. Samtidig fant vi kryo-EM-tettheten som tilsvarer hvilefaktoren Mdf1. I likhet med Mdf1-binding til V. necatrix-ribosomet, binder Mdf1 seg også til E. cuniculi-ribosomet, hvor det blokkerer E-stedet på ribosomet, noe som muligens bidrar til å gjøre ribosomer tilgjengelige når parasittsporer blir metabolsk inaktive ved inaktivering av kroppen (figur 2).
Mdf1 blokkerer E-stedet til ribosomet, noe som ser ut til å bidra til å inaktivere ribosomet når parasittsporer blir metabolsk inaktive. I strukturen til E. cuniculi-ribosomet fant vi at Mdf1 danner en tidligere ukjent kontakt med L1-ribosomstammen, den delen av ribosomet som letter frigjøringen av deacetylert tRNA fra ribosomet under proteinsyntese. Disse kontaktene antyder at Mdf1 dissosierer fra ribosomet ved hjelp av samme mekanisme som deacetylert tRNA, noe som gir en mulig forklaring på hvordan ribosomet fjerner Mdf1 for å reaktivere proteinsyntese.
Strukturen vår avdekket imidlertid en ukjent kontakt mellom Mdf1 og L1-ribosombenet (den delen av ribosomet som hjelper til med å frigjøre deacylert tRNA fra ribosomet under proteinsyntese). Spesielt bruker Mdf1 de samme kontaktene som albuesegmentet til det deacylerte tRNA-molekylet (fig. 2). Denne tidligere ukjente molekylære modelleringen viste at Mdf1 dissosierer fra ribosomet ved hjelp av samme mekanisme som deacetylert tRNA, noe som forklarer hvordan ribosomet fjerner denne dvalefaktoren for å reaktivere proteinsyntese.
Da vi konstruerte rRNA-modellen, fant vi ut at E. cuniculi-ribosomet har unormalt foldede rRNA-fragmenter, som vi kalte fusjonert rRNA (fig. 3). I ribosomer som spenner over livets tre domener, folder rRNA seg inn i strukturer der de fleste rRNA-baser enten danner basepar og folder seg med hverandre eller samhandler med ribosomale proteiner38,39,40. I E. cuniculi-ribosomer ser det imidlertid ut til at rRNA-er bryter med dette foldeprinsippet ved å konvertere noen av heliksene sine til utfoldede rRNA-regioner.
Strukturen til H18 25S rRNA-heliksen i S. cerevisiae, V. necatrix og E. cuniculi. I ribosomer som spenner over de tre livsdomenene, kveiler denne linkeren seg vanligvis til en RNA-heliks som inneholder 24 til 34 rester. I Microsporidia, derimot, reduseres denne rRNA-linkeren gradvis til to enkelttrådete uridinrike linkere som bare inneholder 12 rester. De fleste av disse restene er utsatt for løsemidler. Figuren viser at parasittiske mikrosporidier ser ut til å bryte med de generelle prinsippene for rRNA-folding, der rRNA-baser vanligvis er koblet til andre baser eller involvert i rRNA-protein-interaksjoner. I microsporidier får noen rRNA-fragmenter en ugunstig folding, der den tidligere rRNA-heliksen blir et enkelttrådet fragment som er forlenget nesten i en rett linje. Tilstedeværelsen av disse uvanlige områdene lar microsporidia rRNA binde fjerne rRNA-fragmenter ved hjelp av et minimalt antall RNA-baser.
Det mest slående eksemplet på denne evolusjonære overgangen kan observeres i H18 25S rRNA-heliksen (fig. 3). Hos arter fra E. coli til mennesker inneholder basene i denne rRNA-heliksen 24–32 nukleotider, og danner en litt uregelmessig helikse. I tidligere identifiserte ribosomale strukturer fra V. necatrix og P. locustae,31,32 er basene i H18-heliksen delvis avviklet, men nukleotidbaseparingen er bevart. Imidlertid blir dette rRNA-fragmentet i E. cuniculi de korteste linkerne 228UUUUGU232 og 301UUUUUUUUUU307. I motsetning til typiske rRNA-fragmenter, kveiler ikke disse uridinrike linkerne seg eller har omfattende kontakt med ribosomale proteiner. I stedet inntar de løsemiddelåpne og fullstendig utfoldede strukturer der rRNA-trådene er nesten rett forlenget. Denne strukkede konformasjonen forklarer hvordan E. cuniculi bare bruker 12 RNA-baser for å fylle 33 Å-gapet mellom H16- og H18-rRNA-heliksene, mens andre arter krever minst dobbelt så mange rRNA-baser for å fylle gapet.
Dermed kan vi demonstrere at parasittiske mikrosporidier, gjennom energetisk ugunstig folding, har utviklet en strategi for å kontrahere selv de rRNA-segmentene som forblir bredt konservert på tvers av arter i livets tre domener. Tilsynelatende kan E. cuniculi, ved å akkumulere mutasjoner som transformerer rRNA-helikser til korte poly-U-linkere, danne uvanlige rRNA-fragmenter som inneholder så få nukleotider som mulig for ligering av distale rRNA-fragmenter. Dette bidrar til å forklare hvordan mikrosporidier oppnådde en dramatisk reduksjon i sin grunnleggende molekylære struktur uten å miste sin strukturelle og funksjonelle integritet.
Et annet uvanlig trekk ved E. cuniculi rRNA er utseendet til rRNA uten fortykkelser (fig. 4). Buler er nukleotider uten basepar som vrir seg ut av RNA-heliksen i stedet for å gjemme seg i den. De fleste rRNA-fremspring fungerer som molekylære klebemidler, som bidrar til å binde tilstøtende ribosomale proteiner eller andre rRNA-fragmenter. Noen av bulene fungerer som hengsler, slik at rRNA-heliksen kan bøye seg og folde seg optimalt for produktiv proteinsyntese 41.
a En rRNA-fremspring (S. cerevisiae-nummerering) er fraværende i E. cuniculi-ribosomstrukturen, men er tilstede i de fleste andre eukaryoter b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens og E. cuniculi interne ribosomer. Parasitter mangler mange av de gamle, svært konserverte rRNA-bulene. Disse fortykkelsene stabiliserer ribosomstrukturen; derfor indikerer deres fravær i mikrosporidier en redusert stabilitet av rRNA-folding i mikrosporidieparasitter. Sammenligning med P-stengler (L7/L12-stengler i bakterier) viser at tapet av rRNA-buler noen ganger sammenfaller med forekomsten av nye buler ved siden av de tapte bulene. H42-heliksen i 23S/28S rRNA har en gammel bule (U1206 i Saccharomyces cerevisiae) anslått til å være minst 3,5 milliarder år gammel på grunn av dens beskyttelse i tre livsdomener. I mikrosporidier er denne bulen eliminert. Imidlertid dukket det opp en ny bule ved siden av den tapte bulen (A1306 i E. cuniculi).
Påfallende nok fant vi at E. cuniculi-ribosomer mangler de fleste av rRNA-bulene som finnes i andre arter, inkludert mer enn 30 buler som er konservert i andre eukaryoter (fig. 4a). Dette tapet eliminerer mange kontakter mellom ribosomale underenheter og tilstøtende rRNA-helikser, og skaper noen ganger store hulrom i ribosomet, noe som gjør E. cuniculi-ribosomet mer porøst sammenlignet med mer tradisjonelle ribosomer (fig. 4b). Det er verdt å merke seg at vi fant at de fleste av disse bulene også gikk tapt i de tidligere identifiserte V. necatrix- og P. locustae-ribosomstrukturene, som ble oversett av tidligere strukturelle analyser31,32.
Noen ganger er tapet av rRNA-buler ledsaget av utviklingen av nye buler ved siden av den tapte bulen. For eksempel inneholder den ribosomale P-stammen en U1208-bule (i Saccharomyces cerevisiae) som overlevde fra E. coli til mennesker og er derfor anslått å være 3,5 milliarder år gammel. Under proteinsyntese hjelper denne bulen P-stammen med å bevege seg mellom åpne og lukkede konformasjoner slik at ribosomet kan rekruttere translasjonsfaktorer og levere dem til det aktive setet. I E. cuniculi-ribosomer er denne fortykkelsen fraværende; imidlertid kan en ny fortykkelse (G883) som bare er lokalisert i tre basepar bidra til å gjenopprette den optimale fleksibiliteten til P-stammen (fig. 4c).
Våre data om rRNA uten utbulinger tyder på at rRNA-minimering ikke er begrenset til tap av rRNA-elementer på overflaten av ribosomet, men kan også involvere ribosomkjernen, noe som skaper en parasittspesifikk molekylær defekt som ikke er beskrevet i frittlevende celler. Levende arter observeres.
Etter modellering av kanoniske ribosomale proteiner og rRNA, fant vi at konvensjonelle ribosomale komponenter ikke kan forklare de tre delene av kryo-EM-bildet. To av disse fragmentene er små molekyler i størrelse (fig. 5, tilleggsfigur 8). Det første segmentet er klemt mellom ribosomproteinene uL15 og eL18 i en posisjon som vanligvis okkuperes av C-terminalen til eL18, som er forkortet i E. cuniculi. Selv om vi ikke kan bestemme identiteten til dette molekylet, forklares størrelsen og formen på denne tetthetsøya godt av tilstedeværelsen av spermidinmolekyler. Bindingen til ribosomet stabiliseres av mikrosporidiaspesifikke mutasjoner i uL15-proteinene (Asp51 og Arg56), som ser ut til å øke ribosomets affinitet for dette lille molekylet, ettersom de lar uL15 pakke det lille molekylet inn i en ribosomal struktur. Supplerende figur 2). 8, tilleggsdata 1, 2).
Kryo-EM-avbildning som viser tilstedeværelsen av nukleotider utenfor ribosen bundet til E. cuniculi-ribosomet. I E. cuniculi-ribosomet opptar dette nukleotidet samme plass som 25S rRNA A3186-nukleotidet (Saccharomyces cerevisiae-nummerering) i de fleste andre eukaryote ribosomer. b I den ribosomale strukturen til E. cuniculi er dette nukleotidet plassert mellom ribosomproteinene uL9 og eL20, og stabiliserer dermed kontakten mellom de to proteinene. cd eL20-sekvenskonserveringsanalyse blant microsporidia-arter. Det fylogenetiske treet til Microsporidia-arter (c) og multippel sekvensjustering av eL20-proteinet (d) viser at nukleotidbindende rester F170 og K172 er konservert i de fleste typiske Microsporidia, med unntak av S. lophii, med unntak av tidlig forgrenende Microsporidia, som beholdt ES39L rRNA-forlengelsen. e Denne figuren viser at nukleotidbindende residuer F170 og K172 bare er tilstede i eL20 av det sterkt reduserte microsporidia-genomet, men ikke i andre eukaryoter. Samlet sett tyder disse dataene på at Microsporidian-ribosomer har utviklet et nukleotidbindingssted som ser ut til å binde AMP-molekyler og bruke dem til å stabilisere protein-protein-interaksjoner i ribosomstrukturen. Den høye konserveringen av dette bindingsstedet i Microsporidia og dets fravær i andre eukaryoter antyder at dette stedet kan gi en selektiv overlevelsesfordel for Microsporidia. Dermed ser ikke nukleotidbindingslommen i microsporidia-ribosomet ut til å være et degenerert trekk eller en sluttform for rRNA-nedbrytning som tidligere beskrevet, men snarere en nyttig evolusjonær innovasjon som lar microsporidia-ribosomet binde små molekyler direkte, og bruke dem som molekylære byggesteiner for ribosomer. Denne oppdagelsen gjør microsporidia-ribosomet til det eneste ribosomet som er kjent for å bruke et enkelt nukleotid som sin strukturelle byggestein. f Hypotetisk evolusjonær vei avledet fra nukleotidbinding.
Den andre lavmolekylære tettheten er lokalisert ved grensesnittet mellom ribosomale proteiner uL9 og eL30 (fig. 5a). Dette grensesnittet ble tidligere beskrevet i strukturen til Saccharomyces cerevisiae-ribosomet som et bindingssted for 25S-nukleotidet til rRNA A3186 (del av ES39L rRNA-utvidelsen)38. Det ble vist at i degenererte P. locustae ES39L-ribosomer binder dette grensesnittet et ukjent enkelt nukleotid 31, og det antas at dette nukleotidet er en redusert endelig form av rRNA, der lengden på rRNA er ~130–230 baser. ES39L er redusert til et enkelt nukleotid 32,43. Våre kryo-EM-bilder støtter ideen om at tetthet kan forklares med nukleotider. Imidlertid viste den høyere oppløsningen av strukturen vår at dette nukleotidet er et ekstraribosomalt molekyl, muligens AMP (fig. 5a, b).
Vi spurte deretter om nukleotidbindingsstedet dukket opp i E. cuniculi-ribosomet eller om det eksisterte tidligere. Siden nukleotidbinding hovedsakelig medieres av Phe170- og Lys172-restene i det ribosomale proteinet eL30, vurderte vi konserveringen av disse restene i 4396 representative eukaryoter. Som i tilfellet med uL15 ovenfor, fant vi at Phe170- og Lys172-restene er svært konserverte bare i typiske Microsporidia, men fraværende i andre eukaryoter, inkludert atypiske Microsporidia Mitosporidium og Amphiamblys, der ES39L rRNA-fragmentet ikke er redusert 44, 45, 46 (fig. 5c). -e).
Samlet sett støtter disse dataene ideen om at E. cuniculi og muligens andre kanoniske mikrosporidier har utviklet evnen til effektivt å fange opp et stort antall små metabolitter i ribosomstrukturen for å kompensere for nedgangen i rRNA- og proteinnivåer. Ved å gjøre dette har de utviklet en unik evne til å binde nukleotider utenfor ribosomet, noe som viser at parasittiske molekylstrukturer kompenserer ved å fange opp rikelig med små metabolitter og bruke dem som strukturelle etterligninger av degradert RNA og proteinfragmenter.
Den tredje usimulerte delen av vårt kryo-EM-kart, funnet i den store ribosomale underenheten. Den relativt høye oppløsningen (2,6 Å) på kartet vårt antyder at denne tettheten tilhører proteiner med unike kombinasjoner av store sidekjederester, noe som tillot oss å identifisere denne tettheten som et tidligere ukjent ribosomalt protein som vi identifiserte som. Det ble kalt msL2 (Microsporidia-spesifikt protein L2) (metoder, figur 6). Vårt homologisøk viste at msL2 er konservert i Microsporidia-kladen av slekten Encephaliter og Orosporidium, men fraværende i andre arter, inkludert andre Microsporidia. I den ribosomale strukturen opptar msL2 et gap dannet av tapet av det utvidede ES31L rRNA. I dette tomrommet bidrar msL2 til å stabilisere rRNA-folding og kan kompensere for tapet av ES31L (figur 6).
a Elektrontetthet og modell av det Microsporidia-spesifikke ribosomale proteinet msL2 funnet i E. cuniculi-ribosomer. b De fleste eukaryote ribosomer, inkludert 80S-ribosomet til Saccharomyces cerevisiae, har ES19L rRNA-amplifikasjon tapt hos de fleste Microsporidian-arter. Den tidligere etablerte strukturen til V. necatrix microsporidia-ribosomet antyder at tapet av ES19L i disse parasittene kompenseres av utviklingen av det nye msL1-ribosomale proteinet. I denne studien fant vi at E. cuniculi-ribosomet også utviklet et ekstra ribosomalt RNA-etterligningsprotein som en tilsynelatende kompensasjon for tapet av ES19L. Imidlertid har msL2 (for tiden annotert som det hypotetiske ECU06_1135-proteinet) og msL1 ulik strukturell og evolusjonær opprinnelse. c Denne oppdagelsen av genereringen av evolusjonært ubeslektede msL1- og msL2-ribosomale proteiner antyder at hvis ribosomer akkumulerer skadelige mutasjoner i sitt rRNA, kan de oppnå enestående nivåer av sammensetningsmangfold selv i en liten delmengde av nært beslektede arter. Denne oppdagelsen kan bidra til å avklare opprinnelsen og utviklingen av det mitokondrielle ribosomet, som er kjent for sitt sterkt reduserte rRNA og unormale variasjon i proteinsammensetning på tvers av arter.
Vi sammenlignet deretter msL2-proteinet med det tidligere beskrevne msL1-proteinet, det eneste kjente mikrosporidiaspesifikke ribosomale proteinet som finnes i V. necatrix-ribosomet. Vi ønsket å teste om msL1 og msL2 er evolusjonært beslektet. Analysen vår viste at msL1 og msL2 okkuperer samme hulrom i ribosomstrukturen, men har forskjellige primære og tertiære strukturer, noe som indikerer deres uavhengige evolusjonære opprinnelse (fig. 6). Dermed gir vår oppdagelse av msL2 bevis på at grupper av kompakte eukaryote arter uavhengig kan utvikle strukturelt distinkte ribosomale proteiner for å kompensere for tapet av rRNA-fragmenter. Dette funnet er bemerkelsesverdig ved at de fleste cytoplasmatiske eukaryote ribosomer inneholder et invariant protein, inkludert den samme familien av 81 ribosomale proteiner. Forekomsten av msL1 og msL2 i forskjellige klader av mikrosporidier som respons på tapet av utvidede rRNA-segmenter antyder at nedbrytning av parasittens molekylære arkitektur får parasitter til å søke kompenserende mutasjoner, noe som til slutt kan føre til at de tilegner seg forskjellige parasittstrukturer.
Til slutt, da modellen vår var ferdig, sammenlignet vi sammensetningen av E. cuniculi-ribosomet med det som ble forutsagt fra genomsekvensen. Flere ribosomale proteiner, inkludert eL14, eL38, eL41 og eS30, ble tidligere antatt å mangle i E. cuniculi-genomet på grunn av det tilsynelatende fraværet av deres homologer fra E. cuniculi-genomet. Tap av mange ribosomale proteiner er også forutsagt i de fleste andre sterkt reduserte intracellulære parasitter og endosymbionter. For eksempel, selv om de fleste frittlevende bakterier inneholder den samme familien på 54 ribosomale proteiner, har bare 11 av disse proteinfamiliene detekterbare homologer i hvert analyserte genom av vertsbegrensede bakterier. Til støtte for denne antagelsen har et tap av ribosomale proteiner blitt observert eksperimentelt i V. necatrix og P. locustae microsporidia, som mangler eL38- og eL4131,32-proteinene.
Strukturene våre viser imidlertid at bare eL38, eL41 og eS30 faktisk går tapt i E. cuniculi-ribosomet. EL14-proteinet var bevart, og strukturen vår viste hvorfor dette proteinet ikke kunne bli funnet i homologisøket (fig. 7). I E. cuniculi-ribosomer går mesteparten av eL14-bindingsstedet tapt på grunn av nedbrytning av det rRNA-amplifiserte ES39L. I fravær av ES39L mistet eL14 mesteparten av sin sekundære struktur, og bare 18 % av eL14-sekvensen var identisk i E. cuniculi og S. cerevisiae. Denne dårlige sekvensbevaringen er bemerkelsesverdig fordi selv Saccharomyces cerevisiae og Homo sapiens – organismer som utviklet seg med 1,5 milliarder år mellom seg – deler mer enn 51 % av de samme restene i eL14. Dette anomale tapet av konservering forklarer hvorfor E. cuniculi eL14 for øyeblikket er annotert som det antatte M970_061160-proteinet og ikke som det ribosomale proteinet eL1427.
og Microsporidia-ribosomet mistet ES39L rRNA-forlengelsen, noe som delvis eliminerte bindingsstedet for eL14 ribosomalt protein. I fravær av ES39L gjennomgår eL14-mikrosporeproteinet et tap av sekundærstruktur, der den tidligere rRNA-bindende α-heliksen degenererer til en minimal lengdeløkke. b Multippel sekvensjustering viser at eL14-proteinet er svært konservert i eukaryote arter (57 % sekvensidentitet mellom gjær- og humane homologer), men dårlig konservert og divergerende i mikrosporidier (der ikke mer enn 24 % av restene er identiske med eL14-homologen). fra S. cerevisiae eller H. sapiens). Denne dårlige sekvenskonserveringen og variasjonen i sekundærstruktur forklarer hvorfor eL14-homologen aldri har blitt funnet i E. cuniculi, og hvorfor dette proteinet antas å ha gått tapt i E. cuniculi. I motsetning til dette ble E. cuniculi eL14 tidligere annotert som et antatt M970_061160-protein. Denne observasjonen antyder at mikrosporidie-genomdiversiteten for tiden er overvurdert: noen gener som for tiden antas å være tapt i mikrosporidier er faktisk bevart, om enn i svært differensierte former; i stedet antas noen å kode for mikrosporidie-gener for ormespesifikke proteiner (f.eks. det hypotetiske proteinet M970_061160) som faktisk koder for de svært mangfoldige proteinene som finnes i andre eukaryoter.
Dette funnet tyder på at rRNA-denaturering kan føre til et dramatisk tap av sekvensbevaring i tilstøtende ribosomale proteiner, noe som gjør disse proteinene uoppdagbare for homologisøk. Dermed kan vi overvurdere den faktiske graden av molekylær nedbrytning i små genomorganismer, siden noen proteiner som antas å være tapt faktisk vedvarer, om enn i svært endrede former.
Hvordan kan parasitter beholde funksjonen til sine molekylære maskiner under forhold med ekstrem genomreduksjon? Studien vår besvarer dette spørsmålet ved å beskrive den komplekse molekylære strukturen (ribosomet) til E. cuniculi, en organisme med et av de minste eukaryote genomene.
Det har vært kjent i nesten to tiår at protein- og RNA-molekyler i mikrobielle parasitter ofte avviker fra sine homologe molekyler i frittlevende arter fordi de mangler kvalitetskontrollsentre, er redusert til 50 % av størrelsen sin i frittlevende mikrober, osv. ... mange svekkende mutasjoner som svekker folding og funksjon. For eksempel forventes ribosomene til små genomorganismer, inkludert mange intracellulære parasitter og endosymbionter, å mangle flere ribosomale proteiner og opptil en tredjedel av rRNA-nukleotidene sammenlignet med frittlevende arter 27, 29, 30, 49. Måten disse molekylene fungerer på i parasitter forblir imidlertid i stor grad et mysterium, og studeres hovedsakelig gjennom komparativ genomikk.
Studien vår viser at strukturen til makromolekyler kan avsløre mange aspekter ved evolusjonen som er vanskelige å trekke ut fra tradisjonelle komparative genomiske studier av intracellulære parasitter og andre vertsbegrensede organismer (tilleggsfigur 7). For eksempel viser eksemplet med eL14-proteinet at vi kan overvurdere den faktiske graden av nedbrytning av det molekylære apparatet hos parasittiske arter. Encefalittiske parasitter antas nå å ha hundrevis av mikrosporidiaspesifikke gener. Resultatene våre viser imidlertid at noen av disse tilsynelatende spesifikke genene faktisk bare er svært forskjellige varianter av gener som er vanlige i andre eukaryoter. Dessuten viser eksemplet med msL2-proteinet hvordan vi overser nye ribosomale proteiner og undervurderer innholdet av parasittiske molekylære maskiner. Eksemplet med små molekyler viser hvordan vi kan overse de mest geniale innovasjonene innen parasittiske molekylære strukturer som kan gi dem ny biologisk aktivitet.
Samlet sett forbedrer disse resultatene vår forståelse av forskjellene mellom de molekylære strukturene til vertsbegrensede organismer og deres motparter i frittlevende organismer. Vi viser at molekylære maskiner, lenge antatt å være reduserte, degenererte og utsatt for ulike svekkende mutasjoner, i stedet har et sett med systematisk oversette uvanlige strukturelle trekk.
På den annen side tyder de ikke-klumpete rRNA-fragmentene og de sammensmeltede fragmentene som vi fant i ribosomene til E. cuniculi på at genomreduksjon kan endre selv de delene av det grunnleggende molekylære maskineriet som er bevart i livets tre domener – etter nesten 3,5 milliarder år med uavhengig evolusjon av arter.
De utbulingsfrie og sammensmeltede rRNA-fragmentene i E. cuniculi-ribosomer er av spesiell interesse i lys av tidligere studier av RNA-molekyler i endosymbiotiske bakterier. For eksempel, i bladlusens endosymbiont Buchnera aphidicola, har rRNA- og tRNA-molekyler vist seg å ha temperaturfølsomme strukturer på grunn av A+T-sammensetningsskjevhet og en høy andel ikke-kanoniske basepar20,50. Disse endringene i RNA, så vel som endringer i proteinmolekyler, antas nå å være ansvarlige for endosymbionters overavhengighet av partnere og endosymbionters manglende evne til å overføre varme21, 23. Selv om parasittisk mikrosporidia-rRNA har strukturelt distinkte endringer, antyder arten av disse endringene at redusert termisk stabilitet og høyere avhengighet av chaperonproteiner kan være vanlige trekk ved RNA-molekyler i organismer med reduserte genomer.
På den annen side viser strukturene våre at parasittmikrosporidier har utviklet en unik evne til å motstå bredt konserverte rRNA- og proteinfragmenter, og utviklet evnen til å bruke rikelig med og lett tilgjengelige små metabolitter som strukturelle etterligninger av degenererte rRNA- og proteinfragmenter. Nedbrytning av molekylær struktur. Denne oppfatningen støttes av det faktum at små molekyler som kompenserer for tapet av proteinfragmenter i rRNA og ribosomer til E. cuniculi binder seg til mikrosporidiaspesifikke rester i uL15- og eL30-proteinene. Dette antyder at binding av små molekyler til ribosomer kan være et produkt av positiv seleksjon, der mikrosporidiaspesifikke mutasjoner i ribosomale proteiner har blitt valgt ut for deres evne til å øke ribosomers affinitet for små molekyler, noe som kan føre til mer effektive ribosomale organismer. Oppdagelsen avslører en smart innovasjon i den molekylære strukturen til mikrobielle parasitter og gir oss en bedre forståelse av hvordan parasittmolekylære strukturer opprettholder sin funksjon til tross for reduktiv evolusjon.
For tiden er identifiseringen av disse små molekylene fortsatt uklar. Det er ikke klart hvorfor utseendet til disse små molekylene i ribosomstrukturen varierer mellom mikrosporidiearter. Spesielt er det ikke klart hvorfor nukleotidbinding observeres i ribosomene til E. cuniculi og P. locustae, og ikke i ribosomene til V. necatrix, til tross for tilstedeværelsen av F170-resten i eL20- og K172-proteinene til V. necatrix. Denne delesjonen kan være forårsaket av rest 43 uL6 (lokalisert ved siden av nukleotidbindingslommen), som er tyrosin i V. necatrix og ikke treonin i E. cuniculi og P. locustae. Den store aromatiske sidekjeden til Tyr43 kan forstyrre nukleotidbinding på grunn av sterisk overlapping. Alternativt kan den tilsynelatende nukleotiddelesjonen skyldes den lave oppløsningen til kryo-EM-avbildning, noe som hindrer modelleringen av V. necatrix ribosomale fragmenter.
På den annen side tyder arbeidet vårt på at prosessen med genomforfall kan være en oppfinnsom kraft. Spesielt strukturen til E. cuniculi-ribosomet tyder på at tapet av rRNA og proteinfragmenter i microsporidia-ribosomet skaper evolusjonært press som fremmer endringer i ribosomstrukturen. Disse variantene forekommer langt fra ribosomets aktive sted og ser ut til å bidra til å opprettholde (eller gjenopprette) optimal ribosomsamling som ellers ville blitt forstyrret av redusert rRNA. Dette tyder på at en viktig innovasjon av microsporidia-ribosomet ser ut til å ha utviklet seg til et behov for å bufre gendrift.
Kanskje dette illustreres best av nukleotidbinding, som aldri har blitt observert i andre organismer så langt. Det faktum at nukleotidbindende rester er tilstede i typiske mikrosporidier, men ikke i andre eukaryoter, antyder at nukleotidbindingssteder ikke bare er rester som venter på å forsvinne, eller det endelige stedet for rRNA som skal gjenopprettes til form av individuelle nukleotider. I stedet virker dette stedet som en nyttig funksjon som kunne ha utviklet seg over flere runder med positiv seleksjon. Nukleotidbindingssteder kan være et biprodukt av naturlig seleksjon: Når ES39L er degradert, blir mikrosporidier tvunget til å søke kompensasjon for å gjenopprette optimal ribosombiogenese i fravær av ES39L. Siden dette nukleotidet kan etterligne de molekylære kontaktene til A3186-nukleotidet i ES39L, blir nukleotidmolekylet en byggestein i ribosomet, hvis binding forbedres ytterligere ved mutasjon av eL30-sekvensen.
Når det gjelder den molekylære utviklingen av intracellulære parasitter, viser studien vår at kreftene i darwinistisk naturlig seleksjon og genetisk drift av genomforfall ikke opererer parallelt, men oscillerer. For det første eliminerer genetisk drift viktige trekk ved biomolekyler, noe som gjør kompensasjon sårt nødvendig. Først når parasitter tilfredsstiller dette behovet gjennom darwinistisk naturlig seleksjon, vil makromolekylene deres ha en sjanse til å utvikle sine mest imponerende og innovative egenskaper. Viktigere er det at utviklingen av nukleotidbindingssteder i E. cuniculi-ribosomet antyder at dette tap-for-gevinst-mønsteret av molekylær evolusjon ikke bare amortiserer skadelige mutasjoner, men noen ganger gir helt nye funksjoner til parasittiske makromolekyler.
Denne ideen er i samsvar med Sewell Wrights teori om bevegelig likevekt, som sier at et strengt system med naturlig seleksjon begrenser organismers evne til å innovere51,52,53. Men hvis genetisk drift forstyrrer naturlig seleksjon, kan disse driftene produsere endringer som ikke i seg selv er adaptive (eller til og med skadelige), men som fører til ytterligere endringer som gir høyere kondisjon eller ny biologisk aktivitet. Rammeverket vårt støtter denne ideen ved å illustrere at den samme typen mutasjon som reduserer foldingen og funksjonen til et biomolekyl ser ut til å være den viktigste utløseren for forbedringen av det. I tråd med den vinn-vinn-situasjonen i evolusjonsmodellen viser studien vår at genomforfall, tradisjonelt sett på som en degenerativ prosess, også er en viktig driver for innovasjon, som noen ganger og kanskje til og med ofte lar makromolekyler tilegne seg nye parasittiske aktiviteter.