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L'évolution des parasites microbiens repose sur une interaction complexe entre la sélection naturelle, qui favorise leur amélioration, et la dérive génétique, qui entraîne la perte de gènes et l'accumulation de mutations délétères. Afin de comprendre comment cette interaction se manifeste à l'échelle d'une macromolécule, nous décrivons ici la structure, obtenue par cryo-microscopie électronique, du ribosome d'Encephalitozoon cuniculi, un organisme eucaryote possédant l'un des plus petits génomes naturels. La réduction extrême de l'ARNr dans les ribosomes d'E. cuniculi s'accompagne de changements structuraux inédits, tels que l'apparition de connecteurs d'ARNr fusionnés et d'ARNr sans protubérances, jusqu'alors inconnus. De plus, le ribosome d'E. cuniculi a survécu à la perte de fragments d'ARNr et de protéines en développant la capacité d'utiliser de petites molécules comme analogues structuraux des fragments d'ARNr et des protéines dégradés. En conclusion, nous montrons que des structures moléculaires, longtemps considérées comme réduites, dégénérées et sujettes à des mutations invalidantes, possèdent plusieurs mécanismes compensatoires qui leur permettent de rester actives malgré des contractions moléculaires extrêmes.
Étant donné que la plupart des groupes de parasites microbiens possèdent des outils moléculaires uniques pour exploiter leurs hôtes, nous devons souvent développer des thérapies différentes pour différents groupes de parasites1,2. Cependant, de nouvelles preuves suggèrent que certains aspects de l'évolution des parasites sont convergents et largement prévisibles, indiquant une base potentielle pour des interventions thérapeutiques à grande échelle chez les parasites microbiens3,4,5,6,7,8,9.
Des travaux antérieurs ont mis en évidence une tendance évolutive commune chez les parasites microbiens, appelée réduction ou dégradation du génome^10,11,12,13. Les recherches actuelles montrent que lorsque les micro-organismes abandonnent leur mode de vie libre pour devenir des parasites intracellulaires (ou endosymbiontes), leur génome subit des métamorphoses lentes mais remarquables sur des millions d'années^9,11. Au cours de ce processus, la dégradation du génome, les parasites microbiens accumulent des mutations délétères qui transforment de nombreux gènes autrefois importants en pseudogènes, entraînant une perte progressive de gènes et un effondrement mutationnel^14,15. Cet effondrement peut détruire jusqu'à 95 % des gènes chez les organismes intracellulaires les plus anciens, comparativement aux espèces libres apparentées. Ainsi, l'évolution des parasites intracellulaires est un bras de fer entre deux forces opposées : la sélection naturelle darwinienne, qui favorise l'amélioration des parasites, et la dégradation du génome, qui les condamne à disparaître. La manière dont le parasite parvient à survivre à ce bras de fer et à conserver l'activité de sa structure moléculaire reste encore mal comprise.
Bien que le mécanisme de dégradation du génome ne soit pas entièrement élucidé, il semble principalement dû à la dérive génétique. Les parasites, vivant en populations réduites, asexuées et génétiquement limitées, ne peuvent éliminer efficacement les mutations délétères qui surviennent parfois lors de la réplication de l'ADN. Ceci entraîne une accumulation irréversible de mutations nocives et une réduction du génome parasitaire. Par conséquent, le parasite perd non seulement les gènes devenus inutiles à sa survie dans l'environnement intracellulaire, mais c'est surtout l'incapacité des populations parasitaires à éliminer efficacement les mutations délétères sporadiques qui provoque leur accumulation dans l'ensemble du génome, y compris dans leurs gènes les plus importants.
Notre compréhension actuelle de la réduction du génome repose en grande partie sur la comparaison des séquences génomiques, sans s'intéresser aux modifications des molécules impliquées dans les fonctions cellulaires de base et constituant des cibles thérapeutiques potentielles. Des études comparatives ont montré que le fardeau des mutations microbiennes intracellulaires délétères semble prédisposer les protéines et les acides nucléiques à un repliement incorrect et à leur agrégation, les rendant plus dépendants des chaperonnes et hypersensibles à la chaleur^{19,20,21,22,23}. De plus, divers parasites – issus d'une évolution indépendante parfois séparée par 2,5 milliards d'années – ont subi une perte similaire de centres de contrôle qualité dans leurs mécanismes de synthèse protéique^5,6 et de réparation de l'ADN²⁴. Cependant, l'impact du mode de vie intracellulaire sur toutes les autres propriétés des macromolécules cellulaires, notamment l'adaptation moléculaire à un fardeau croissant de mutations délétères, reste encore mal connu.
Dans ce travail, afin de mieux comprendre l'évolution des protéines et des acides nucléiques des micro-organismes intracellulaires, nous avons déterminé la structure des ribosomes du parasite intracellulaire *Encephalitozoon cuniculi*. *E. cuniculi* est un organisme fongiforme appartenant au groupe des microsporidies parasites, caractérisées par des génomes eucaryotes exceptionnellement petits et utilisées comme organismes modèles pour l'étude de la dégradation du génome^{25,26,27,28,29,30}. Récemment, la structure des ribosomes a été déterminée par cryo-microscopie électronique pour les génomes modérément réduits des microsporidies *Paranosema locustae* et *Vairimorpha necatrix*^31,32 (génome d'environ 3,2 Mb). Ces structures suggèrent qu'une partie de la perte d'amplification de l'ARNr est compensée par le développement de nouveaux contacts entre protéines ribosomiques voisines ou par l'acquisition de nouvelles protéines ribosomiques msL1^31,32. L’espèce Encephalitozoon (génome d’environ 2,5 millions de paires de bases), ainsi que son plus proche parent Ordospora, illustrent le degré ultime de réduction du génome chez les eucaryotes : elles possèdent moins de 2 000 gènes codant des protéines, et l’on suppose que leurs ribosomes sont non seulement dépourvus de fragments d’expansion d’ARNr (fragments d’ARNr qui distinguent les ribosomes eucaryotes des ribosomes bactériens), mais également qu’ils possèdent quatre protéines ribosomiques en raison de l’absence d’homologues dans le génome d’E. cuniculi^26,27,28. Par conséquent, nous avons conclu que le ribosome d’E. cuniculi peut révéler des stratégies d’adaptation moléculaire à la dégradation du génome jusqu’alors inconnues.
Notre structure cryo-EM représente le plus petit ribosome cytoplasmique eucaryote jamais caractérisé et apporte un éclairage nouveau sur la façon dont le degré extrême de réduction du génome influence la structure, l'assemblage et l'évolution de la machinerie moléculaire essentielle à la cellule. Nous avons constaté que le ribosome d'E. cuniculi contrevient à de nombreux principes largement conservés du repliement de l'ARN et de l'assemblage ribosomique, et avons découvert une nouvelle protéine ribosomique jusqu'alors inconnue. De façon tout à fait inattendue, nous montrons que les ribosomes de microsporidies ont développé la capacité de se lier à de petites molécules, et nous émettons l'hypothèse que des troncatures dans l'ARNr et les protéines induisent des innovations évolutives susceptibles de conférer au ribosome des propriétés utiles.
Afin d'améliorer notre compréhension de l'évolution des protéines et des acides nucléiques chez les organismes intracellulaires, nous avons décidé d'isoler des spores d'E. cuniculi à partir de cultures de cellules de mammifères infectées, dans le but de purifier leurs ribosomes et d'en déterminer la structure. Il est difficile d'obtenir une grande quantité de microsporidies parasites, car celles-ci ne peuvent être cultivées dans un milieu nutritif. Elles se développent et se reproduisent exclusivement à l'intérieur de la cellule hôte. Par conséquent, pour obtenir la biomasse d'E. cuniculi nécessaire à la purification des ribosomes, nous avons infecté la lignée cellulaire rénale de mammifères RK13 avec des spores d'E. cuniculi et cultivé ces cellules infectées pendant plusieurs semaines afin de permettre la croissance et la multiplication d'E. cuniculi. À partir d'une monocouche de cellules infectées d'environ un demi-mètre carré, nous avons pu purifier environ 300 mg de spores de microsporidies et les utiliser pour isoler les ribosomes. Nous avons ensuite lysé les spores purifiées à l'aide de billes de verre et isolé les ribosomes bruts par fractionnement progressif des lysats avec du polyéthylène glycol. Cela nous a permis d'obtenir environ 300 µg de ribosomes bruts d'E. cuniculi pour l'analyse structurale.
Nous avons ensuite acquis des images de cryo-microscopie électronique (cryo-ME) à partir des échantillons de ribosomes obtenus et les avons traitées à l'aide de masques correspondant à la grande sous-unité ribosomique, à la tête de la petite sous-unité et à la petite sous-unité. Ce processus nous a permis d'acquérir des images d'environ 108 000 particules ribosomiques et de calculer des images de cryo-ME avec une résolution de 2,7 Å (Figures supplémentaires 1 à 3). Nous avons ensuite utilisé ces images de cryo-ME pour modéliser l'ARNr, les protéines ribosomiques et le facteur d'hibernation Mdf1 associés aux ribosomes d'E. cuniculi (Fig. 1a, b).
a. Structure du ribosome d'E. cuniculi en complexe avec le facteur d'hibernation Mdf1 (identifiant PDB : 7QEP). b. Carte du facteur d'hibernation Mdf1 associé au ribosome d'E. cuniculi. c. Carte de structure secondaire comparant l'ARNr récupéré chez les microsporidies aux structures ribosomiques connues. Les panneaux indiquent la localisation des fragments d'ARNr amplifiés (ES) et des sites actifs du ribosome, notamment le site de décodage (DC), la boucle de la sarcinicine (SRL) et le centre peptidyl-transférase (PTC). d. La densité électronique correspondant au centre peptidyl-transférase du ribosome d'E. cuniculi suggère que ce site catalytique possède la même structure chez le parasite E. cuniculi et ses hôtes, dont H. sapiens. e, f La densité électronique correspondante du centre de décodage (e) et la structure schématique de ce centre (f) indiquent qu'E. cuniculi possède le résidu U1491 au lieu de l'A1491 (numérotation d'E. coli) présent chez de nombreux autres eucaryotes. Cette différence suggère qu'E. cuniculi pourrait être sensible aux antibiotiques ciblant ce site actif.
Contrairement aux structures précédemment établies des ribosomes de V. necatrix et P. locustae (ces deux structures appartiennent à la même famille de microsporidies, les Nosematidae, et sont très similaires), les ribosomes d'E. cuniculi subissent de nombreux processus de fragmentation de l'ARNr et des protéines, ainsi qu'une dénaturation supplémentaire (Figures supplémentaires 4 à 6). Au niveau de l'ARNr, les changements les plus marquants incluent la perte complète du fragment d'ARNr 25S amplifié ES12L et la dégénérescence partielle des hélices h39, h41 et H18 (Fig. 1c, Fig. supplémentaire 4). Parmi les protéines ribosomiques, les changements les plus frappants comprenaient la perte complète de la protéine eS30 et le raccourcissement des protéines eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 et eS7 (Figures supplémentaires 4 et 5).
Ainsi, la réduction extrême du génome des espèces d'Encephalotozoon/Ordospora se reflète dans la structure de leurs ribosomes : les ribosomes d'E. cuniculi subissent la perte la plus importante de contenu protéique parmi les ribosomes cytoplasmiques eucaryotes ayant fait l'objet d'une caractérisation structurale, et ils sont dépourvus des fragments d'ARNr et de protéines largement conservés non seulement chez les eucaryotes, mais aussi dans les trois domaines du vivant. La structure du ribosome d'E. cuniculi fournit le premier modèle moléculaire de ces modifications et révèle des événements évolutifs passés inaperçus tant en génomique comparative qu'en études de structure biomoléculaire intracellulaire (Figure supplémentaire 7). Nous décrivons ci-dessous chacun de ces événements, ainsi que leurs origines évolutives probables et leur impact potentiel sur la fonction ribosomique.
Nous avons ensuite constaté que, outre d'importantes troncatures d'ARNr, les ribosomes d'E. cuniculi présentent des variations d'ARNr au niveau de l'un de leurs sites actifs. Bien que le centre peptidyl-transférase du ribosome d'E. cuniculi possède la même structure que les autres ribosomes eucaryotes (Fig. 1d), le centre de décodage diffère en raison d'une variation de séquence au niveau du nucléotide 1491 (numérotation d'E. coli, Fig. 1e, f). Cette observation est importante car le site de décodage des ribosomes eucaryotes contient généralement les résidus G1408 et A1491, contrairement aux résidus A1408 et G1491 de type bactérien. Cette variation explique la différence de sensibilité des ribosomes bactériens et eucaryotes à la famille des aminoglycosides, des antibiotiques ribosomiques, et à d'autres petites molécules ciblant le site de décodage. Au niveau du site de décodage du ribosome d’E. cuniculi, le résidu A1491 a été remplacé par U1491, créant potentiellement une interface de liaison unique pour les petites molécules ciblant ce site actif. Cette même variante A14901 est également présente chez d’autres microsporidies telles que P. locustae et V. necatrix, ce qui suggère qu’elle est largement répandue parmi les espèces de microsporidies (Fig. 1f).
Nos échantillons de ribosomes d'E. cuniculi ayant été isolés de spores métaboliquement inactives, nous avons analysé la carte de cryo-microscopie électronique (cryo-ME) d'E. cuniculi afin d'y rechercher des interactions ribosomiques précédemment décrites en conditions de stress ou de carence. Facteurs d'hibernation 31, 32, 36, 37 et 38. Nous avons comparé la structure précédemment établie du ribosome en hibernation avec la carte de cryo-ME du ribosome d'E. cuniculi. Pour l'amarrage moléculaire, nous avons utilisé des ribosomes de S. cerevisiae complexés au facteur d'hibernation Stm138, des ribosomes de criquet migrateur complexés au facteur Lso232 et des ribosomes de V. necatrix complexés aux facteurs Mdf1 et Mdf231. Nous avons également déterminé la densité cryo-ME correspondant au facteur de repos Mdf1. De même que Mdf1 se lie au ribosome de V. necatrix, Mdf1 se lie également au ribosome d'E. cuniculi, où il bloque le site E du ribosome, contribuant peut-être à rendre les ribosomes disponibles lorsque les spores du parasite deviennent métaboliquement inactives lors de l'inactivation du corps (Figure 2).
La protéine Mdf1 bloque le site E du ribosome, ce qui semble contribuer à son inactivation lorsque les spores du parasite deviennent métaboliquement inactives. Dans la structure du ribosome d'E. cuniculi, nous avons découvert que Mdf1 forme un contact jusqu'alors inconnu avec la tige ribosomique L1, la partie du ribosome qui facilite la libération de l'ARNt désacétylé lors de la synthèse protéique. Ces contacts suggèrent que Mdf1 se dissocie du ribosome selon le même mécanisme que l'ARNt désacétylé, ce qui pourrait expliquer comment le ribosome élimine Mdf1 pour réactiver la synthèse protéique.
Cependant, notre structure a révélé un contact inconnu entre Mdf1 et la branche L1 du ribosome (la partie du ribosome qui contribue à la libération de l'ARNt désacylé lors de la synthèse protéique). Plus précisément, Mdf1 utilise les mêmes contacts que le segment coudé de la molécule d'ARNt désacylé (Fig. 2). Cette modélisation moléculaire inédite a montré que Mdf1 se dissocie du ribosome selon le même mécanisme que l'ARNt désacylé, ce qui explique comment le ribosome élimine ce facteur d'hibernation pour réactiver la synthèse protéique.
Lors de la construction du modèle d'ARNr, nous avons constaté que le ribosome d'E. cuniculi présente des fragments d'ARNr anormalement repliés, que nous avons appelés ARNr fusionnés (Fig. 3). Dans les ribosomes présents dans les trois domaines du vivant, l'ARNr se replie en structures où la plupart de ses bases s'apparient et se replient entre elles ou interagissent avec des protéines ribosomiques^38,39,40. Cependant, dans les ribosomes d'E. cuniculi, les ARNr semblent déroger à ce principe de repliement en convertissant certaines de leurs hélices en régions d'ARNr non repliées.
Structure de l'hélice H18 de l'ARNr 25S chez *S. cerevisiae*, *V. necatrix* et *E. cuniculi*. Typiquement, dans les ribosomes couvrant les trois domaines du vivant, ce segment de liaison s'enroule en une hélice d'ARN contenant 24 à 34 résidus. Chez les microsporidies, en revanche, ce segment de liaison de l'ARNr est progressivement réduit à deux segments monocaténaires riches en uridine ne contenant que 12 résidus. La plupart de ces résidus sont exposés au solvant. La figure montre que les microsporidies parasites semblent déroger aux principes généraux du repliement de l'ARNr, où les bases de l'ARNr sont habituellement liées à d'autres bases ou impliquées dans des interactions ARNr-protéines. Chez les microsporidies, certains fragments d'ARNr adoptent un repliement défavorable, dans lequel l'ancienne hélice d'ARNr devient un fragment monocaténaire allongé presque en ligne droite. La présence de ces régions inhabituelles permet à l'ARNr des microsporidies de se lier à des fragments d'ARNr distants en utilisant un nombre minimal de bases d'ARN.
L'exemple le plus frappant de cette transition évolutive s'observe au niveau de l'hélice H18 de l'ARNr 25S (Fig. 3). Chez les espèces allant d'E. coli à l'homme, les bases de cette hélice d'ARNr contiennent 24 à 32 nucléotides, formant une hélice légèrement irrégulière. Dans les structures ribosomiques précédemment identifiées chez V. necatrix et P. locustae^31,32, les bases de l'hélice H18 sont partiellement déroulées, mais l'appariement des bases nucléotidiques est préservé. Cependant, chez E. cuniculi, ce fragment d'ARNr devient les plus courts segments de liaison 228UUUGU232 et 301UUUUUUUUU307. Contrairement aux fragments d'ARNr typiques, ces segments de liaison riches en uridine ne s'enroulent pas et n'établissent pas de contacts étroits avec les protéines ribosomiques. Ils adoptent plutôt des structures ouvertes au solvant et totalement dépliées dans lesquelles les brins d'ARNr sont presque rectilignes. Cette conformation étirée explique comment E. cuniculi utilise seulement 12 bases d'ARN pour combler l'espace de 33 Å entre les hélices d'ARNr H16 et H18, alors que d'autres espèces nécessitent au moins deux fois plus de bases d'ARNr pour combler cet espace.
Ainsi, nous pouvons démontrer que, grâce à un repliement énergétiquement défavorable, les microsporidies parasites ont développé une stratégie leur permettant de contracter même les segments d'ARNr largement conservés chez les espèces des trois domaines du vivant. Apparemment, en accumulant des mutations transformant les hélices d'ARNr en courts segments poly-U, *E. cuniculi* peut former des fragments d'ARNr inhabituels, contenant le moins de nucléotides possible pour la ligation de fragments d'ARNr distaux. Ceci contribue à expliquer comment les microsporidies ont réussi à réduire considérablement leur structure moléculaire de base sans perdre leur intégrité structurale et fonctionnelle.
Une autre caractéristique inhabituelle de l'ARNr d'E. cuniculi est l'absence de renflements (Fig. 4). Ces renflements sont des nucléotides non appariés qui s'écartent de l'hélice d'ARN au lieu d'y être inclus. La plupart de ces protrusions agissent comme des adhésifs moléculaires, facilitant la liaison des protéines ribosomiques adjacentes ou d'autres fragments d'ARNr. Certains renflements font office de charnières, permettant à l'hélice d'ARNr de se plier et de se replier de manière optimale pour une synthèse protéique efficace⁴¹.
a) Une protubérance d'ARNr (numérotation de S. cerevisiae) est absente de la structure ribosomique d'E. cuniculi, mais présente chez la plupart des autres eucaryotes. b) Les ribosomes internes d'E. coli, de S. cerevisiae, d'H. sapiens et d'E. cuniculi sont dépourvus de nombreuses protubérances d'ARNr anciennes et hautement conservées. Ces épaississements stabilisent la structure ribosomique ; leur absence chez les microsporidies indique donc une stabilité réduite du repliement de l'ARNr chez ces parasites. La comparaison avec les tiges P (tiges L7/L12 chez les bactéries) montre que la disparition des protubérances d'ARNr coïncide parfois avec l'apparition de nouvelles protubérances à proximité des protubérances disparues. L'hélice H42 de l'ARNr 23S/28S possède une protubérance ancienne (U1206 chez Saccharomyces cerevisiae) dont l'âge est estimé à au moins 3,5 milliards d'années, du fait de sa protection dans trois domaines du vivant. Chez les microsporidies, ce renflement disparaît. Cependant, un nouveau renflement apparaît à côté du renflement disparu (A1306 chez E. cuniculi).
De façon surprenante, nous avons constaté que les ribosomes d'E. cuniculi sont dépourvus de la plupart des protubérances d'ARNr présentes chez d'autres espèces, notamment plus de 30 protubérances conservées chez d'autres eucaryotes (Fig. 4a). Cette absence élimine de nombreux contacts entre les sous-unités ribosomiques et les hélices d'ARNr adjacentes, créant parfois de grandes cavités au sein du ribosome et rendant ainsi le ribosome d'E. cuniculi plus poreux que les ribosomes plus classiques (Fig. 4b). Notamment, nous avons observé que la plupart de ces protubérances étaient également absentes des structures ribosomiques de V. necatrix et P. locustae précédemment identifiées, et qui avaient été négligées par les analyses structurales antérieures^31,32.
Parfois, la disparition des protubérances de l'ARNr s'accompagne de l'apparition de nouvelles protubérances adjacentes. Par exemple, la tige P ribosomique contient une protubérance U1208 (chez Saccharomyces cerevisiae) qui a subsisté d'E. coli à l'homme et dont l'âge est donc estimé à 3,5 milliards d'années. Lors de la synthèse protéique, cette protubérance permet à la tige P d'adopter une conformation ouverte ou fermée, permettant ainsi au ribosome de recruter les facteurs de traduction et de les acheminer vers le site actif. Chez les ribosomes d'E. cuniculi, cet épaississement est absent ; cependant, un nouvel épaississement (G883), situé sur seulement trois paires de bases, contribue à la restauration de la flexibilité optimale de la tige P (Fig. 4c).
Nos données sur l'ARNr sans protubérances suggèrent que la minimisation de l'ARNr ne se limite pas à la perte d'éléments d'ARNr à la surface du ribosome, mais peut également impliquer le noyau ribosomique, créant un défaut moléculaire spécifique au parasite qui n'a pas été décrit dans les cellules libres.
Après avoir modélisé les protéines ribosomiques canoniques et l'ARNr, nous avons constaté que les composants ribosomiques conventionnels ne peuvent expliquer les trois parties de l'image de cryo-microscopie électronique. Deux de ces fragments sont de la taille de petites molécules (Fig. 5, Fig. S8). Le premier segment est intercalé entre les protéines ribosomiques uL15 et eL18, à une position habituellement occupée par l'extrémité C-terminale de eL18, qui est raccourcie chez *E. cuniculi*. Bien que nous ne puissions déterminer l'identité de cette molécule, la taille et la forme de cet îlot de densité sont bien expliquées par la présence de molécules de spermidine. Sa liaison au ribosome est stabilisée par des mutations spécifiques aux microsporidies dans les protéines uL15 (Asp51 et Arg56), qui semblent augmenter l'affinité du ribosome pour cette petite molécule, car elles permettent à uL15 d'envelopper la petite molécule dans une structure ribosomique (Fig. S2, données supplémentaires 1 et 2).
L’imagerie par cryo-microscopie électronique (cryo-ME) révèle la présence de nucléotides en dehors du ribose lié au ribosome d’E. cuniculi. Dans ce ribosome, ce nucléotide occupe la même position que le nucléotide A3186 de l’ARNr 25S (numérotation de Saccharomyces cerevisiae) dans la plupart des autres ribosomes eucaryotes. b Dans la structure ribosomique d’E. cuniculi, ce nucléotide est situé entre les protéines ribosomiques uL9 et eL20, stabilisant ainsi le contact entre ces deux protéines. cd Analyse de la conservation de la séquence eL20 chez les espèces de microsporidies. L'arbre phylogénétique des espèces de Microsporidia (c) et l'alignement multiple de séquences de la protéine eL20 (d) montrent que les résidus de liaison aux nucléotides F170 et K172 sont conservés chez la plupart des Microsporidia typiques, à l'exception de S. lophii et des Microsporidia à divergence précoce, qui ont conservé l'extension d'ARNr ES39L. Cette figure montre que les résidus de liaison aux nucléotides F170 et K172 sont présents uniquement dans eL20 du génome fortement réduit des Microsporidia, mais pas chez les autres eucaryotes. Globalement, ces données suggèrent que les ribosomes des Microsporidia ont développé un site de liaison aux nucléotides qui semble se lier aux molécules d'AMP et les utiliser pour stabiliser les interactions protéine-protéine dans la structure ribosomique. La forte conservation de ce site de liaison chez les Microsporidia et son absence chez les autres eucaryotes suggèrent que ce site pourrait conférer un avantage sélectif de survie aux Microsporidia. Ainsi, la poche de liaison aux nucléotides du ribosome de microsporidies ne semble pas être une caractéristique dégénérée ou une forme finale de dégradation de l'ARNr, comme décrit précédemment, mais plutôt une innovation évolutive utile permettant au ribosome de microsporidies de se lier directement à de petites molécules, les utilisant comme éléments constitutifs des ribosomes. Cette découverte fait du ribosome de microsporidies le seul ribosome connu à utiliser un seul nucléotide comme élément constitutif de sa structure. f Voie évolutive hypothétique dérivée de la liaison aux nucléotides.
La seconde zone de faible densité moléculaire se situe à l'interface entre les protéines ribosomiques uL9 et eL30 (Fig. 5a). Cette interface a été précédemment décrite dans la structure du ribosome de Saccharomyces cerevisiae comme un site de liaison pour le nucléotide 25S de l'ARNr A3186 (faisant partie de l'extension ES39L de l'ARNr)³⁸. Il a été montré que dans les ribosomes ES39L dégénérés de P. locustae, cette interface lie un nucléotide unique inconnu³¹, et il est supposé que ce nucléotide est une forme finale réduite de l'ARNr, dont la longueur est d'environ 130 à 230 bases. ES39L est réduit à un seul nucléotide^32,43. Nos images de cryo-microscopie électronique confirment l'hypothèse selon laquelle cette densité peut s'expliquer par la présence de nucléotides. Cependant, la résolution plus élevée de notre structure a révélé que ce nucléotide est une molécule extraribosomique, probablement l'AMP (Fig. 5a, b).
Nous avons ensuite cherché à déterminer si le site de liaison des nucléotides était présent dans le ribosome d'E. cuniculi ou s'il existait déjà. La liaison des nucléotides étant principalement assurée par les résidus Phe170 et Lys172 de la protéine ribosomique eL30, nous avons évalué la conservation de ces résidus chez 4396 eucaryotes représentatifs. Comme pour uL15 mentionné précédemment, nous avons constaté que les résidus Phe170 et Lys172 sont hautement conservés uniquement chez les microsporidies typiques, mais absents chez d'autres eucaryotes, notamment les microsporidies atypiques Mitosporidium et Amphiamblys, chez lesquelles le fragment d'ARNr ES39L n'est pas réduit (Fig. 5c-e).
L’ensemble de ces données appuie l’hypothèse selon laquelle E. cuniculi, et possiblement d’autres microsporidies canoniques, ont développé la capacité de capturer efficacement de grandes quantités de petits métabolites dans la structure ribosomique afin de compenser la diminution des niveaux d’ARNr et de protéines. Ce faisant, elles ont développé une capacité unique à lier des nucléotides en dehors du ribosome, démontrant ainsi que les structures moléculaires parasitaires compensent en capturant d’abondants petits métabolites et en les utilisant comme modèles structuraux de fragments d’ARN et de protéines dégradés.
La troisième partie non simulée de notre carte de cryo-microscopie électronique (cryo-ME) se situe dans la grande sous-unité ribosomique. La résolution relativement élevée (2,6 Å) de notre carte suggère que cette densité appartient à des protéines présentant des combinaisons uniques de résidus à chaînes latérales volumineuses, ce qui nous a permis d'identifier cette densité comme une protéine ribosomique jusqu'alors inconnue, que nous avons nommée msL2 (protéine L2 spécifique aux Microsporidies) (voir Méthodes, figure 6). Notre recherche d'homologie a montré que msL2 est conservée dans le clade des Microsporidies des genres Encephaliter et Orosporidium, mais absente chez d'autres espèces, y compris d'autres Microsporidies. Dans la structure ribosomique, msL2 occupe un espace laissé vacant par la perte de l'ARNr ES31L étendu. Dans cet espace, msL2 contribue à stabiliser le repliement de l'ARNr et peut compenser la perte de ES31L (figure 6).
a) Densité électronique et modèle de la protéine ribosomique spécifique des microsporidies msL2, présente dans les ribosomes d'E. cuniculi. b) La plupart des ribosomes eucaryotes, y compris le ribosome 80S de Saccharomyces cerevisiae, présentent une amplification de l'ARNr ES19L, absente chez la plupart des espèces de microsporidies. La structure précédemment établie du ribosome de V. necatrix suggère que la perte d'ES19L chez ces parasites est compensée par l'évolution de la nouvelle protéine ribosomique msL1. Dans cette étude, nous avons constaté que le ribosome d'E. cuniculi a également développé une protéine supplémentaire mimétique de l'ARN ribosomique, apparemment en compensation de la perte d'ES19L. Cependant, msL2 (actuellement identifiée comme la protéine hypothétique ECU06_1135) et msL1 ont des origines structurales et évolutives différentes. La découverte de la génération des protéines ribosomiques msL1 et msL2, non apparentées sur le plan évolutif, suggère que l'accumulation de mutations délétères dans l'ARN ribosomique des ribosomes peut engendrer une diversité de composition sans précédent, même au sein d'un petit sous-ensemble d'espèces étroitement apparentées. Cette découverte pourrait contribuer à élucider l'origine et l'évolution du ribosome mitochondrial, connu pour son ARN ribosomique fortement réduit et la variabilité anormale de sa composition protéique selon les espèces.
Nous avons ensuite comparé la protéine msL2 à la protéine msL1, précédemment décrite et seule protéine ribosomique spécifique des microsporidies connue, présente dans le ribosome de V. necatrix. Nous souhaitions déterminer si msL1 et msL2 sont apparentées sur le plan évolutif. Notre analyse a montré que msL1 et msL2 occupent la même cavité dans la structure ribosomique, mais présentent des structures primaire et tertiaire différentes, ce qui indique leur origine évolutive indépendante (Fig. 6). Ainsi, la découverte de msL2 démontre que des groupes d'espèces eucaryotes compactes peuvent développer indépendamment des protéines ribosomiques structurellement distinctes pour compenser la perte de fragments d'ARNr. Cette découverte est remarquable, car la plupart des ribosomes eucaryotes cytoplasmiques contiennent une protéine invariante, appartenant notamment à la même famille de 81 protéines ribosomiques. L'apparition de msL1 et msL2 dans divers clades de microsporidies en réponse à la perte de segments d'ARNr étendus suggère que la dégradation de l'architecture moléculaire du parasite amène les parasites à rechercher des mutations compensatoires, qui peuvent éventuellement conduire à leur acquisition dans différentes populations de parasites. structures.
Enfin, une fois notre modèle achevé, nous avons comparé la composition du ribosome d'E. cuniculi à celle prédite par la séquence du génome. Plusieurs protéines ribosomiques, dont eL14, eL38, eL41 et eS30, étaient auparavant considérées comme absentes du génome d'E. cuniculi en raison de l'absence apparente de leurs homologues. La perte de nombreuses protéines ribosomiques est également prédite chez la plupart des autres parasites intracellulaires et endosymbiontes fortement réduits. Par exemple, bien que la plupart des bactéries libres possèdent la même famille de 54 protéines ribosomiques, seules 11 de ces familles de protéines présentent des homologues détectables dans chaque génome analysé de bactéries dépendantes d'un hôte spécifique. À l'appui de cette hypothèse, une perte de protéines ribosomiques a été observée expérimentalement chez les microsporidies V. necatrix et P. locustae, qui sont dépourvues des protéines eL38 et eL41^31,32.
Cependant, nos structures montrent que seuls les résidus eL38, eL41 et eS30 sont effectivement perdus dans le ribosome d'E. cuniculi. La protéine eL14 est conservée et notre structure explique pourquoi elle n'a pas été détectée lors de la recherche d'homologie (Fig. 7). Dans les ribosomes d'E. cuniculi, la majeure partie du site de liaison de eL14 est perdue suite à la dégradation de l'élément ES39L amplifié par l'ARNr. En l'absence d'ES39L, eL14 perd la majeure partie de sa structure secondaire et seulement 18 % de sa séquence est identique chez E. cuniculi et S. cerevisiae. Cette faible conservation de la séquence est remarquable, car même Saccharomyces cerevisiae et Homo sapiens — des organismes séparés par 1,5 milliard d'années d'évolution — partagent plus de 51 % des mêmes résidus dans eL14. Cette perte anormale de conservation explique pourquoi E. cuniculi eL14 est actuellement annoté comme la protéine putative M970_061160 et non comme la protéine ribosomique eL1427.
Le ribosome des microsporidies a perdu l'extension ES39L de l'ARNr, ce qui a partiellement éliminé le site de liaison de la protéine ribosomique eL14. En l'absence d'ES39L, la protéine eL14 des microspores subit une perte de structure secondaire : l'ancienne hélice α de liaison à l'ARNr dégénère en une boucle de longueur minimale. L'alignement de séquences multiples montre que la protéine eL14 est hautement conservée chez les eucaryotes (57 % d'identité de séquence entre les homologues de levure et humains), mais peu conservée et divergente chez les microsporidies (où pas plus de 24 % des résidus sont identiques à l'homologue de eL14). Cette faible conservation de séquence et cette variabilité de structure secondaire expliquent pourquoi l'homologue de eL14 n'a jamais été trouvé chez E. cuniculi et pourquoi on pense que cette protéine a été perdue chez E. cuniculi. En revanche, la protéine eL14 d'E. cuniculi était auparavant annotée comme une protéine putative M970_061160. Cette observation suggère que la diversité du génome des microsporidies est actuellement surestimée : certains gènes considérés comme perdus chez les microsporidies sont en réalité conservés, bien que sous des formes très différenciées ; d'autres, supposés coder pour des protéines spécifiques aux vers (par exemple, la protéine hypothétique M970_061160), codent en fait pour des protéines très diverses présentes chez d'autres eucaryotes.
Cette découverte suggère que la dénaturation de l'ARNr peut entraîner une perte importante de conservation de séquence dans les protéines ribosomiques adjacentes, les rendant indétectables par recherche d'homologie. Par conséquent, nous pourrions surestimer le degré réel de dégradation moléculaire chez les organismes à petit génome, car certaines protéines considérées comme perdues persistent en réalité, bien que sous des formes fortement altérées.
Comment les parasites peuvent-ils conserver la fonction de leurs machines moléculaires dans des conditions de réduction extrême de leur génome ? Notre étude répond à cette question en décrivant la structure moléculaire complexe (ribosome) d’E. cuniculi, un organisme possédant l’un des plus petits génomes eucaryotes.
On sait depuis près de vingt ans que les molécules de protéines et d'ARN des parasites microbiens diffèrent souvent de leurs homologues chez les espèces libres. En effet, elles sont dépourvues de centres de contrôle qualité, leur taille est réduite de moitié par rapport à celle des microbes libres, et elles présentent de nombreuses mutations invalidantes qui altèrent leur repliement et leur fonction. Par exemple, les ribosomes des organismes à petit génome, notamment de nombreux parasites intracellulaires et endosymbiontes, sont généralement dépourvus de plusieurs protéines ribosomiques et de jusqu'à un tiers des nucléotides d'ARNr par rapport aux espèces libres^{27, 29, 30, 49}. Cependant, le fonctionnement de ces molécules chez les parasites demeure largement un mystère, principalement étudié par la génomique comparative.
Notre étude montre que la structure des macromolécules peut révéler de nombreux aspects de l'évolution difficiles à extraire des études de génomique comparative classiques des parasites intracellulaires et autres organismes à hôte restreint (Fig. suppl. 7). Par exemple, le cas de la protéine eL14 illustre la tendance à surestimer le degré réel de dégradation de l'appareil moléculaire chez les espèces parasitaires. On considère aujourd'hui que les parasites encéphalitiques possèdent des centaines de gènes spécifiques aux microsporidies. Or, nos résultats montrent que certains de ces gènes, apparemment spécifiques, ne sont en réalité que des variantes de gènes communs à d'autres eucaryotes. De plus, le cas de la protéine msL2 illustre comment nous négligeons les nouvelles protéines ribosomiques et sous-estimons la complexité des machines moléculaires parasitaires. Enfin, le cas des petites molécules montre comment nous pouvons passer à côté des innovations les plus ingénieuses dans les structures moléculaires parasitaires, innovations susceptibles de leur conférer de nouvelles activités biologiques.
Pris ensemble, ces résultats améliorent notre compréhension des différences entre les structures moléculaires des organismes inféodés à un hôte et celles des organismes libres. Nous montrons que les machines moléculaires, longtemps considérées comme réduites, dégénérantes et sujettes à diverses mutations invalidantes, possèdent en réalité un ensemble de caractéristiques structurales inhabituelles, systématiquement négligées.
En revanche, les fragments d'ARNr non volumineux et les fragments fusionnés que nous avons trouvés dans les ribosomes d'E. cuniculi suggèrent que la réduction du génome peut modifier même les parties de la machinerie moléculaire de base qui sont préservées dans les trois domaines du vivant – après près de 3,5 milliards d'années d'évolution indépendante des espèces.
Les fragments d'ARNr sans protubérance et fusionnés des ribosomes d'E. cuniculi présentent un intérêt particulier à la lumière d'études antérieures sur les molécules d'ARN chez les bactéries endosymbiotiques. Par exemple, chez le puceron endosymbiotique Buchnera aphidicola, il a été démontré que les molécules d'ARNr et d'ARNt possèdent des structures thermosensibles en raison d'une composition biaisée en A+T et d'une forte proportion de paires de bases non canoniques^20,50. Ces modifications de l'ARN, ainsi que celles des molécules protéiques, sont désormais considérées comme responsables de la forte dépendance des endosymbiontes à leurs partenaires et de leur incapacité à transférer la chaleur^21,23. Bien que l'ARNr des microsporidies parasites présente des modifications structurales distinctes, la nature de ces modifications suggère qu'une stabilité thermique réduite et une dépendance accrue aux protéines chaperonnes pourraient être des caractéristiques communes des molécules d'ARN chez les organismes à génome réduit.
D'autre part, nos structures montrent que les microsporidies parasites ont développé une capacité unique à résister aux fragments d'ARNr et de protéines largement conservés, en étant capables d'utiliser de petits métabolites abondants et facilement disponibles comme mimes structuraux de fragments d'ARNr et de protéines dégénérés. Dégradation de la structure moléculaire. Cette hypothèse est étayée par le fait que de petites molécules compensant la perte de fragments protéiques dans l'ARNr et les ribosomes d'E. cuniculi se lient à des résidus spécifiques aux microsporidies dans les protéines uL15 et eL30. Ceci suggère que la liaison de petites molécules aux ribosomes pourrait être le produit d'une sélection positive, au cours de laquelle des mutations spécifiques aux microsporidies dans les protéines ribosomiques auraient été sélectionnées pour leur capacité à augmenter l'affinité des ribosomes pour les petites molécules, ce qui pourrait conduire à des organismes ribosomiques plus efficaces. Cette découverte révèle une innovation ingénieuse dans la structure moléculaire des parasites microbiens et nous permet de mieux comprendre comment les structures moléculaires des parasites maintiennent leur fonction malgré une évolution réductrice.
À l'heure actuelle, l'identification de ces petites molécules demeure incertaine. On ignore pourquoi leur présence dans la structure ribosomique diffère selon les espèces de microsporidies. En particulier, on ne comprend pas pourquoi la liaison des nucléotides est observée dans les ribosomes d'E. cuniculi et de P. locustae, mais pas dans ceux de V. necatrix, malgré la présence du résidu F170 dans les protéines eL20 et K172 de V. necatrix. Cette absence pourrait être due au résidu 43 uL6 (situé à proximité du site de liaison des nucléotides), qui est une tyrosine chez V. necatrix et non une thréonine chez E. cuniculi et P. locustae. La chaîne latérale aromatique volumineuse de Tyr43 pourrait interférer avec la liaison des nucléotides par encombrement stérique. Par ailleurs, cette absence apparente de nucléotide pourrait être due à la faible résolution de l'imagerie par cryo-microscopie électronique, ce qui limite la modélisation des fragments ribosomiques de V. necatrix.
En revanche, nos travaux suggèrent que le processus de dégradation du génome pourrait constituer une force inventive. Plus précisément, la structure du ribosome d'E. cuniculi indique que la perte de fragments d'ARNr et de protéines dans le ribosome des microsporidies exerce une pression évolutive favorisant des modifications de sa structure. Ces variants, situés loin du site actif du ribosome, semblent contribuer au maintien (ou à la restauration) d'un assemblage ribosomique optimal, qui serait autrement perturbé par la réduction de l'ARNr. Ceci suggère qu'une innovation majeure du ribosome des microsporidies semble avoir évolué vers la nécessité de compenser la dérive génétique.
L'exemple le plus parlant est sans doute la liaison des nucléotides, jamais observée jusqu'à présent chez d'autres organismes. La présence de résidus de liaison aux nucléotides chez les microsporidies typiques, mais leur absence chez les autres eucaryotes, suggère que ces sites de liaison ne sont pas de simples vestiges voués à disparaître, ni le site final de la restauration de l'ARNr sous forme de nucléotides individuels. Il semble plutôt s'agir d'une caractéristique utile ayant pu évoluer au cours de plusieurs cycles de sélection positive. Les sites de liaison aux nucléotides pourraient être un sous-produit de la sélection naturelle : une fois ES39L dégradé, les microsporidies sont contraintes de compenser ce déficit pour rétablir une biogenèse ribosomique optimale en son absence. Ce nucléotide pouvant mimer les contacts moléculaires du nucléotide A3186 d'ES39L, il devient un élément constitutif du ribosome, dont la liaison est encore améliorée par la mutation de la séquence eL30.
Concernant l'évolution moléculaire des parasites intracellulaires, notre étude montre que les forces de la sélection naturelle darwinienne et de la dérive génétique (dégradation du génome) n'agissent pas en parallèle, mais de manière oscillatoire. La dérive génétique élimine d'abord des caractéristiques importantes des biomolécules, rendant la compensation indispensable. Ce n'est que lorsque les parasites satisfont ce besoin par la sélection naturelle darwinienne que leurs macromolécules ont une chance de développer leurs caractéristiques les plus remarquables et innovantes. De manière significative, l'évolution des sites de liaison des nucléotides dans le ribosome d'E. cuniculi suggère que ce modèle d'évolution moléculaire, basé sur la perte et le gain, non seulement amortit les mutations délétères, mais confère parfois des fonctions entièrement nouvelles aux macromolécules parasitaires.
Cette idée est cohérente avec la théorie de l'équilibre mobile de Sewell Wright, selon laquelle un système strict de sélection naturelle limite la capacité d'innovation des organismes^51,52,53. Cependant, si la dérive génétique perturbe la sélection naturelle, ces dérives peuvent engendrer des changements qui, en eux-mêmes, ne sont pas adaptatifs (voire même délétères), mais qui conduisent à d'autres changements conférant une meilleure adaptation ou une nouvelle activité biologique. Notre cadre théorique appuie cette idée en montrant que le même type de mutation qui réduit le repliement et la fonction d'une biomolécule semble être le principal facteur déclencheur de son amélioration. Conformément au modèle évolutif gagnant-gagnant, notre étude révèle que la dégradation du génome, traditionnellement perçue comme un processus dégénératif, est également un moteur majeur d'innovation, permettant parfois, voire souvent, aux macromolécules d'acquérir de nouvelles activités parasitaires.