Tack för att du besöker Nature.com. Webbläsarversionen du använder har begränsat CSS-stöd. För bästa möjliga upplevelse rekommenderar vi att du använder en uppdaterad webbläsare (eller inaktiverar kompatibilitetsläge i Internet Explorer). Under tiden, för att säkerställa fortsatt stöd, kommer vi att rendera webbplatsen utan stilar och JavaScript.
Utvecklingen av mikrobiella parasiter innebär en motverkan mellan naturligt urval, vilket får parasiter att förbättras, och genetisk drift, vilket får parasiter att förlora gener och ackumulera skadliga mutationer. För att förstå hur denna motverkan sker på skalan av en enda makromolekyl beskriver vi här kryo-EM-strukturen hos ribosomen hos Encephalitozoon cuniculi, en eukaryot organism med ett av de minsta genomerna i naturen. Den extrema reduktionen av rRNA i E. cuniculi-ribosomer åtföljs av exempellösa strukturella förändringar, såsom utvecklingen av tidigare okända sammansmälta rRNA-länkar och rRNA utan utbuktningar. Dessutom överlevde E. cuniculi-ribosomen förlusten av rRNA-fragment och proteiner genom att utveckla förmågan att använda små molekyler som strukturella härmare av nedbrutna rRNA-fragment och proteiner. Sammantaget visar vi att molekylära strukturer som länge ansetts vara reducerade, degenererade och utsatta för försvagande mutationer har ett antal kompensationsmekanismer som håller dem aktiva trots extrema molekylära kontraktioner.
Eftersom de flesta grupper av mikrobiella parasiter har unika molekylära verktyg för att utnyttja sina värdar, måste vi ofta utveckla olika terapeutiska medel för olika grupper av parasiter1,2. Nya bevis tyder dock på att vissa aspekter av parasiternas evolution är konvergenta och i stort sett förutsägbara, vilket indikerar en potentiell grund för breda terapeutiska interventioner mot mikrobiella parasiter3,4,5,6,7,8,9.
Tidigare arbete har identifierat en gemensam evolutionär trend hos mikrobiella parasiter som kallas genomreduktion eller genomsönderfall10,11,12,13. Aktuell forskning visar att när mikroorganismer ger upp sin frittlevande livsstil och blir intracellulära parasiter (eller endosymbioner), genomgår deras genom långsamma men fantastiska metamorfoser under miljontals år9,11. I en process som kallas genomsönderfall ackumulerar mikrobiella parasiter skadliga mutationer som förvandlar många tidigare viktiga gener till pseudogener, vilket leder till gradvis genförlust och mutationskollaps14,15. Denna kollaps kan förstöra upp till 95 % av generna i de äldsta intracellulära organismerna jämfört med närbesläktade frittlevande arter. Således är utvecklingen av intracellulära parasiter en dragkamp mellan två motsatta krafter: darwinistiskt naturligt urval, som leder till förbättring av parasiter, och genomets kollaps, som kastar parasiter i glömska. Hur parasiten lyckades ta sig ur denna dragkamp och behålla aktiviteten i sin molekylära struktur är fortfarande oklart.
Även om mekanismen för genomförfall inte är helt klarlagd, verkar det huvudsakligen ske på grund av frekvent genetisk drift. Eftersom parasiter lever i små, asexuella och genetiskt begränsade populationer, kan de inte effektivt eliminera skadliga mutationer som ibland uppstår under DNA-replikation. Detta leder till irreversibel ansamling av skadliga mutationer och minskning av parasitens genom. Som ett resultat förlorar parasiten inte bara gener som inte längre är nödvändiga för dess överlevnad i den intracellulära miljön. Det är parasitpopulationernas oförmåga att effektivt eliminera sporadiska skadliga mutationer som gör att dessa mutationer ackumuleras i hela genomet, inklusive deras viktigaste gener.
Mycket av vår nuvarande förståelse av genomreduktion baseras enbart på jämförelser av genomsekvenser, med mindre uppmärksamhet på förändringar i faktiska molekyler som utför hushållsfunktioner och fungerar som potentiella läkemedelsmål. Jämförande studier har visat att bördan av skadliga intracellulära mikrobiella mutationer verkar predisponera proteiner och nukleinsyror för att felveckas och aggregeras, vilket gör dem mer chaperonberoende och överkänsliga för värme19,20,21,22,23. Dessutom upplevde olika parasiter – oberoende av evolution ibland separerade med så mycket som 2,5 miljarder år – en liknande förlust av kvalitetskontrollcentra i sin proteinsyntes5,6 och DNA-reparationsmekanismer24. Emellertid är lite känt om effekten av intracellulär livsstil på alla andra egenskaper hos cellulära makromolekyler, inklusive molekylär anpassning till en ökande börda av skadliga mutationer.
I detta arbete, för att bättre förstå utvecklingen av proteiner och nukleinsyror hos intracellulära mikroorganismer, bestämde vi strukturen hos ribosomer hos den intracellulära parasiten Encephalitozoon cuniculi. E. cuniculi är en svampliknande organism som tillhör en grupp parasitiska mikrosporidier som har ovanligt små eukaryota genom och därför används som modellorganismer för att studera genomsönderfall25,26,27,28,29,30. Nyligen bestämdes kryo-EM-ribosomstrukturen för måttligt reducerade genom av Microsporidia, Paranosema locustae och Vairimorpha necatrix31,32 (~3,2 Mb genom). Dessa strukturer tyder på att viss förlust av rRNA-amplifiering kompenseras av utvecklingen av nya kontakter mellan angränsande ribosomala proteiner eller förvärv av nya msL131,32 ribosomala proteiner. Arten Encephalitozoon (genom ~2,5 miljoner bp), tillsammans med deras närmaste släkting Ordospora, uppvisar den ultimata graden av genomreduktion hos eukaryoter – de har färre än 2000 proteinkodande gener, och det förväntas att deras ribosomer inte bara saknar rRNA-expansionsfragment (rRNA-fragment som skiljer eukaryota ribosomer från bakteriella ribosomer) utan också har fyra ribosomala proteiner på grund av deras brist på homologer i E. cuniculi-genomet 26, 27, 28. Därför drog vi slutsatsen att E. cuniculi-ribosomen kan avslöja tidigare okända strategier för molekylär anpassning till genomsönderfall.
Vår kryo-EM-struktur representerar den minsta eukaryota cytoplasmiska ribosomen som någonsin karakteriserats och ger insikt i hur den slutliga graden av genomreduktion påverkar strukturen, sammansättningen och utvecklingen av det molekylära maskineriet som är integrerat i cellen. Vi fann att E. cuniculi-ribosomen bryter mot många av de allmänt konserverade principerna för RNA-vikning och ribosomsammansättning, och upptäckte ett nytt, tidigare okänt ribosomalt protein. Ganska oväntat visar vi att mikrosporidia-ribosomer har utvecklat förmågan att binda till små molekyler, och antar att trunkeringar i rRNA och proteiner utlöser evolutionära innovationer som i slutändan kan ge användbara egenskaper till ribosomen.
För att förbättra vår förståelse av proteiners och nukleinsyrors utveckling i intracellulära organismer beslutade vi att isolera E. cuniculi-sporer från kulturer av infekterade däggdjursceller för att rena deras ribosomer och bestämma strukturen hos dessa ribosomer. Det är svårt att erhålla ett stort antal parasitiska mikrosporidier eftersom mikrosporidier inte kan odlas i ett näringsmedium. Istället växer och reproducerar de sig endast inuti värdcellen. För att erhålla E. cuniculi-biomassa för ribosomrening infekterade vi därför däggdjursnjurcellinjen RK13 med E. cuniculi-sporer och odlade dessa infekterade celler i flera veckor för att låta E. cuniculi växa och föröka sig. Med hjälp av ett infekterat cellmonolager på ungefär en halv kvadratmeter kunde vi rena cirka 300 mg Microsporidia-sporer och använda dem för att isolera ribosomer. Vi sönderdelade sedan de renade sporerna med glaspärlor och isolerade de råa ribosomerna med stegvis polyetylenglykolfraktionering av lysaten. Detta gjorde det möjligt för oss att erhålla cirka 300 µg råa E. cuniculi-ribosomer för strukturanalys.
Vi samlade sedan in kryo-EM-bilder med hjälp av de resulterande ribosomproverna och bearbetade dessa bilder med hjälp av masker motsvarande den stora ribosomala subenheten, den lilla subenhetshuvudet och den lilla subenheten. Under denna process samlade vi in ​​bilder av cirka 108 000 ribosomala partiklar och beräknade kryo-EM-bilder med en upplösning på 2,7 Å (kompletterande figurer 1-3). Vi använde sedan kryoEM-bilder för att modellera rRNA, ribosomalt protein och hibernationsfaktor Mdf1 associerat med E. cuniculi-ribosomer (Fig. 1a, b).
a Struktur av E. cuniculi-ribosomen i komplex med hibernationsfaktorn Mdf1 (pdb-id 7QEP). b Karta över hibernationsfaktorn Mdf1 associerad med E. cuniculi-ribosomen. c Karta över sekundärstrukturen som jämför återvunnet rRNA i mikrosporidiska arter med kända ribosomala strukturer. Panelerna visar platsen för de amplifierade rRNA-fragmenten (ES) och ribosomaktiva platser, inklusive avkodningsstället (DC), sarcinicinloopen (SRL) och peptidyltransferascentret (PTC). d Elektrondensiteten som motsvarar peptidyltransferascentret i E. cuniculi-ribosomen antyder att detta katalytiska ställe har samma struktur i E. cuniculi-parasiten och dess värdar, inklusive H. sapiens. e, f Motsvarande elektrondensitet för avkodningscentret (e) och den schematiska strukturen för avkodningscentret (f) indikerar att E. cuniculi har resterna U1491 istället för A1491 (E. coli-numrering) i många andra eukaryoter. Denna förändring tyder på att E. cuniculi kan vara känslig för antibiotika som riktar sig mot detta aktiva område.
I motsats till de tidigare etablerade strukturerna hos V. necatrix- och P. locustae-ribosomer (båda strukturerna representerar samma microsporidia-familj Nosematidae och är mycket lika varandra), genomgår 31,32 E. cuniculi-ribosomer ett flertal processer av rRNA- och proteinfragmentering. Ytterligare denaturering (kompletterande figurer 4-6). I rRNA inkluderade de mest slående förändringarna fullständig förlust av det amplifierade 25S rRNA-fragmentet ES12L och partiell degeneration av h39-, h41- och H18-helixarna (fig. 1c, kompletterande figur 4). Bland ribosomala proteiner inkluderade de mest slående förändringarna fullständig förlust av eS30-proteinet och förkortning av proteinerna eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 och eS7 (kompletterande figurer 4, 5).
Således återspeglas den extrema reduktionen av genomet hos Encephalotozoon/Ordospora-arter i deras ribosomstruktur: E. cuniculi-ribosomer upplever den mest dramatiska förlusten av proteininnehåll i eukaryota cytoplasmatiska ribosomer som är föremål för strukturell karakterisering, och de har inte ens de rRNA- och proteinfragment som är i stor utsträckning konserverade, inte bara i eukaryoter, utan också i livets tre domäner. Strukturen hos E. cuniculi-ribosomen ger den första molekylära modellen för dessa förändringar och avslöjar evolutionära händelser som har förbisetts av både jämförande genomik och studier av intracellulär biomolekylär struktur (kompletterande figur 7). Nedan beskriver vi var och en av dessa händelser tillsammans med deras sannolika evolutionära ursprung och deras potentiella inverkan på ribosomfunktionen.
Vi fann sedan att, förutom stora rRNA-trunkeringar, har E. cuniculi-ribosomer rRNA-variationer vid ett av sina aktiva ställen. Även om peptidyltransferascentret i E. cuniculi-ribosomen har samma struktur som andra eukaryota ribosomer (Fig. 1d), skiljer sig avkodningscentret på grund av sekvensvariation vid nukleotid 1491 (E. coli-numrering, Fig. 1e, f). Denna observation är viktig eftersom avkodningsstället för eukaryota ribosomer vanligtvis innehåller resterna G1408 och A1491 jämfört med bakterietypresterna A1408 och G1491. Denna variation ligger till grund för den olika känsligheten hos bakteriella och eukaryota ribosomer för aminoglykosidfamiljen av ribosomala antibiotika och andra små molekyler som riktar sig mot avkodningsstället. Vid avkodningsstället för E. cuniculi-ribosomen ersattes rest A1491 med U1491, vilket potentiellt skapade ett unikt bindningsgränssnitt för små molekyler som riktar sig mot detta aktiva ställe. Samma A14901-variant finns även i andra mikrosporidier såsom P. locustae och V. necatrix, vilket tyder på att den är utbredd bland mikrosporidiearter (Fig. 1f).
Eftersom våra E. cuniculi-ribosomprover isolerades från metaboliskt inaktiva sporer, testade vi kryo-EM-kartan för E. cuniculi för tidigare beskriven ribosombindning under stress- eller svältförhållanden. Idrottsfaktorer 31, 32, 36, 37, 38. Vi matchade den tidigare etablerade strukturen för den idrottande ribosomen med kryo-EM-kartan för E. cuniculi-ribosomen. För dockning användes S. cerevisiae-ribosomer i komplex med idrottsfaktorn Stm138, johannesbrödribosomer i komplex med Lso232-faktorn och V. necatrix-ribosomer i komplex med Mdf1- och Mdf231-faktorerna. Samtidigt fann vi kryo-EM-densiteten som motsvarade vilofaktorn Mdf1. I likhet med Mdf1 som binder till V. necatrix-ribosomen, binder Mdf1 även till E. cuniculi-ribosomen, där den blockerar E-stället på ribosomen, vilket möjligen bidrar till att göra ribosomer tillgängliga när parasitsporer blir metaboliskt inaktiva vid kroppsinaktivering (Figur 2).
Mdf1 blockerar E-stället på ribosomen, vilket verkar bidra till att inaktivera ribosomen när parasitsporer blir metaboliskt inaktiva. I strukturen av E. cuniculi-ribosomen fann vi att Mdf1 bildar en tidigare okänd kontakt med L1-ribosomstammen, den del av ribosomen som underlättar frisättningen av deacylerat tRNA från ribosomen under proteinsyntesen. Dessa kontakter tyder på att Mdf1 dissocierar från ribosomen med samma mekanism som deacetylerat tRNA, vilket ger en möjlig förklaring till hur ribosomen avlägsnar Mdf1 för att återaktivera proteinsyntesen.
Vår struktur avslöjade dock en okänd kontakt mellan Mdf1 och L1-ribosombenet (den del av ribosomen som hjälper till att frigöra deacylerat tRNA från ribosomen under proteinsyntesen). I synnerhet använder Mdf1 samma kontakter som armbågssegmentet av den deacylerade tRNA-molekylen (Fig. 2). Denna tidigare okända molekylära modellering visade att Mdf1 dissocierar från ribosomen med samma mekanism som deacetylerat tRNA, vilket förklarar hur ribosomen tar bort denna vilolägesfaktor för att återaktivera proteinsyntesen.
När vi konstruerade rRNA-modellen fann vi att E. cuniculi-ribosomen har onormalt veckade rRNA-fragment, vilka vi kallade fuserat rRNA (Fig. 3). I ribosomer som spänner över livets tre domäner veckas rRNA till strukturer där de flesta rRNA-baser antingen baspar och veckas med varandra eller interagerar med ribosomala proteiner38,39,40. I E. cuniculi-ribosomer verkar dock rRNA bryta mot denna vikningsprincip genom att omvandla några av sina helixar till ovikta rRNA-regioner.
Strukturen av H18 25S rRNA-helixen i S. cerevisiae, V. necatrix och E. cuniculi. Vanligtvis, i ribosomer som spänner över de tre livsdomänerna, lindas denna länkare till en RNA-helix som innehåller 24 till 34 rester. I Microsporidia, däremot, reduceras denna rRNA-länkare gradvis till två enkelsträngade uridinrika länkare som endast innehåller 12 rester. De flesta av dessa rester exponeras för lösningsmedel. Figuren visar att parasitiska mikrosporidier verkar bryta mot de allmänna principerna för rRNA-veckning, där rRNA-baser vanligtvis är kopplade till andra baser eller involverade i rRNA-protein-interaktioner. I microsporidier antar vissa rRNA-fragment en ogynnsam veckning, där den tidigare rRNA-helixen blir ett enkelsträngat fragment som förlängs nästan i en rak linje. Närvaron av dessa ovanliga regioner gör att microsporidia-rRNA kan binda till avlägsna rRNA-fragment med hjälp av ett minimalt antal RNA-baser.
Det mest slående exemplet på denna evolutionära övergång kan observeras i H18 25S rRNA-helixen (Fig. 3). Hos arter från E. coli till människor innehåller baserna i denna rRNA-helix 24–32 nukleotider, vilket bildar en något oregelbunden helix. I tidigare identifierade ribosomala strukturer från V. necatrix och P. locustae,31,32 är baserna i H18-helixen delvis avlindade, men nukleotidbasparningen bevaras. I E. cuniculi blir dock detta rRNA-fragment de kortaste länkarna 228UUUUGU232 och 301UUUUUUUUUU307. Till skillnad från typiska rRNA-fragment lindas inte dessa uridinrika länkar eller har omfattande kontakt med ribosomala proteiner. Istället antar de lösningsmedelsöppna och helt ovikta strukturer där rRNA-strängarna är nästan rakt utsträckta. Denna utsträckta konformation förklarar hur E. cuniculi endast använder 12 RNA-baser för att fylla 33 Å-gapet mellan H16- och H18-rRNA-helixarna, medan andra arter kräver minst dubbelt så många rRNA-baser för att fylla gapet.
Vi kan således visa att parasitiska mikrosporidier, genom energetiskt ogynnsam veckning, har utvecklat en strategi för att kontrahera även de rRNA-segment som förblir i stort sett konserverade över arter i livets tre domäner. Tydligen kan E. cuniculi, genom att ackumulera mutationer som omvandlar rRNA-helixar till korta poly-U-länkar, bilda ovanliga rRNA-fragment som innehåller så få nukleotider som möjligt för ligering av distala rRNA-fragment. Detta hjälper till att förklara hur mikrosporidier uppnådde en dramatisk minskning av sin grundläggande molekylstruktur utan att förlora sin strukturella och funktionella integritet.
En annan ovanlig egenskap hos E. cuniculi rRNA är att rRNA förekommer utan förtjockningar (Fig. 4). Utbuktningar är nukleotider utan baspar som vrids ut ur RNA-helixen istället för att gömma sig i den. De flesta rRNA-utbuktningar fungerar som molekylära lim, vilket hjälper till att binda intilliggande ribosomala proteiner eller andra rRNA-fragment. Några av utbuktningarna fungerar som gångjärn, vilket gör att rRNA-helixen kan böjas och vikas optimalt för produktiv proteinsyntes 41.
a En rRNA-utbuktning (S. cerevisiae-numrering) saknas i E. cuniculis ribosomstruktur, men finns i de flesta andra eukaryoter b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens och E. cuniculis interna ribosomer. Parasiter saknar många av de uråldriga, mycket konserverade rRNA-utbuktningarna. Dessa förtjockningar stabiliserar ribosomstrukturen; därför indikerar deras frånvaro i mikrosporidier en minskad stabilitet av rRNA-veckningen i mikrosporidieparasiter. Jämförelse med P-stammar (L7/L12-stammar i bakterier) visar att förlusten av rRNA-knölar ibland sammanfaller med uppkomsten av nya knölar bredvid de förlorade knölarna. H42-helixen i 23S/28S rRNA har en uråldrig utbuktning (U1206 i Saccharomyces cerevisiae) som uppskattas vara minst 3,5 miljarder år gammal på grund av dess skydd i tre livets domäner. I mikrosporidier är denna utbuktning eliminerad. Emellertid uppstod en ny utbuktning bredvid den förlorade utbuktningen (A1306 i E. cuniculi).
Slående nog fann vi att E. cuniculi-ribosomer saknar de flesta av de rRNA-utbuktningar som finns i andra arter, inklusive mer än 30 utbuktningar som konserverats i andra eukaryoter (Fig. 4a). Denna förlust eliminerar många kontakter mellan ribosomala subenheter och angränsande rRNA-helixar, vilket ibland skapar stora ihåliga hålrum i ribosomen, vilket gör E. cuniculi-ribosomen mer porös jämfört med mer traditionella ribosomer (Fig. 4b). Det är värt att notera att vi fann att de flesta av dessa utbuktningar också förlorades i de tidigare identifierade V. necatrix- och P. locustae-ribosomstrukturerna, vilka förbiseddes i tidigare strukturanalyser31,32.
Ibland åtföljs förlusten av rRNA-utbuktningar av utvecklingen av nya utbuktningar bredvid den förlorade utbuktningen. Till exempel innehåller den ribosomala P-stammen en U1208-utbuktning (hos Saccharomyces cerevisiae) som överlevde från E. coli till människor och uppskattas därför vara 3,5 miljarder år gammal. Under proteinsyntesen hjälper denna utbuktning P-stammen att röra sig mellan öppna och slutna konformationer så att ribosomen kan rekrytera translationsfaktorer och leverera dem till det aktiva sätet. I E. cuniculi-ribosomer saknas denna förtjockning; dock kan en ny förtjockning (G883) som endast finns i tre baspar bidra till att återställa P-stammens optimala flexibilitet (Fig. 4c).
Våra data om rRNA utan utbuktningar tyder på att rRNA-minimering inte är begränsad till förlusten av rRNA-element på ribosomens yta, utan också kan involvera ribosomkärnan, vilket skapar en parasitspecifik molekylär defekt som inte har beskrivits i fritt levande celler. Ingen levande arter observeras.
Efter modellering av kanoniska ribosomala proteiner och rRNA fann vi att konventionella ribosomala komponenter inte kan förklara de tre delarna av kryo-EM-bilden. Två av dessa fragment är små molekyler i storlek (Fig. 5, kompletterande Fig. 8). Det första segmentet är inklämt mellan ribosomproteinerna uL15 och eL18 i en position som vanligtvis upptas av C-terminalen av eL18, vilken är förkortad i E. cuniculi. Även om vi inte kan fastställa identiteten på denna molekyl, förklaras storleken och formen på denna densitetsö väl av närvaron av spermidinmolekyler. Dess bindning till ribosomen stabiliseras av mikrosporidiaspecifika mutationer i uL15-proteinerna (Asp51 och Arg56), vilka verkar öka ribosomens affinitet för denna lilla molekyl, eftersom de tillåter uL15 att linda in den lilla molekylen i en ribosomal struktur. Kompletterande Figur 2). 8, ytterligare data 1, 2).
Kryo-EM-avbildning som visar närvaron av nukleotider utanför ribosen bundna till E. cuniculi-ribosomen. I E. cuniculi-ribosomen upptar denna nukleotid samma plats som 25S rRNA A3186-nukleotiden (Saccharomyces cerevisiae-numrering) i de flesta andra eukaryota ribosomer. b I den ribosomala strukturen hos E. cuniculi är denna nukleotid belägen mellan ribosomproteinerna uL9 och eL20, vilket stabiliserar kontakten mellan de två proteinerna. cd eL20-sekvenskonserveringsanalys bland microsporidia-arter. Det fylogenetiska trädet för Microsporidia-arter (c) och multipel sekvensinriktning av eL20-proteinet (d) visar att nukleotidbindande rester F170 och K172 är konserverade i de flesta typiska Microsporidier, med undantag för S. lophii, med undantag för tidigt förgrenande Microsporidier, som behöll ES39L rRNA-förlängningen. e Denna figur visar att nukleotidbindande rester F170 och K172 endast finns i eL20 i det starkt reducerade microsporidie-genomet, men inte i andra eukaryoter. Sammantaget tyder dessa data på att Microsporidian-ribosomer har utvecklat ett nukleotidbindningsställe som verkar binda AMP-molekyler och använda dem för att stabilisera protein-protein-interaktioner i ribosomstrukturen. Den höga konserveringen av detta bindningsställe i Microsporidia och dess frånvaro i andra eukaryoter tyder på att detta ställe kan ge en selektiv överlevnadsfördel för Microsporidia. Således verkar nukleotidbindningsfickan i microsporidia-ribosomen inte vara en degenererad egenskap eller slutform av rRNA-nedbrytning som tidigare beskrivits, utan snarare en användbar evolutionär innovation som gör att microsporidia-ribosomen kan binda direkt till små molekyler och använda dem som molekylära byggstenar för ribosomer. Denna upptäckt gör microsporidia-ribosomen till den enda ribosomen som är känd för att använda en enda nukleotid som sitt strukturella byggstenar. f Hypotetisk evolutionär väg härledd från nukleotidbindning.
Den andra lågmolekylära densiteten är belägen vid gränssnittet mellan ribosomala proteinerna uL9 och eL30 (Fig. 5a). Detta gränssnitt beskrevs tidigare i strukturen av Saccharomyces cerevisiae-ribosomen som ett bindningsställe för 25S-nukleotiden i rRNA A3186 (del av ES39L rRNA-förlängningen)38. Det visades att i degenererade P. locustae ES39L-ribosomer binder detta gränssnitt en okänd enstaka nukleotid 31, och det antas att denna nukleotid är en reducerad slutlig form av rRNA, där längden på rRNA är ~130-230 baser. ES39L är reducerad till en enstaka nukleotid 32,43. Våra kryo-EM-bilder stöder idén att densiteten kan förklaras av nukleotider. Den högre upplösningen av vår struktur visade dock att denna nukleotid är en extraribosomal molekyl, möjligen AMP (Fig. 5a, b).
Vi frågade sedan om nukleotidbindningsstället fanns i E. cuniculi-ribosomen eller om det existerade tidigare. Eftersom nukleotidbindning huvudsakligen medieras av Phe170- och Lys172-resterna i det ribosomala proteinet eL30, utvärderade vi konserveringen av dessa rester i 4396 representativa eukaryoter. Liksom i fallet med uL15 ovan fann vi att Phe170- och Lys172-resterna är starkt konserverade endast i typiska Microsporidier, men frånvarande i andra eukaryoter, inklusive atypiska Microsporidier Mitosporidium och Amphiamblys, där ES39L rRNA-fragmentet inte är reducerat 44, 45, 46 (Fig. 5c). -e).
Sammantaget stöder dessa data idén att E. cuniculi och eventuellt andra kanoniska mikrosporidier har utvecklat förmågan att effektivt fånga ett stort antal små metaboliter i ribosomstrukturen för att kompensera för minskningen av rRNA- och proteinnivåer. Genom att göra detta har de utvecklat en unik förmåga att binda nukleotider utanför ribosomen, vilket visar att parasitiska molekylstrukturer kompenserar genom att fånga rikligt med små metaboliter och använda dem som strukturella efterliknare av nedbrutet RNA och proteinfragment.
Den tredje osimulerade delen av vår kryo-EM-karta, som finns i den stora ribosomala subenheten. Den relativt höga upplösningen (2,6 Å) på vår karta antyder att denna densitet tillhör proteiner med unika kombinationer av stora sidokedjerester, vilket gjorde det möjligt för oss att identifiera denna densitet som ett tidigare okänt ribosomalt protein som vi identifierade som msL2 (Microsporidia-specifikt protein L2) (metoder, figur 6). Vår homologisökning visade att msL2 är konserverat i Microsporidia-kladen av släktet Encephaliter och Orosporidium, men frånvarande i andra arter, inklusive andra Microsporidier. I den ribosomala strukturen upptar msL2 ett gap som bildas av förlusten av det utökade ES31L rRNA. I detta tomrum hjälper msL2 till att stabilisera rRNA-veckningen och kan kompensera för förlusten av ES31L (Figur 6).
a Elektrondensitet och modell av det Microsporidia-specifika ribosomala proteinet msL2 som finns i E. cuniculi-ribosomer. b De flesta eukaryota ribosomer, inklusive 80S-ribosomen hos Saccharomyces cerevisiae, har ES19L rRNA-amplifiering förlorad hos de flesta Microsporidian-arter. Den tidigare etablerade strukturen hos V. necatrix microsporidia-ribosomen antyder att förlusten av ES19L hos dessa parasiter kompenseras av utvecklingen av det nya msL1-ribosomala proteinet. I denna studie fann vi att E. cuniculi-ribosomen också utvecklade ett ytterligare ribosomalt RNA-härmande protein som en skenbar kompensation för förlusten av ES19L. Emellertid har msL2 (för närvarande annoterat som det hypotetiska ECU06_1135-proteinet) och msL1 olika strukturella och evolutionära ursprung. c Denna upptäckt av genereringen av evolutionärt orelaterade msL1- och msL2-ribosomala proteiner tyder på att om ribosomer ackumulerar skadliga mutationer i sitt rRNA, kan de uppnå oöverträffade nivåer av kompositionell mångfald även i en liten delmängd av närbesläktade arter. Denna upptäckt skulle kunna bidra till att klargöra ursprunget och utvecklingen av den mitokondriella ribosomen, som är känd för sitt starkt reducerade rRNA och onormala variation i proteinsammansättning mellan arter.
Vi jämförde sedan msL2-proteinet med det tidigare beskrivna msL1-proteinet, det enda kända microsporidia-specifika ribosomala proteinet som finns i V. necatrix-ribosomen. Vi ville testa om msL1 och msL2 är evolutionärt besläktade. Vår analys visade att msL1 och msL2 upptar samma hålighet i ribosomstrukturen, men har olika primära och tertiära strukturer, vilket indikerar deras oberoende evolutionära ursprung (Fig. 6). Vår upptäckt av msL2 ger således bevis för att grupper av kompakta eukaryota arter oberoende av varandra kan utveckla strukturellt distinkta ribosomala proteiner för att kompensera för förlusten av rRNA-fragment. Detta fynd är anmärkningsvärt eftersom de flesta cytoplasmatiska eukaryota ribosomer innehåller ett invariant protein, inklusive samma familj av 81 ribosomala proteiner. Förekomsten av msL1 och msL2 i olika klader av microsporidia som svar på förlusten av utökade rRNA-segment tyder på att nedbrytning av parasitens molekylära arkitektur får parasiter att söka kompensatoriska mutationer, vilket så småningom kan leda till att de förvärvas i olika parasitpopulationer.
Slutligen, när vår modell var färdigställd, jämförde vi sammansättningen av E. cuniculi-ribosomen med den som förutspåddes från genomsekvensen. Flera ribosomala proteiner, inklusive eL14, eL38, eL41 och eS30, ansågs tidigare saknas i E. cuniculi-genomet på grund av den uppenbara avsaknaden av deras homologer från E. cuniculi-genomet. Förlust av många ribosomala proteiner förutspås också i de flesta andra starkt reducerade intracellulära parasiter och endosymbioner. Till exempel, även om de flesta fritt levande bakterier innehåller samma familj av 54 ribosomala proteiner, har endast 11 av dessa proteinfamiljer detekterbara homologer i varje analyserat genom av värdbegränsade bakterier. Till stöd för denna uppfattning har en förlust av ribosomala proteiner observerats experimentellt i V. necatrix och P. locustae mikrosporidier, som saknar proteinerna eL38 och eL4131,32.
Våra strukturer visar dock att endast eL38, eL41 och eS30 faktiskt går förlorade i E. cuniculi-ribosomen. Proteinet eL14 bevarades och vår struktur visade varför detta protein inte kunde hittas i homologisökningen (Fig. 7). I E. cuniculi-ribosomer förloras det mesta av eL14-bindningsstället på grund av nedbrytning av det rRNA-amplifierade ES39L. I frånvaro av ES39L förlorade eL14 det mesta av sin sekundära struktur, och endast 18 % av eL14-sekvensen var identisk i E. cuniculi och S. cerevisiae. Denna dåliga sekvensbevaring är anmärkningsvärd eftersom även Saccharomyces cerevisiae och Homo sapiens – organismer som utvecklades med 1,5 miljarder år mellanrum – delar mer än 51 % av samma rester i eL14. Denna anomala förlust av konservering förklarar varför E. cuniculi eL14 för närvarande antecknas som det förmodade M970_061160-proteinet och inte som det ribosomala proteinet eL1427.
och Microsporidia-ribosomen förlorade ES39L rRNA-förlängningen, vilket delvis eliminerade bindningsstället för eL14 ribosomalt protein. I frånvaro av ES39L genomgår eL14-mikrosporproteinet en förlust av sekundärstruktur, där den tidigare rRNA-bindande α-helixen degenererar till en slinga med minimal längd. b Multipel sekvensinriktning visar att eL14-proteinet är starkt konserverat i eukaryota arter (57 % sekvensidentitet mellan jäst- och humana homologer), men dåligt konserverat och divergerande i mikrosporidier (där högst 24 % av resterna är identiska med eL14-homologen). från S. cerevisiae eller H. sapiens). Denna dåliga sekvenskonservering och sekundära strukturvariabilitet förklarar varför eL14-homologen aldrig har hittats i E. cuniculi och varför detta protein tros ha gått förlorat i E. cuniculi. Däremot annoterades E. cuniculi eL14 tidigare som ett förmodat M970_061160-protein. Denna observation tyder på att mikrosporidiers genomdiversitet för närvarande överskattas: vissa gener som för närvarande tros vara förlorade i mikrosporidier är i själva verket bevarade, om än i mycket differentierade former; istället tros vissa koda för mikrosporidiegener för maskspecifika proteiner (t.ex. det hypotetiska proteinet M970_061160) som faktiskt kodar för de mycket olika proteiner som finns i andra eukaryoter.
Detta fynd tyder på att denaturering av rRNA kan leda till en dramatisk förlust av sekvenskonservering i intilliggande ribosomala proteiner, vilket gör dessa proteiner odetekterbara för homologisökningar. Därför kan vi överskatta den faktiska graden av molekylär nedbrytning i små genomorganismer, eftersom vissa proteiner som tros vara förlorade faktiskt kvarstår, om än i mycket förändrade former.
Hur kan parasiter bibehålla funktionen hos sina molekylära maskiner under förhållanden med extrem genomreduktion? Vår studie besvarar denna fråga genom att beskriva den komplexa molekylära strukturen (ribosomen) hos E. cuniculi, en organism med ett av de minsta eukaryota genomen.
Det har varit känt i nästan två decennier att protein- och RNA-molekyler i mikrobiella parasiter ofta skiljer sig från sina homologa molekyler hos frittlevande arter eftersom de saknar kvalitetskontrollcenter, är reducerade till 50 % av sin storlek hos frittlevande mikrober, etc. många försvagande mutationer som försämrar veckning och funktion. Till exempel förväntas ribosomerna hos små genomorganismer, inklusive många intracellulära parasiter och endosymbioner, sakna flera ribosomala proteiner och upp till en tredjedel av rRNA-nukleotiderna jämfört med frittlevande arter 27, 29, 30, 49. Hur dessa molekyler fungerar i parasiter är dock fortfarande till stor del ett mysterium, som huvudsakligen studeras genom jämförande genomik.
Vår studie visar att makromolekylers struktur kan avslöja många aspekter av evolutionen som är svåra att utvinna från traditionella jämförande genomiska studier av intracellulära parasiter och andra värdbegränsade organismer (kompletterande figur 7). Till exempel visar exemplet med eL14-proteinet att vi kan överskatta den faktiska graden av nedbrytning av den molekylära apparaten hos parasitära arter. Encefalitiska parasiter tros nu ha hundratals mikrosporidiaspecifika gener. Våra resultat visar dock att några av dessa till synes specifika gener i själva verket bara är väldigt olika varianter av gener som är vanliga hos andra eukaryoter. Dessutom visar exemplet med msL2-proteinet hur vi förbiser nya ribosomala proteiner och underskattar innehållet av parasitiska molekylära maskiner. Exemplet med små molekyler visar hur vi kan förbise de mest geniala innovationerna inom parasitiska molekylära strukturer som kan ge dem ny biologisk aktivitet.
Sammantaget förbättrar dessa resultat vår förståelse av skillnaderna mellan de molekylära strukturerna hos värdbegränsade organismer och deras motsvarigheter hos fritt levande organismer. Vi visar att molekylära maskiner, som länge ansetts vara reducerade, degenererade och utsatta för olika försvagande mutationer, istället har en uppsättning systematiskt förbisedda ovanliga strukturella egenskaper.
Å andra sidan tyder de icke-skrymmande rRNA-fragmenten och de sammansmälta fragmenten som vi hittade i ribosomerna hos E. cuniculi på att genomreduktion kan förändra även de delar av det grundläggande molekylära maskineriet som bevaras i livets tre domäner – efter nästan 3,5 miljarder år av oberoende evolution av arter.
De utbuktningsfria och sammansmälta rRNA-fragmenten i E. cuniculi-ribosomer är av särskilt intresse mot bakgrund av tidigare studier av RNA-molekyler i endosymbiotiska bakterier. Till exempel, i bladlössens endosymbiont Buchnera aphidicola, har rRNA- och tRNA-molekyler visat sig ha temperaturkänsliga strukturer på grund av A+T-kompositionsbias och en hög andel icke-kanoniska baspar20,50. Dessa förändringar i RNA, liksom förändringar i proteinmolekyler, tros nu vara ansvariga för endosymbionternas överberoende av partners och endosymbionternas oförmåga att överföra värme21, 23. Även om parasitiskt mikrosporidia-rRNA har strukturellt distinkta förändringar, tyder arten av dessa förändringar på att minskad termisk stabilitet och högre beroende av chaperonproteiner kan vara vanliga egenskaper hos RNA-molekyler i organismer med reducerade genom.
Å andra sidan visar våra strukturer att parasitmikrosporidier har utvecklat en unik förmåga att motstå brett konserverade rRNA- och proteinfragment, och utvecklat förmågan att använda rikligt förekommande och lättillgängliga små metaboliter som strukturella härmare av degenererade rRNA- och proteinfragment. Nedbrytning av molekylstruktur. Denna åsikt stöds av det faktum att små molekyler som kompenserar för förlusten av proteinfragment i rRNA och ribosomer hos E. cuniculi binder till mikrosporidiaspecifika rester i uL15- och eL30-proteinerna. Detta tyder på att bindning av små molekyler till ribosomer kan vara en produkt av positiv selektion, där mikrosporidiaspecifika mutationer i ribosomala proteiner har selekterats för sin förmåga att öka ribosomers affinitet för små molekyler, vilket kan leda till mer effektiva ribosomala organismer. Upptäckten avslöjar en smart innovation i den molekylära strukturen hos mikrobiella parasiter och ger oss en bättre förståelse för hur parasitmolekylära strukturer bibehåller sin funktion trots reduktiv evolution.
För närvarande är identifieringen av dessa små molekyler oklar. Det är inte klart varför dessa små molekylers utseende i ribosomstrukturen skiljer sig mellan olika mikrosporidiaarter. I synnerhet är det inte klart varför nukleotidbindning observeras i ribosomerna hos E. cuniculi och P. locustae, och inte i ribosomerna hos V. necatrix, trots närvaron av F170-resten i eL20- och K172-proteinerna hos V. necatrix. Denna deletion kan orsakas av rest 43 uL6 (belägen intill nukleotidbindningsfickan), vilket är tyrosin i V. necatrix och inte treonin i E. cuniculi och P. locustae. Den skrymmande aromatiska sidokedjan hos Tyr43 kan störa nukleotidbindningen på grund av sterisk överlappning. Alternativt kan den skenbara nukleotiddeletionen bero på den låga upplösningen vid kryo-EM-avbildning, vilket hindrar modelleringen av V. necatrix ribosomfragment.
Å andra sidan tyder vårt arbete på att processen med genomsönderfall kan vara en uppfinningsrik kraft. I synnerhet tyder strukturen hos E. cuniculi-ribosomen på att förlusten av rRNA och proteinfragment i microsporidia-ribosomen skapar evolutionärt tryck som främjar förändringar i ribosomstrukturen. Dessa varianter förekommer långt ifrån ribosomens aktiva plats och verkar bidra till att upprätthålla (eller återställa) optimal ribosomsammansättning som annars skulle störas av reducerat rRNA. Detta tyder på att en viktig innovation hos microsporidia-ribosomen verkar ha utvecklats till ett behov av att buffra gendrift.
Detta illustreras kanske bäst av nukleotidbindning, vilket aldrig tidigare observerats i andra organismer. Det faktum att nukleotidbindande rester finns i typiska mikrosporidier, men inte i andra eukaryoter, tyder på att nukleotidbindningsställen inte bara är reliker som väntar på att försvinna, eller den slutliga platsen för rRNA att återställas till formen av individuella nukleotider. Istället verkar denna plats vara en användbar egenskap som kunde ha utvecklats under flera omgångar av positiv selektion. Nukleotidbindningsställen kan vara en biprodukt av naturligt urval: när ES39L har brytts ner tvingas mikrosporidier att söka kompensation för att återställa optimal ribosombiogenes i frånvaro av ES39L. Eftersom denna nukleotid kan härma de molekylära kontakterna för A3186-nukleotiden i ES39L, blir nukleotidmolekylen en byggsten i ribosomen, vars bindning ytterligare förbättras genom mutation av eL30-sekvensen.
När det gäller den molekylära evolutionen av intracellulära parasiter visar vår studie att krafterna i det darwinistiska naturliga urvalet och den genetiska driften i genomförfallet inte verkar parallellt, utan oscillerar. För det första eliminerar genetisk drift viktiga egenskaper hos biomolekyler, vilket gör kompensation mycket nödvändig. Först när parasiter tillfredsställer detta behov genom darwinistiskt naturligt urval kommer deras makromolekyler att ha en chans att utveckla sina mest imponerande och innovativa egenskaper. Viktigt är att evolutionen av nukleotidbindningsställen i E. cuniculi-ribosomen antyder att detta förlust-för-vinst-mönster av molekylär evolution inte bara amorterar skadliga mutationer, utan ibland ger helt nya funktioner till parasitiska makromolekyler.
Denna idé överensstämmer med Sewell Wrights teori om rörlig jämvikt, som säger att ett strikt system av naturligt urval begränsar organismers förmåga att förnya sig51,52,53. Men om genetisk drift stör det naturliga urvalet kan dessa driftar producera förändringar som i sig inte är anpassningsbara (eller ens skadliga) utan leder till ytterligare förändringar som ger högre kondition eller ny biologisk aktivitet. Vårt ramverk stöder denna idé genom att illustrera att samma typ av mutation som minskar en biomolekyls veckning och funktion verkar vara den främsta utlösaren för dess förbättring. I linje med den win-win-baserade evolutionära modellen visar vår studie att genomförfall, traditionellt sett som en degenerativ process, också är en viktig drivkraft för innovation, vilket ibland och kanske till och med ofta gör det möjligt för makromolekyler att förvärva nya parasitiska aktiviteter. kan använda dem.