Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS. Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili da onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Evolucija mikrobnih parazita uključuje suprotstavljanje između prirodne selekcije, koja uzrokuje poboljšanje parazita, i genetskog drifta, koji uzrokuje gubitak gena kod parazita i akumuliranje štetnih mutacija. Ovdje, kako bismo razumjeli kako se ovo suprotstavljanje događa na skali jedne makromolekule, opisujemo krio-EM strukturu ribosoma Encephalitozoon cuniculi, eukariotskog organizma s jednim od najmanjih genoma u prirodi. Ekstremno smanjenje rRNA u ribosomima E. cuniculi praćeno je neviđenim strukturnim promjenama, poput evolucije prethodno nepoznatih spojenih rRNA linkera i rRNA bez izbočina. Osim toga, ribosom E. cuniculi preživio je gubitak rRNA fragmenata i proteina razvijajući sposobnost korištenja malih molekula kao strukturnih imitatora degradiranih rRNA fragmenata i proteina. Sveukupno, pokazujemo da molekularne strukture za koje se dugo mislilo da su reducirane, degenerirane i podložne iscrpljujućim mutacijama imaju niz kompenzacijskih mehanizama koji ih održavaju aktivnima uprkos ekstremnim molekularnim kontrakcijama.
Budući da većina grupa mikrobnih parazita ima jedinstvene molekularne alate za iskorištavanje svojih domaćina, često moramo razviti različite terapije za različite grupe parazita1,2. Međutim, novi dokazi ukazuju na to da su neki aspekti evolucije parazita konvergentni i uglavnom predvidljivi, što ukazuje na potencijalnu osnovu za široke terapijske intervencije kod mikrobnih parazita3,4,5,6,7,8,9.
Prethodni rad je identificirao zajednički evolucijski trend kod mikrobnih parazita koji se naziva redukcija genoma ili propadanje genoma10,11,12,13. Trenutna istraživanja pokazuju da kada mikroorganizmi odustanu od svog slobodnog načina života i postanu intracelularni paraziti (ili endosimbionti), njihovi genomi prolaze kroz spore, ali nevjerovatne metamorfoze tokom miliona godina9,11. U procesu poznatom kao propadanje genoma, mikrobni paraziti akumuliraju štetne mutacije koje mnoge prethodno važne gene pretvaraju u pseudogene, što dovodi do postepenog gubitka gena i mutacijskog kolapsa14,15. Ovaj kolaps može uništiti do 95% gena u najstarijim intracelularnim organizmima u poređenju sa blisko srodnim slobodnoživućim vrstama. Dakle, evolucija intracelularnih parazita je natezanje konopa između dvije suprotstavljene sile: darvinističke prirodne selekcije, koja dovodi do poboljšanja parazita, i kolapsa genoma, koji baca parazite u zaborav. Kako je parazit uspio izaći iz ovog natezanja konopa i zadržati aktivnost svoje molekularne strukture, ostaje nejasno.
Iako mehanizam propadanja genoma nije u potpunosti shvaćen, čini se da se javlja uglavnom zbog čestog genetičkog drifta. Budući da paraziti žive u malim, aseksualnim i genetski ograničenim populacijama, oni ne mogu efikasno eliminirati štetne mutacije koje se ponekad javljaju tokom replikacije DNK. To dovodi do nepovratnog nakupljanja štetnih mutacija i smanjenja genoma parazita. Kao rezultat toga, parazit ne samo da gubi gene koji više nisu neophodni za njegov opstanak u unutarćelijskom okruženju. Nemogućnost populacija parazita da efikasno eliminišu sporadične štetne mutacije uzrokuje akumulaciju ovih mutacija u cijelom genomu, uključujući i njihove najvažnije gene.
Veliki dio našeg trenutnog razumijevanja redukcije genoma zasniva se isključivo na poređenjima genomskih sekvenci, s manje pažnje posvećene promjenama u stvarnim molekulima koji obavljaju funkcije održavanja i služe kao potencijalne mete lijekova. Komparativne studije su pokazale da teret štetnih intracelularnih mikrobnih mutacija izgleda predisponira proteine ​​i nukleinske kiseline da se pogrešno savijaju i agregiraju, čineći ih ovisnijima o šaperonima i preosjetljivijima na toplinu19,20,21,22,23. Osim toga, razni paraziti - nezavisna evolucija ponekad razdvojena čak 2,5 milijarde godina - doživjeli su sličan gubitak centara za kontrolu kvalitete u svojoj sintezi proteina5,6 i mehanizmima popravka DNK24. Međutim, malo se zna o utjecaju intracelularnog načina života na sva ostala svojstva ćelijskih makromolekula, uključujući molekularnu adaptaciju na rastući teret štetnih mutacija.
U ovom radu, kako bismo bolje razumjeli evoluciju proteina i nukleinskih kiselina intracelularnih mikroorganizama, odredili smo strukturu ribosoma intracelularnog parazita Encephalitozoon cuniculi. E. cuniculi je organizam sličan gljivici koji pripada grupi parazitskih mikrosporidija koje imaju neobično male eukariotske genome i stoga se koriste kao modelni organizmi za proučavanje raspadanja genoma25,26,27,28,29,30. Nedavno je određena krio-EM struktura ribosoma za umjereno reducirane genome Microsporidia, Paranosema locustae i Vairimorpha necatrix31,32 (genom od ~3,2 Mb). Ove strukture sugeriraju da se određeni gubitak amplifikacije rRNA kompenzira razvojem novih kontakata između susjednih ribosomskih proteina ili sticanjem novih ribosomskih proteina msL131,32. Vrsta Encephalitozoon (genom ~2,5 miliona bp), zajedno sa svojim najbližim srodnikom Ordospora, pokazuje krajnji stepen redukcije genoma kod eukariota – imaju manje od 2000 gena koji kodiraju proteine, a očekuje se da njihovi ribosomi nisu samo lišeni fragmenata rRNA ekspanzije (fragmenti rRNA koji razlikuju eukariotske ribosome od bakterijskih ribosoma), već imaju i četiri ribosomska proteina zbog nedostatka homologa u genomu E. cuniculi26,27,28. Stoga smo zaključili da ribosom E. cuniculi može otkriti prethodno nepoznate strategije za molekularnu adaptaciju na propadanje genoma.
Naša krio-EM struktura predstavlja najmanji eukariotski citoplazmatski ribosom koji je do sada okarakteriziran i pruža uvid u to kako krajnji stepen redukcije genoma utiče na strukturu, sastavljanje i evoluciju molekularnog sistema koji je sastavni dio ćelije. Otkrili smo da ribosom E. cuniculi krši mnoge od široko očuvanih principa savijanja RNK i sastavljanja ribosoma, te otkrili novi, ranije nepoznati ribosomski protein. Sasvim neočekivano, pokazujemo da su ribosomi mikrosporidija evoluirali sposobnost vezivanja malih molekula i pretpostavljamo da skraćivanja u rRNA i proteinima pokreću evolucijske inovacije koje bi u konačnici mogle dati korisne kvalitete ribosomu.
Kako bismo poboljšali naše razumijevanje evolucije proteina i nukleinskih kiselina u unutarćelijskim organizmima, odlučili smo izolirati spore E. cuniculi iz kultura zaraženih ćelija sisara kako bismo pročistili njihove ribosome i odredili strukturu tih ribosoma. Teško je dobiti veliki broj parazitskih mikrosporidija jer se mikrosporidija ne može kultivirati u hranjivoj podlozi. Umjesto toga, one rastu i razmnožavaju se samo unutar ćelije domaćina. Stoga smo, da bismo dobili biomasu E. cuniculi za pročišćavanje ribosoma, inficirali ćelijsku liniju bubrega sisara RK13 sporama E. cuniculi i kultivirali ove zaražene ćelije nekoliko sedmica kako bismo omogućili E. cuniculi da raste i razmnožava se. Koristeći monosloj zaraženih ćelija od oko pola kvadratnog metra, uspjeli smo pročistiti oko 300 mg spora mikrosporidija i koristiti ih za izolaciju ribosoma. Zatim smo pročišćene spore razbili staklenim kuglicama i izolirali sirove ribosome koristeći postepeno frakcioniranje lizata polietilen glikolom. To nam je omogućilo da dobijemo približno 300 µg sirovih ribosoma E. cuniculi za strukturnu analizu.
Zatim smo prikupili krio-EM slike koristeći dobijene uzorke ribosoma i obradili ove slike koristeći maske koje odgovaraju velikoj ribosomskoj podjedinici, glavi male podjedinice i maloj podjedinici. Tokom ovog procesa, prikupili smo slike oko 108.000 ribosomskih čestica i izračunali krio-EM slike s rezolucijom od 2,7 Å (Dopunske slike 1-3). Zatim smo koristili krio-EM slike za modeliranje rRNA, ribosomskog proteina i faktora hibernacije Mdf1 povezanog s ribosomima E. cuniculi (Slika 1a, b).
a Struktura ribosoma E. cuniculi u kompleksu sa faktorom hibernacije Mdf1 (pdb id 7QEP). b Mapa faktora hibernacije Mdf1 povezanog sa ribosomom E. cuniculi. c Mapa sekundarne strukture koja poredi obnovljenu rRNA kod mikrosporidijanskih vrsta sa poznatim ribosomskim strukturama. Paneli prikazuju lokaciju amplifikovanih fragmenata rRNA (ES) i aktivnih mjesta ribosoma, uključujući mjesto dekodiranja (DC), sarcinicinsku petlju (SRL) i peptidil transferazni centar (PTC). d Gustina elektrona koja odgovara centru peptidil transferaze ribosoma E. cuniculi sugeriše da ovo katalitičko mjesto ima istu strukturu kod parazita E. cuniculi i njegovih domaćina, uključujući H. sapiens. e, f Odgovarajuća gustina elektrona centra za dekodiranje (e) i shematska struktura centra za dekodiranje (f) ukazuju na to da E. cuniculi ima ostatke U1491 umjesto A1491 (numeracija E. coli) kod mnogih drugih eukariota. Ova promjena ukazuje na to da bi E. cuniculi mogla biti osjetljiva na antibiotike koji ciljaju ovo aktivno mjesto.
Za razliku od prethodno utvrđenih struktura ribosoma V. necatrix i P. locustae (obje strukture predstavljaju istu porodicu mikrosporidija Nosematidae i vrlo su slične jedna drugoj), 31,32 ribosomi E. cuniculi prolaze kroz brojne procese fragmentacije rRNA i proteina. Daljnja denaturacija (Dopunske slike 4-6). Kod rRNA, najupečatljivije promjene uključivale su potpuni gubitak amplificiranog 25S rRNA fragmenta ES12L i djelomičnu degeneraciju heliksa h39, h41 i H18 (Slika 1c, Dopunska slika 4). Među ribosomskim proteinima, najupečatljivije promjene uključivale su potpuni gubitak proteina eS30 i skraćivanje proteina eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 i ​​eS7 (Dopunske slike 4, 5).
Dakle, ekstremno smanjenje genoma vrsta Encephalotozoon/Ordospora ogleda se u njihovoj strukturi ribosoma: ribosomi E. cuniculi doživljavaju najdramatičniji gubitak sadržaja proteina u eukariotskim citoplazmatskim ribosomima koji su podložni strukturnoj karakterizaciji, a nemaju čak ni one rRNA i proteinske fragmente koji su široko očuvani ne samo kod eukariota, već i u tri domene života. Struktura ribosoma E. cuniculi pruža prvi molekularni model za ove promjene i otkriva evolucijske događaje koji su previđeni i komparativnom genomikom i studijama intracelularne biomolekularne strukture (Dopunska slika 7). U nastavku opisujemo svaki od ovih događaja zajedno s njihovim vjerovatnim evolucijskim porijeklom i njihovim potencijalnim utjecajem na funkciju ribosoma.
Zatim smo otkrili da, pored velikih skraćenja rRNA, ribosomi E. cuniculi imaju varijacije rRNA na jednom od svojih aktivnih mjesta. Iako peptidil transferazni centar ribosoma E. cuniculi ima istu strukturu kao i drugi eukariotski ribosomi (slika 1d), centar za dekodiranje se razlikuje zbog varijacije sekvence na nukleotidu 1491 (numeracija E. coli, slika 1e, f). Ovo zapažanje je važno jer mjesto dekodiranja eukariotskih ribosoma obično sadrži ostatke G1408 i A1491 u poređenju sa ostacima bakterijskog tipa A1408 i G1491. Ova varijacija je osnova različite osjetljivosti bakterijskih i eukariotskih ribosoma na porodicu aminoglikozida ribosomskih antibiotika i drugih malih molekula koje ciljaju mjesto dekodiranja. Na mjestu dekodiranja ribosoma E. cuniculi, ostatak A1491 je zamijenjen sa U1491, potencijalno stvarajući jedinstveno vezivno sučelje za male molekule koje ciljaju ovo aktivno mjesto. Ista varijanta A14901 prisutna je i u drugim mikrosporidijama kao što su P. locustae i V. necatrix, što ukazuje na to da je široko rasprostranjena među vrstama mikrosporidija (Slika 1f).
Budući da su naši uzorci ribosoma E. cuniculi izolirani iz metabolički neaktivnih spora, testirali smo krio-EM mapu E. cuniculi na prethodno opisano vezivanje ribosoma pod stresom ili uvjetima gladovanja. Faktori hibernacije 31, 32, 36, 37, 38. Uporedili smo prethodno utvrđenu strukturu hibernirajućeg ribosoma s krio-EM mapom ribosoma E. cuniculi. Za spajanje su korišteni ribosomi S. cerevisiae u kompleksu s faktorom hibernacije Stm138, ribosomi skakavaca u kompleksu s faktorom Lso232 i ribosomi V. necatrix u kompleksu s faktorima Mdf1 i Mdf231. Istovremeno, pronašli smo krio-EM gustoću koja odgovara faktoru odmora Mdf1. Slično vezivanju Mdf1 za ribosom V. necatrix, Mdf1 se također veže za ribosom E. cuniculi, gdje blokira E mjesto ribosoma, što moguće pomaže da ribosomi postanu dostupni kada spore parazita postanu metabolički neaktivne nakon inaktivacije tijela (Slika 2).
Mdf1 blokira E mjesto ribosoma, što izgleda pomaže u inaktivaciji ribosoma kada spore parazita postanu metabolički neaktivne. U strukturi ribosoma E. cuniculi otkrili smo da Mdf1 formira ranije nepoznati kontakt sa stablom ribosoma L1, dijelom ribosoma koji olakšava oslobađanje deacilirane tRNA iz ribosoma tokom sinteze proteina. Ovi kontakti sugeriraju da se Mdf1 disocira od ribosoma koristeći isti mehanizam kao i deacetilirana tRNA, što pruža moguće objašnjenje kako ribosom uklanja Mdf1 da bi reaktivirao sintezu proteina.
Međutim, naša struktura je otkrila nepoznati kontakt između Mdf1 i L1 ribosomske noge (dijela ribosoma koji pomaže u oslobađanju deacilirane tRNA iz ribosoma tokom sinteze proteina). Konkretno, Mdf1 koristi iste kontakte kao i lakatni segment deacilirane molekule tRNA (Slika 2). Ovo prethodno nepoznato molekularno modeliranje pokazalo je da se Mdf1 disocira od ribosoma koristeći isti mehanizam kao i deacetilirana tRNA, što objašnjava kako ribosom uklanja ovaj faktor hibernacije kako bi reaktivirao sintezu proteina.
Prilikom konstruisanja rRNA modela, otkrili smo da ribosom E. cuniculi ima abnormalno savijene rRNA fragmente, koje smo nazvali spojena rRNA (Sl. 3). U ribosomima koji obuhvataju tri domene života, rRNA se savija u strukture u kojima većina rRNA baza ili se uparuje i savija jedna s drugom ili interaguje sa ribosomskim proteinima38,39,40. Međutim, u ribosomima E. cuniculi, čini se da rRNA krše ovaj princip savijanja pretvarajući neke od svojih heliksa u nesavijene rRNA regije.
Struktura H18 25S rRNA heliksa kod S. cerevisiae, V. necatrix i E. cuniculi. Tipično, u ribosomima koji obuhvataju tri životna domena, ovaj linker se uvija u RNK heliks koji sadrži 24 do 34 ostatka. Kod mikrosporidija, nasuprot tome, ovaj rRNA linker se postepeno redukuje na dva jednolančana linkera bogata uridinom koji sadrže samo 12 ostataka. Većina ovih ostataka je izložena rastvaračima. Slika pokazuje da parazitske mikrosporidiije izgleda krše opšte principe savijanja rRNA, gdje su rRNA baze obično povezane sa drugim bazama ili uključene u interakcije rRNA-protein. Kod mikrosporidija, neki rRNA fragmenti preuzimaju nepovoljan pregib, u kojem bivši rRNA heliks postaje jednolančani fragment izdužen gotovo u pravoj liniji. Prisustvo ovih neobičnih regija omogućava rRNA mikrosporidija da se veže za udaljene rRNA fragmente koristeći minimalan broj RNK baza.
Najupečatljiviji primjer ove evolucijske tranzicije može se primijetiti u H18 25S rRNA heliksu (Sl. 3). Kod vrsta od E. coli do ljudi, baze ovog rRNA heliksa sadrže 24-32 nukleotida, formirajući blago nepravilnu spiralu. U prethodno identificiranim ribosomskim strukturama iz V. necatrix i P. locustae,31,32 baze H18 heliksa su djelomično odmotane, ali je sparivanje nukleotidnih baza očuvano. Međutim, kod E. cuniculi ovaj rRNA fragment postaje najkraći linkeri 228UUUGU232 i 301UUUUUUUUUU307. Za razliku od tipičnih rRNA fragmenata, ovi linkeri bogati uridinom se ne uvijaju niti ostvaruju opsežan kontakt s ribosomskim proteinima. Umjesto toga, oni usvajaju otvorene za rastvarač i potpuno odmotane strukture u kojima su lanci rRNA produženi gotovo ravno. Ova rastegnuta konformacija objašnjava kako E. cuniculi koristi samo 12 RNK baza da popuni prazninu od 33 Å između H16 i H18 rRNA heliksa, dok drugim vrstama treba najmanje dvostruko više rRNA baza da popune prazninu.
Dakle, možemo pokazati da su, putem energetski nepovoljnog savijanja, parazitske mikrosporidije razvile strategiju za kontrakciju čak i onih segmenata rRNA koji ostaju široko očuvani među vrstama u tri domena života. Očigledno, akumuliranjem mutacija koje transformišu helikse rRNA u kratke poli-U linkere, E. cuniculi može formirati neobične fragmente rRNA koji sadrže što je moguće manje nukleotida za ligaciju distalnih fragmenata rRNA. Ovo pomaže u objašnjavanju kako su mikrosporidije postigle dramatično smanjenje svoje osnovne molekularne strukture bez gubitka strukturnog i funkcionalnog integriteta.
Još jedna neobična karakteristika rRNA E. cuniculi je pojava rRNA bez zadebljanja (Sl. 4). Izbočine su nukleotidi bez baznih parova koji se uvijaju iz RNK spirale umjesto da se skrivaju u njoj. Većina izbočina rRNA djeluje kao molekularni adhezivi, pomažući u vezivanju susjednih ribosomskih proteina ili drugih fragmenata rRNA. Neke od izbočina djeluju kao šarke, omogućavajući rRNA spirali da se optimalno savija i savija za produktivnu sintezu proteina 41.
a Izbočina rRNA (numeracija S. cerevisiae) je odsutna iz strukture ribosoma E. cuniculi, ali je prisutna u većini drugih eukariota b Unutrašnji ribosomi E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens i E. cuniculi. Paraziti nemaju mnoga od drevnih, visoko konzerviranih izbočina rRNA. Ova zadebljanja stabilizuju strukturu ribosoma; stoga, njihovo odsustvo u mikrosporidijama ukazuje na smanjenu stabilnost savijanja rRNA kod parazita mikrosporidija. Poređenje sa P stabljikama (stabljike L7/L12 kod bakterija) pokazuje da gubitak izbočina rRNA ponekad odgovara pojavi novih izbočina pored izgubljenih. H42 spirala u 23S/28S rRNA ima drevnu izbočinu (U1206 kod Saccharomyces cerevisiae) za koju se procjenjuje da je stara najmanje 3,5 milijarde godina zbog svoje zaštite u tri domena života. Kod mikrosporidija, ova izbočina je eliminisana. Međutim, nova izbočina se pojavila pored izgubljene izbočine (A1306 kod E. cuniculi).
Iznenađujuće je da smo otkrili da ribosomima E. cuniculi nedostaje većina rRNA ispupčenja koja se nalaze kod drugih vrsta, uključujući više od 30 ispupčenja sačuvanih kod drugih eukariota (Slika 4a). Ovaj gubitak eliminira mnoge kontakte između ribosomskih podjedinica i susjednih rRNA heliksa, ponekad stvarajući velike šupljine unutar ribosoma, čineći ribosom E. cuniculi poroznijim u poređenju s tradicionalnijim ribosomima (Slika 4b). Značajno je da smo otkrili da je većina ovih ispupčenja također izgubljena u prethodno identificiranim strukturama ribosoma V. necatrix i P. locustae, što je previdjelo prethodne strukturne analize31,32.
Ponekad gubitak izbočina rRNA prati razvoj novih izbočina pored izgubljene izbočine. Na primjer, ribosomska P-stabljika sadrži izbočinu U1208 (kod Saccharomyces cerevisiae) koja je preživjela od E. coli do ljudi i stoga se procjenjuje da je stara 3,5 milijarde godina. Tokom sinteze proteina, ova izbočina pomaže P stabljici da se kreće između otvorene i zatvorene konformacije tako da ribosom može regrutovati faktore translacije i dostaviti ih na aktivno mjesto. Kod ribosoma E. cuniculi, ovo zadebljanje je odsutno; međutim, novo zadebljanje (G883) koje se nalazi samo u tri bazna para može doprinijeti obnavljanju optimalne fleksibilnosti P stabljike (Slika 4c).
Naši podaci o rRNA bez izbočina sugeriraju da minimizacija rRNA nije ograničena samo na gubitak rRNA elemenata na površini ribosoma, već može uključivati ​​i jezgro ribosoma, stvarajući molekularni defekt specifičan za parazita koji nije opisan u slobodnoživućim ćelijama. Opažaju se žive vrste.
Nakon modeliranja kanonskih ribosomskih proteina i rRNA, otkrili smo da konvencionalne ribosomske komponente ne mogu objasniti tri dijela krio-EM slike. Dva od ovih fragmenata su molekule male veličine (Sl. 5, Dopunska slika 8). Prvi segment je smješten između ribosomskih proteina uL15 i eL18 na poziciji koju obično zauzima C-terminus eL18, koji je skraćen kod E. cuniculi. Iako ne možemo utvrditi identitet ovog molekula, veličina i oblik ovog ostrva gustine dobro se objašnjavaju prisustvom molekula spermidina. Njegovo vezivanje za ribosom stabilizovano je mutacijama specifičnim za mikrosporidiju u proteinima uL15 (Asp51 i Arg56), koje izgleda povećavaju afinitet ribosoma za ovaj mali molekul, jer omogućavaju uL15 da umota mali molekul u ribosomsku strukturu. Dopunska slika 2). 8, dodatni podaci 1, 2).
Krio-EM snimanje koje prikazuje prisustvo nukleotida izvan riboze vezane za ribosom E. cuniculi. U ribosomu E. cuniculi, ovaj nukleotid zauzima isto mjesto kao i nukleotid 25S rRNA A3186 (numeracija Saccharomyces cerevisiae) u većini drugih eukariotskih ribosoma. b U ribosomskoj strukturi E. cuniculi, ovaj nukleotid se nalazi između ribosomskih proteina uL9 i eL20, čime se stabilizuje kontakt između dva proteina. cd Analiza očuvanosti sekvence eL20 među vrstama mikrosporidija. Filogenetsko stablo vrsta mikrosporidija (c) i višestruko poravnanje sekvenci proteina eL20 (d) pokazuju da su ostaci F170 i K172 koji vežu nukleotide očuvani u većini tipičnih mikrosporidija, s izuzetkom S. lophii, s izuzetkom mikrosporidija s ranim grananjem, koje su zadržale ekstenziju ES39L rRNA. e Ova slika pokazuje da su ostaci F170 i K172 koji vežu nukleotide prisutni samo u eL20 visoko reduciranog genoma mikrosporidija, ali ne i kod drugih eukariota. Sveukupno, ovi podaci sugeriraju da su ribosomi mikrosporidija razvili mjesto vezivanja nukleotida koje, izgleda, veže molekule AMP-a i koristi ih za stabilizaciju interakcija protein-protein u strukturi ribosoma. Visoka konzervacija ovog mjesta vezivanja kod mikrosporidija i njegovo odsustvo kod drugih eukariota sugerira da ovo mjesto može pružiti selektivnu prednost u preživljavanju za mikrosporidi. Dakle, džep za vezivanje nukleotida u ribosomu mikrosporidija ne čini se degeneriranom karakteristikom ili krajnjim oblikom degradacije rRNA kao što je prethodno opisano, već korisnom evolucijskom inovacijom koja omogućava ribosomu mikrosporidija da direktno veže male molekule, koristeći ih kao molekularne gradivne blokove za ribosome. Ovo otkriće čini ribosom mikrosporidija jedinim ribosomom za koji se zna da koristi jedan nukleotid kao svoj strukturni gradivni blok. f Hipotetički evolucijski put izveden iz vezivanja nukleotida.
Druga gustoća niske molekularne težine nalazi se na granici između ribosomskih proteina uL9 i eL30 (Slika 5a). Ova granica je prethodno opisana u strukturi ribosoma Saccharomyces cerevisiae kao mjesto vezivanja za 25S nukleotid rRNA A3186 (dio ES39L rRNA ekstenzije)38. Pokazano je da se u degeneriranim ribosomima P. locustae ES39L, ova granica veže za nepoznati pojedinačni nukleotid 31, i pretpostavlja se da je ovaj nukleotid reducirani konačni oblik rRNA, u kojem je dužina rRNA ~130-230 baza. ES39L je reduciran na jedan nukleotid 32.43. Naše krio-EM slike podržavaju ideju da se gustoća može objasniti nukleotidima. Međutim, veća rezolucija naše strukture pokazala je da je ovaj nukleotid ekstraribosomska molekula, moguće AMP (Slika 5a, b).
Zatim smo se pitali da li se mjesto vezivanja nukleotida pojavljuje na ribosomu E. cuniculi ili je postojalo ranije. Budući da je vezivanje nukleotida uglavnom posredovano ostacima Phe170 i Lys172 u ribosomskom proteinu eL30, procijenili smo očuvanost ovih ostataka u 4396 reprezentativnih eukariota. Kao u slučaju uL15 gore, otkrili smo da su ostaci Phe170 i Lys172 visoko očuvani samo u tipičnim mikrosporidijama, ali odsutni u drugim eukariotima, uključujući atipične mikrosporidije Mitosporidium i Amphiamblys, u kojima ES39L rRNA fragment nije reduciran 44, 45, 46 (Slika 5c). -e).
Uzeti zajedno, ovi podaci podržavaju ideju da su E. cuniculi i moguće druge kanonske mikrosporidije razvile sposobnost efikasnog hvatanja velikog broja malih metabolita u strukturi ribosoma kako bi kompenzirale pad nivoa rRNA i proteina. Pritom su razvile jedinstvenu sposobnost vezivanja nukleotida izvan ribosoma, što pokazuje da parazitske molekularne strukture kompenziraju hvatanjem obilnih malih metabolita i njihovim korištenjem kao strukturnih imitatora degradiranih fragmenata RNK i proteina.
Treći nesimulirani dio naše krio-EM mape, pronađen u velikoj ribosomskoj podjedinici. Relativno visoka rezolucija (2,6 Å) naše mape sugerira da ova gustoća pripada proteinima s jedinstvenim kombinacijama ostataka velikih bočnih lanaca, što nam je omogućilo da identificiramo ovu gustoću kao prethodno nepoznati ribosomski protein koji smo identificirali kao... Nazvan je msL2 (Microsporidia-specifični protein L2) (metode, slika 6). Naša pretraga homologije pokazala je da je msL2 očuvan u kladu Microsporidia roda Encephaliter i Orosporidium, ali odsutan kod drugih vrsta, uključujući druge Microsporidia. U ribosomskoj strukturi, msL2 zauzima prazninu nastala gubitkom proširene ES31L rRNA. U ovoj praznini, msL2 pomaže u stabilizaciji savijanja rRNA i može kompenzirati gubitak ES31L (Slika 6).
a Gustina elektrona i model ribosomskog proteina msL2 specifičnog za mikrosporidiju, pronađenog u ribosomima E. cuniculi. b Većina eukariotskih ribosoma, uključujući 80S ribosom Saccharomyces cerevisiae, ima gubitak amplifikacije ES19L rRNA kod većine vrsta mikrosporidija. Prethodno utvrđena struktura ribosoma mikrosporidija V. necatrix sugerira da je gubitak ES19L kod ovih parazita kompenziran evolucijom novog ribosomskog proteina msL1. U ovoj studiji otkrili smo da je ribosom E. cuniculi također razvio dodatni protein koji imitira ribosomsku RNK kao očiglednu kompenzaciju za gubitak ES19L. Međutim, msL2 (trenutno označen kao hipotetički protein ECU06_1135) i msL1 imaju različito strukturno i evolucijsko porijeklo. c Ovo otkriće stvaranja evolucijski nepovezanih ribosomskih proteina msL1 i msL2 sugerira da ako ribosomi akumuliraju štetne mutacije u svojoj rRNA, mogu postići neviđene nivoe raznolikosti sastava čak i kod male podskupine blisko srodnih vrsta. Ovo otkriće bi moglo pomoći u razjašnjavanju porijekla i evolucije mitohondrijskog ribosoma, koji je poznat po svojoj visoko reduciranoj rRNA i abnormalnoj varijabilnosti u sastavu proteina među vrstama.
Zatim smo uporedili protein msL2 sa prethodno opisanim proteinom msL1, jedinim poznatim ribosomskim proteinom specifičnim za mikrosporidiju koji se nalazi u ribosomu V. necatrix. Željeli smo testirati da li su msL1 i msL2 evolucijski povezani. Naša analiza je pokazala da msL1 i msL2 zauzimaju istu šupljinu u ribosomskoj strukturi, ali imaju različite primarne i tercijarne strukture, što ukazuje na njihovo nezavisno evolucijsko porijeklo (Sl. 6). Dakle, naše otkriće msL2 pruža dokaz da grupe kompaktnih eukariotskih vrsta mogu nezavisno evoluirati strukturno različite ribosomske proteine ​​kako bi kompenzirale gubitak rRNA fragmenata. Ovo otkriće je značajno po tome što većina citoplazmatskih eukariotskih ribosoma sadrži invarijantni protein, uključujući istu porodicu od 81 ribosomskog proteina. Pojava msL1 i msL2 u različitim kladama mikrosporidija kao odgovor na gubitak proširenih rRNA segmenata sugerira da degradacija molekularne arhitekture parazita uzrokuje da paraziti traže kompenzacijske mutacije, što na kraju može dovesti do njihovog sticanja u različitim populacijama parazita.
Konačno, kada je naš model završen, uporedili smo sastav ribosoma E. cuniculi sa onim predviđenim na osnovu sekvence genoma. Ranije se smatralo da nekoliko ribosomskih proteina, uključujući eL14, eL38, eL41 i eS30, nedostaje iz genoma E. cuniculi zbog očiglednog odsustva njihovih homologa iz genoma E. cuniculi. Gubitak mnogih ribosomskih proteina se također predviđa kod većine drugih visoko reduciranih intracelularnih parazita i endosimbionta. Na primjer, iako većina slobodnoživućih bakterija sadrži istu porodicu od 54 ribosomskih proteina, samo 11 od ovih proteinskih porodica ima detektabilne homologe u svakom analiziranom genomu bakterija ograničenih na domaćina. U prilog ovoj ideji, eksperimentalno je uočen gubitak ribosomskih proteina kod mikrosporidija V. necatrix i P. locustae, kojima nedostaju proteini eL38 i eL4131,32.
Međutim, naše strukture pokazuju da su samo eL38, eL41 i eS30 zapravo izgubljeni u ribosomu E. cuniculi. Protein eL14 je bio očuvan, a naša struktura je pokazala zašto se ovaj protein nije mogao pronaći u pretrazi homologije (Sl. 7). U ribosomima E. cuniculi, većina mjesta vezivanja eL14 je izgubljena zbog degradacije rRNA-amplificiranog ES39L. U odsustvu ES39L, eL14 je izgubio većinu svoje sekundarne strukture, a samo 18% sekvence eL14 bilo je identično u E. cuniculi i S. cerevisiae. Ova loša očuvanost sekvence je značajna jer čak i Saccharomyces cerevisiae i Homo sapiens - organizmi koji su evoluirali u razmaku od 1,5 milijardi godina - dijele više od 51% istih ostataka u eL14. Ovaj anomalni gubitak očuvanosti objašnjava zašto se E. cuniculi eL14 trenutno označava kao pretpostavljeni protein M970_061160, a ne kao ribosomski protein eL1427.
i Ribosom mikrosporidija izgubio je ES39L rRNA ekstenziju, što je djelimično eliminisalo mjesto vezivanja ribosomskog proteina eL14. U odsustvu ES39L, protein mikrospora eL14 gubi sekundarnu strukturu, pri čemu se bivša α-heliks koja veže rRNA degenerira u petlju minimalne dužine. b Višestruko poravnanje sekvenci pokazuje da je protein eL14 visoko konzerviran kod eukariotskih vrsta (57% identičnosti sekvence između kvasca i ljudskih homologa), ali slabo konzerviran i divergentan kod mikrosporidija (kod kojih ne više od 24% ostataka je identično homologu eL14). od S. cerevisiae ili H. sapiens). Ova slaba konzervacija sekvenci i varijabilnost sekundarne strukture objašnjavaju zašto homolog eL14 nikada nije pronađen kod E. cuniculi i zašto se smatra da je ovaj protein izgubljen kod E. cuniculi. Nasuprot tome, eL14 E. cuniculi je prethodno označen kao pretpostavljeni protein M970_061160. Ovo zapažanje sugerira da je raznolikost genoma mikrosporidija trenutno precijenjena: neki geni za koje se trenutno smatra da su izgubljeni u mikrosporidijama su zapravo sačuvani, iako u visoko diferenciranim oblicima; umjesto toga, smatra se da neki kodiraju gene mikrosporidija za proteine ​​specifične za crve (npr. hipotetički protein M970_061160) zapravo kodira vrlo raznolike proteine ​​koji se nalaze u drugim eukariotima.
Ovo otkriće ukazuje na to da denaturacija rRNA može dovesti do dramatičnog gubitka očuvanosti sekvenci u susjednim ribosomskim proteinima, čineći ove proteine ​​neotkrivenim za pretrage homologije. Stoga bismo mogli precijeniti stvarni stepen molekularne degradacije kod organizama s malim genomom, budući da neki proteini za koje se smatra da su izgubljeni zapravo opstaju, iako u znatno izmijenjenim oblicima.
Kako paraziti mogu zadržati funkciju svojih molekularnih mašina u uslovima ekstremne redukcije genoma? Naša studija odgovara na ovo pitanje opisujući složenu molekularnu strukturu (ribosom) E. cuniculi, organizma s jednim od najmanjih eukariotskih genoma.
Već skoro dvije decenije je poznato da se molekule proteina i RNK u mikrobnim parazitima često razlikuju od svojih homolognih molekula u slobodnoživućim vrstama jer im nedostaju centri za kontrolu kvaliteta, smanjene su na 50% svoje veličine kod slobodnoživućih mikroba itd., imaju mnogo iscrpljujućih mutacija koje oštećuju savijanje i funkciju. Na primjer, očekuje se da ribosomi organizama s malim genomom, uključujući mnoge unutarćelijske parazite i endosimbionte, nemaju nekoliko ribosomskih proteina i do jedne trećine rRNA nukleotida u poređenju sa slobodnoživućim vrstama 27, 29, 30, 49. Međutim, način na koji ovi molekuli funkcionišu u parazitima ostaje uglavnom misterija, proučavana uglavnom kroz komparativnu genomiku.
Naša studija pokazuje da struktura makromolekula može otkriti mnoge aspekte evolucije koje je teško izvući iz tradicionalnih komparativnih genomskih studija intracelularnih parazita i drugih organizama ograničenih na domaćina (Dopunska slika 7). Na primjer, primjer proteina eL14 pokazuje da možemo precijeniti stvarni stepen degradacije molekularnog aparata kod parazitskih vrsta. Vjeruje se da encefalitični paraziti sada imaju stotine gena specifičnih za mikrosporidiju. Međutim, naši rezultati pokazuju da su neki od ovih naizgled specifičnih gena zapravo samo vrlo različite varijante gena koji su uobičajeni kod drugih eukariota. Štaviše, primjer proteina msL2 pokazuje kako previđamo nove ribosomske proteine ​​i podcjenjujemo sadržaj parazitskih molekularnih mašina. Primjer malih molekula pokazuje kako možemo previdjeti najgenijalnije inovacije u parazitskim molekularnim strukturama koje im mogu dati novu biološku aktivnost.
Uzeti zajedno, ovi rezultati poboljšavaju naše razumijevanje razlika između molekularnih struktura organizama ograničenih na domaćina i njihovih pandana u slobodnoživućim organizmima. Pokazujemo da molekularne mašine, za koje se dugo smatralo da su reducirane, degenerirane i podložne raznim iscrpljujućim mutacijama, umjesto toga imaju skup sistematski zanemarenih neobičnih strukturnih karakteristika.
S druge strane, ne-glomazni fragmenti rRNA i spojeni fragmenti koje smo pronašli u ribosomima E. cuniculi sugeriraju da redukcija genoma može promijeniti čak i one dijelove osnovnog molekularnog mehanizma koji su sačuvani u tri domena života - nakon gotovo 3,5 milijarde godina nezavisne evolucije vrsta.
Fragmenti rRNA bez izbočina i spojeni fragmenti u ribosomima E. cuniculi su od posebnog interesa u svjetlu prethodnih studija molekula RNK u endosimbiotskim bakterijama. Na primjer, kod endosimbionta lisnih uši Buchnera aphidicola, pokazalo se da molekule rRNA i tRNA imaju temperaturno osjetljive strukture zbog pristranosti sastava A+T i visokog udjela nekanonskih baznih parova20,50. Smatra se da su ove promjene u RNK, kao i promjene u molekulama proteina, odgovorne za prekomjernu ovisnost endosimbionata o partnerima i nemogućnost endosimbionata da prenose toplinu21,23. Iako rRNA parazitskih mikrosporidija ima strukturno različite promjene, priroda ovih promjena sugerira da smanjena termička stabilnost i veća ovisnost o proteinima šaperona mogu biti zajedničke karakteristike molekula RNK u organizmima s reduciranim genomima.
S druge strane, naše strukture pokazuju da su parazitske mikrosporidije razvile jedinstvenu sposobnost da se odupru široko konzerviranim rRNA i proteinskim fragmentima, razvijajući sposobnost korištenja obilnih i lako dostupnih malih metabolita kao strukturnih imitatora degeneriranih rRNA i proteinskih fragmenata. Degradacija molekularne strukture. . Ovo mišljenje podržava činjenica da se male molekule koje kompenziraju gubitak proteinskih fragmenata u rRNA i ribosomima E. cuniculi vežu za ostatke specifične za mikrosporidije u proteinima uL15 i eL30. Ovo sugerira da vezivanje malih molekula za ribosome može biti proizvod pozitivne selekcije, u kojoj su mutacije specifične za mikrosporidije u ribosomskim proteinima odabrane zbog njihove sposobnosti da povećaju afinitet ribosoma za male molekule, što može dovesti do efikasnijih ribosomskih organizama. Otkriće otkriva pametnu inovaciju u molekularnoj strukturi mikrobnih parazita i daje nam bolje razumijevanje kako molekularne strukture parazita održavaju svoju funkciju uprkos redukcijskoj evoluciji.
Trenutno, identifikacija ovih malih molekula ostaje nejasna. Nije jasno zašto se izgled ovih malih molekula u ribosomskoj strukturi razlikuje između vrsta mikrosporidija. Posebno, nije jasno zašto se vezivanje nukleotida uočava u ribosomima E. cuniculi i P. locustae, a ne u ribosomima V. necatrix, uprkos prisustvu ostatka F170 u proteinima eL20 i K172 V. necatrix. Ovu deleciju može uzrokovati ostatak 43 uL6 (smješten uz džep za vezivanje nukleotida), koji je tirozin u V. necatrix, a ne treonin u E. cuniculi i P. locustae. Glomazni aromatični bočni lanac Tyr43 može ometati vezivanje nukleotida zbog sternog preklapanja. Alternativno, prividna delecija nukleotida može biti posljedica niske rezolucije krio-EM snimanja, što otežava modeliranje ribosomskih fragmenata V. necatrix.
S druge strane, naš rad sugerira da proces raspadanja genoma može biti inventivna sila. Konkretno, struktura ribosoma E. cuniculi sugerira da gubitak rRNA i proteinskih fragmenata u ribosomu mikrosporidija stvara evolucijski pritisak koji potiče promjene u strukturi ribosoma. Ove varijante se javljaju daleko od aktivnog mjesta ribosoma i čini se da pomažu u održavanju (ili obnavljanju) optimalnog sklopa ribosoma koji bi inače bio poremećen reduciranom rRNA. Ovo sugerira da se čini da je glavna inovacija ribosoma mikrosporidija evoluirala u potrebu za ublažavanjem genskog drifta.
Možda je ovo najbolje ilustrovano vezivanjem nukleotida, koje do sada nikada nije uočeno kod drugih organizama. Činjenica da su ostaci koji vežu nukleotide prisutni u tipičnim mikrosporidijama, ali ne i kod drugih eukariota, sugeriše da mjesta vezivanja nukleotida nisu samo ostaci koji čekaju da nestanu ili konačno mjesto za rRNA da se vrati u oblik pojedinačnih nukleotida. Umjesto toga, ovo mjesto izgleda kao korisna karakteristika koja je mogla evoluirati tokom nekoliko rundi pozitivne selekcije. Mjesta vezivanja nukleotida mogu biti nusprodukt prirodne selekcije: kada se ES39L degradira, mikrosporidije su prisiljene tražiti kompenzaciju kako bi obnovile optimalnu biogenezu ribosoma u odsustvu ES39L. Budući da ovaj nukleotid može oponašati molekularne kontakte nukleotida A3186 u ES39L, molekula nukleotida postaje gradivni blok ribosoma, čije se vezivanje dodatno poboljšava mutacijom sekvence eL30.
Što se tiče molekularne evolucije intracelularnih parazita, naša studija pokazuje da sile Darvinove prirodne selekcije i genetičkog drifta raspadanja genoma ne djeluju paralelno, već osciliraju. Prvo, genetički drift eliminira važne karakteristike biomolekula, čineći kompenzaciju prijeko potrebnom. Tek kada paraziti zadovolje ovu potrebu putem Darvinove prirodne selekcije, njihovi makromolekuli će imati priliku da razviju svoje najimpresivnije i najinovativnije osobine. Važno je napomenuti da evolucija mjesta vezivanja nukleotida u ribosomu E. cuniculi sugerira da ovaj obrazac molekularne evolucije "gubitak-dobitak" ne samo da amortizira štetne mutacije, već ponekad daje potpuno nove funkcije parazitskim makromolekulama.
Ova ideja je u skladu sa Sewell Wrightovom teorijom pokretne ravnoteže, koja tvrdi da strogi sistem prirodne selekcije ograničava sposobnost organizama za inovacije51,52,53. Međutim, ako genetički drift poremeti prirodnu selekciju, ovi driftovi mogu proizvesti promjene koje same po sebi nisu adaptivne (ili čak štetne), ali vode do daljnjih promjena koje pružaju veću sposobnost prilagođavanja ili novu biološku aktivnost. Naš okvir podržava ovu ideju ilustrujući da se ista vrsta mutacije koja smanjuje nabor i funkciju biomolekula čini glavnim okidačem za njegovo poboljšanje. U skladu s evolucijskim modelom u kojem svi dobivaju, naša studija pokazuje da je propadanje genoma, tradicionalno smatrano degenerativnim procesom, također glavni pokretač inovacija, ponekad, a možda čak i često, omogućavajući makromolekulama da steknu nove parazitske aktivnosti. Mogu ih koristiti.