Matur nuwun sampun ngunjungi Nature.com. Versi browser sing sampeyan gunakake nduweni dhukungan CSS sing winates. Kanggo pengalaman sing paling apik, disaranake sampeyan nggunakake browser sing wis dianyari (utawa mateni Mode Kompatibilitas ing Internet Explorer). Kangge, kanggo njamin dhukungan sing terus-terusan, kita bakal nampilake situs tanpa gaya lan JavaScript.
Evolusi parasit mikroba nglibatake kontraaksi antarane seleksi alam, sing nyebabake parasit saya apik, lan hanyutan genetik, sing nyebabake parasit kelangan gen lan nglumpukake mutasi sing ngrusak. Ing kene, kanggo mangerteni kepiye kontraaksi iki kedadeyan ing skala makromolekul tunggal, kita njlentrehake struktur cryo-EM ribosom Encephalitozoon cuniculi, organisme eukariotik kanthi salah sawijining genom paling cilik ing alam. Reduksi rRNA sing ekstrem ing ribosom E. cuniculi diiringi owah-owahan struktural sing durung tau ana sadurunge, kayata evolusi penghubung rRNA sing wis ora dingerteni lan rRNA tanpa tonjolan. Kajaba iku, ribosom E. cuniculi slamet saka ilang fragmen lan protein rRNA kanthi ngembangake kemampuan kanggo nggunakake molekul cilik minangka tiruan struktural fragmen lan protein rRNA sing wis rusak. Sakabèhé, kita nuduhake manawa struktur molekul sing wis suwe dianggep suda, degenerasi, lan kena mutasi sing nglemahake duwe sawetara mekanisme kompensasi sing njaga supaya tetep aktif sanajan kontraksi molekuler sing ekstrem.
Amarga umume klompok parasit mikroba duwe piranti molekuler unik kanggo ngeksploitasi inang, kita asring kudu ngembangake terapi sing beda kanggo klompok parasit sing beda1,2. Nanging, bukti anyar nuduhake manawa sawetara aspek evolusi parasit iku konvergen lan umume bisa diprediksi, nuduhake basis potensial kanggo intervensi terapeutik sing amba ing parasit mikroba3,4,5,6,7,8,9.
Karya sadurunge wis ngidentifikasi tren evolusi umum ing parasit mikroba sing diarani reduksi genom utawa bosok genom10,11,12,13. Riset saiki nuduhake yen nalika mikroorganisme ninggalake gaya urip bebas lan dadi parasit intraseluler (utawa endosimbion), genome ngalami metamorfosis alon nanging apik tenan sajrone jutaan taun9,11. Ing proses sing dikenal minangka bosok genom, parasit mikroba nglumpukake mutasi sing ngrusak sing ngowahi akeh gen sing sadurunge penting dadi pseudogen, sing nyebabake ilang gen bertahap lan ambruk mutasi14,15. Runtuh iki bisa ngrusak nganti 95% gen ing organisme intraseluler paling tuwa dibandhingake karo spesies urip bebas sing raket banget. Dadi, evolusi parasit intraseluler minangka tarik tambang antarane rong kekuatan sing berlawanan: seleksi alam Darwinian, sing nyebabake perbaikan parasit, lan ambruk genom, mbuwang parasit menyang lalen. Kepiye parasit kasebut bisa metu saka tarik tambang iki lan njaga aktivitas struktur molekuler isih durung jelas.
Senajan mekanisme bosok genom durung dimangerteni kanthi lengkap, nanging katon kedadeyan utamane amarga penyimpangan genetik sing kerep. Amarga parasit urip ing populasi cilik, aseksual, lan winates sacara genetis, dheweke ora bisa ngilangi mutasi mbebayani sing kadhangkala kedadeyan sajrone replikasi DNA kanthi efektif. Iki nyebabake akumulasi mutasi mbebayani sing ora bisa dibalekake lan pengurangan genom parasit. Akibate, parasit ora mung kelangan gen sing ora perlu maneh kanggo kaslametane ing lingkungan intraseluler. Ketidakmampuan populasi parasit kanggo ngilangi mutasi mbebayani sporadis kanthi efektif sing nyebabake mutasi kasebut nglumpuk ing saindenging genom, kalebu gen sing paling penting.
Sebagéan gedhé pangerten kita saiki babagan pangurangan genom mung adhedhasar perbandingan urutan genom, kanthi kurang perhatian marang owah-owahan ing molekul nyata sing nindakake fungsi tata graha lan dadi target obat potensial. Panliten komparatif nuduhake manawa beban mutasi mikroba intraseluler sing ngrusak katon nyebabake protein lan asam nukleat salah lipat lan agregat, saengga luwih gumantung karo pendamping lan hipersensitif marang panas19,20,21,22,23. Kajaba iku, macem-macem parasit—evolusi independen kadhangkala dipisahake nganti 2,5 milyar taun—ngalami mundhut pusat kontrol kualitas sing padha ing sintesis protein5,6 lan mekanisme ndandani DNA24. Nanging, sethithik sing dingerteni babagan dampak gaya urip intraseluler ing kabeh sifat makromolekul seluler liyane, kalebu adaptasi molekuler kanggo beban mutasi sing ngrusak sing saya tambah.
Ing karya iki, supaya luwih ngerti evolusi protein lan asam nukleat mikroorganisme intraseluler, kita nemtokake struktur ribosom parasit intraseluler Encephalitozoon cuniculi. E. cuniculi minangka organisme kaya jamur sing kalebu klompok mikrosporidia parasit sing duwe genom eukariotik sing cilik banget lan mulane digunakake minangka organisme model kanggo nyinaoni pembusukan genom25,26,27,28,29,30. Bubar, struktur ribosom cryo-EM ditemtokake kanggo genom Microsporidia, Paranosema locustae, lan Vairimorpha necatrix31,32 (genom ~3,2 Mb). Struktur kasebut nuduhake yen sawetara mundhut amplifikasi rRNA dikompensasi kanthi pangembangan kontak anyar antarane protein ribosom tetanggan utawa akuisisi protein ribosom msL131,32 anyar. Spesies Encephalitozoon (genom ~2,5 yuta bp), bebarengan karo sedulur paling cedhak Ordospora, nduduhake tingkat pungkasan saka reduksi genom ing eukariota - dheweke duwe kurang saka 2000 gen pengkode protein, lan diarepake ribosom ora mung ora duwe fragmen ekspansi rRNA (fragmen rRNA sing mbedakake ribosom eukariotik saka ribosom bakteri) uga duwe papat protein ribosom amarga ora ana homolog ing genom E. cuniculi26,27,28. Mulane, kita nyimpulake yen ribosom E. cuniculi bisa mbukak strategi sing sadurunge ora dingerteni kanggo adaptasi molekuler kanggo bosok genom.
Struktur cryo-EM kita makili ribosom sitoplasma eukariotik paling cilik sing kudu dicirikake lan menehi wawasan babagan kepiye tingkat pungkasan reduksi genom mengaruhi struktur, perakitan, lan evolusi mesin molekuler sing integral karo sel kasebut. Kita nemokake manawa ribosom E. cuniculi nglanggar akeh prinsip lipatan RNA lan perakitan ribosom sing dilestarikan sacara wiyar, lan nemokake protein ribosom anyar sing sadurunge ora dingerteni. Kanthi ora disangka-sangka, kita nuduhake manawa ribosom mikrosporidia wis ngembangake kemampuan kanggo ngiket molekul cilik, lan hipotesis manawa pemotongan ing rRNA lan protein micu inovasi evolusioner sing pungkasane bisa menehi kualitas sing migunani kanggo ribosom.
Kanggo ningkatake pangerten babagan evolusi protein lan asam nukleat ing organisme intraseluler, kita mutusake kanggo ngisolasi spora E. cuniculi saka kultur sel mamalia sing kena infeksi kanggo nyuceni ribosom lan nemtokake struktur ribosom kasebut. Angel entuk akeh mikrosporidia parasit amarga mikrosporidia ora bisa dikultur ing medium nutrisi. Nanging, dheweke mung tuwuh lan ngasilake maneh ing njero sel inang. Mulane, kanggo entuk biomassa E. cuniculi kanggo pemurnian ribosom, kita nginfeksi garis sel ginjel mamalia RK13 nganggo spora E. cuniculi lan ngkultur sel sing kena infeksi iki sajrone pirang-pirang minggu supaya E. cuniculi bisa tuwuh lan berkembang biak. Nggunakake monolayer sel sing kena infeksi udakara setengah meter persegi, kita bisa nyuceni udakara 300 mg spora Microsporidia lan digunakake kanggo ngisolasi ribosom. Banjur kita ngrusak spora sing dimurnike nganggo manik-manik kaca lan ngisolasi ribosom mentah nggunakake fraksinasi polietilen glikol langkah demi langkah saka lisat. Iki ngidini kita entuk udakara 300 µg ribosom E. cuniculi mentah kanggo analisis struktural.
Banjur kita ngumpulake gambar cryo-EM nggunakake sampel ribosom sing diasilake lan ngolah gambar kasebut nggunakake topeng sing cocog karo subunit ribosom gedhe, sirah subunit cilik, lan subunit cilik. Sajrone proses iki, kita ngumpulake gambar udakara 108.000 partikel ribosom lan ngitung gambar cryo-EM kanthi resolusi 2,7 Å (Gambar Tambahan 1-3). Banjur kita nggunakake gambar cryoEM kanggo model rRNA, protein ribosom, lan faktor hibernasi Mdf1 sing ana gandhengane karo ribosom E. cuniculi (Gambar 1a, b).
a Struktur ribosom E. cuniculi sing kompleks karo faktor hibernasi Mdf1 (pdb id 7QEP). b Peta faktor hibernasi Mdf1 sing ana gandhengane karo ribosom E. cuniculi. c Peta struktur sekunder sing mbandhingake rRNA sing dipulihake ing spesies Mikrosporidian karo struktur ribosom sing dikenal. Panel kasebut nuduhake lokasi fragmen rRNA (ES) sing diamplifikasi lan situs aktif ribosom, kalebu situs dekoding (DC), loop sarcinicin (SRL), lan pusat transferase peptidil (PTC). d Kapadhetan elektron sing cocog karo pusat transferase peptidil saka ribosom E. cuniculi nuduhake yen situs katalitik iki duwe struktur sing padha ing parasit E. cuniculi lan inang, kalebu H. sapiens. e, f Kapadhetan elektron sing cocog saka pusat dekoding (e) lan struktur skematis pusat dekoding (f) nuduhake yen E. cuniculi duwe residu U1491 tinimbang A1491 (penomoran E. coli) ing akeh eukariota liyane. Owah-owahan iki nuduhake yen E. cuniculi bisa uga sensitif marang antibiotik sing narget situs aktif iki.
Beda karo struktur ribosom V. necatrix lan P. locustae sing wis ditetepake sadurunge (loro-lorone struktur makili kulawarga microsporidia sing padha Nosematidae lan meh padha siji lan sijine), 31,32 ribosom E. cuniculi ngalami pirang-pirang proses rRNA lan fragmentasi protein. Denaturasi luwih lanjut (Gambar Tambahan 4-6). Ing rRNA, owah-owahan sing paling mencolok kalebu ilang lengkap fragmen rRNA 25S ES12L sing diamplifikasi lan degenerasi parsial heliks h39, h41, lan H18 (Gambar 1c, Gambar Tambahan 4). Antarane protein ribosom, owah-owahan sing paling mencolok kalebu ilang lengkap protein eS30 lan pemendekan protein eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17, lan eS7 (Gambar Tambahan 4, 5).
Dadi, pangurangan genom spesies Encephalotozoon/Ordospora sing ekstrem katon ing struktur ribosom: ribosom E. cuniculi ngalami mundhut kandungan protein sing paling dramatis ing ribosom sitoplasma eukariotik sing tundhuk karo karakterisasi struktural, lan dheweke malah ora duwe rRNA lan fragmen protein sing dilestarikake sacara wiyar ora mung ing eukariota, nanging uga ing telung domain urip. Struktur ribosom E. cuniculi nyedhiyakake model molekuler pertama kanggo owah-owahan kasebut lan mbukak acara evolusi sing wis dilirwakake dening genomik komparatif lan studi struktur biomolekul intraseluler (Gambar Tambahan 7). Ing ngisor iki, kita njlentrehake saben acara kasebut bebarengan karo asal-usul evolusi sing mungkin lan dampak potensial ing fungsi ribosom.
Banjur kita nemokake manawa, saliyane pemotongan rRNA sing gedhe, ribosom E. cuniculi duwe variasi rRNA ing salah sawijining situs aktif. Sanajan pusat transferase peptidil saka ribosom E. cuniculi duwe struktur sing padha karo ribosom eukariotik liyane (Gambar 1d), pusat dekoding beda amarga variasi urutan ing nukleotida 1491 (penomoran E. coli, Gambar 1e, f). Pengamatan iki penting amarga situs dekoding ribosom eukariotik biasane ngemot residu G1408 lan A1491 dibandhingake karo residu tipe bakteri A1408 lan G1491. Variasi iki ndasari sensitivitas ribosom bakteri lan eukariotik sing beda kanggo kulawarga aminoglikosida antibiotik ribosom lan molekul cilik liyane sing nargetake situs dekoding. Ing situs dekoding ribosom E. cuniculi, residu A1491 diganti karo U1491, sing bisa nggawe antarmuka pengikatan unik kanggo molekul cilik sing nargetake situs aktif iki. Varian A14901 sing padha uga ana ing mikrosporidia liyane kayata P. locustae lan V. necatrix, sing nuduhake manawa iki nyebar ing antarane spesies mikrosporidia (Gambar 1f).
Amarga sampel ribosom E. cuniculi kita diisolasi saka spora sing ora aktif sacara metabolik, kita nguji peta cryo-EM E. cuniculi kanggo pengikatan ribosom sing wis diterangake sadurunge ing kahanan stres utawa kelaparan. Faktor hibernasi 31,32,36,37, 38. Kita cocogake struktur ribosom hibernasi sing wis ditetepake sadurunge karo peta cryo-EM ribosom E. cuniculi. Kanggo docking, ribosom S. cerevisiae digunakake ing kompleks karo faktor hibernasi Stm138, ribosom belalang ing kompleks karo faktor Lso232, lan ribosom V. necatrix ing kompleks karo faktor Mdf1 lan Mdf231. Ing wektu sing padha, kita nemokake kapadhetan cryo-EM sing cocog karo faktor istirahat Mdf1. Padha karo Mdf1 sing kaiket karo ribosom V. necatrix, Mdf1 uga kaiket karo ribosom E. cuniculi, ing ngendi iku mblokir situs E ribosom, bisa uga mbantu nggawe ribosom kasedhiya nalika spora parasit dadi ora aktif sacara metabolik nalika inaktivasi awak (Gambar 2).
Mdf1 mblokir situs E ribosom, sing katon mbantu ngnonaktifake ribosom nalika spora parasit dadi ora aktif sacara metabolik. Ing struktur ribosom E. cuniculi, kita nemokake manawa Mdf1 mbentuk kontak sing sadurunge ora dingerteni karo batang ribosom L1, bagean saka ribosom sing nggampangake pelepasan tRNA sing dideasilasi saka ribosom sajrone sintesis protein. Kontak kasebut nuduhake manawa Mdf1 misah saka ribosom nggunakake mekanisme sing padha karo tRNA sing dideasetilasi, menehi panjelasan sing bisa ditindakake babagan kepiye ribosom mbusak Mdf1 kanggo ngaktifake maneh sintesis protein.
Nanging, struktur kita nuduhake kontak sing ora dingerteni antarane Mdf1 lan sikil ribosom L1 (bagean ribosom sing mbantu ngeculake tRNA sing wis dideasilasi saka ribosom sajrone sintesis protein). Utamane, Mdf1 nggunakake kontak sing padha karo segmen sikut saka molekul tRNA sing wis dideasilasi (Gambar 2). Pemodelan molekuler sing sadurunge ora dingerteni iki nuduhake yen Mdf1 misah saka ribosom nggunakake mekanisme sing padha karo tRNA sing wis dideasetilasi, sing nerangake kepiye ribosom mbusak faktor hibernasi iki kanggo ngaktifake maneh sintesis protein.
Nalika mbangun model rRNA, kita nemokake yen ribosom E. cuniculi duwe fragmen rRNA sing dilipet kanthi ora normal, sing diarani rRNA sing dilebur (Gambar 3). Ing ribosom sing nyakup telung domain urip, rRNA dilipet dadi struktur ing ngendi umume basa rRNA bisa dipasangake basa lan dilipet siji liyane utawa sesambungan karo protein ribosom38,39,40. Nanging, ing ribosom E. cuniculi, rRNA katon nglanggar prinsip lipatan iki kanthi ngowahi sawetara heliks dadi wilayah rRNA sing ora dilipat.
Struktur heliks rRNA H18 25S ing S. cerevisiae, V. necatrix, lan E. cuniculi. Biasane, ing ribosom sing nyakup telung domain urip, penghubung iki nggulung dadi heliks RNA sing ngemot 24 nganti 34 residu. Ing Microsporidia, kosok baline, penghubung rRNA iki mboko sithik dadi rong penghubung sugih uridin untaian tunggal sing mung ngemot 12 residu. Umume residu iki kena pelarut. Gambar kasebut nuduhake yen mikrosporidia parasit katon nglanggar prinsip umum lipatan rRNA, ing ngendi basa rRNA biasane digandhengake karo basa liyane utawa melu interaksi rRNA-protein. Ing mikrosporidia, sawetara fragmen rRNA njupuk lipatan sing ora apik, ing ngendi heliks rRNA sadurunge dadi fragmen untaian tunggal sing meh dawa ing garis lurus. Anane wilayah sing ora biasa iki ngidini mikrosporidia rRNA kanggo ngiket fragmen rRNA sing adoh nggunakake jumlah basa RNA minimal.
Conto sing paling narik kawigaten saka transisi evolusi iki bisa diamati ing heliks rRNA H18 25S (Gambar 3). Ing spesies saka E. coli nganti manungsa, basa heliks rRNA iki ngandhut 24-32 nukleotida, mbentuk heliks sing rada ora teratur. Ing struktur ribosom sing wis diidentifikasi sadurunge saka V. necatrix lan P. locustae,31,32 basa heliks H18 sebagian ora digulung, nanging pasangan basa nukleotida tetep dipertahankan. Nanging, ing E. cuniculi fragmen rRNA iki dadi penghubung paling cendhak 228UUUUGU232 lan 301UUUUUUUUUU307. Ora kaya fragmen rRNA khas, penghubung sing sugih uridin iki ora nggulung utawa nggawe kontak ekstensif karo protein ribosom. Nanging, dheweke nggunakake struktur sing mbukak pelarut lan ora dilipat kanthi lengkap ing ngendi untaian rRNA meh lurus. Konformasi sing diulur iki njelasake kepiye E. cuniculi mung nggunakake 12 basa RNA kanggo ngisi celah 33 Å antarane heliks rRNA H16 lan H18, dene spesies liyane mbutuhake paling ora kaping pindho basa rRNA kanggo ngisi celah kasebut.
Dadi, kita bisa nduduhake manawa, liwat lipatan sing ora nguntungake sacara energi, mikrosporidia parasit wis ngembangake strategi kanggo ngontrak sanajan segmen rRNA sing tetep dilestarikan sacara wiyar ing antarane spesies ing telung domain urip. Ketoke, kanthi nglumpukake mutasi sing ngowahi heliks rRNA dadi penghubung poli-U cendhak, E. cuniculi bisa mbentuk fragmen rRNA sing ora biasa sing ngemot nukleotida sesedikit mungkin kanggo ligasi fragmen rRNA distal. Iki mbantu nerangake kepiye mikrosporidia entuk pengurangan dramatis ing struktur molekul dhasar tanpa kelangan integritas struktural lan fungsional.
Fitur liyane sing ora umum saka rRNA E. cuniculi yaiku tampilan rRNA tanpa penebalan (Gambar 4). Tonjolan yaiku nukleotida tanpa pasangan basa sing metu saka heliks RNA tinimbang ndhelik ing njero. Umume tonjolan rRNA tumindak minangka perekat molekuler, mbantu ngiket protein ribosom sing jejer utawa fragmen rRNA liyane. Sawetara tonjolan tumindak minangka engsel, saengga heliks rRNA bisa mlengkung lan melu kanthi optimal kanggo sintesis protein sing produktif 41.
a Tonjolan rRNA (penomoran S. cerevisiae) ora ana ing struktur ribosom E. cuniculi, nanging ana ing umume eukariota liyane b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens, lan ribosom internal E. cuniculi. Parasit ora duwe akeh tonjolan rRNA kuna sing lestari banget. Penebalan iki nyetabilake struktur ribosom; mulane, ora anane ing mikrosporidia nuduhake stabilitas lipatan rRNA sing suda ing parasit mikrosporidia. Perbandingan karo batang P (batang L7/L12 ing bakteri) nuduhake yen ilang benjolan rRNA kadhangkala pas karo munculé benjolan anyar ing jejere benjolan sing ilang. Heliks H42 ing rRNA 23S/28S duwe tonjolan kuna (U1206 ing Saccharomyces cerevisiae) sing dikira paling ora umur 3,5 milyar taun amarga perlindungane ing telung domain urip. Ing mikrosporidia, tonjolan iki diilangi. Nanging, ana tonjolan anyar sing muncul ing jejere tonjolan sing ilang (A1306 ing E. cuniculi).
Sing nggumunake, kita nemokake yen ribosom E. cuniculi ora duwe sebagian besar tonjolan rRNA sing ditemokake ing spesies liyane, kalebu luwih saka 30 tonjolan sing dilestarikan ing eukariota liyane (Gambar 4a). Kerugian iki ngilangi akeh kontak antarane subunit ribosom lan heliks rRNA sing jejer, kadhangkala nggawe rongga gedhe ing ribosom, nggawe ribosom E. cuniculi luwih keropos dibandhingake karo ribosom sing luwih tradisional (Gambar 4b). Khususé, kita nemokake yen sebagian besar tonjolan iki uga ilang ing struktur ribosom V. necatrix lan P. locustae sing wis diidentifikasi sadurunge, sing ora digatekake dening analisis struktural sadurunge31,32.
Kadhangkala ilangé tonjolan rRNA dibarengi karo perkembangan tonjolan anyar ing jejere tonjolan sing ilang. Contoné, batang-P ribosom ngandhut tonjolan U1208 (ing Saccharomyces cerevisiae) sing slamet saka E. coli nganti manungsa lan mulané dikira-kira umuré 3,5 milyar taun. Sajrone sintesis protein, tonjolan iki mbantu batang P obah ing antarane konformasi mbukak lan nutup supaya ribosom bisa ngrekrut faktor terjemahan lan ngirim menyang situs aktif. Ing ribosom E. cuniculi, penebalan iki ora ana; Nanging, penebalan anyar (G883) sing mung dumunung ing telung pasangan basa bisa nyumbang kanggo pemulihan fleksibilitas optimal batang P (Gambar 4c).
Data kita babagan rRNA tanpa tonjolan nuduhake yen minimalisasi rRNA ora winates ing ilange unsur rRNA ing permukaan ribosom, nanging uga bisa nglibatake inti ribosom, sing nggawe cacat molekuler spesifik parasit sing durung diterangake ing sel sing urip bebas. Spesies urip diamati.
Sawise model protein ribosom kanonik lan rRNA, kita nemokake manawa komponen ribosom konvensional ora bisa nerangake telung bagean saka gambar cryo-EM. Loro fragmen iki ukurane molekul cilik (Gambar 5, Gambar Tambahan 8). Segmen pertama diapit ing antarane protein ribosom uL15 lan eL18 ing posisi sing biasane dikuwasani dening C-terminus eL18, sing dicekak ing E. cuniculi. Sanajan kita ora bisa nemtokake identitas molekul iki, ukuran lan bentuk pulo kapadhetan iki diterangake kanthi apik dening anané molekul spermidine. Ikatane karo ribosom distabilisasi dening mutasi spesifik mikrosporidia ing protein uL15 (Asp51 lan Arg56), sing katon nambah afinitas ribosom kanggo molekul cilik iki, amarga ngidini uL15 mbungkus molekul cilik dadi struktur ribosom. Gambar Tambahan 2). 8, data tambahan 1, 2).
Pencitraan Cryo-EM nuduhake anané nukleotida ing njaba ribosa sing kaiket karo ribosom E. cuniculi. Ing ribosom E. cuniculi, nukleotida iki manggoni papan sing padha karo nukleotida 25S rRNA A3186 (penomoran Saccharomyces cerevisiae) ing umume ribosom eukariotik liyane. b Ing struktur ribosom E. cuniculi, nukleotida iki dumunung ing antarane protein ribosom uL9 lan eL20, saengga nyetabilake kontak antarane rong protein kasebut. cd analisis konservasi urutan eL20 ing antarane spesies mikrosporidia. Wit filogenetik spesies Microsporidia (c) lan penyelarasan urutan ganda protein eL20 (d) nuduhake yen residu pengikat nukleotida F170 lan K172 dilestarikake ing umume Microsporidia sing khas, kajaba S. lophii, kajaba Microsporidia sing bercabang awal, sing njaga ekstensi rRNA ES39L. e Gambar iki nuduhake yen residu pengikat nukleotida F170 lan K172 mung ana ing eL20 saka genom mikrosporidia sing wis suda banget, nanging ora ana ing eukariota liyane. Sakabèhé, data iki nuduhake yen ribosom Mikrosporidia wis ngembangake situs pengikat nukleotida sing katon ngiket molekul AMP lan nggunakake kanggo nyetabilake interaksi protein-protein ing struktur ribosom. Konservasi sing dhuwur saka situs pengikatan iki ing Mikrosporidia lan ora ana ing eukariota liyane nuduhake yen situs iki bisa menehi kauntungan kaslametan selektif kanggo Mikrosporidia. Mangkono, kanthong pengikat nukleotida ing ribosom mikrosporidia ora katon minangka fitur degenerasi utawa bentuk pungkasan degradasi rRNA kaya sing diterangake sadurunge, nanging luwih minangka inovasi evolusioner sing migunani sing ngidini ribosom mikrosporidia kanggo langsung ngiket molekul cilik, nggunakake minangka blok bangunan molekuler. blok bangunan kanggo ribosom. Panemon iki ndadekake ribosom mikrosporidia minangka siji-sijine ribosom sing dikenal nggunakake nukleotida tunggal minangka blok bangunan struktural. f Jalur evolusi hipotetis sing asale saka pengikatan nukleotida.
Kapadhetan bobot molekul rendah kapindho dumunung ing antarmuka antarane protein ribosom uL9 lan eL30 (Gambar 5a). Antarmuka iki sadurunge diterangake ing struktur ribosom Saccharomyces cerevisiae minangka situs pengikatan kanggo nukleotida 25S rRNA A3186 (bagean saka ekstensi rRNA ES39L)38. Dituduhake manawa ing ribosom P. locustae ES39L sing degenerasi, antarmuka iki ngiket nukleotida tunggal sing ora dingerteni 31, lan dianggep manawa nukleotida iki minangka bentuk rRNA pungkasan sing dikurangi, ing ngendi dawa rRNA yaiku ~130-230 basa. ES39L dikurangi dadi nukleotida tunggal 32.43. Gambar cryo-EM kita ndhukung ide manawa kapadhetan bisa diterangake dening nukleotida. Nanging, resolusi struktur sing luwih dhuwur nuduhake manawa nukleotida iki minangka molekul ekstraribosomal, bisa uga AMP (Gambar 5a, b).
Banjur kita takon apa situs pengikatan nukleotida muncul ing ribosom E. cuniculi utawa wis ana sadurunge. Amarga pengikatan nukleotida utamane dimediasi dening residu Phe170 lan Lys172 ing protein ribosom eL30, kita ngevaluasi konservasi residu kasebut ing 4396 eukariota sing representatif. Kaya ing kasus uL15 ing ndhuwur, kita nemokake manawa residu Phe170 lan Lys172 mung dilestarikan ing Microsporidia khas, nanging ora ana ing eukariota liyane, kalebu Microsporidia atipikal Mitosporidium lan Amphiamblys, ing ngendi fragmen rRNA ES39L ora direduksi 44, 45, 46 (Gambar 5c). -e).
Yen digabungake, data iki ndhukung ide manawa E. cuniculi lan bisa uga mikrosporidia kanonik liyane wis ngembangake kemampuan kanggo nangkep metabolit cilik kanthi efisien ing struktur ribosom kanggo ngimbangi penurunan tingkat rRNA lan protein. Kanthi mengkono, dheweke wis ngembangake kemampuan unik kanggo ngiket nukleotida ing njaba ribosom, sing nuduhake manawa struktur molekul parasit ngimbangi kanthi nangkep metabolit cilik sing akeh lan nggunakake minangka tiruan struktural saka RNA lan fragmen protein sing wis rusak.
Bagean katelu saka peta cryo-EM kita sing ora disimulasi, ditemokake ing subunit ribosom gedhe. Resolusi sing relatif dhuwur (2,6 Å) saka peta kita nuduhake manawa kapadhetan iki kalebu protein kanthi kombinasi unik saka residu rantai samping gedhe, sing ngidini kita ngenali kapadhetan iki minangka protein ribosom sing sadurunge ora dingerteni sing kita identifikasi minangka. Iki dijenengi msL2 (protein spesifik Microsporidia L2) (metode, gambar 6). Panelusuran homologi kita nuduhake manawa msL2 dilestarikake ing clade Microsporidia saka genus Encephaliter lan Orosporidium, nanging ora ana ing spesies liyane, kalebu Microsporidia liyane. Ing struktur ribosom, msL2 manggoni celah sing dibentuk dening ilang rRNA ES31L sing diperpanjang. Ing kekosongan iki, msL2 mbantu nyetabilake lipatan rRNA lan bisa ngimbangi ilang ES31L (Gambar 6).
a Kapadhetan elektron lan model protein ribosom spesifik Microsporidia msL2 sing ditemokake ing ribosom E. cuniculi. b Umume ribosom eukariotik, kalebu ribosom 80S saka Saccharomyces cerevisiae, duwe amplifikasi rRNA ES19L sing ilang ing umume spesies Microsporidian. Struktur ribosom microsporidia V. necatrix sing wis ditetepake sadurunge nuduhake yen ilang ES19L ing parasit iki dikompensasi dening evolusi protein ribosom msL1 anyar. Ing panliten iki, kita nemokake yen ribosom E. cuniculi uga ngembangake protein mimik RNA ribosom tambahan minangka kompensasi sing katon kanggo ilang ES19L. Nanging, msL2 (saiki dianotasi minangka protein ECU06_1135 hipotetis) lan msL1 duwe asal-usul struktural lan evolusi sing beda. Panemon babagan generasi protein ribosom msL1 lan msL2 sing ora ana hubungane karo evolusi iki nuduhake yen ribosom nglumpukake mutasi sing ngrugekake ing rRNA, dheweke bisa entuk tingkat keragaman komposisi sing durung tau ana sadurunge sanajan ing sebagian cilik spesies sing raket banget. Panemon iki bisa mbantu njlentrehake asal-usul lan evolusi ribosom mitokondria, sing dikenal amarga rRNA sing suda banget lan variabilitas abnormal ing komposisi protein ing antarane spesies.
Banjur kita mbandhingake protein msL2 karo protein msL1 sing wis diterangake sadurunge, siji-sijine protein ribosom spesifik mikrosporidia sing ditemokake ing ribosom V. necatrix. Kita pengin nguji apa msL1 lan msL2 ana hubungane sacara evolusi. Analisis kita nuduhake yen msL1 lan msL2 manggoni rongga sing padha ing struktur ribosom, nanging duwe struktur primer lan tersier sing beda, sing nuduhake asal evolusi independen (Gambar 6). Dadi, panemuan msL2 kita menehi bukti yen klompok spesies eukariotik kompak bisa kanthi mandiri ngembangake protein ribosom sing beda sacara struktural kanggo ngimbangi ilang fragmen rRNA. Temuan iki penting amarga umume ribosom eukariotik sitoplasma ngemot protein invarian, kalebu kulawarga sing padha saka 81 protein ribosom. Muncule msL1 lan msL2 ing macem-macem klad mikrosporidia minangka respon kanggo ilang segmen rRNA sing luwih dawa nuduhake yen degradasi arsitektur molekul parasit nyebabake parasit nggoleki mutasi kompensasi, sing pungkasane bisa nyebabake akuisisi ing populasi parasit sing beda.
Pungkasan, nalika model kita rampung, kita mbandhingake komposisi ribosom E. cuniculi karo sing diprediksi saka urutan genom. Sawetara protein ribosom, kalebu eL14, eL38, eL41, lan eS30, sadurunge dianggep ilang saka genom E. cuniculi amarga ora ana homolog saka genom E. cuniculi. Ilange akeh protein ribosom uga diprediksi ing umume parasit intraseluler lan endosimbion liyane sing suda banget. Contone, sanajan umume bakteri sing urip bebas ngemot kulawarga sing padha saka 54 protein ribosom, mung 11 saka kulawarga protein iki sing duwe homolog sing bisa dideteksi ing saben genom bakteri sing diwatesi inang sing dianalisis. Kanggo ndhukung gagasan iki, ilange protein ribosom wis diamati kanthi eksperimen ing V. necatrix lan P. locustae microsporidia, sing ora duwe protein eL38 lan eL4131,32.
Nanging, struktur kita nuduhake yen mung eL38, eL41, lan eS30 sing ilang ing ribosom E. cuniculi. Protein eL14 dilestarikake lan struktur kita nuduhake kenapa protein iki ora bisa ditemokake ing panelusuran homologi (Gambar 7). Ing ribosom E. cuniculi, sebagian besar situs pengikatan eL14 ilang amarga degradasi ES39L sing dikuatake rRNA. Tanpa ES39L, eL14 kelangan sebagian besar struktur sekunder, lan mung 18% saka urutan eL14 sing identik ing E. cuniculi lan S. cerevisiae. Pengawetan urutan sing kurang apik iki luar biasa amarga sanajan Saccharomyces cerevisiae lan Homo sapiens—organisme sing berkembang kanthi jarak 1,5 milyar taun—nduweni luwih saka 51% residu sing padha ing eL14. Ilangé konservasi sing ora normal iki njelasaké kenapa E. cuniculi eL14 saiki dianotasi minangka protein M970_061160 sing diduga lan dudu minangka protein ribosom eL1427.
lan ribosom Microsporidia kelangan ekstensi rRNA ES39L, sing sebagian ngilangi situs pengikatan protein ribosom eL14. Tanpa anané ES39L, protein mikrospora eL14 ngalami mundhut struktur sekunder, ing ngendi α-helix pengikat rRNA sadurunge degenerasi dadi puteran dawa minimal. b Penyelarasan urutan ganda nuduhake yen protein eL14 dilestarikan banget ing spesies eukariotik (57% identitas urutan antarane homolog ragi lan manungsa), nanging kurang dilestarikan lan divergen ing mikrosporidia (ing ngendi ora luwih saka 24% residu identik karo homolog eL14). saka S. cerevisiae utawa H. sapiens). Konservasi urutan sing kurang apik lan variabilitas struktur sekunder iki nerangake kenapa homolog eL14 ora tau ditemokake ing E. cuniculi lan kenapa protein iki dianggep wis ilang ing E. cuniculi. Kosok baline, E. cuniculi eL14 sadurunge dianotasi minangka protein M970_061160 sing diduga. Pengamatan iki nuduhake yen keragaman genom microsporidia saiki wis dikira-kira banget: sawetara gen sing saiki dianggep ilang ing microsporidia nyatane isih disimpen, sanajan ing bentuk sing wis dibedakake banget; nanging, sawetara dianggep ngode gen microsporidia kanggo protein spesifik cacing (kayata, protein hipotetis M970_061160) sejatine ngode protein sing maneka warna sing ditemokake ing eukariota liyane.
Temuan iki nuduhake yen denaturasi rRNA bisa nyebabake mundhut konservasi urutan sing dramatis ing protein ribosom sing jejer, saengga protein kasebut ora bisa dideteksi kanggo panelusuran homologi. Mangkono, kita bisa ngira-ngira tingkat degradasi molekuler sing nyata ing organisme genom cilik, amarga sawetara protein sing dianggep ilang sejatine isih ana, sanajan ing bentuk sing wis owah banget.
Kepiye carane parasit bisa njaga fungsi mesin molekuler ing kahanan reduksi genom sing ekstrem? Panliten kita njawab pitakonan iki kanthi njlentrehake struktur molekul kompleks (ribosom) E. cuniculi, organisme kanthi salah sawijining genom eukariotik paling cilik.
Wis meh rong dekade dingerteni manawa molekul protein lan RNA ing parasit mikroba asring beda karo molekul homolog ing spesies sing urip bebas amarga ora duwe pusat kontrol kualitas, suda dadi 50% saka ukurane ing mikroba sing urip bebas, lan liya-liyane. akeh mutasi sing nglemahake sing ngganggu lipatan lan fungsi. Contone, ribosom organisme genom cilik, kalebu akeh parasit intraseluler lan endosimbion, diarepake ora duwe sawetara protein ribosom lan nganti sapratelo nukleotida rRNA dibandhingake karo spesies sing urip bebas 27, 29, 30, 49. Nanging, cara molekul kasebut berfungsi ing parasit tetep dadi misteri, sing disinaoni utamane liwat genomik komparatif.
Panliten kita nuduhake yen struktur makromolekul bisa mbukak akeh aspek evolusi sing angel diekstrak saka panliten genomik komparatif tradisional babagan parasit intraseluler lan organisme liyane sing diwatesi inang (Gambar Tambahan 7). Contone, conto protein eL14 nuduhake yen kita bisa ngira-ngira tingkat degradasi aparatus molekuler ing spesies parasit. Parasit ensefalitis saiki dipercaya duwe atusan gen spesifik mikrosporidia. Nanging, asil kita nuduhake yen sawetara gen sing katon spesifik iki sejatine mung varian gen sing beda banget sing umum ing eukariota liyane. Kajaba iku, conto protein msL2 nuduhake kepiye kita nglirwakake protein ribosom anyar lan ngremehake isi mesin molekuler parasit. Conto molekul cilik nuduhake kepiye kita bisa nglirwakake inovasi paling cerdas ing struktur molekul parasit sing bisa menehi aktivitas biologis anyar.
Yen digabungake, asil iki nambah pangerten kita babagan bedane antarane struktur molekul organisme sing diwatesi inang lan rekan-rekan ing organisme sing urip bebas. Kita nuduhake yen mesin molekuler, sing wis suwe dianggep suda, rusak, lan kena macem-macem mutasi sing nglemahake, malah duwe sakumpulan fitur struktural sing ora biasa sing diabaikan kanthi sistematis.
Ing sisih liya, fragmen rRNA sing ora gedhe lan fragmen sing nyawiji sing ditemokake ing ribosom E. cuniculi nuduhake manawa reduksi genom bisa ngganti bagean-bagean saka mesin molekul dhasar sing isih ana ing telung domain urip - sawise meh 3,5 milyar taun. evolusi spesies sing independen.
Fragmen rRNA sing bebas tonjolan lan nyawiji ing ribosom E. cuniculi nduweni minat khusus ing cahya saka panliten sadurunge babagan molekul RNA ing bakteri endosimbiotik. Contone, ing endosimbion kutu daun Buchnera aphidicola, molekul rRNA lan tRNA wis dituduhake duwe struktur sensitif suhu amarga bias komposisi A+T lan proporsi pasangan basa non-kanonik sing dhuwur20,50. Owah-owahan ing RNA iki, uga owah-owahan ing molekul protein, saiki dianggep tanggung jawab kanggo katergantungan endosimbion marang pasangan lan ketidakmampuan endosimbion kanggo nransfer panas21, 23. Sanajan rRNA mikrosporidia parasit duwe owah-owahan struktural sing béda, sifat owah-owahan kasebut nuduhake yen stabilitas termal sing suda lan katergantungan sing luwih dhuwur marang protein chaperone bisa uga dadi fitur umum molekul RNA ing organisme kanthi genom sing suda.
Ing sisih liya, struktur kita nuduhake yen mikrosporidia parasit wis ngembangake kemampuan unik kanggo nolak fragmen rRNA lan protein sing dilestarikan sacara wiyar, ngembangake kemampuan kanggo nggunakake metabolit cilik sing akeh lan gampang kasedhiya minangka tiruan struktural saka fragmen rRNA lan protein sing degenerasi. Degradasi struktur molekul. . Pendapat iki didhukung dening kasunyatan manawa molekul cilik sing ngimbangi ilang fragmen protein ing rRNA lan ribosom E. cuniculi kaiket karo residu spesifik mikrosporidia ing protein uL15 lan eL30. Iki nuduhake yen pengikatan molekul cilik menyang ribosom bisa uga minangka produk saka seleksi positif, ing ngendi mutasi spesifik Mikrosporidia ing protein ribosom wis dipilih amarga kemampuane kanggo nambah afinitas ribosom kanggo molekul cilik, sing bisa nyebabake organisme ribosom sing luwih efisien. Panemon iki mbukak inovasi cerdas ing struktur molekul parasit mikroba lan menehi kita pangerten sing luwih apik babagan kepiye struktur molekul parasit njaga fungsine sanajan evolusi reduktif.
Saiki, identifikasi molekul-molekul cilik iki isih durung cetha. Durung cetha kenapa tampilan molekul-molekul cilik iki ing struktur ribosom beda-beda antarane spesies mikrosporidia. Utamane, durung cetha kenapa ikatan nukleotida diamati ing ribosom E. cuniculi lan P. locustae, lan ora ing ribosom V. necatrix, sanajan ana residu F170 ing protein eL20 lan K172 saka V. necatrix. Delesi iki bisa uga disebabake dening residu 43 uL6 (dumunung ing jejere kanthong ikatan nukleotida), yaiku tirosin ing V. necatrix lan dudu treonin ing E. cuniculi lan P. locustae. Rantai sisi aromatik Tyr43 sing gedhe bisa ngganggu ikatan nukleotida amarga tumpang tindih sterik. Utawa, delesi nukleotida sing katon bisa uga amarga resolusi pencitraan cryo-EM sing kurang, sing ngalangi pemodelan fragmen ribosom V. necatrix.
Ing sisih liya, karya kita nuduhake yen proses bosok genom bisa uga dadi kekuatan inventif. Utamane, struktur ribosom E. cuniculi nuduhake yen ilang rRNA lan fragmen protein ing ribosom mikrosporidia nggawe tekanan evolusioner sing ningkatake owah-owahan ing struktur ribosom. Varian kasebut kedadeyan adoh saka situs aktif ribosom lan katon mbantu njaga (utawa mulihake) perakitan ribosom optimal sing bakal diganggu dening rRNA sing suda. Iki nuduhake yen inovasi utama ribosom mikrosporidia katon wis berkembang dadi kabutuhan kanggo nyangga penyimpangan gen.
Mbok menawa iki paling apik digambarake kanthi ikatan nukleotida, sing durung nate diamati ing organisme liyane nganti saiki. Kasunyatan manawa residu ikatan nukleotida ana ing mikrosporidia khas, nanging ora ing eukariota liyane, nuduhake manawa situs ikatan nukleotida ora mung peninggalan sing ngenteni ilang, utawa situs pungkasan kanggo rRNA sing bakal dibalekake menyang bentuk nukleotida individu. Nanging, situs iki katon kaya fitur sing migunani sing bisa berkembang sajrone sawetara babak seleksi positif. Situs ikatan nukleotida bisa uga minangka produk sampingan saka seleksi alam: sawise ES39L didegradasi, mikrosporidia dipeksa golek kompensasi kanggo mulihake biogenesis ribosom sing optimal tanpa ES39L. Amarga nukleotida iki bisa niru kontak molekuler nukleotida A3186 ing ES39L, molekul nukleotida dadi blok bangunan ribosom, sing ikatane luwih apik kanthi mutasi urutan eL30.
Babagan evolusi molekuler parasit intraseluler, panliten kita nuduhake yen kekuwatan seleksi alam Darwinian lan hanyutan genetik saka bosok genom ora beroperasi bebarengan, nanging osilasi. Kapisan, hanyutan genetik ngilangi fitur penting biomolekul, saengga kompensasi dibutuhake banget. Mung nalika parasit nyukupi kabutuhan iki liwat seleksi alam Darwinian, makromolekul bakal duwe kesempatan kanggo ngembangake sipat sing paling nyengsemake lan inovatif. Sing penting, evolusi situs pengikatan nukleotida ing ribosom E. cuniculi nuduhake yen pola evolusi molekuler loss-to-gain iki ora mung amortisasi mutasi sing ngrusak, nanging kadhangkala menehi fungsi anyar kanggo makromolekul parasit.
Ide iki konsisten karo teori keseimbangan obah Sewell Wright, sing nyatakake yen sistem seleksi alam sing ketat mbatesi kemampuan organisme kanggo inovasi51,52,53. Nanging, yen hanyutan genetik ngganggu seleksi alam, hanyutan kasebut bisa ngasilake owah-owahan sing ora adaptif (utawa malah ngrugekake) nanging nyebabake owah-owahan luwih lanjut sing nyedhiyakake kebugaran sing luwih dhuwur utawa aktivitas biologis anyar. Kerangka kerja kita ndhukung ide iki kanthi nggambarake yen jinis mutasi sing padha sing nyuda lipatan lan fungsi biomolekul katon minangka pemicu utama kanggo perbaikan. Selaras karo model evolusi win-win, panliten kita nuduhake yen bosok genom, sing sacara tradisional dideleng minangka proses degeneratif, uga minangka pendorong utama inovasi, kadhangkala lan malah bisa uga asring ngidini makromolekul entuk aktivitas parasit anyar. bisa nggunakake.