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La evolución de los parásitos microbianos implica una interacción entre la selección natural, que favorece la mejora de los parásitos, y la deriva genética, que provoca la pérdida de genes y la acumulación de mutaciones perjudiciales. Para comprender cómo se produce esta interacción a escala de una sola macromolécula, describimos la estructura por criomicroscopía electrónica del ribosoma de Encephalitozoon cuniculi, un organismo eucariota con uno de los genomas más pequeños de la naturaleza. La extrema reducción del ARNr en los ribosomas de E. cuniculi se acompaña de cambios estructurales sin precedentes, como la evolución de conectores de ARNr fusionados previamente desconocidos y ARNr sin protuberancias. Además, el ribosoma de E. cuniculi sobrevivió a la pérdida de fragmentos de ARNr y proteínas desarrollando la capacidad de utilizar pequeñas moléculas como imitadores estructurales de los fragmentos de ARNr y proteínas degradados. En resumen, demostramos que las estructuras moleculares que durante mucho tiempo se consideraron reducidas, degeneradas y susceptibles a mutaciones debilitantes poseen diversos mecanismos compensatorios que las mantienen activas a pesar de las extremas contracciones moleculares.
Debido a que la mayoría de los grupos de parásitos microbianos tienen herramientas moleculares únicas para explotar a sus huéspedes, a menudo tenemos que desarrollar diferentes terapias para diferentes grupos de parásitos1,2. Sin embargo, nuevas evidencias sugieren que algunos aspectos de la evolución de los parásitos son convergentes y en gran medida predecibles, lo que indica una base potencial para intervenciones terapéuticas amplias en parásitos microbianos3,4,5,6,7,8,9.
Trabajos previos han identificado una tendencia evolutiva común en parásitos microbianos denominada reducción o degradación del genoma10,11,12,13. Investigaciones actuales demuestran que, cuando los microorganismos abandonan su estilo de vida libre y se convierten en parásitos intracelulares (o endosimbiontes), sus genomas experimentan metamorfosis lentas pero asombrosas a lo largo de millones de años9,11. En un proceso conocido como degradación del genoma, los parásitos microbianos acumulan mutaciones deletéreas que transforman muchos genes previamente importantes en pseudogenes, lo que conlleva una pérdida gradual de genes y un colapso mutacional14,15. Este colapso puede destruir hasta el 95 % de los genes en los organismos intracelulares más antiguos en comparación con especies de vida libre estrechamente relacionadas. Por lo tanto, la evolución de los parásitos intracelulares es una lucha entre dos fuerzas opuestas: la selección natural darwiniana, que conduce a la mejora de los parásitos, y el colapso del genoma, que los condena al olvido. Aún no está claro cómo el parásito logró emerger de esta lucha y conservar la actividad de su estructura molecular.
Aunque el mecanismo de degradación del genoma no se comprende del todo, parece deberse principalmente a la deriva genética frecuente. Dado que los parásitos viven en poblaciones pequeñas, asexuales y genéticamente limitadas, no pueden eliminar eficazmente las mutaciones perjudiciales que a veces se producen durante la replicación del ADN. Esto conlleva una acumulación irreversible de mutaciones dañinas y una reducción del genoma del parásito. Como resultado, el parásito no solo pierde genes que ya no son necesarios para su supervivencia en el entorno intracelular, sino que la incapacidad de las poblaciones de parásitos para eliminar eficazmente las mutaciones perjudiciales esporádicas provoca que estas se acumulen en todo el genoma, incluidos sus genes más importantes.
Gran parte de nuestra comprensión actual de la reducción del genoma se basa únicamente en comparaciones de secuencias genómicas, con menos atención a los cambios en las moléculas reales que realizan funciones básicas y sirven como posibles dianas farmacológicas. Estudios comparativos han demostrado que la carga de mutaciones microbianas intracelulares deletéreas parece predisponer a las proteínas y los ácidos nucleicos a plegarse incorrectamente y agregarse, haciéndolos más dependientes de chaperonas e hipersensibles al calor19,20,21,22,23. Además, varios parásitos —con una evolución independiente separada a veces por hasta 2.500 millones de años— experimentaron una pérdida similar de centros de control de calidad en sus mecanismos de síntesis de proteínas5,6 y reparación del ADN24. Sin embargo, se sabe poco sobre el impacto del estilo de vida intracelular en todas las demás propiedades de las macromoléculas celulares, incluida la adaptación molecular a una carga creciente de mutaciones deletéreas.
En este trabajo, con el fin de comprender mejor la evolución de las proteínas y los ácidos nucleicos de los microorganismos intracelulares, determinamos la estructura de los ribosomas del parásito intracelular Encephalitozoon cuniculi. E. cuniculi es un organismo similar a un hongo que pertenece a un grupo de microsporidios parásitos que tienen genomas eucariotas inusualmente pequeños y, por lo tanto, se utilizan como organismos modelo para estudiar la degradación del genoma25,26,27,28,29,30. Recientemente, se determinó la estructura del ribosoma mediante crio-EM para genomas moderadamente reducidos de Microsporidia, Paranosema locustae y Vairimorpha necatrix31,32 (genoma de ~3,2 Mb). Estas estructuras sugieren que cierta pérdida de amplificación del ARNr se compensa con el desarrollo de nuevos contactos entre proteínas ribosomales vecinas o la adquisición de nuevas proteínas ribosomales msL131,32. La especie Encephalitozoon (genoma de aproximadamente 2,5 millones de pares de bases), junto con su pariente más cercano Ordospora, demuestra el grado máximo de reducción del genoma en eucariotas: tienen menos de 2000 genes codificadores de proteínas, y se espera que sus ribosomas no solo carezcan de fragmentos de expansión de ARNr (fragmentos de ARNr que distinguen a los ribosomas eucariotas de los bacterianos), sino que también tengan cuatro proteínas ribosómicas debido a la falta de homólogos en el genoma de E. cuniculi26,27,28. Por lo tanto, concluimos que el ribosoma de E. cuniculi puede revelar estrategias previamente desconocidas para la adaptación molecular a la degradación del genoma.
Nuestra estructura obtenida mediante crio-EM representa el ribosoma citoplasmático eucariota más pequeño caracterizado hasta la fecha y proporciona información sobre cómo el grado máximo de reducción del genoma afecta la estructura, el ensamblaje y la evolución de la maquinaria molecular esencial para la célula. Descubrimos que el ribosoma de E. cuniculi viola muchos de los principios ampliamente conservados del plegamiento del ARN y el ensamblaje del ribosoma, y ​​encontramos una nueva proteína ribosomal previamente desconocida. De manera inesperada, demostramos que los ribosomas de microsporidios han desarrollado la capacidad de unirse a moléculas pequeñas, e hipotetizamos que las truncaciones en el ARNr y las proteínas desencadenan innovaciones evolutivas que, en última instancia, podrían conferir cualidades útiles al ribosoma.
Para comprender mejor la evolución de las proteínas y los ácidos nucleicos en organismos intracelulares, decidimos aislar esporas de E. cuniculi de cultivos de células de mamíferos infectadas para purificar sus ribosomas y determinar su estructura. Es difícil obtener una gran cantidad de microsporidios parásitos, ya que no se pueden cultivar en un medio nutritivo. En cambio, crecen y se reproducen únicamente dentro de la célula huésped. Por lo tanto, para obtener biomasa de E. cuniculi para la purificación de ribosomas, infectamos la línea celular renal de mamíferos RK13 con esporas de E. cuniculi y cultivamos estas células infectadas durante varias semanas para permitir que E. cuniculi creciera y se multiplicara. Utilizando una monocapa de células infectadas de aproximadamente medio metro cuadrado, pudimos purificar unos 300 mg de esporas de Microsporidia y utilizarlas para aislar los ribosomas. Posteriormente, disgregamos las esporas purificadas con perlas de vidrio y aislamos los ribosomas crudos mediante fraccionamiento gradual con polietilenglicol de los lisados. Esto nos permitió obtener aproximadamente 300 µg de ribosomas crudos de E. cuniculi para su análisis estructural.
A continuación, obtuvimos imágenes de crio-EM a partir de las muestras de ribosomas resultantes y las procesamos utilizando máscaras correspondientes a la subunidad ribosómica grande, la cabeza de la subunidad pequeña y la subunidad pequeña. Durante este proceso, obtuvimos imágenes de aproximadamente 108 000 partículas ribosómicas y calculamos imágenes de crio-EM con una resolución de 2,7 Å (Figuras complementarias 1-3). Posteriormente, utilizamos las imágenes de crio-EM para modelar el ARNr, la proteína ribosómica y el factor de hibernación Mdf1 asociados a los ribosomas de E. cuniculi (Fig. 1a, b).
a Estructura del ribosoma de E. cuniculi en complejo con el factor de hibernación Mdf1 (pdb id 7QEP). b Mapa del factor de hibernación Mdf1 asociado al ribosoma de E. cuniculi. c Mapa de estructura secundaria que compara el ARNr recuperado en especies de Microsporidium con estructuras ribosomales conocidas. Los paneles muestran la ubicación de los fragmentos de ARNr amplificados (ES) y los sitios activos del ribosoma, incluyendo el sitio de decodificación (DC), el bucle de sarcinicina (SRL) y el centro de peptidiltransferasa (PTC). d La densidad electrónica correspondiente al centro de peptidiltransferasa del ribosoma de E. cuniculi sugiere que este sitio catalítico tiene la misma estructura en el parásito E. cuniculi y sus huéspedes, incluyendo H. sapiens. e, f La densidad electrónica correspondiente del centro de decodificación (e) y la estructura esquemática del centro de decodificación (f) indican que E. cuniculi presenta los residuos U1491 en lugar de A1491 (según la numeración de E. coli) presentes en muchos otros eucariotas. Este cambio sugiere que E. cuniculi podría ser sensible a antibióticos que actúan sobre este sitio activo.
A diferencia de las estructuras previamente establecidas de los ribosomas de V. necatrix y P. locustae (ambas estructuras representan la misma familia de microsporidios Nosematidae y son muy similares entre sí), 31,32 los ribosomas de E. cuniculi experimentan numerosos procesos de fragmentación de ARNr y proteínas. Desnaturalización adicional (Figuras suplementarias 4-6). En el ARNr, los cambios más notables incluyeron la pérdida completa del fragmento amplificado de ARNr 25S ES12L y la degeneración parcial de las hélices h39, h41 y H18 (Fig. 1c, Fig. suplementaria 4). Entre las proteínas ribosomales, los cambios más notables incluyeron la pérdida completa de la proteína eS30 y el acortamiento de las proteínas eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 y eS7 (Figuras suplementarias 4, 5).
Así, la extrema reducción de los genomas de las especies de Encephalotozoon/Ordospora se refleja en la estructura de sus ribosomas: los ribosomas de E. cuniculi experimentan la pérdida más drástica de contenido proteico entre los ribosomas citoplasmáticos eucariotas sometidos a caracterización estructural, y ni siquiera poseen los fragmentos de ARNr y proteínas ampliamente conservados no solo en eucariotas, sino también en los tres dominios de la vida. La estructura del ribosoma de E. cuniculi proporciona el primer modelo molecular para estos cambios y revela eventos evolutivos que han pasado desapercibidos tanto para la genómica comparativa como para los estudios de la estructura biomolecular intracelular (Figura suplementaria 7). A continuación, describimos cada uno de estos eventos junto con sus probables orígenes evolutivos y su impacto potencial en la función del ribosoma.
Posteriormente, descubrimos que, además de grandes truncamientos de ARNr, los ribosomas de E. cuniculi presentan variaciones en el ARNr en uno de sus sitios activos. Si bien el centro de peptidiltransferasa del ribosoma de E. cuniculi tiene la misma estructura que otros ribosomas eucariotas (Fig. 1d), el centro de decodificación difiere debido a una variación de secuencia en el nucleótido 1491 (numeración de E. coli, Fig. 1e, f). Esta observación es importante porque el sitio de decodificación de los ribosomas eucariotas generalmente contiene los residuos G1408 y A1491, en comparación con los residuos A1408 y G1491 de tipo bacteriano. Esta variación explica la diferente sensibilidad de los ribosomas bacterianos y eucariotas a la familia de antibióticos ribosomales aminoglucósidos y otras moléculas pequeñas que actúan sobre el sitio de decodificación. En el sitio de decodificación del ribosoma de E. cuniculi, el residuo A1491 fue reemplazado por U1491, lo que potencialmente crea una interfaz de unión única para moléculas pequeñas que se dirigen a este sitio activo. La misma variante A14901 también está presente en otros microsporidios como P. locustae y V. necatrix, lo que sugiere que está ampliamente distribuida entre las especies de microsporidios (Fig. 1f).
Debido a que nuestras muestras de ribosomas de E. cuniculi fueron aisladas de esporas metabólicamente inactivas, probamos el mapa de crio-EM de E. cuniculi para la unión de ribosomas previamente descrita bajo condiciones de estrés o inanición. Factores de hibernación 31,32,36,37, 38. Comparamos la estructura previamente establecida del ribosoma hibernante con el mapa de crio-EM del ribosoma de E. cuniculi. Para el acoplamiento, se utilizaron ribosomas de S. cerevisiae en complejo con el factor de hibernación Stm138, ribosomas de langosta en complejo con el factor Lso232 y ribosomas de V. necatrix en complejo con los factores Mdf1 y Mdf231. Al mismo tiempo, encontramos la densidad de crio-EM correspondiente al factor de reposo Mdf1. De forma similar a como Mdf1 se une al ribosoma de V. necatrix, Mdf1 también se une al ribosoma de E. cuniculi, donde bloquea el sitio E del ribosoma, posiblemente ayudando a que los ribosomas estén disponibles cuando las esporas del parásito se vuelven metabólicamente inactivas tras la inactivación del cuerpo (Figura 2).
Mdf1 bloquea el sitio E del ribosoma, lo que aparentemente contribuye a su inactivación cuando las esporas del parásito se vuelven metabólicamente inactivas. En la estructura del ribosoma de E. cuniculi, observamos que Mdf1 establece un contacto previamente desconocido con el tallo ribosomal L1, la parte del ribosoma que facilita la liberación del ARNt desacetilado durante la síntesis de proteínas. Estos contactos sugieren que Mdf1 se disocia del ribosoma mediante el mismo mecanismo que el ARNt desacetilado, lo que podría explicar cómo el ribosoma elimina Mdf1 para reactivar la síntesis de proteínas.
Sin embargo, nuestra estructura reveló un contacto desconocido entre Mdf1 y la pata ribosómica L1 (la parte del ribosoma que ayuda a liberar el ARNt desacilado durante la síntesis de proteínas). En concreto, Mdf1 utiliza los mismos contactos que el segmento del codo de la molécula de ARNt desacilado (Fig. 2). Este modelado molecular, hasta ahora desconocido, demostró que Mdf1 se disocia del ribosoma mediante el mismo mecanismo que el ARNt desacetilado, lo que explica cómo el ribosoma elimina este factor de hibernación para reactivar la síntesis de proteínas.
Al construir el modelo de ARNr, encontramos que el ribosoma de E. cuniculi tiene fragmentos de ARNr plegados de forma anómala, a los que denominamos ARNr fusionado (Fig. 3). En los ribosomas de los tres dominios de la vida, el ARNr se pliega en estructuras en las que la mayoría de las bases del ARNr se aparean y pliegan entre sí o interactúan con proteínas ribosomales38,39,40. Sin embargo, en los ribosomas de E. cuniculi, los ARNr parecen violar este principio de plegamiento al convertir algunas de sus hélices en regiones de ARNr desplegadas.
Estructura de la hélice de ARNr 25S H18 en S. cerevisiae, V. necatrix y E. cuniculi. Normalmente, en los ribosomas de los tres dominios de la vida, este conector se enrolla formando una hélice de ARN que contiene de 24 a 34 residuos. En Microsporidia, en cambio, este conector de ARNr se reduce gradualmente a dos conectores monocatenarios ricos en uridina que contienen solo 12 residuos. La mayoría de estos residuos están expuestos a disolventes. La figura muestra que los microsporidios parásitos parecen violar los principios generales del plegamiento del ARNr, donde las bases del ARNr suelen estar acopladas a otras bases o participan en interacciones ARNr-proteína. En microsporidios, algunos fragmentos de ARNr adoptan un plegamiento desfavorable, en el que la antigua hélice de ARNr se convierte en un fragmento monocatenario alargado casi en línea recta. La presencia de estas regiones inusuales permite que el ARNr de los microsporidios se una a fragmentos de ARNr distantes utilizando un número mínimo de bases de ARN.
El ejemplo más llamativo de esta transición evolutiva se puede observar en la hélice H18 del ARNr 25S (Fig. 3). En especies desde E. coli hasta humanos, las bases de esta hélice de ARNr contienen 24-32 nucleótidos, formando una hélice ligeramente irregular. En estructuras ribosómicas previamente identificadas de V. necatrix y P. locustae,31,32 las bases de la hélice H18 están parcialmente desenrolladas, pero se conserva el apareamiento de bases de nucleótidos. Sin embargo, en E. cuniculi este fragmento de ARNr se convierte en los enlazadores más cortos 228UUUGU232 y 301UUUUUUUUU307. A diferencia de los fragmentos típicos de ARNr, estos enlazadores ricos en uridina no se enrollan ni establecen un contacto extenso con las proteínas ribosómicas. En cambio, adoptan estructuras abiertas al disolvente y completamente desplegadas en las que las hebras de ARNr se extienden casi rectas. Esta conformación alargada explica cómo E. cuniculi utiliza solo 12 bases de ARN para llenar el espacio de 33 Å entre las hélices de ARNr H16 y H18, mientras que otras especies requieren al menos el doble de bases de ARNr para llenar ese espacio.
Así, podemos demostrar que, mediante un plegamiento energéticamente desfavorable, los microsporidios parásitos han desarrollado una estrategia para contraer incluso aquellos segmentos de ARNr que se conservan ampliamente entre las especies de los tres dominios de la vida. Aparentemente, al acumular mutaciones que transforman las hélices de ARNr en cortos enlaces de poli-U, E. cuniculi puede formar fragmentos de ARNr inusuales que contienen la menor cantidad posible de nucleótidos para la ligación de fragmentos distales de ARNr. Esto ayuda a explicar cómo los microsporidios lograron una drástica reducción en su estructura molecular básica sin perder su integridad estructural y funcional.
Otra característica inusual del ARNr de E. cuniculi es la aparición de ARNr sin engrosamientos (Fig. 4). Los abultamientos son nucleótidos sin pares de bases que se retuercen fuera de la hélice de ARN en lugar de ocultarse en ella. La mayoría de las protrusiones del ARNr actúan como adhesivos moleculares, ayudando a unir proteínas ribosómicas adyacentes u otros fragmentos de ARNr. Algunos de los abultamientos actúan como bisagras, permitiendo que la hélice de ARNr se flexione y se pliegue de manera óptima para una síntesis productiva de proteínas 41.
a Una protuberancia de ARNr (numeración de S. cerevisiae) está ausente de la estructura del ribosoma de E. cuniculi, pero presente en la mayoría de los demás eucariotas b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens y los ribosomas internos de E. cuniculi. Los parásitos carecen de muchos de los antiguos y altamente conservados abultamientos de ARNr. Estos engrosamientos estabilizan la estructura del ribosoma; por lo tanto, su ausencia en los microsporidios indica una estabilidad reducida del plegamiento del ARNr en los parásitos microsporidios. La comparación con los tallos P (tallos L7/L12 en bacterias) muestra que la pérdida de abultamientos de ARNr a veces coincide con la aparición de nuevos abultamientos junto a los abultamientos perdidos. La hélice H42 en el ARNr 23S/28S tiene un abultamiento antiguo (U1206 en Saccharomyces cerevisiae) que se estima que tiene al menos 3.5 mil millones de años debido a su protección en tres dominios de la vida. En los microsporidios, esta protuberancia se elimina. Sin embargo, apareció una nueva protuberancia junto a la que se había perdido (A1306 en E. cuniculi).
Sorprendentemente, descubrimos que los ribosomas de E. cuniculi carecen de la mayoría de las protuberancias de ARNr presentes en otras especies, incluyendo más de 30 protuberancias conservadas en otros eucariotas (Fig. 4a). Esta pérdida elimina muchos contactos entre las subunidades ribosómicas y las hélices de ARNr adyacentes, creando a veces grandes huecos dentro del ribosoma, lo que hace que el ribosoma de E. cuniculi sea más poroso en comparación con los ribosomas más tradicionales (Fig. 4b). Cabe destacar que encontramos que la mayoría de estas protuberancias también se perdieron en las estructuras ribosómicas de V. necatrix y P. locustae previamente identificadas, las cuales pasaron desapercibidas en análisis estructurales anteriores31,32.
En ocasiones, la pérdida de protuberancias en el ARNr se acompaña del desarrollo de nuevas protuberancias junto a la perdida. Por ejemplo, el tallo P ribosomal contiene una protuberancia U1208 (en Saccharomyces cerevisiae) que ha sobrevivido desde E. coli hasta los humanos y, por lo tanto, se estima que tiene 3500 millones de años. Durante la síntesis de proteínas, esta protuberancia ayuda al tallo P a alternar entre conformaciones abiertas y cerradas para que el ribosoma pueda reclutar factores de traducción y entregarlos al sitio activo. En los ribosomas de E. cuniculi, este engrosamiento está ausente; sin embargo, un nuevo engrosamiento (G883) ubicado en solo tres pares de bases puede contribuir a la restauración de la flexibilidad óptima del tallo P (Fig. 4c).
Nuestros datos sobre el ARNr sin protuberancias sugieren que la minimización del ARNr no se limita a la pérdida de elementos de ARNr en la superficie del ribosoma, sino que también puede involucrar el núcleo del ribosoma, creando un defecto molecular específico del parásito que no se ha descrito en células de vida libre. especies vivas observadas.
Tras modelar las proteínas ribosómicas canónicas y el ARNr, descubrimos que los componentes ribosómicos convencionales no pueden explicar las tres partes de la imagen de crio-EM. Dos de estos fragmentos son moléculas pequeñas (Fig. 5, Fig. suplementaria 8). El primer segmento se encuentra intercalado entre las proteínas ribosómicas uL15 y eL18 en una posición que normalmente ocupa el extremo C-terminal de eL18, el cual está acortado en E. cuniculi. Aunque no podemos determinar la identidad de esta molécula, el tamaño y la forma de esta isla de densidad se explican bien por la presencia de moléculas de espermidina. Su unión al ribosoma se estabiliza mediante mutaciones específicas de microsporidios en las proteínas uL15 (Asp51 y Arg56), que parecen aumentar la afinidad del ribosoma por esta molécula pequeña, ya que permiten que uL15 la envuelva en una estructura ribosómica. Figura suplementaria 2). 8, datos adicionales 1, 2).
Imágenes de crio-EM que muestran la presencia de nucleótidos fuera de la ribosa unida al ribosoma de E. cuniculi. En el ribosoma de E. cuniculi, este nucleótido ocupa el mismo lugar que el nucleótido A3186 del ARNr 25S (numeración de Saccharomyces cerevisiae) en la mayoría de los demás ribosomas eucariotas. b En la estructura ribosomal de E. cuniculi, este nucleótido se encuentra entre las proteínas ribosomales uL9 y eL20, estabilizando así el contacto entre las dos proteínas. cd Análisis de conservación de la secuencia eL20 entre especies de microsporidios. El árbol filogenético de especies de Microsporidia (c) y el alineamiento de secuencias múltiples de la proteína eL20 (d) muestran que los residuos de unión de nucleótidos F170 y K172 se conservan en la mayoría de los Microsporidia típicos, con la excepción de S. lophii, con la excepción de los Microsporidia de ramificación temprana, que retuvieron la extensión del ARNr ES39L. e Esta figura muestra que los residuos de unión de nucleótidos F170 y K172 están presentes solo en eL20 del genoma altamente reducido de microsporidios, pero no en otros eucariotas. En general, estos datos sugieren que los ribosomas de microsporidios han desarrollado un sitio de unión de nucleótidos que parece unirse a moléculas de AMP y utilizarlas para estabilizar las interacciones proteína-proteína en la estructura ribosomal. La alta conservación de este sitio de unión en microsporidios y su ausencia en otros eucariotas sugiere que este sitio puede proporcionar una ventaja de supervivencia selectiva para microsporidios. Por lo tanto, el bolsillo de unión de nucleótidos en el ribosoma de microsporidios no parece ser una característica degenerada o una forma final de degradación del ARNr como se describió anteriormente, sino más bien una innovación evolutiva útil que permite al ribosoma de microsporidios unirse directamente a moléculas pequeñas, utilizándolas como bloques de construcción moleculares para los ribosomas. Este descubrimiento convierte al ribosoma de microsporidios en el único ribosoma conocido que utiliza un solo nucleótido como su bloque de construcción estructural. f Vía evolutiva hipotética derivada de la unión de nucleótidos.
La segunda densidad de bajo peso molecular se encuentra en la interfaz entre las proteínas ribosómicas uL9 y eL30 (Fig. 5a). Esta interfaz se describió previamente en la estructura del ribosoma de Saccharomyces cerevisiae como un sitio de unión para el nucleótido 25S del ARNr A3186 (parte de la extensión del ARNr ES39L)38. Se demostró que en los ribosomas ES39L degenerados de P. locustae, esta interfaz se une a un nucleótido único desconocido31, y se supone que este nucleótido es una forma final reducida del ARNr, en la que la longitud del ARNr es de ~130-230 bases. ES39L se reduce a un nucleótido único32.43. Nuestras imágenes de crio-EM respaldan la idea de que la densidad puede explicarse por nucleótidos. Sin embargo, la mayor resolución de nuestra estructura mostró que este nucleótido es una molécula extrarribosómica, posiblemente AMP (Fig. 5a, b).
Luego nos preguntamos si el sitio de unión de nucleótidos aparecía en el ribosoma de E. cuniculi o si existía previamente. Dado que la unión de nucleótidos está mediada principalmente por los residuos Phe170 y Lys172 en la proteína ribosomal eL30, evaluamos la conservación de estos residuos en 4396 eucariotas representativos. Al igual que en el caso de uL15 mencionado anteriormente, encontramos que los residuos Phe170 y Lys172 están altamente conservados solo en Microsporidia típicos, pero ausentes en otros eucariotas, incluidos los Microsporidia atípicos Mitosporidium y Amphiamblys, en los que el fragmento de ARNr ES39L no está reducido 44, 45, 46 (Fig. 5c). -e).
En conjunto, estos datos respaldan la idea de que E. cuniculi y posiblemente otros microsporidios canónicos han desarrollado la capacidad de capturar eficientemente grandes cantidades de pequeños metabolitos en la estructura del ribosoma para compensar la disminución de los niveles de ARNr y proteínas. Al hacerlo, han desarrollado una capacidad única para unirse a nucleótidos fuera del ribosoma, lo que demuestra que las estructuras moleculares parasitarias compensan capturando abundantes metabolitos pequeños y usándolos como imitadores estructurales de fragmentos de ARN y proteínas degradados.
La tercera parte no simulada de nuestro mapa de crio-EM, encontrada en la subunidad ribosomal grande. La resolución relativamente alta (2,6 Å) de nuestro mapa sugiere que esta densidad pertenece a proteínas con combinaciones únicas de residuos de cadena lateral grande, lo que nos permitió identificar esta densidad como una proteína ribosomal previamente desconocida que identificamos como msL2 (proteína específica de Microsporidia L2) (métodos, figura 6). Nuestra búsqueda de homología mostró que msL2 está conservada en el clado Microsporidia del género Encephaliter y Orosporidium, pero ausente en otras especies, incluyendo otros Microsporidia. En la estructura ribosomal, msL2 ocupa un hueco formado por la pérdida del ARNr ES31L extendido. En este hueco, msL2 ayuda a estabilizar el plegamiento del ARNr y puede compensar la pérdida de ES31L (Figura 6).
a Densidad electrónica y modelo de la proteína ribosómica específica de Microsporidia msL2 encontrada en los ribosomas de E. cuniculi. b La mayoría de los ribosomas eucariotas, incluido el ribosoma 80S de Saccharomyces cerevisiae, tienen la amplificación del ARNr ES19L perdida en la mayoría de las especies de Microsporidia. La estructura previamente establecida del ribosoma de la microsporidia V. necatrix sugiere que la pérdida de ES19L en estos parásitos es compensada por la evolución de la nueva proteína ribosómica msL1. En este estudio, encontramos que el ribosoma de E. cuniculi también desarrolló una proteína adicional que imita al ARN ribosómico como una compensación aparente por la pérdida de ES19L. Sin embargo, msL2 (actualmente anotada como la proteína hipotética ECU06_1135) y msL1 tienen orígenes estructurales y evolutivos diferentes. Este descubrimiento sobre la generación de las proteínas ribosómicas msL1 y msL2, evolutivamente no relacionadas, sugiere que si los ribosomas acumulan mutaciones perjudiciales en su ARNr, pueden alcanzar niveles sin precedentes de diversidad compositiva incluso en un pequeño subconjunto de especies estrechamente relacionadas. Este hallazgo podría ayudar a esclarecer el origen y la evolución del ribosoma mitocondrial, conocido por su ARNr altamente reducido y la variabilidad anómala en su composición proteica entre especies.
Luego comparamos la proteína msL2 con la proteína msL1 descrita previamente, la única proteína ribosómica específica de microsporidios conocida que se encuentra en el ribosoma de V. necatrix. Queríamos comprobar si msL1 y msL2 están relacionadas evolutivamente. Nuestro análisis mostró que msL1 y msL2 ocupan la misma cavidad en la estructura ribosómica, pero tienen estructuras primaria y terciaria diferentes, lo que indica su origen evolutivo independiente (Fig. 6). Por lo tanto, nuestro descubrimiento de msL2 proporciona evidencia de que grupos de especies eucariotas compactas pueden desarrollar de forma independiente proteínas ribosómicas estructuralmente distintas para compensar la pérdida de fragmentos de ARNr. Este hallazgo es notable, ya que la mayoría de los ribosomas eucariotas citoplasmáticos contienen una proteína invariante, incluida la misma familia de 81 proteínas ribosómicas. La aparición de msL1 y msL2 en varios clados de microsporidios en respuesta a la pérdida de segmentos extendidos de ARNr sugiere que la degradación de la arquitectura molecular del parásito hace que los parásitos busquen mutaciones compensatorias, que eventualmente pueden conducir a su adquisición en diferentes poblaciones de parásitos. estructuras.
Finalmente, una vez completado nuestro modelo, comparamos la composición del ribosoma de E. cuniculi con la predicha a partir de la secuencia del genoma. Se creía previamente que varias proteínas ribosómicas, incluidas eL14, eL38, eL41 y eS30, estaban ausentes del genoma de E. cuniculi debido a la aparente ausencia de sus homólogos en dicho genoma. La pérdida de muchas proteínas ribosómicas también se predice en la mayoría de los demás parásitos intracelulares y endosimbiontes altamente reducidos. Por ejemplo, aunque la mayoría de las bacterias de vida libre contienen la misma familia de 54 proteínas ribosómicas, solo 11 de estas familias de proteínas tienen homólogos detectables en cada genoma analizado de bacterias restringidas a un huésped. En apoyo de esta idea, se ha observado experimentalmente una pérdida de proteínas ribosómicas en los microsporidios V. necatrix y P. locustae, que carecen de las proteínas eL38 y eL4131,32.
Sin embargo, nuestras estructuras muestran que solo eL38, eL41 y eS30 se pierden realmente en el ribosoma de E. cuniculi. La proteína eL14 se conservó y nuestra estructura mostró por qué esta proteína no pudo ser encontrada en la búsqueda de homología (Fig. 7). En los ribosomas de E. cuniculi, la mayor parte del sitio de unión de eL14 se pierde debido a la degradación del ES39L amplificado por el ARNr. En ausencia de ES39L, eL14 perdió la mayor parte de su estructura secundaria, y solo el 18% de la secuencia de eL14 fue idéntica en E. cuniculi y S. cerevisiae. Esta escasa preservación de la secuencia es notable porque incluso Saccharomyces cerevisiae y Homo sapiens —organismos que evolucionaron con 1.500 millones de años de diferencia— comparten más del 51% de los mismos residuos en eL14. Esta pérdida anómala de conservación explica por qué la proteína eL14 de E. cuniculi está actualmente anotada como la supuesta proteína M970_061160 y no como la proteína ribosómica eL1427.
y el ribosoma de Microsporidia perdió la extensión de ARNr ES39L, lo que eliminó parcialmente el sitio de unión de la proteína ribosomal eL14. En ausencia de ES39L, la proteína de microspora eL14 sufre una pérdida de estructura secundaria, en la que la antigua hélice α de unión al ARNr degenera en un bucle de longitud mínima. b El alineamiento de secuencias múltiples muestra que la proteína eL14 está altamente conservada en especies eucariotas (57% de identidad de secuencia entre homólogos de levadura y humanos), pero poco conservada y divergente en microsporidios (en los que no más del 24% de los residuos son idénticos al homólogo eL14). de S. cerevisiae o H. sapiens). Esta escasa conservación de secuencia y variabilidad de la estructura secundaria explica por qué el homólogo eL14 nunca se ha encontrado en E. cuniculi y por qué se cree que esta proteína se ha perdido en E. cuniculi. Por el contrario, E. cuniculi eL14 fue previamente anotado como una supuesta proteína M970_061160. Esta observación sugiere que la diversidad del genoma de los microsporidios está actualmente sobreestimada: algunos genes que se creían perdidos en los microsporidios en realidad se conservan, aunque en formas altamente diferenciadas; en cambio, algunos que se cree que codifican genes de microsporidios para proteínas específicas de gusanos (por ejemplo, la proteína hipotética M970_061160) en realidad codifican las proteínas muy diversas que se encuentran en otros eucariotas.
Este hallazgo sugiere que la desnaturalización del ARNr puede provocar una pérdida drástica de la conservación de la secuencia en las proteínas ribosómicas adyacentes, lo que las hace indetectables para las búsquedas de homología. Por lo tanto, podríamos sobreestimar el grado real de degradación molecular en organismos con genomas pequeños, ya que algunas proteínas que se creían perdidas en realidad persisten, aunque en formas muy alteradas.
¿Cómo pueden los parásitos conservar la función de sus máquinas moleculares en condiciones de extrema reducción del genoma? Nuestro estudio responde a esta pregunta describiendo la compleja estructura molecular (ribosoma) de E. cuniculi, un organismo con uno de los genomas eucariotas más pequeños.
Se sabe desde hace casi dos décadas que las moléculas de proteínas y ARN en los parásitos microbianos a menudo difieren de sus moléculas homólogas en las especies de vida libre porque carecen de centros de control de calidad, se reducen al 50% de su tamaño en los microbios de vida libre, etc., muchas mutaciones debilitantes que afectan el plegamiento y la función. Por ejemplo, se espera que los ribosomas de los organismos de genoma pequeño, incluidos muchos parásitos intracelulares y endosimbiontes, carezcan de varias proteínas ribosómicas y hasta un tercio de los nucleótidos de ARNr en comparación con las especies de vida libre 27, 29, 30, 49. Sin embargo, la forma en que estas moléculas funcionan en el parásito sigue siendo en gran medida un misterio, estudiado principalmente a través de la genómica comparativa.
Nuestro estudio demuestra que la estructura de las macromoléculas puede revelar muchos aspectos de la evolución que son difíciles de extraer de los estudios genómicos comparativos tradicionales de parásitos intracelulares y otros organismos restringidos a un huésped (Figura suplementaria 7). Por ejemplo, el caso de la proteína eL14 muestra que podemos sobreestimar el grado real de degradación del aparato molecular en especies parásitas. Actualmente se cree que los parásitos encefalíticos poseen cientos de genes específicos de microsporidios. Sin embargo, nuestros resultados muestran que algunos de estos genes aparentemente específicos son en realidad variantes muy diferentes de genes comunes en otros eucariotas. Además, el caso de la proteína msL2 muestra cómo pasamos por alto nuevas proteínas ribosómicas y subestimamos el contenido de las máquinas moleculares parasitarias. El ejemplo de las moléculas pequeñas muestra cómo podemos pasar por alto las innovaciones más ingeniosas en las estructuras moleculares parasitarias que pueden conferirles nueva actividad biológica.
En conjunto, estos resultados mejoran nuestra comprensión de las diferencias entre las estructuras moleculares de los organismos restringidos a un huésped y sus homólogos en organismos de vida libre. Demostramos que las máquinas moleculares, que durante mucho tiempo se creyeron reducidas, degeneradas y sujetas a diversas mutaciones debilitantes, poseen, en realidad, un conjunto de características estructurales inusuales que se habían pasado por alto sistemáticamente.
Por otro lado, los fragmentos de ARNr no voluminosos y los fragmentos fusionados que encontramos en los ribosomas de E. cuniculi sugieren que la reducción del genoma puede cambiar incluso aquellas partes de la maquinaria molecular básica que se conservan en los tres dominios de la vida, después de casi 3.500 millones de años de evolución independiente de las especies.
Los fragmentos de ARNr fusionados y sin abultamiento en los ribosomas de E. cuniculi son de particular interés a la luz de estudios previos de moléculas de ARN en bacterias endosimbióticas. Por ejemplo, en el endosimbionte de pulgones Buchnera aphidicola, se ha demostrado que las moléculas de ARNr y ARNt tienen estructuras sensibles a la temperatura debido a un sesgo en la composición de A+T y una alta proporción de pares de bases no canónicos20,50. Se cree que estos cambios en el ARN, así como los cambios en las moléculas de proteínas, son responsables de la excesiva dependencia de los endosimbiontes de sus socios y de la incapacidad de los endosimbiontes para transferir calor 21, 23. Aunque el ARNr de las microsporidias parásitas tiene cambios estructurales distintos, la naturaleza de estos cambios sugiere que la estabilidad térmica reducida y la mayor dependencia de las proteínas chaperonas pueden ser características comunes de las moléculas de ARN en organismos con genomas reducidos.
Por otro lado, nuestras estructuras muestran que los microsporidios parásitos han desarrollado una capacidad única para resistir fragmentos de ARNr y proteínas ampliamente conservados, desarrollando la capacidad de utilizar metabolitos pequeños, abundantes y fácilmente disponibles, como imitadores estructurales de fragmentos de ARNr y proteínas degenerados. Degradación de la estructura molecular. Esta opinión está respaldada por el hecho de que las moléculas pequeñas que compensan la pérdida de fragmentos de proteínas en el ARNr y los ribosomas de E. cuniculi se unen a residuos específicos de microsporidios en las proteínas uL15 y eL30. Esto sugiere que la unión de moléculas pequeñas a los ribosomas puede ser producto de la selección positiva, en la que las mutaciones específicas de microsporidios en las proteínas ribosómicas han sido seleccionadas por su capacidad para aumentar la afinidad de los ribosomas por las moléculas pequeñas, lo que puede conducir a organismos ribosómicos más eficientes. El descubrimiento revela una innovación inteligente en la estructura molecular de los parásitos microbianos y nos brinda una mejor comprensión de cómo las estructuras moleculares de los parásitos mantienen su función a pesar de la evolución reductiva.
Actualmente, la identificación de estas pequeñas moléculas sigue sin estar clara. No se sabe por qué su aparición en la estructura ribosomal difiere entre las especies de microsporidios. En particular, no se entiende por qué se observa la unión de nucleótidos en los ribosomas de E. cuniculi y P. locustae, pero no en los de V. necatrix, a pesar de la presencia del residuo F170 en las proteínas eL20 y K172 de V. necatrix. Esta deleción podría deberse al residuo 43 uL6 (situado junto al sitio de unión de nucleótidos), que es tirosina en V. necatrix y no treonina en E. cuniculi y P. locustae. La voluminosa cadena lateral aromática de Tyr43 puede interferir con la unión de nucleótidos debido a la superposición estérica. Otra posibilidad es que la aparente deleción de nucleótidos se deba a la baja resolución de la imagen por crio-EM, lo que dificulta la modelización de los fragmentos ribosomales de V. necatrix.
Por otro lado, nuestro trabajo sugiere que el proceso de degradación del genoma podría ser una fuerza creativa. En particular, la estructura del ribosoma de E. cuniculi indica que la pérdida de ARNr y fragmentos de proteínas en el ribosoma de las microsporidias genera una presión evolutiva que promueve cambios en su estructura. Estas variantes se encuentran lejos del sitio activo del ribosoma y parecen contribuir a mantener (o restaurar) un ensamblaje óptimo del ribosoma que, de otro modo, se vería afectado por la reducción del ARNr. Esto sugiere que una importante innovación del ribosoma de las microsporidias parece haber evolucionado hasta convertirse en una necesidad de amortiguar la deriva genética.
Quizás esto se ilustre mejor con la unión de nucleótidos, que hasta ahora no se había observado en otros organismos. El hecho de que los residuos de unión a nucleótidos estén presentes en microsporidios típicos, pero no en otros eucariotas, sugiere que los sitios de unión a nucleótidos no son meras reliquias a la espera de desaparecer, ni el sitio final para que el ARNr se restaure a la forma de nucleótidos individuales. En cambio, este sitio parece ser una característica útil que podría haber evolucionado a lo largo de varias rondas de selección positiva. Los sitios de unión a nucleótidos podrían ser un subproducto de la selección natural: una vez que ES39L se degrada, los microsporidios se ven obligados a buscar compensación para restaurar la biogénesis óptima del ribosoma en ausencia de ES39L. Dado que este nucleótido puede imitar los contactos moleculares del nucleótido A3186 en ES39L, la molécula de nucleótido se convierte en un componente básico del ribosoma, cuya unión mejora aún más mediante la mutación de la secuencia eL30.
En lo que respecta a la evolución molecular de los parásitos intracelulares, nuestro estudio demuestra que las fuerzas de la selección natural darwiniana y la deriva genética de la degradación del genoma no operan en paralelo, sino que oscilan. En primer lugar, la deriva genética elimina características importantes de las biomoléculas, lo que hace que la compensación sea sumamente necesaria. Solo cuando los parásitos satisfacen esta necesidad mediante la selección natural darwiniana, sus macromoléculas tienen la oportunidad de desarrollar sus rasgos más impresionantes e innovadores. Es importante destacar que la evolución de los sitios de unión de nucleótidos en el ribosoma de E. cuniculi sugiere que este patrón de pérdida-ganancia en la evolución molecular no solo amortiza las mutaciones deletéreas, sino que a veces confiere funciones completamente nuevas a las macromoléculas parasitarias.
Esta idea es consistente con la teoría del equilibrio móvil de Sewell Wright, que establece que un sistema estricto de selección natural limita la capacidad de los organismos para innovar51,52,53. Sin embargo, si la deriva genética interrumpe la selección natural, estas derivas pueden producir cambios que no son en sí mismos adaptativos (o incluso perjudiciales) pero conducen a cambios adicionales que proporcionan una mayor aptitud o una nueva actividad biológica. Nuestro marco respalda esta idea al ilustrar que el mismo tipo de mutación que reduce el plegamiento y la función de una biomolécula parece ser el principal desencadenante de su mejora. En línea con el modelo evolutivo de beneficio mutuo, nuestro estudio muestra que la degradación del genoma, tradicionalmente vista como un proceso degenerativo, también es un importante impulsor de la innovación, a veces y quizás incluso a menudo permitiendo que las macromoléculas adquieran nuevas actividades parasitarias. pueden utilizarlas.