Dėkojame, kad apsilankėte Nature.com. Jūsų naudojama naršyklės versija turi ribotą CSS palaikymą. Kad galėtumėte naudotis visomis įmanomomis funkcijomis, rekomenduojame naudoti atnaujintą naršyklę (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“). Tuo tarpu, siekdami užtikrinti nuolatinį palaikymą, svetainę pateiksime be stilių ir „JavaScript“.
Mikrobinių parazitų evoliucija apima natūralios atrankos, dėl kurios parazitai tobulėja, ir genetinio dreifo, dėl kurio parazitai praranda genus ir kaupia žalingas mutacijas, priešingą poveikį. Siekdami suprasti, kaip ši priešingybė vyksta vienos makromolekulės mastu, aprašome Encephalitozoon cuniculi, eukariotinio organizmo, turinčio vieną mažiausių genomų gamtoje, ribosomos krio-EM struktūrą. Ekstremalų rRNR sumažėjimą E. cuniculi ribosomose lydi precedento neturintys struktūriniai pokyčiai, tokie kaip anksčiau nežinomų susiliejusių rRNR jungčių ir rRNR be iškilimų evoliucija. Be to, E. cuniculi ribosoma išgyveno rRNR fragmentų ir baltymų praradimą, išsiugdydama gebėjimą naudoti mažas molekules kaip suskaidytų rRNR fragmentų ir baltymų struktūrinius imitatorius. Apskritai parodome, kad molekulinės struktūros, kurios ilgai buvo laikomos redukuotomis, degeneravusiomis ir linkusios į silpninančias mutacijas, turi daug kompensacinių mechanizmų, kurie išlaiko jas aktyvias, nepaisant ekstremalių molekulinių susitraukimų.
Kadangi dauguma mikrobinių parazitų grupių turi unikalius molekulinius įrankius savo šeimininkams išnaudoti, dažnai turime kurti skirtingus gydymo būdus skirtingoms parazitų grupėms1,2. Tačiau nauji duomenys rodo, kad kai kurie parazitų evoliucijos aspektai yra konverguojantys ir daugiausia nuspėjami, o tai rodo galimą plataus masto terapinių intervencijų, skirtų mikrobiniams parazitams, pagrindą3,4,5,6,7,8,9.
Ankstesni darbai nustatė bendrą mikrobinių parazitų evoliucijos tendenciją, vadinamą genomo redukcija arba genomo irimu10,11,12,13. Dabartiniai tyrimai rodo, kad kai mikroorganizmai atsisako savo laisvo gyvenimo būdo ir tampa viduląsteliniais parazitais (arba endosimbiontais), jų genomai per milijonus metų patiria lėtas, bet nuostabias metamorfozes9,11. Proceso, vadinamo genomo irimu, metu mikrobiniai parazitai kaupia žalingas mutacijas, kurios daugelį anksčiau svarbių genų paverčia pseudogenais, o tai lemia laipsnišką genų praradimą ir mutacijų kolapsą14,15. Šis kolapsas gali sunaikinti iki 95 % genų seniausiuose viduląsteliniuose organizmuose, palyginti su artimai giminingomis laisvai gyvenančiomis rūšimis. Taigi, viduląstelinių parazitų evoliucija yra dviejų priešingų jėgų kova: Darvino natūralioji atranka, dėl kurios parazitai pagerėjo, ir genomo kolapsas, dėl kurio parazitai nugrimzdo į užmarštį. Kaip parazitui pavyko išbristi iš šios kovos ir išlaikyti savo molekulinės struktūros aktyvumą, lieka neaišku.
Nors genomo irimo mechanizmas nėra iki galo ištirtas, atrodo, kad jis vyksta daugiausia dėl dažno genetinio dreifo. Kadangi parazitai gyvena mažose, nelytinėse ir genetiškai ribotose populiacijose, jie negali veiksmingai pašalinti žalingų mutacijų, kurios kartais atsiranda DNR replikacijos metu. Tai veda prie negrįžtamo žalingų mutacijų kaupimosi ir parazito genomo redukcijos. Dėl to parazitas ne tik praranda genus, kurie nebėra būtini jo išlikimui ląstelės viduje. Būtent parazitų populiacijų nesugebėjimas veiksmingai pašalinti sporadinių žalingų mutacijų sukelia šių mutacijų kaupimąsi visame genome, įskaitant svarbiausius genus.
Didžioji dalis dabartinio genomo redukcijos supratimo grindžiama vien genomo sekų palyginimu, mažiau dėmesio skiriant pokyčiams tikrose molekulėse, kurios atlieka tvarkončias funkcijas ir yra potencialūs vaistų taikiniai. Lyginamieji tyrimai parodė, kad žalingų tarpląstelinių mikrobų mutacijų našta, atrodo, lemia baltymų ir nukleorūgšties netinkamą lankstymąsi ir agregaciją, todėl jie labiau priklausomi nuo šaperonų ir yra jautrūs karščiui19,20,21,22,23. Be to, įvairūs parazitai, kurių nepriklausoma evoliucija kartais skyrė net 2,5 milijardo metų, patyrė panašų kokybės kontrolės centrų praradimą savo baltymų sintezėje5,6 ir DNR atstatymo mechanizmuose24. Tačiau mažai žinoma apie tarpląstelinio gyvenimo būdo poveikį visoms kitoms ląstelių makromolekulių savybėms, įskaitant molekulinę adaptaciją prie didėjančios žalingų mutacijų naštos.
Šiame darbe, siekdami geriau suprasti viduląstelinių mikroorganizmų baltymų ir nukleorūgščių evoliuciją, nustatėme viduląstelinio parazito Encephalitozoon cuniculi ribosomų struktūrą. E. cuniculi yra į grybelį panašus organizmas, priklausantis parazitinių mikrosporidijų grupei, turinčiai neįprastai mažus eukariotinius genomus ir todėl naudojamoms kaip modeliniai organizmai genomo irimui tirti25,26,27,28,29,30. Neseniai krio-EM ribosomų struktūra buvo nustatyta vidutiniškai redukuotiems Microsporidijų, Paranosema locustae ir Vairimorpha necatrix31,32 genomams (~3,2 Mb genomas). Šios struktūros rodo, kad tam tikrą rRNR amplifikacijos praradimą kompensuoja naujų kontaktų tarp kaimyninių ribosominių baltymų atsiradimas arba naujų msL131,32 ribosominių baltymų įgijimas. Encefalitozoon rūšis (genomas ~2,5 mln. bp), kaip ir artimiausia giminaitė Ordospora, demonstruoja didžiausią genomo redukcijos laipsnį tarp eukariotų – jos turi mažiau nei 2000 baltymus koduojančių genų, ir tikimasi, kad jų ribosomos ne tik neturi rRNR ekspansijos fragmentų (rRNR fragmentų, kurie skiria eukariotines ribosomas nuo bakterijų ribosomų), bet ir turi keturis ribosominius baltymus dėl homologų trūkumo E. cuniculi genome26,27,28. Todėl padarėme išvadą, kad E. cuniculi ribosoma gali atskleisti anksčiau nežinomas molekulinės adaptacijos prie genomo irimo strategijas.
Mūsų krio-EM struktūra atspindi mažiausią eukariotinę citoplazminę ribosomą, kurią dar galima apibūdinti, ir suteikia įžvalgų apie tai, kaip didžiausias genomo redukcijos laipsnis veikia ląstelės molekulinio mechanizmo struktūrą, surinkimą ir evoliuciją. Nustatėme, kad E. cuniculi ribosoma pažeidžia daugelį plačiai išsaugotų RNR lankstymosi ir ribosomų surinkimo principų, ir atradome naują, anksčiau nežinomą ribosominį baltymą. Gana netikėtai parodome, kad mikrosporidijų ribosomos išsiugdė gebėjimą jungtis prie mažų molekulių, ir iškėlėme hipotezę, kad rRNR ir baltymų sutrumpinimas sukelia evoliucines inovacijas, kurios galiausiai gali suteikti ribosomai naudingų savybių.
Siekdami geriau suprasti baltymų ir nukleorūgščių evoliuciją ląstelėse esančiuose organizmuose, nusprendėme išskirti E. cuniculi sporas iš užkrėstų žinduolių ląstelių kultūrų, kad išgrynintume jų ribosomas ir nustatytume šių ribosomų struktūrą. Sunku gauti daug parazitinių mikrosporidijų, nes mikrosporidijų negalima kultivuoti maitinamojoje terpėje. Jos auga ir dauginasi tik šeimininkės ląstelės viduje. Todėl, norėdami gauti E. cuniculi biomasę ribosomų gryninimui, užkrėtėme žinduolių inkstų ląstelių liniją RK13 E. cuniculi sporomis ir kelias savaites kultivavome šias užkrėstas ląsteles, kad E. cuniculi galėtų augti ir daugintis. Naudodami maždaug pusės kvadratinio metro užkrėstų ląstelių monosluoksnį, galėjome išgryninti apie 300 mg Microsporidia sporų ir panaudoti jas ribosomoms išskirti. Tada išgrynintas sporas suardėme stiklo karoliukais ir išskyrėme neapdorotas ribosomas, naudodami laipsnišką lizatų polietilenglikolio frakcionavimą. Tai leido mums gauti maždaug 300 µg neapdorotų E. cuniculi ribosomų struktūrinei analizei.
Tada, naudodami gautus ribosomų mėginius, surinkome krio-EM vaizdus ir apdorojome šiuos vaizdus naudodami kaukes, atitinkančias didelį ribosominį subvienetą, mažą subvieneto galvą ir mažą subvienetą. Šio proceso metu surinkome apie 108 000 ribosominių dalelių vaizdus ir apskaičiavome krio-EM vaizdus su 2,7 Å skiriamąja geba (papildomi 1–3 paveikslai). Tada panaudojome krio-EM vaizdus rRNR, ribosominio baltymo ir hibernacijos faktoriaus Mdf1, susijusio su E. cuniculi ribosomomis, modeliavimui (1a, b pav.).
a E. cuniculi ribosomos struktūra komplekse su hibernacijos faktoriumi Mdf1 (pdb id 7QEP). b Hibernacijos faktoriaus Mdf1, susijusio su E. cuniculi ribosoma, žemėlapis. c Antrinės struktūros žemėlapis, kuriame lyginama išgauta rRNR iš Microsporidian rūšių su žinomomis ribosominėmis struktūromis. Paneliuose parodyta amplifikuotų rRNR fragmentų (ES) ir ribosomų aktyviųjų vietų, įskaitant dekodavimo vietą (DC), sarcinicino kilpą (SRL) ir peptidiltransferazės centrą (PTC), vieta. d Elektronų tankis, atitinkantis E. cuniculi ribosomos peptidiltransferazės centrą, rodo, kad ši katalizinė vieta turi tokią pačią struktūrą E. cuniculi parazite ir jo šeimininkuose, įskaitant H. sapiens. e, f Atitinkamas dekodavimo centro elektronų tankis (e) ir dekodavimo centro scheminė struktūra (f) rodo, kad E. cuniculi turi U1491 liekanas, o ne A1491 (E. coli numeracija) daugelyje kitų eukariotų. Šis pokytis rodo, kad E. cuniculi gali būti jautri antibiotikams, kurie veikia šią aktyviąją vietą.
Skirtingai nuo anksčiau nustatytų V. necatrix ir P. locustae ribosomų struktūrų (abi struktūros atstovauja tai pačiai mikrosporidijų šeimai Nosematidae ir yra labai panašios viena į kitą),31,32 E. cuniculi ribosomos patiria daugybę rRNR ir baltymų fragmentacijos procesų. Tolesnė denatūracija (papildomi 4–6 paveikslai). rRNR ryškiausi pokyčiai buvo visiškas amplifikuoto 25S rRNR fragmento ES12L praradimas ir dalinė h39, h41 ir H18 spiralių degeneracija (1c pav., papildomas 4 paveikslas). Tarp ribosominių baltymų ryškiausi pokyčiai buvo visiškas eS30 baltymo praradimas ir eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 ir eS7 baltymų sutrumpėjimas (papildomi 4 ir 5 paveikslai).
Taigi, ekstremalus Encephalotozoon/Ordospora rūšių genomų sumažėjimas atsispindi jų ribosomų struktūroje: E. cuniculi ribosomos patiria didžiausią baltymų kiekio sumažėjimą iš eukariotinių citoplazminių ribosomų, kurioms atliktas struktūrinis apibūdinimas, ir jos net neturi tų rRNR ir baltymų fragmentų, kurie yra plačiai konservuoti ne tik eukariotuose, bet ir trijuose gyvybės domenuose. E. cuniculi ribosomos struktūra pateikia pirmąjį šių pokyčių molekulinį modelį ir atskleidžia evoliucinius įvykius, kurie buvo nepastebėti tiek lyginamosios genomikos, tiek tarpląstelinės biomolekulinės struktūros tyrimuose (papildomas 7 pav.). Toliau aprašome kiekvieną iš šių įvykių kartu su jų tikėtina evoliucine kilme ir galimu poveikiu ribosomų funkcijai.
Tada nustatėme, kad be didelių rRNR sutrumpėjimų, E. cuniculi ribosomos turi rRNR variantų vienoje iš savo aktyviųjų vietų. Nors E. cuniculi ribosomos peptidiltransferazės centras turi tokią pačią struktūrą kaip ir kitos eukariotinės ribosomos (1d pav.), dekodavimo centras skiriasi dėl sekos variacijos ties 1491 nukleotidu (E. coli numeracija, 1e, f pav.). Šis pastebėjimas yra svarbus, nes eukariotinių ribosomų dekodavimo vietoje paprastai yra G1408 ir A1491 liekanos, palyginti su bakterijų tipo A1408 ir G1491 liekanomis. Šis variantas paaiškina skirtingą bakterijų ir eukariotinių ribosomų jautrumą ribosominių antibiotikų aminoglikozidų šeimai ir kitoms mažoms molekulėms, kurios veikia dekodavimo vietą. E. cuniculi ribosomos dekodavimo vietoje A1491 liekana buvo pakeista U1491, potencialiai sukuriant unikalią jungimosi sąsają mažoms molekulėms, nukreiptoms į šią aktyviąją vietą. Tas pats A14901 variantas yra ir kitose mikrosporidijose, tokiose kaip P. locustae ir V. necatrix, o tai rodo, kad jis yra plačiai paplitęs tarp mikrosporidijų rūšių (1f pav.).
Kadangi mūsų E. cuniculi ribosomų mėginiai buvo išskirti iš metaboliškai neaktyvių sporų, ištyrėme E. cuniculi krio-EM žemėlapį, ieškodami anksčiau aprašyto ribosomų prisijungimo streso ar bado sąlygomis. Žiemos miego faktoriai 31, 32, 36, 37, 38. Anksčiau nustatytą žiemojančios ribosomos struktūrą sulyginome su E. cuniculi ribosomos krio-EM žemėlapiu. Dokui S. cerevisiae ribosomos buvo panaudotos komplekse su žiemos faktoriumi Stm138, saldžiavaisio pupmedžio ribosomos – komplekse su Lso232 faktoriumi, o V. necatrix ribosomos – komplekse su Mdf1 ir Mdf231 faktoriais. Tuo pačiu metu nustatėme krio-EM tankį, atitinkantį ramybės faktorių Mdf1. Panašiai kaip Mdf1 jungiasi prie V. necatrix ribosomos, Mdf1 taip pat jungiasi prie E. cuniculi ribosomos, kur blokuoja ribosomos E vietą, galbūt padėdamas ribosomoms tapti prieinamoms, kai parazitų sporos tampa metaboliškai neaktyvios dėl organizmo inaktyvacijos (2 pav.).
Mdf1 blokuoja ribosomos E vietą, kuri, atrodo, padeda inaktyvuoti ribosomą, kai parazito sporos tampa metaboliškai neaktyvios. E. cuniculi ribosomos struktūroje nustatėme, kad Mdf1 sudaro anksčiau nežinomą kontaktą su L1 ribosomos kamienu – ribosomos dalimi, kuri palengvina deacilintos tRNR išsiskyrimą iš ribosomos baltymų sintezės metu. Šie kontaktai rodo, kad Mdf1 disocijuojasi nuo ribosomos tuo pačiu mechanizmu kaip ir deacetilinta tRNR, o tai gali paaiškinti, kaip ribosoma pašalina Mdf1, kad iš naujo aktyvuotų baltymų sintezę.
Tačiau mūsų struktūra atskleidė nežinomą kontaktą tarp Mdf1 ir L1 ribosomos kojos (ribosomos dalies, kuri padeda išskirti deacilintą tRNR iš ribosomos baltymų sintezės metu). Visų pirma, Mdf1 naudoja tuos pačius kontaktus kaip ir deacilintos tRNR molekulės alkūnės segmentas (2 pav.). Šis anksčiau nežinomas molekulinis modeliavimas parodė, kad Mdf1 disocijuojasi nuo ribosomos tuo pačiu mechanizmu kaip ir deacetilinta tRNR, o tai paaiškina, kaip ribosoma pašalina šį žiemos miego faktorių, kad iš naujo aktyvuotų baltymų sintezę.
Konstruodami rRNR modelį, nustatėme, kad E. cuniculi ribosoma turi nenormaliai susilanksčiusius rRNR fragmentus, kuriuos pavadinome susiliejusia rRNR (3 pav.). Ribosomose, apimančiose tris gyvybės domenus, rRNR susilanksto į struktūras, kuriose dauguma rRNR bazių poruojasi ir susilanksto viena su kita arba sąveikauja su ribosominiais baltymais38,39,40. Tačiau E. cuniculi ribosomose rRNR, atrodo, pažeidžia šį susilankstymo principą, paversdamos kai kurias savo spirales nesusilanksčiusiomis rRNR sritimis.
H18 25S rRNR spiralės struktūra S. cerevisiae, V. necatrix ir E. cuniculi bakterijose. Paprastai ribosomose, apimančiose tris gyvybės domenus, ši jungtis susisuka į RNR spiralę, kurioje yra nuo 24 iki 34 liekanų. Priešingai, mikrosporidijose ši rRNR jungtis palaipsniui redukuojama iki dviejų viengrandžių, uridinu praturtintų jungčių, turinčių tik 12 liekanų. Dauguma šių liekanų yra veikiamos tirpiklių. Paveikslėlyje parodyta, kad parazitinės mikrosporidijos, atrodo, pažeidžia bendruosius rRNR lankstymosi principus, kai rRNR bazės paprastai yra sujungtos su kitomis bazėmis arba dalyvauja rRNR ir baltymų sąveikoje. Mikrosporidijose kai kurie rRNR fragmentai įgauna nepalankią raukšlę, kurioje buvusi rRNR spiralė tampa beveik tiesia linija pailgintu viengrandiu fragmentu. Šių neįprastų sričių buvimas leidžia mikrosporidijų rRNR prisijungti prie tolimų rRNR fragmentų, naudojant minimalų RNR bazių skaičių.
Ryškiausias šio evoliucinio perėjimo pavyzdys yra H18 25S rRNR spiralė (3 pav.). Rūšims nuo E. coli iki žmonių šios rRNR spiralės bazės turi 24–32 nukleotidus, sudarydamos šiek tiek netaisyklingą spiralę. Anksčiau identifikuotose ribosominėse struktūrose iš V. necatrix ir P. locustae31,32 H18 spiralės bazės yra iš dalies išsivyniojusios, tačiau nukleotidų bazių poravimasis išsaugomas. Tačiau E. cuniculi šis rRNR fragmentas tampa trumpiausiais jungikliais 228UUUGU232 ir 301UUUUUUUUUU307. Skirtingai nuo tipiškų rRNR fragmentų, šie uridinu turtingi jungikliai nesusisukinėja ir neužmezga didelio kontakto su ribosomų baltymais. Vietoj to, jie įgauna tirpiklio atviras ir visiškai išsilanksčiusias struktūras, kuriose rRNR grandinės yra ištiestos beveik tiesiai. Ši ištempta konformacija paaiškina, kodėl E. cuniculi naudoja tik 12 RNR bazių, kad užpildytų 33 Å tarpą tarp H16 ir H18 rRNR spiralių, o kitoms rūšims reikia bent dvigubai daugiau rRNR bazių, kad užpildytų tarpą.
Taigi, galime parodyti, kad dėl energetiškai nepalankaus lankstymosi parazitinės mikrosporidijos sukūrė strategiją, kaip susitraukti net ir tuos rRNR segmentus, kurie išlieka plačiai konservuoti skirtingose ​​rūšyse trijose gyvybės srityse. Matyt, kaupdamos mutacijas, kurios transformuoja rRNR spirales į trumpus poli-U jungiklius, E. cuniculi gali sudaryti neįprastus rRNR fragmentus, turinčius kuo mažiau nukleotidų distalinių rRNR fragmentų ligavimui. Tai padeda paaiškinti, kaip mikrosporidijos pasiekė dramatišką savo pagrindinės molekulinės struktūros sumažėjimą neprarasdamos savo struktūrinio ir funkcinio vientisumo.
Dar vienas neįprastas E. cuniculi rRNR bruožas yra rRNR išvaizda be sustorėjimų (4 pav.). Išsipūtimai yra nukleotidai be bazių porų, kurie išsisuka iš RNR spiralės, o ne joje pasislepia. Dauguma rRNR išsikišimų veikia kaip molekuliniai klijai, padedantys prisijungti prie gretimų ribosomų baltymų ar kitų rRNR fragmentų. Kai kurie išsikišimai veikia kaip vyriai, leidžiantys rRNR spiralei optimaliai lankstytis ir klostytis, kad būtų galima produktyviai baltymų sintezei vykti 41.
a E. cuniculi ribosomų struktūroje nėra rRNR iškilimo (S. cerevisiae numeracija), tačiau jis yra daugumoje kitų eukariotų. b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens ir E. cuniculi vidinėse ribosomose. Parazitams trūksta daugelio senovinių, labai konservatyvių rRNR iškilimų. Šie sustorėjimai stabilizuoja ribosomų struktūrą; todėl jų nebuvimas mikrosporidijose rodo sumažėjusį rRNR lankstymosi stabilumą mikrosporidijų parazituose. Palyginimas su P stiebais (L7/L12 stiebai bakterijose) rodo, kad rRNR iškilimų praradimas kartais sutampa su naujų iškilimų atsiradimu šalia prarastų iškilimų. H42 spiralė 23S/28S rRNR turi senovinį iškilimą (U1206 Saccharomyces cerevisiae), kuris, kaip manoma, yra mažiausiai 3,5 milijardo metų senumo dėl jo apsaugos trijose gyvybės srityse. Mikrosporidijose šis iškilimas išnyksta. Tačiau šalia prarasto iškilimo atsirado naujas iškilimas (A1306 E. cuniculi).
Įspūdingai, pastebėjome, kad E. cuniculi ribosomose trūksta daugumos rRNR iškilimų, randamų kitose rūšyse, įskaitant daugiau nei 30 iškilimų, išsaugotų kituose eukariotuose (4a pav.). Šis praradimas panaikina daugelį kontaktų tarp ribosomų subvienetų ir gretimų rRNR spiralių, kartais ribosomoje sukurdamas dideles tuščiavidures ertmes, todėl E. cuniculi ribosoma tampa porėtesnė, palyginti su tradiciškesnėmis ribosomomis (4b pav.). Pažymėtina, kad nustatėme, jog dauguma šių iškilimų taip pat buvo prarasti anksčiau identifikuotose V. necatrix ir P. locustae ribosomų struktūrose, kurios nebuvo pastebėtos atliekant ankstesnes struktūrines analizes31,32.
Kartais rRNR iškilimų praradimas yra lydimas naujų iškilimų atsiradimo šalia prarasto iškilimo. Pavyzdžiui, ribosominiame P stiebe yra U1208 iškilimas (Saccharomyces cerevisiae), kuris išliko nuo E. coli iki žmonių ir todėl yra maždaug 3,5 milijardo metų senumo. Baltymų sintezės metu šis iškilimas padeda P stiebui judėti tarp atviros ir uždaros konformacijos, kad ribosoma galėtų pritraukti transliacijos faktorius ir juos pristatyti į aktyviąją vietą. E. cuniculi ribosomose šio sustorėjimo nėra; tačiau naujas sustorėjimas (G883), esantis tik trijose bazių porose, gali prisidėti prie optimalaus P stiebo lankstumo atkūrimo (4c pav.).
Mūsų duomenys apie rRNR be iškilimų rodo, kad rRNR kiekio sumažinimas neapsiriboja rRNR elementų praradimu ribosomos paviršiuje, bet gali apimti ir ribosomos branduolį, sukurdamas parazitui būdingą molekulinį defektą, kuris nebuvo aprašytas laisvai gyvose ląstelėse. Stebimos gyvos rūšys.
Sumodeliavę kanoninius ribosominius baltymus ir rRNR, nustatėme, kad įprasti ribosominiai komponentai negali paaiškinti trijų krio-EM vaizdo dalių. Du iš šių fragmentų yra mažos molekulės (5 pav., papildomas 8 pav.). Pirmasis segmentas yra tarp ribosominių baltymų uL15 ir eL18, padėtyje, kurią paprastai užima eL18 C-galas, kuris E. cuniculi yra sutrumpintas. Nors negalime nustatyti šios molekulės tapatybės, šios tankio salos dydį ir formą gerai paaiškina spermidino molekulių buvimas. Jos prisijungimą prie ribosomos stabilizuoja mikrosporidijoms būdingos uL15 baltymų mutacijos (Asp51 ir Arg56), kurios, atrodo, padidina ribosomos afinitetą šiai mažai molekulei, nes leidžia uL15 apvynioti mažą molekulę ribosominėje struktūroje. Papildomas 2 pav., 8 papildomi duomenys 1, 2).
Krio-EM vaizdavimas, rodantis nukleotidų buvimą už ribozės ribų, prisijungusių prie E. cuniculi ribosomos. E. cuniculi ribosomoje šis nukleotidas užima tą pačią vietą, kaip ir 25S rRNR A3186 nukleotidas (Saccharomyces cerevisiae numeracija) daugumoje kitų eukariotinių ribosomų. b E. cuniculi ribosominėje struktūroje šis nukleotidas yra tarp ribosominių baltymų uL9 ir eL20, taip stabilizuodamas kontaktą tarp šių dviejų baltymų. cd eL20 sekos išsaugojimo analizė tarp mikrosporidijų rūšių. Mikrosporidijų rūšių filogenetinis medis (c) ir eL20 baltymo daugybinis sekų lygiavimas (d) rodo, kad nukleotidus jungiančios liekanos F170 ir K172 yra išsaugotos daugumoje tipiškų mikrosporidijų, išskyrus S. lophii, išskyrus anksti šakojasinčias mikrosporidijas, kurios išlaikė ES39L rRNR plėtinį. e Šiame paveiksle parodyta, kad nukleotidus jungiančios liekanos F170 ir K172 yra tik labai redukuoto mikrosporidijų genomo eL20, bet ne kituose eukariotuose. Apskritai šie duomenys rodo, kad mikrosporidijų ribosomos sukūrė nukleotidų jungimosi vietą, kuri, atrodo, jungiasi su AMP molekulėmis ir naudoja jas baltymų sąveikai ribosomų struktūroje stabilizuoti. Didelis šios jungimosi vietos konservatyvumas mikrosporidijose ir jos nebuvimas kituose eukariotuose rodo, kad ši vieta gali suteikti selektyvų išgyvenimo pranašumą mikrosporidijoms. Taigi, nukleotidų jungimosi kišenė mikrosporidijų ribosomoje, atrodo, nėra išsigimęs rRNR degradacijos požymis ar galutinė forma, kaip aprašyta anksčiau, o veikiau naudinga evoliucinė naujovė, leidžianti mikrosporidijų ribosomai tiesiogiai jungtis prie mažų molekulių, naudojant jas kaip molekulinius statybinius blokus. Šis atradimas paverčia mikrosporidijų ribosomą vienintele žinoma ribosoma, kuri naudoja vieną nukleotidą kaip savo struktūrinį statybinį bloką. f Hipotetinis evoliucinis kelias, kilęs iš nukleotidų jungimosi.
Antrasis mažos molekulinės masės tankis yra ribosominių baltymų uL9 ir eL30 sąsajoje (5a pav.). Ši sąsaja anksčiau buvo aprašyta Saccharomyces cerevisiae ribosomos struktūroje kaip rRNR A3186 25S nukleotido (ES39L rRNR pratęsimo dalies) prisijungimo vieta38. Buvo parodyta, kad degeneravusiose P. locustae ES39L ribosomose ši sąsaja jungiasi su nežinomu vienu nukleotidu 31, ir manoma, kad šis nukleotidas yra redukuota galutinė rRNR forma, kurioje rRNR ilgis yra ~130–230 bazių. ES39L yra redukuotas iki vieno nukleotido 32,43. Mūsų krio-EM vaizdai patvirtina idėją, kad tankį galima paaiškinti nukleotidais. Tačiau didesnė mūsų struktūros skiriamoji geba parodė, kad šis nukleotidas yra ekstraribosominė molekulė, galbūt AMP (5a, b pav.).
Tada paklausėme, ar nukleotidų prisijungimo vieta atsirado E. cuniculi ribosomoje, ar ji egzistavo anksčiau. Kadangi nukleotidų prisijungimą daugiausia lemia Phe170 ir Lys172 liekanos eL30 ribosominiame baltyme, įvertinome šių liekanų konservatyvumą 4396 reprezentatyviuose eukariotuose. Kaip ir aukščiau minėtame uL15 atveju, nustatėme, kad Phe170 ir Lys172 liekanos yra labai konservatyvios tik tipinėse Microsporidia, bet jų nėra kituose eukariotuose, įskaitant netipines Microsporidia Mitosporidium ir Amphiamblys, kuriose ES39L rRNR fragmentas nėra redukuotas 44, 45, 46 (5c pav.). -e).
Apibendrinus šiuos duomenis, galima teigti, kad E. cuniculi ir galbūt kitos kanoninės mikrosporidijos išsiugdė gebėjimą efektyviai užfiksuoti didelį kiekį mažų metabolitų ribosomų struktūroje, kad kompensuotų rRNR ir baltymų kiekio sumažėjimą. Taip darydamos, jos išvystė unikalų gebėjimą jungtis prie nukleotidų už ribosomos ribų, o tai rodo, kad parazitinės molekulinės struktūros kompensuoja užfiksuodamos gausius mažus metabolitus ir naudodamos juos kaip struktūrinius suskaidytų RNR ir baltymų fragmentų imitatorius.
Trečioji nemodiliuota mūsų krio-EM žemėlapio dalis, rasta dideliame ribosominiame subvienete. Santykinai didelė mūsų žemėlapio skiriamoji geba (2,6 Å) rodo, kad šis tankis priklauso baltymams su unikaliais didelių šoninių grandinių liekanų deriniais, todėl šį tankį identifikavome kaip anksčiau nežinomą ribosominį baltymą, kurį identifikavome kaip... Jis buvo pavadintas msL2 (Microsporidia-specifinis baltymas L2) (metodai, 6 pav.). Mūsų homologijos paieška parodė, kad msL2 yra konservuotas Encephaliter genties Microsporidia klade ir Orosporidium, bet nėra kitose rūšyse, įskaitant kitas Microsporidia. Ribosominėje struktūroje msL2 užima tarpą, susidariusį praradus išplėstinę ES31L rRNR. Šioje tuštumoje msL2 padeda stabilizuoti rRNR sulankstymą ir gali kompensuoti ES31L praradimą (6 pav.).
a Microsporidia specifinio ribosominio baltymo msL2, randamo E. cuniculi ribosomose, elektronų tankis ir modelis. b Daugumoje eukariotinių ribosomų, įskaitant Saccharomyces cerevisiae 80S ribosomą, daugumoje Microsporidia rūšių prarasta ES19L rRNR amplifikacija. Anksčiau nustatyta V. necatrix microsporidia ribosomos struktūra rodo, kad ES19L praradimą šiuose parazituose kompensuoja naujo msL1 ribosominio baltymo evoliucija. Šiame tyrime nustatėme, kad E. cuniculi ribosoma taip pat sukūrė papildomą ribosominę RNR imituojantį baltymą kaip akivaizdžią ES19L praradimo kompensaciją. Tačiau msL2 (šiuo metu anotuotas kaip hipotetinis ECU06_1135 baltymas) ir msL1 turi skirtingą struktūrinę ir evoliucinę kilmę. c Šis evoliuciškai nesusijusių msL1 ir msL2 ribosominių baltymų generavimo atradimas rodo, kad jei ribosomos sukaupia žalingas mutacijas savo rRNR, jos gali pasiekti precedento neturintį sudėties įvairovės lygį net ir nedideliame glaudžiai susijusių rūšių pogrupyje. Šis atradimas galėtų padėti išsiaiškinti mitochondrijų ribosomos, kuri žinoma dėl labai sumažėjusios rRNR ir nenormalaus baltymų sudėties kintamumo tarp rūšių, kilmę ir evoliuciją.
Tada palyginome msL2 baltymą su anksčiau aprašytu msL1 baltymu – vieninteliu žinomu mikrosporidijoms būdingu ribosominiu baltymu, randamu V. necatrix ribosomoje. Norėjome patikrinti, ar msL1 ir msL2 yra evoliuciškai susiję. Mūsų analizė parodė, kad msL1 ir msL2 užima tą pačią ertmę ribosominėje struktūroje, tačiau turi skirtingas pirmines ir tretines struktūras, o tai rodo jų nepriklausomą evoliucinę kilmę (6 pav.). Taigi, mūsų msL2 atradimas pateikia įrodymų, kad kompaktiškų eukariotinių rūšių grupės gali nepriklausomai evoliucionuoti struktūriškai skirtingus ribosominius baltymus, kad kompensuotų rRNR fragmentų praradimą. Šis atradimas yra svarbus tuo, kad daugumoje citoplazminių eukariotinių ribosomų yra invariantinis baltymas, įskaitant tą pačią 81 ribosominio baltymo šeimą. msL1 ir msL2 atsiradimas įvairiose mikrosporidijų kladose, reaguojant į išplėstinių rRNR segmentų praradimą, rodo, kad parazito molekulinės architektūros degradacija verčia parazitus ieškoti kompensacinių mutacijų, kurios galiausiai gali lemti jų įgijimą skirtingose ​​parazitų populiacijose.
Galiausiai, kai mūsų modelis buvo baigtas, palyginome E. cuniculi ribosomos sudėtį su ta, kuri buvo prognozuojama pagal genomo seką. Anksčiau manyta, kad E. cuniculi genome trūksta kelių ribosominių baltymų, įskaitant eL14, eL38, eL41 ir eS30, dėl akivaizdaus jų homologų nebuvimo E. cuniculi genome. Daugelio ribosominių baltymų praradimas taip pat prognozuojamas daugumoje kitų labai redukuotų tarpląstelinių parazitų ir endosimbiontų. Pavyzdžiui, nors dauguma laisvai gyvenančių bakterijų turi tą pačią 54 ribosominių baltymų šeimą, tik 11 iš šių baltymų šeimų turi aptinkamų homologų kiekviename analizuotame šeimininko apribotų bakterijų genome. Šią mintį patvirtina tai, kad ribosominių baltymų praradimas buvo eksperimentiškai pastebėtas V. necatrix ir P. locustae mikrosporidijose, kuriose trūksta eL38 ir eL4131,32 baltymų.
Tačiau mūsų struktūros rodo, kad E. cuniculi ribosomoje iš tikrųjų prarasti tik eL38, eL41 ir eS30. eL14 baltymas buvo konservuotas, ir mūsų struktūra parodė, kodėl šio baltymo nepavyko rasti atliekant homologijos paiešką (7 pav.). E. cuniculi ribosomose didžioji dalis eL14 prisijungimo vietos yra prarasta dėl rRNR amplifikuoto ES39L degradacijos. Nesant ES39L, eL14 prarado didžiąją dalį savo antrinės struktūros ir tik 18 % eL14 sekos buvo identiška E. cuniculi ir S. cerevisiae. Šis prastas sekos išsaugojimas yra stebėtinas, nes net Saccharomyces cerevisiae ir Homo sapiens – organizmai, kurie išsivystė 1,5 milijardo metų skirtumu – turi daugiau nei 51 % tų pačių liekanų eL14. Šis anomalinis konservatyvumo praradimas paaiškina, kodėl E. cuniculi eL14 šiuo metu anotuojamas kaip tariamas M970_061160 baltymas, o ne kaip eL1427 ribosominis baltymas.
ir „Microsporidia“ ribosoma prarado ES39L rRNR išplėtimą, kuris iš dalies panaikino eL14 ribosominio baltymo prisijungimo vietą. Nesant ES39L, eL14 mikrosporos baltymas praranda antrinę struktūrą, kai buvusi rRNR prisijungianti α spiralė degeneruoja į minimalaus ilgio kilpą. b Daugybinis sekų lygiavimas rodo, kad eL14 baltymas yra labai konservatyvus eukariotinėse rūšyse (57 % sekos tapatumas tarp mielių ir žmogaus homologų), tačiau prastai konservuotas ir skirtingas mikrosporidijose (kuriose ne daugiau kaip 24 % liekanų yra identiškos eL14 homologui). iš S. cerevisiae arba H. sapiens). Šis prastas sekos konservatyvumas ir antrinės struktūros kintamumas paaiškina, kodėl eL14 homologas niekada nebuvo rastas E. cuniculi ir kodėl manoma, kad šis baltymas buvo prarastas E. cuniculi. Priešingai, E. cuniculi eL14 anksčiau buvo anotuotas kaip galimas M970_061160 baltymas. Šis stebėjimas rodo, kad mikrosporidijų genomo įvairovė šiuo metu yra pervertinta: kai kurie genai, kurie šiuo metu laikomi prarastais mikrosporidijose, iš tikrųjų yra išsaugoti, nors ir labai diferencijuotomis formomis; vietoj to manoma, kad kai kurie iš jų koduoja mikrosporidijų genus, skirtus kirminams būdingiems baltymams (pvz., hipotetinis baltymas M970_061160 iš tikrųjų koduoja labai įvairius baltymus, randamus kituose eukariotuose).
Šis atradimas rodo, kad rRNR denatūracija gali lemti dramatišką sekos konservatyvumo praradimą gretimuose ribosominiuose baltymuose, todėl šių baltymų neįmanoma aptikti homologijos paieškoms. Taigi, galime pervertinti tikrąjį molekulinio skaidymo laipsnį mažo genomo organizmuose, nes kai kurie baltymai, kurie, kaip manoma, yra prarasti, iš tikrųjų išlieka, nors ir labai pakitusiomis formomis.
Kaip parazitai gali išlaikyti savo molekulinių mašinų funkciją esant ekstremaliam genomo redukavimui? Mūsų tyrimas atsako į šį klausimą aprašydamas sudėtingą E. cuniculi, organizmo, turinčio vieną mažiausių eukariotinių genomų, molekulinę struktūrą (ribosomą).
Jau beveik du dešimtmečius žinoma, kad mikrobinių parazitų baltymų ir RNR molekulės dažnai skiriasi nuo homologiškų molekulių laisvai gyvenančiose rūšyse, nes joms trūksta kokybės kontrolės centrų, laisvai gyvenančiuose mikrobuose jos yra sumažintos iki 50 % savo dydžio ir pan. Yra daug silpninančių mutacijų, kurios sutrikdo jų lankstymąsi ir funkciją. Pavyzdžiui, tikimasi, kad mažų genominių organizmų, įskaitant daugelį viduląstelinių parazitų ir endosimbiontų, ribosomose trūksta kelių ribosominių baltymų ir iki trečdalio rRNR nukleotidų, palyginti su laisvai gyvenančiomis rūšimis [27, 29, 30, 49]. Tačiau šių molekulių veikimo būdas parazituose išlieka paslaptimi, daugiausia tiriamas lyginamosios genomikos metodais.
Mūsų tyrimas rodo, kad makromolekulių struktūra gali atskleisti daugelį evoliucijos aspektų, kuriuos sunku išskirti iš tradicinių lyginamųjų genominių tyrimų, atliktų su viduląsteliniais parazitais ir kitais šeimininko ribojamais organizmais (papildomas 7 pav.). Pavyzdžiui, eL14 baltymo pavyzdys rodo, kad galime pervertinti tikrąjį molekulinio aparato degradacijos laipsnį parazitinėse rūšyse. Manoma, kad encefalitiniai parazitai dabar turi šimtus mikrosporidijoms būdingų genų. Tačiau mūsų rezultatai rodo, kad kai kurie iš šių, atrodytų, specifinių genų iš tikrųjų yra tik labai skirtingi genų variantai, kurie yra įprasti kituose eukariotuose. Be to, msL2 baltymo pavyzdys rodo, kaip mes nepastebime naujų ribosominių baltymų ir nepakankamai įvertiname parazitinių molekulinių mašinų turinį. Mažų molekulių pavyzdys rodo, kaip galime nepastebėti išradingiausių parazitinių molekulinių struktūrų naujovių, kurios gali suteikti joms naują biologinį aktyvumą.
Apibendrinus šiuos rezultatus, galima geriau suprasti skirtumus tarp šeimininko apribotų organizmų ir jų atitikmenų laisvai gyvenančiuose organizmuose molekulinių struktūrų. Parodome, kad molekulinės mašinos, kurios ilgą laiką buvo laikomos redukuotomis, degeneravusiomis ir linkusios į įvairias silpninančias mutacijas, vietoj to turi sistemingai nepastebimų neįprastų struktūrinių ypatybių rinkinį.
Kita vertus, nedidelių gabaritų rRNR fragmentai ir susilieję fragmentai, kuriuos radome E. cuniculi ribosomose, rodo, kad genomo redukcija gali pakeisti net tas pagrindinio molekulinio mechanizmo dalis, kurios yra išsaugotos trijose gyvybės srityse – po beveik 3,5 milijardo metų trukusios nepriklausomos rūšių evoliucijos.
Atsižvelgiant į ankstesnius RNR molekulių tyrimus endosimbiotinėse bakterijose, ypač įdomūs yra išsipūtę ir susilieję rRNR fragmentai E. cuniculi ribosomose. Pavyzdžiui, amarų endosimbionte Buchnera aphidicola rRNR ir tRNR molekulės pasižymi jautriomis temperatūrai struktūromis dėl A+T sudėties paklaidos ir didelės nekanoninių bazių porų dalies [20, 50]. Manoma, kad šie RNR pokyčiai, taip pat baltymų molekulių pokyčiai, yra atsakingi už pernelyg didelę endosimbiontų priklausomybę nuo partnerių ir endosimbiontų nesugebėjimą perduoti šilumos [21, 23]. Nors parazitinių mikrosporidijų rRNR turi struktūrinių pokyčių, šių pokyčių pobūdis rodo, kad sumažėjęs terminis stabilumas ir didesnė priklausomybė nuo chaperoninių baltymų gali būti dažni RNR molekulių požymiai organizmuose su sumažintu genomu.
Kita vertus, mūsų struktūros rodo, kad parazitų mikrosporidijos išsiugdė unikalų gebėjimą atsispirti plačiai konservuotiems rRNR ir baltymų fragmentams, išvystydamos gebėjimą naudoti gausius ir lengvai prieinamus mažus metabolitus kaip struktūrinius degeneravusių rRNR ir baltymų fragmentų imitatorius. Molekulinės struktūros degradacija. Šią nuomonę patvirtina faktas, kad mažos molekulės, kurios kompensuoja baltymų fragmentų praradimą E. cuniculi rRNR ir ribosomose, jungiasi prie mikrosporidijoms būdingų liekanų uL15 ir eL30 baltymuose. Tai rodo, kad mažų molekulių prisijungimas prie ribosomų gali būti teigiamos atrankos produktas, kai mikrosporidijoms būdingos ribosomų baltymų mutacijos buvo atrinktos dėl jų gebėjimo padidinti ribosomų afinitetą mažoms molekulėms, o tai gali lemti efektyvesnius ribosominius organizmus. Šis atradimas atskleidžia išmanią mikrobinių parazitų molekulinės struktūros inovaciją ir leidžia mums geriau suprasti, kaip parazitų molekulinės struktūros išlaiko savo funkciją nepaisant redukcinės evoliucijos.
Šiuo metu šių mažų molekulių identifikavimas lieka neaiškus. Neaišku, kodėl šių mažų molekulių išvaizda ribosominėje struktūroje skiriasi tarp mikrosporidijų rūšių. Visų pirma, neaišku, kodėl nukleotidų prisijungimas stebimas E. cuniculi ir P. locustae ribosomose, o ne V. necatrix ribosomose, nepaisant F170 liekanos buvimo V. necatrix eL20 ir K172 baltymuose. Šią ištrynimą gali sukelti 43 uL6 liekana (esanti greta nukleotidų prisijungimo kišenės), kuri V. necatrix yra tirozinas, o E. cuniculi ir P. locustae ne treoninas. Didelės apimties aromatinė Tyr43 šoninė grandinė gali trukdyti nukleotidų prisijungimui dėl sterinio persidengimo. Arba akivaizdi nukleotidų ištrynimas gali būti dėl mažos krioelektroninio vaizdavimo skiriamosios gebos, kuri trukdo modeliuoti V. necatrix ribosomų fragmentus.
Kita vertus, mūsų darbas rodo, kad genomo irimo procesas gali būti išradinga jėga. Visų pirma, E. cuniculi ribosomos struktūra rodo, kad rRNR ir baltymų fragmentų praradimas mikrosporidijų ribosomoje sukuria evoliucinį spaudimą, kuris skatina ribosomų struktūros pokyčius. Šie variantai atsiranda toli nuo ribosomos aktyviosios vietos ir, atrodo, padeda palaikyti (arba atkurti) optimalų ribosomų surinkimą, kurį kitaip sutrikdytų redukuota rRNR. Tai rodo, kad svarbi mikrosporidijų ribosomos inovacija, atrodo, išsivystė į poreikį buferuoti genų dreifą.
Galbūt tai geriausiai iliustruoja nukleotidų prisijungimas, kuris iki šiol niekada nebuvo pastebėtas kituose organizmuose. Tai, kad nukleotidų prisijungimo liekanos yra tipinėse mikrosporidijose, bet ne kituose eukariotuose, rodo, kad nukleotidų prisijungimo vietos nėra tik išnykimo laukiantys reliktai ar galutinė vieta, kur rRNR bus atkurta į atskirų nukleotidų formą. Vietoj to, ši vieta atrodo kaip naudinga savybė, kuri galėjo išsivystyti per kelis teigiamos atrankos etapus. Nukleotidų prisijungimo vietos gali būti natūralios atrankos šalutinis produktas: kai ES39L yra suskaidomas, mikrosporidijos yra priverstos ieškoti kompensacijos, kad atkurtų optimalią ribosomų biogenezę, kai nėra ES39L. Kadangi šis nukleotidas gali imituoti A3186 nukleotido molekulinius kontaktus ES39L, nukleotido molekulė tampa ribosomos statybiniu bloku, kurio prisijungimas dar labiau pagerėja mutuojant eL30 seką.
Kalbant apie viduląstelinių parazitų molekulinę evoliuciją, mūsų tyrimas rodo, kad Darvino natūraliosios atrankos ir genomo irimo genetinio dreifo jėgos neveikia lygiagrečiai, o svyruoja. Pirma, genetinis dreifas pašalina svarbias biomolekulių savybes, todėl kompensacija tampa labai reikalinga. Tik tada, kai parazitai patenkins šį poreikį Darvino natūraliosios atrankos būdu, jų makromolekulės turės galimybę išvystyti įspūdingiausius ir novatoriškiausius bruožus. Svarbu tai, kad nukleotidų jungimosi vietų evoliucija E. cuniculi ribosomoje rodo, kad šis molekulinės evoliucijos „nuostolis į pelną“ modelis ne tik panaikina žalingas mutacijas, bet kartais ir suteikia parazitinėms makromolekulėms visiškai naujas funkcijas.
Ši idėja atitinka Sewello Wrighto judančios pusiausvyros teoriją, kurioje teigiama, kad griežta natūralios atrankos sistema riboja organizmų gebėjimą kurti naujoves51,52,53. Tačiau jei genetinis dreifas sutrikdo natūralią atranką, šie dreifai gali sukelti pokyčius, kurie patys savaime nėra adaptyvūs (ar net žalingi), bet veda prie tolesnių pokyčių, užtikrinančių didesnį tinkamumą ar naują biologinį aktyvumą. Mūsų sistema patvirtina šią idėją, iliustruodama, kad tos pačios rūšies mutacija, kuri sumažina biomolekulės lankstumą ir funkciją, atrodo, yra pagrindinė jos tobulėjimo varomoji jėga. Remiantis abipusiai naudingu evoliucijos modeliu, mūsų tyrimas rodo, kad genomo irimas, tradiciškai laikomas degeneraciniu procesu, taip pat yra pagrindinė inovacijų varomoji jėga, kartais ir galbūt net dažnai leidžianti makromolekulėms įgyti naujų parazitinių veiklų.