Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS. Za najbolje iskustvo preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazivat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Evolucija mikrobnih parazita uključuje suprotstavljanje između prirodne selekcije, koja uzrokuje poboljšanje parazita, i genetskog drifta, koji uzrokuje gubitak gena kod parazita i akumulaciju štetnih mutacija. Ovdje, kako bismo razumjeli kako se ovo suprotstavljanje događa na razini jedne makromolekule, opisujemo krio-EM strukturu ribosoma Encephalitozoon cuniculi, eukariotskog organizma s jednim od najmanjih genoma u prirodi. Ekstremno smanjenje rRNA u ribosomima E. cuniculi popraćeno je neviđenim strukturnim promjenama, poput evolucije prethodno nepoznatih spojenih rRNA poveznica i rRNA bez izbočina. Osim toga, ribosom E. cuniculi preživio je gubitak rRNA fragmenata i proteina razvijajući sposobnost korištenja malih molekula kao strukturnih imitatora degradiranih rRNA fragmenata i proteina. Sveukupno, pokazujemo da molekularne strukture za koje se dugo mislilo da su reducirane, degenerirane i podložne iscrpljujućim mutacijama imaju niz kompenzacijskih mehanizama koji ih održavaju aktivnima unatoč ekstremnim molekularnim kontrakcijama.
Budući da većina skupina mikrobnih parazita ima jedinstvene molekularne alate za iskorištavanje svojih domaćina, često moramo razviti različite terapije za različite skupine parazita1,2. Međutim, novi dokazi upućuju na to da su neki aspekti evolucije parazita konvergentni i uglavnom predvidljivi, što ukazuje na potencijalnu osnovu za široke terapijske intervencije kod mikrobnih parazita3,4,5,6,7,8,9.
Prethodni rad identificirao je zajednički evolucijski trend kod mikrobnih parazita nazvan redukcija genoma ili propadanje genoma10,11,12,13. Trenutna istraživanja pokazuju da kada mikroorganizmi odustanu od svog slobodnog načina života i postanu unutarstanični paraziti (ili endosimbionti), njihovi genomi prolaze kroz spore, ali nevjerojatne metamorfoze tijekom milijuna godina9,11. U procesu poznatom kao propadanje genoma, mikrobni paraziti akumuliraju štetne mutacije koje mnoge prethodno važne gene pretvaraju u pseudogene, što dovodi do postupnog gubitka gena i mutacijskog kolapsa14,15. Ovaj kolaps može uništiti do 95% gena u najstarijim unutarstaničnim organizmima u usporedbi s blisko srodnim slobodnoživućim vrstama. Dakle, evolucija unutarstaničnih parazita je natezanje konopa između dvije suprotstavljene sile: darvinističke prirodne selekcije, koja dovodi do poboljšanja parazita, i kolapsa genoma, koji baca parazite u zaborav. Kako je parazit uspio izaći iz ovog natezanja konopa i zadržati aktivnost svoje molekularne strukture, ostaje nejasno.
Iako mehanizam propadanja genoma nije u potpunosti razjašnjen, čini se da se događa uglavnom zbog čestog genetskog drifta. Budući da paraziti žive u malim, aseksualnim i genetski ograničenim populacijama, ne mogu učinkovito eliminirati štetne mutacije koje se ponekad javljaju tijekom replikacije DNK. To dovodi do nepovratnog nakupljanja štetnih mutacija i smanjenja genoma parazita. Kao rezultat toga, parazit ne samo da gubi gene koji više nisu potrebni za njegov opstanak u unutarstaničnom okruženju. Nemogućnost populacija parazita da učinkovito eliminiraju sporadične štetne mutacije uzrokuje nakupljanje tih mutacija u cijelom genomu, uključujući i njihove najvažnije gene.
Velik dio našeg trenutnog razumijevanja redukcije genoma temelji se isključivo na usporedbama genomskih sekvenci, s manje pažnje posvećene promjenama u stvarnim molekulama koje obavljaju funkcije održavanja i služe kao potencijalne mete lijekova. Komparativne studije pokazale su da teret štetnih unutarstaničnih mikrobnih mutacija predisponira proteine ​​i nukleinske kiseline za pogrešno savijanje i agregaciju, čineći ih ovisnijima o šaperonima i preosjetljivijima na toplinu19,20,21,22,23. Osim toga, razni paraziti - neovisna evolucija ponekad razdvojena čak 2,5 milijarde godina - doživjeli su sličan gubitak centara za kontrolu kvalitete u svojoj sintezi proteina5,6 i mehanizmima popravka DNA24. Međutim, malo se zna o utjecaju unutarstaničnog načina života na sva ostala svojstva staničnih makromolekula, uključujući molekularnu prilagodbu rastućem teretu štetnih mutacija.
U ovom radu, kako bismo bolje razumjeli evoluciju proteina i nukleinskih kiselina unutarstaničnih mikroorganizama, odredili smo strukturu ribosoma unutarstaničnog parazita Encephalitozoon cuniculi. E. cuniculi je organizam sličan gljivici koji pripada skupini parazitskih mikrosporidija koje imaju neobično male eukariotske genome i stoga se koriste kao modelni organizmi za proučavanje raspadanja genoma25,26,27,28,29,30. Nedavno je određena cryo-EM struktura ribosoma za umjereno reducirane genome Microsporidia, Paranosema locustae i Vairimorpha necatrix31,32 (genom od ~3,2 Mb). Ove strukture sugeriraju da se dio gubitka amplifikacije rRNA kompenzira razvojem novih kontakata između susjednih ribosomskih proteina ili stjecanjem novih ribosomskih proteina msL131,32. Vrsta Encephalitozoon (genom ~2,5 milijuna bp), zajedno s najbližim rođakom Ordospora, pokazuje krajnji stupanj redukcije genoma kod eukariota – imaju manje od 2000 gena koji kodiraju proteine, a očekuje se da njihovi ribosomi ne samo da su lišeni fragmenata rRNA ekspanzije (fragmenti rRNA koji razlikuju eukariotske ribosome od bakterijskih ribosoma), već imaju i četiri ribosomska proteina zbog nedostatka homologa u genomu E. cuniculi26,27,28. Stoga smo zaključili da ribosom E. cuniculi može otkriti prethodno nepoznate strategije za molekularnu prilagodbu raspadanju genoma.
Naša krio-EM struktura predstavlja najmanji eukariotski citoplazmatski ribosom koji je do sada karakteriziran i pruža uvid u to kako konačni stupanj redukcije genoma utječe na strukturu, sastavljanje i evoluciju molekularnog sustava koji je sastavni dio stanice. Otkrili smo da ribosom E. cuniculi krši mnoge široko očuvane principe savijanja RNA i sastavljanja ribosoma te otkrili novi, prethodno nepoznati ribosomski protein. Sasvim neočekivano pokazujemo da su ribosomi mikrosporidija razvili sposobnost vezanja malih molekula i pretpostavljamo da skraćivanja u rRNA i proteinima pokreću evolucijske inovacije koje bi u konačnici mogle dati korisne kvalitete ribosomu.
Kako bismo bolje razumjeli evoluciju proteina i nukleinskih kiselina u unutarstaničnim organizmima, odlučili smo izolirati spore E. cuniculi iz kultura zaraženih stanica sisavaca kako bismo pročistili njihove ribosome i odredili strukturu tih ribosoma. Teško je dobiti veliki broj parazitskih mikrosporidija jer se mikrosporidije ne mogu uzgajati u hranjivom mediju. Umjesto toga, rastu i razmnožavaju se samo unutar stanice domaćina. Stoga smo, kako bismo dobili biomasu E. cuniculi za pročišćavanje ribosoma, zarazili staničnu liniju bubrega sisavaca RK13 sporama E. cuniculi i uzgajali te zaražene stanice nekoliko tjedana kako bi se E. cuniculi omogućio rast i razmnožavanje. Koristeći monosloj zaraženih stanica od oko pola kvadratnog metra, uspjeli smo pročistiti oko 300 mg spora mikrosporidija i upotrijebiti ih za izolaciju ribosoma. Zatim smo pročišćene spore razbili staklenim kuglicama i izolirali sirove ribosome postupnim frakcioniranjem lizata polietilen glikolom. To nam je omogućilo da dobijemo približno 300 µg sirovih ribosoma E. cuniculi za strukturnu analizu.
Zatim smo prikupili krio-EM slike koristeći dobivene uzorke ribosoma i obradili te slike pomoću maski koje odgovaraju velikoj ribosomskoj podjedinici, glavi male podjedinice i maloj podjedinici. Tijekom ovog procesa prikupili smo slike oko 108 000 ribosomskih čestica i izračunali krio-EM slike s rezolucijom od 2,7 Å (dodatne slike 1-3). Zatim smo koristili krioEM slike za modeliranje rRNA, ribosomskog proteina i faktora hibernacije Mdf1 povezanog s ribosomima E. cuniculi (slika 1a, b).
a Struktura ribosoma E. cuniculi u kompleksu s faktorom hibernacije Mdf1 (pdb id 7QEP). b Karta faktora hibernacije Mdf1 povezanog s ribosomom E. cuniculi. c Karta sekundarne strukture koja uspoređuje oporavljenu rRNA u vrstama mikrosporidija s poznatim ribosomskim strukturama. Ploče prikazuju lokaciju amplificiranih fragmenata rRNA (ES) i aktivnih mjesta ribosoma, uključujući mjesto dekodiranja (DC), sarcinicinsku petlju (SRL) i peptidil transferazni centar (PTC). d Gustoća elektrona koja odgovara centru peptidil transferaze ribosoma E. cuniculi sugerira da ovo katalitičko mjesto ima istu strukturu u parazitu E. cuniculi i njegovim domaćinima, uključujući H. sapiens. e, f Odgovarajuća gustoća elektrona centra dekodiranja (e) i shematska struktura centra dekodiranja (f) ukazuju na to da E. cuniculi ima ostatke U1491 umjesto A1491 (numeriranje E. coli) u mnogim drugim eukariotima. Ova promjena sugerira da bi E. cuniculi mogla biti osjetljiva na antibiotike koji ciljaju ovo aktivno mjesto.
Za razliku od prethodno utvrđenih struktura ribosoma V. necatrix i P. locustae (obje strukture predstavljaju istu porodicu mikrosporidija Nosematidae i vrlo su slične jedna drugoj), 31,32 ribosomi E. cuniculi prolaze kroz brojne procese fragmentacije rRNA i proteina. Daljnja denaturacija (Dopunske slike 4-6). U rRNA, najupečatljivije promjene uključivale su potpuni gubitak amplificiranog 25S rRNA fragmenta ES12L i djelomičnu degeneraciju heliksa h39, h41 i H18 (slika 1c, dodatna slika 4). Među ribosomskim proteinima, najupečatljivije promjene uključivale su potpuni gubitak proteina eS30 i skraćivanje proteina eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 i ​​eS7 (Dopunske slike 4, 5).
Dakle, ekstremno smanjenje genoma vrsta Encephalotozoon/Ordospora odražava se u njihovoj strukturi ribosoma: ribosomi E. cuniculi doživljavaju najdramatičniji gubitak sadržaja proteina u eukariotskim citoplazmatskim ribosomima koji su podložni strukturnoj karakterizaciji, a nemaju čak ni one rRNA i proteinske fragmente koji su široko očuvani ne samo u eukariotima, već i u tri domene života. Struktura ribosoma E. cuniculi pruža prvi molekularni model za ove promjene i otkriva evolucijske događaje koji su previđeni i komparativnom genomikom i studijama unutarstanične biomolekularne strukture (Dopunska slika 7). U nastavku opisujemo svaki od ovih događaja zajedno s njihovim vjerojatnim evolucijskim podrijetlom i njihovim potencijalnim utjecajem na funkciju ribosoma.
Zatim smo otkrili da, osim velikih skraćenja rRNA, ribosomi E. cuniculi imaju varijacije rRNA na jednom od svojih aktivnih mjesta. Iako peptidil transferazni centar ribosoma E. cuniculi ima istu strukturu kao i drugi eukariotski ribosomi (slika 1d), centar za dekodiranje razlikuje se zbog varijacije sekvence na nukleotidu 1491 (numeriranje E. coli, slika 1e, f). Ovo zapažanje je važno jer mjesto dekodiranja eukariotskih ribosoma obično sadrži ostatke G1408 i A1491 u usporedbi s ostacima bakterijskog tipa A1408 i G1491. Ova varijacija je temelj različite osjetljivosti bakterijskih i eukariotskih ribosoma na aminoglikozidnu obitelj ribosomskih antibiotika i drugih malih molekula koje ciljaju mjesto dekodiranja. Na mjestu dekodiranja ribosoma E. cuniculi, ostatak A1491 zamijenjen je s U1491, potencijalno stvarajući jedinstveno vezno sučelje za male molekule koje ciljaju ovo aktivno mjesto. Ista varijanta A14901 prisutna je i u drugim mikrosporidijama kao što su P. locustae i V. necatrix, što sugerira da je široko rasprostranjena među vrstama mikrosporidija (slika 1f).
Budući da su naši uzorci ribosoma E. cuniculi izolirani iz metabolički neaktivnih spora, testirali smo krio-EM mapu E. cuniculi na prethodno opisano vezanje ribosoma u uvjetima stresa ili gladovanja. Faktori hibernacije 31, 32, 36, 37, 38. Usporedili smo prethodno utvrđenu strukturu hibernirajućeg ribosoma s krio-EM mapom ribosoma E. cuniculi. Za spajanje su korišteni ribosomi S. cerevisiae u kompleksu s faktorom hibernacije Stm138, ribosomi skakavaca u kompleksu s faktorom Lso232 i ribosomi V. necatrix u kompleksu s faktorima Mdf1 i Mdf231. Istovremeno, pronašli smo krio-EM gustoću koja odgovara faktoru odmora Mdf1. Slično vezanju Mdf1 na ribosom V. necatrix, Mdf1 se također veže na ribosom E. cuniculi, gdje blokira E mjesto ribosoma, što vjerojatno pomaže u činjenici da ribosomi postanu dostupni kada spore parazita postanu metabolički neaktivne nakon inaktivacije tijela (Slika 2).
Mdf1 blokira E mjesto ribosoma, što, čini se, pomaže u inaktivaciji ribosoma kada spore parazita postanu metabolički neaktivne. U strukturi ribosoma E. cuniculi otkrili smo da Mdf1 formira prethodno nepoznati kontakt s L1 ribosomskom stabljikom, dijelom ribosoma koji olakšava oslobađanje deacilirane tRNA iz ribosoma tijekom sinteze proteina. Ovi kontakti sugeriraju da se Mdf1 disocira od ribosoma koristeći isti mehanizam kao i deacetilirana tRNA, što pruža moguće objašnjenje kako ribosom uklanja Mdf1 kako bi reaktivirao sintezu proteina.
Međutim, naša struktura otkrila je nepoznati kontakt između Mdf1 i ribosomske noge L1 (dijela ribosoma koji pomaže u oslobađanju deacilirane tRNA iz ribosoma tijekom sinteze proteina). Konkretno, Mdf1 koristi iste kontakte kao i lakat deacilirane molekule tRNA (slika 2). Ovo prethodno nepoznato molekularno modeliranje pokazalo je da se Mdf1 disocira od ribosoma koristeći isti mehanizam kao i deacetilirana tRNA, što objašnjava kako ribosom uklanja ovaj faktor hibernacije kako bi reaktivirao sintezu proteina.
Prilikom konstruiranja rRNA modela, otkrili smo da ribosom E. cuniculi ima abnormalno savijene rRNA fragmente, koje smo nazvali spojena rRNA (slika 3). U ribosomima koji obuhvaćaju tri domene života, rRNA se savija u strukture u kojima se većina rRNA baza ili sparuje i savija jedna s drugom ili interagira s ribosomskim proteinima38,39,40. Međutim, u ribosomima E. cuniculi, čini se da rRNA krše ovaj princip savijanja pretvarajući neke od svojih uzvojnica u nesavijene rRNA regije.
Struktura H18 25S rRNA heliksa u S. cerevisiae, V. necatrix i E. cuniculi. Tipično, u ribosomima koji obuhvaćaju tri životne domene, ovaj linker se namotava u RNA heliks koji sadrži 24 do 34 ostatka. Nasuprot tome, u mikrosporidijama, ovaj rRNA linker se postupno reducira na dva jednolančana linkera bogata uridinom koji sadrže samo 12 ostataka. Većina tih ostataka izložena je otapalima. Slika pokazuje da parazitske mikrosporidije krše opća načela savijanja rRNA, gdje su rRNA baze obično povezane s drugim bazama ili uključene u interakcije rRNA-protein. U mikrosporidijama, neki rRNA fragmenti poprimaju nepovoljan pregib, u kojem bivša rRNA heliks postaje jednolančani fragment izdužen gotovo u ravnoj liniji. Prisutnost ovih neobičnih regija omogućuje rRNA mikrosporidija da veže udaljene rRNA fragmente koristeći minimalan broj RNA baza.
Najupečatljiviji primjer ovog evolucijskog prijelaza može se vidjeti u H18 25S rRNA heliksu (slika 3). U vrstama od E. coli do ljudi, baze ovog rRNA heliksa sadrže 24-32 nukleotida, tvoreći blago nepravilnu spiralu. U prethodno identificiranim ribosomskim strukturama iz V. necatrix i P. locustae,31,32 baze H18 heliksa su djelomično odmotane, ali je sparivanje nukleotidnih baza sačuvano. Međutim, u E. cuniculi ovaj rRNA fragment postaje najkraći povezivači 228UUUGU232 i 301UUUUUUUUUU307. Za razliku od tipičnih rRNA fragmenata, ovi povezivači bogati uridinom ne namotavaju se niti ostvaruju opsežan kontakt s ribosomskim proteinima. Umjesto toga, usvajaju strukture otvorene za otapalo i potpuno razmotane u kojima su lanci rRNA produženi gotovo ravno. Ova rastegnuta konformacija objašnjava kako E. cuniculi koristi samo 12 RNA baza za popunjavanje praznine od 33 Å između H16 i H18 rRNA heliksa, dok drugim vrstama treba barem dvostruko više rRNA baza za popunjavanje praznine.
Dakle, možemo pokazati da su parazitske mikrosporidije, putem energetski nepovoljnog savijanja, razvile strategiju za kontrakciju čak i onih segmenata rRNA koji ostaju široko očuvani među vrstama u tri domene života. Očito, akumuliranjem mutacija koje transformiraju spirale rRNA u kratke poli-U poveznice, E. cuniculi može formirati neobične fragmente rRNA koji sadrže što manje nukleotida za ligaciju distalnih fragmenata rRNA. To pomaže objasniti kako su mikrosporidije postigle dramatično smanjenje svoje osnovne molekularne strukture bez gubitka strukturnog i funkcionalnog integriteta.
Još jedna neobična značajka rRNA E. cuniculi je pojava rRNA bez zadebljanja (slika 4). Izbočine su nukleotidi bez baznih parova koji se uvijaju iz spirale RNA umjesto da se skrivaju u njoj. Većina izbočina rRNA djeluje kao molekularna ljepila, pomažući u vezanju susjednih ribosomskih proteina ili drugih fragmenata rRNA. Neke od izbočina djeluju kao šarke, omogućujući spirali rRNA da se optimalno savija i savija za produktivnu sintezu proteina 41.
a Izbočina rRNA (numeracija S. cerevisiae) je odsutna iz strukture ribosoma E. cuniculi, ali je prisutna u većini drugih eukariota b Unutarnji ribosomi E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens i E. cuniculi. parazitima nedostaju mnoge drevne, visoko konzervirane izbočine rRNA. Ta zadebljanja stabiliziraju strukturu ribosoma; stoga njihova odsutnost u mikrosporidijama ukazuje na smanjenu stabilnost savijanja rRNA u parazitima mikrosporidija. Usporedba s P stabljikama (stabljike L7/L12 u bakterijama) pokazuje da gubitak izbočina rRNA ponekad odgovara pojavi novih izbočina pored izgubljenih izbočina. H42 spirala u 23S/28S rRNA ima drevnu izbočinu (U1206 u Saccharomyces cerevisiae) za koju se procjenjuje da je stara najmanje 3,5 milijarde godina zbog svoje zaštite u tri domene života. U mikrosporidijama je ova izbočina eliminirana. Međutim, nova izbočina pojavila se pokraj izgubljene izbočine (A1306 u E. cuniculi).
Zanimljivo je da smo otkrili da ribosomima E. cuniculi nedostaje većina rRNA izbočina koje se nalaze kod drugih vrsta, uključujući više od 30 izbočina sačuvanih kod drugih eukariota (slika 4a). Ovaj gubitak eliminira mnoge kontakte između ribosomskih podjedinica i susjednih rRNA heliksa, ponekad stvarajući velike šuplje praznine unutar ribosoma, čineći ribosom E. cuniculi poroznijim u usporedbi s tradicionalnijim ribosomima (slika 4b). Značajno je da smo otkrili da je većina tih izbočina također izgubljena u prethodno identificiranim strukturama ribosoma V. necatrix i P. locustae, koje su prethodne strukturne analize previdjele31,32.
Ponekad gubitak izbočina rRNA prati razvoj novih izbočina pored izgubljene izbočine. Na primjer, ribosomska P-stabljika sadrži izbočinu U1208 (kod Saccharomyces cerevisiae) koja je preživjela od E. coli do ljudi i stoga se procjenjuje da je stara 3,5 milijarde godina. Tijekom sinteze proteina, ova izbočina pomaže P stabljici da se kreće između otvorenih i zatvorenih konformacija tako da ribosom može regrutirati faktore translacije i dostaviti ih na aktivno mjesto. U ribosomima E. cuniculi ovo zadebljanje je odsutno; međutim, novo zadebljanje (G883) smješteno samo u tri bazna para može doprinijeti obnavljanju optimalne fleksibilnosti P stabljike (slika 4c).
Naši podaci o rRNA bez izbočina sugeriraju da minimizacija rRNA nije ograničena samo na gubitak rRNA elemenata na površini ribosoma, već može uključivati ​​i jezgru ribosoma, stvarajući molekularni defekt specifičan za parazita koji nije opisan u slobodnoživućim stanicama. Opažene su žive vrste.
Nakon modeliranja kanonskih ribosomskih proteina i rRNA, otkrili smo da konvencionalne ribosomske komponente ne mogu objasniti tri dijela krio-EM slike. Dva od ovih fragmenata su male molekule (slika 5, dodatna slika 8). Prvi segment je smješten između ribosomskih proteina uL15 i eL18 na položaju koji obično zauzima C-terminalni kraj eL18, koji je skraćen kod E. cuniculi. Iako ne možemo utvrditi identitet ove molekule, veličina i oblik ovog otoka gustoće dobro se objašnjavaju prisutnošću molekula spermidina. Njegovo vezanje za ribosom stabilizirano je mutacijama specifičnim za mikrosporidiju u proteinima uL15 (Asp51 i Arg56), koje, čini se, povećavaju afinitet ribosoma za ovu malu molekulu, jer omogućuju uL15 da omota malu molekulu u ribosomsku strukturu. Dodatna slika 2). 8, dodatni podaci 1, 2).
Krio-EM snimanje prikazuje prisutnost nukleotida izvan riboze vezane za ribosom E. cuniculi. U ribosomu E. cuniculi, ovaj nukleotid zauzima isto mjesto kao i nukleotid 25S rRNA A3186 (numeracija Saccharomyces cerevisiae) u većini drugih eukariotskih ribosoma. b U ribosomskoj strukturi E. cuniculi, ovaj nukleotid se nalazi između ribosomskih proteina uL9 i eL20, čime se stabilizira kontakt između dva proteina. cd Analiza očuvanosti sekvence eL20 među vrstama mikrosporidija. Filogenetsko stablo vrsta mikrosporidija (c) i višestruko poravnanje sekvenci proteina eL20 (d) pokazuju da su ostaci F170 i K172 koji vežu nukleotide očuvani u većini tipičnih mikrosporidija, s izuzetkom S. lophii, s izuzetkom ranih mikrosporidija koje se granaju, a koje su zadržale ekstenziju ES39L rRNA. e Ova slika pokazuje da su ostaci F170 i K172 koji vežu nukleotide prisutni samo u eL20 visoko reduciranog genoma mikrosporidija, ali ne i u drugim eukariotima. Sveukupno, ovi podaci sugeriraju da su ribosomi mikrosporidija razvili mjesto vezanja nukleotida koje se čini da veže molekule AMP-a i koristi ih za stabilizaciju interakcija protein-protein u strukturi ribosoma. Visoka konzervacija ovog mjesta vezanja u mikrosporidijama i njegova odsutnost u drugim eukariotima sugerira da ovo mjesto može pružiti selektivnu prednost preživljavanja za mikrosporidijima. Dakle, džep za vezanje nukleotida u ribosomu mikrosporidija ne čini se degeneriranom značajkom ili krajnjim oblikom degradacije rRNA kao što je prethodno opisano, već korisnom evolucijskom inovacijom koja omogućuje ribosomu mikrosporidija da izravno veže male molekule, koristeći ih kao molekularne gradivne blokove za ribosome. Ovo otkriće čini ribosom mikrosporidija jedinim ribosomom za koji se zna da koristi jedan nukleotid kao svoj strukturni gradivni blok. f Hipotetički evolucijski put izveden iz vezanja nukleotida.
Druga gustoća niske molekularne težine nalazi se na granici između ribosomskih proteina uL9 i eL30 (slika 5a). Ovo sučelje je prethodno opisano u strukturi ribosoma Saccharomyces cerevisiae kao mjesto vezanja za 25S nukleotid rRNA A3186 (dio ES39L rRNA ekstenzije)38. Pokazalo se da se u degeneriranim ribosomima P. locustae ES39L ovo sučelje veže na nepoznati pojedinačni nukleotid 31, a pretpostavlja se da je taj nukleotid reducirani konačni oblik rRNA, u kojem je duljina rRNA ~130-230 baza. ES39L je reduciran na jedan nukleotid 32,43. Naše krio-EM slike podupiru ideju da se gustoća može objasniti nukleotidima. Međutim, veća rezolucija naše strukture pokazala je da je taj nukleotid ekstraribosomska molekula, moguće AMP (slika 5a, b).
Zatim smo se pitali je li se mjesto vezanja nukleotida pojavilo u ribosomu E. cuniculi ili je postojalo ranije. Budući da je vezanje nukleotida uglavnom posredovano ostacima Phe170 i Lys172 u ribosomskom proteinu eL30, procijenili smo očuvanost tih ostataka u 4396 reprezentativnih eukariota. Kao u slučaju uL15 gore, otkrili smo da su ostaci Phe170 i Lys172 visoko očuvani samo u tipičnim mikrosporidijama, ali odsutni u drugim eukariotima, uključujući atipične mikrosporidije Mitosporidium i Amphiamblys, u kojima fragment ES39L rRNA nije reduciran 44, 45, 46 (slika 5c). -e).
Uzeti zajedno, ovi podaci podupiru ideju da su E. cuniculi i moguće druge kanonske mikrosporidije razvile sposobnost učinkovitog hvatanja velikog broja malih metabolita u strukturi ribosoma kako bi kompenzirale pad razine rRNA i proteina. Pritom su razvile jedinstvenu sposobnost vezanja nukleotida izvan ribosoma, što pokazuje da parazitske molekularne strukture kompenziraju hvatanjem obilnih malih metabolita i njihovim korištenjem kao strukturnih oponašatelja degradiranih fragmenata RNA i proteina.
Treći nesimulirani dio naše krio-EM karte, pronađen u velikoj ribosomskoj podjedinici. Relativno visoka rezolucija (2,6 Å) naše karte sugerira da ova gustoća pripada proteinima s jedinstvenim kombinacijama ostataka velikih bočnih lanaca, što nam je omogućilo da identificiramo ovu gustoću kao prethodno nepoznati ribosomski protein koji smo identificirali kao. Nazvan je msL2 (Microsporidia-specifični protein L2) (metode, slika 6). Naše pretraživanje homologije pokazalo je da je msL2 očuvan u kladu Microsporidia roda Encephaliter i Orosporidium, ali odsutan kod drugih vrsta, uključujući druge Microsporidia. U ribosomskoj strukturi, msL2 zauzima prazninu nastala gubitkom proširene ES31L rRNA. U toj praznini, msL2 pomaže u stabilizaciji savijanja rRNA i može nadoknaditi gubitak ES31L (Slika 6).
a Gustoća elektrona i model ribosomskog proteina msL2 specifičnog za mikrosporidiju, pronađenog u ribosomima E. cuniculi. b Većina eukariotskih ribosoma, uključujući 80S ribosom Saccharomyces cerevisiae, ima gubitak amplifikacije ES19L rRNA kod većine vrsta mikrosporidija. Prethodno utvrđena struktura ribosoma mikrosporidija V. necatrix sugerira da je gubitak ES19L kod ovih parazita kompenziran evolucijom novog ribosomskog proteina msL1. U ovom istraživanju otkrili smo da je ribosom E. cuniculi također razvio dodatni protein koji mimicira ribosomsku RNA kao očitu kompenzaciju za gubitak ES19L. Međutim, msL2 (trenutno označen kao hipotetski protein ECU06_1135) i msL1 imaju različito strukturno i evolucijsko podrijetlo. c Ovo otkriće stvaranja evolucijski nepovezanih ribosomskih proteina msL1 i msL2 sugerira da ako ribosomi akumuliraju štetne mutacije u svojoj rRNA, mogu postići neviđene razine raznolikosti sastava čak i u maloj podskupini blisko srodnih vrsta. Ovo otkriće moglo bi pomoći u razjašnjavanju podrijetla i evolucije mitohondrijskog ribosoma, koji je poznat po svojoj izrazito reduciranoj rRNA i abnormalnoj varijabilnosti u sastavu proteina među vrstama.
Zatim smo usporedili protein msL2 s prethodno opisanim proteinom msL1, jedinim poznatim ribosomskim proteinom specifičnim za mikrosporidiju koji se nalazi u ribosomu V. necatrix. Željeli smo testirati jesu li msL1 i msL2 evolucijski povezani. Naša analiza pokazala je da msL1 i msL2 zauzimaju istu šupljinu u ribosomskoj strukturi, ali imaju različite primarne i tercijarne strukture, što ukazuje na njihovo neovisno evolucijsko podrijetlo (slika 6). Dakle, naše otkriće msL2 pruža dokaz da skupine kompaktnih eukariotskih vrsta mogu neovisno razvijati strukturno različite ribosomske proteine ​​kako bi kompenzirale gubitak fragmenata rRNA. Ovo otkriće je značajno po tome što većina citoplazmatskih eukariotskih ribosoma sadrži invarijantni protein, uključujući istu obitelj od 81 ribosomskog proteina. Pojava msL1 i msL2 u različitim kladama mikrosporidija kao odgovor na gubitak proširenih segmenata rRNA sugerira da degradacija molekularne arhitekture parazita uzrokuje da paraziti traže kompenzacijske mutacije, što na kraju može dovesti do njihovog stjecanja u različitim populacijama parazita.
Konačno, kada je naš model dovršen, usporedili smo sastav ribosoma E. cuniculi s onim predviđenim iz sekvence genoma. Prije se smatralo da nekoliko ribosomskih proteina, uključujući eL14, eL38, eL41 i eS30, nedostaje iz genoma E. cuniculi zbog očite odsutnosti njihovih homologa iz genoma E. cuniculi. Gubitak mnogih ribosomskih proteina također se predviđa kod većine drugih visoko reduciranih unutarstaničnih parazita i endosimbionta. Na primjer, iako većina slobodnoživućih bakterija sadrži istu obitelj od 54 ribosomska proteina, samo 11 od tih proteinskih obitelji ima detektabilne homologe u svakom analiziranom genomu bakterija ograničenih na domaćina. U prilog ovoj tvrdnji, eksperimentalno je uočen gubitak ribosomskih proteina u mikrosporidijama V. necatrix i P. locustae, kojima nedostaju proteini eL38 i eL4131,32.
Međutim, naše strukture pokazuju da su samo eL38, eL41 i eS30 zapravo izgubljeni u ribosomu E. cuniculi. Protein eL14 je bio očuvan, a naša struktura je pokazala zašto se ovaj protein nije mogao pronaći u pretrazi homologije (slika 7). U ribosomima E. cuniculi, većina mjesta vezanja eL14 je izgubljena zbog degradacije rRNA-amplificiranog ES39L. U odsutnosti ES39L, eL14 je izgubio većinu svoje sekundarne strukture, a samo 18% sekvence eL14 bilo je identično u E. cuniculi i S. cerevisiae. Ova loša očuvanost sekvence je značajna jer čak i Saccharomyces cerevisiae i Homo sapiens - organizmi koji su evoluirali s razmakom od 1,5 milijardi godina - dijele više od 51% istih ostataka u eL14. Ovaj anomalni gubitak očuvanosti objašnjava zašto se E. cuniculi eL14 trenutno označava kao pretpostavljeni protein M970_061160, a ne kao ribosomski protein eL1427.
i Ribosom mikrosporidija izgubio je ekstenziju ES39L rRNA, što je djelomično eliminiralo mjesto vezanja ribosomskog proteina eL14. U odsutnosti ES39L, protein mikrospora eL14 gubi sekundarnu strukturu, u kojoj bivša α-heliks koja veže rRNA degenerira u petlju minimalne duljine. b Višestruko poravnanje sekvenci pokazuje da je protein eL14 visoko konzerviran u eukariotskim vrstama (57% identičnosti sekvence između kvasca i ljudskih homologa), ali slabo konzerviran i divergentan u mikrosporidijama (u kojima je ne više od 24% ostataka identično homologu eL14). od S. cerevisiae ili H. sapiens). Ova slaba konzervacija sekvence i varijabilnost sekundarne strukture objašnjavaju zašto homolog eL14 nikada nije pronađen u E. cuniculi i zašto se smatra da je ovaj protein izgubljen u E. cuniculi. Nasuprot tome, eL14 E. cuniculi prethodno je označen kao pretpostavljeni protein M970_061160. Ovo opažanje sugerira da je raznolikost genoma mikrosporidija trenutno precijenjena: neki geni za koje se trenutno smatra da su izgubljeni u mikrosporidijama zapravo su sačuvani, iako u visoko diferenciranim oblicima; umjesto toga, smatra se da neki kodiraju gene mikrosporidija za proteine ​​specifične za crve (npr. hipotetski protein M970_061160) zapravo kodira vrlo raznolike proteine ​​pronađene u drugim eukariotima.
Ovo otkriće sugerira da denaturacija rRNA može dovesti do dramatičnog gubitka očuvanosti sekvenci u susjednim ribosomskim proteinima, čineći te proteine ​​neotkrivenima za pretrage homologije. Stoga bismo mogli precijeniti stvarni stupanj molekularne degradacije u organizmima s malim genomom, budući da neki proteini za koje se smatra da su izgubljeni zapravo opstaju, iako u vrlo izmijenjenim oblicima.
Kako paraziti mogu zadržati funkciju svojih molekularnih strojeva u uvjetima ekstremne redukcije genoma? Naša studija odgovara na ovo pitanje opisujući složenu molekularnu strukturu (ribosom) E. cuniculi, organizma s jednim od najmanjih eukariotskih genoma.
Već gotovo dva desetljeća poznato je da se molekule proteina i RNA u mikrobnim parazitima često razlikuju od svojih homolognih molekula u slobodnoživućim vrstama jer im nedostaju centri za kontrolu kvalitete, smanjene su na 50% svoje veličine u slobodnoživućim mikrobima itd., mnoge iscrpljujuće mutacije koje narušavaju savijanje i funkciju. Na primjer, očekuje se da ribosomi organizama s malim genomom, uključujući mnoge unutarstanične parazite i endosimbionte, nemaju nekoliko ribosomskih proteina i do jedne trećine rRNA nukleotida u usporedbi sa slobodnoživućim vrstama 27, 29, 30, 49. Međutim, način na koji te molekule funkcioniraju u parazitima ostaje uglavnom misterij, proučavan uglavnom kroz komparativnu genomiku.
Naša studija pokazuje da struktura makromolekula može otkriti mnoge aspekte evolucije koje je teško izvući iz tradicionalnih komparativnih genomskih studija unutarstaničnih parazita i drugih organizama ograničenih na domaćina (Dodatna slika 7). Na primjer, primjer proteina eL14 pokazuje da možemo precijeniti stvarni stupanj degradacije molekularnog aparata kod parazitskih vrsta. Vjeruje se da encefalitični paraziti sada imaju stotine gena specifičnih za mikrosporidi. Međutim, naši rezultati pokazuju da su neki od ovih naizgled specifičnih gena zapravo samo vrlo različite varijante gena koji su uobičajeni kod drugih eukariota. Štoviše, primjer proteina msL2 pokazuje kako previđamo nove ribosomske proteine ​​i podcjenjujemo sadržaj parazitskih molekularnih strojeva. Primjer malih molekula pokazuje kako možemo previdjeti najdomišljatije inovacije u parazitskim molekularnim strukturama koje im mogu dati novu biološku aktivnost.
Uzeti zajedno, ovi rezultati poboljšavaju naše razumijevanje razlika između molekularnih struktura organizama ograničenih na domaćina i njihovih pandana u slobodnoživućim organizmima. Pokazujemo da molekularni strojevi, za koje se dugo smatralo da su reducirani, degenerirani i podložni raznim iscrpljujućim mutacijama, umjesto toga imaju skup sustavno zanemarenih neobičnih strukturnih značajki.
S druge strane, ne-glomazni fragmenti rRNA i spojeni fragmenti koje smo pronašli u ribosomima E. cuniculi sugeriraju da redukcija genoma može promijeniti čak i one dijelove osnovnog molekularnog mehanizma koji su sačuvani u tri domene života - nakon gotovo 3,5 milijarde godina neovisne evolucije vrsta.
Fragmenti rRNA bez izbočina i spojeni fragmenti u ribosomima E. cuniculi od posebnog su interesa u svjetlu prethodnih studija molekula RNA u endosimbiotskim bakterijama. Na primjer, kod endosimbionta lisnih uši Buchnera aphidicola, pokazalo se da molekule rRNA i tRNA imaju temperaturno osjetljive strukture zbog pristranosti sastava A+T i visokog udjela nekanonskih baznih parova20,50. Smatra se da su ove promjene u RNA, kao i promjene u molekulama proteina, odgovorne za prekomjernu ovisnost endosimbionata o partnerima i nemogućnost endosimbionata da prenose toplinu21,23. Iako rRNA parazitskih mikrosporidija ima strukturno različite promjene, priroda tih promjena sugerira da smanjena toplinska stabilnost i veća ovisnost o proteinima šaperonima mogu biti uobičajene značajke molekula RNA u organizmima s reduciranim genomima.
S druge strane, naše strukture pokazuju da su parazitske mikrosporidije razvile jedinstvenu sposobnost otpora široko očuvanim rRNA i proteinskim fragmentima, razvijajući sposobnost korištenja obilnih i lako dostupnih malih metabolita kao strukturnih imitatora degeneriranih rRNA i proteinskih fragmenata. Degradacija molekularne strukture. . Ovo mišljenje podupire činjenica da se male molekule koje kompenziraju gubitak proteinskih fragmenata u rRNA i ribosomima E. cuniculi vežu za ostatke specifične za mikrosporidije u proteinima uL15 i eL30. To sugerira da vezanje malih molekula za ribosome može biti produkt pozitivne selekcije, u kojoj su mutacije specifične za mikrosporidije u ribosomskim proteinima odabrane zbog njihove sposobnosti povećanja afiniteta ribosoma za male molekule, što može dovesti do učinkovitijih ribosomskih organizama. Otkriće otkriva pametnu inovaciju u molekularnoj strukturi mikrobnih parazita i daje nam bolje razumijevanje kako molekularne strukture parazita održavaju svoju funkciju unatoč redukcijskoj evoluciji.
Trenutno, identifikacija ovih malih molekula ostaje nejasna. Nije jasno zašto se izgled ovih malih molekula u ribosomskoj strukturi razlikuje između vrsta mikrosporidija. Posebno nije jasno zašto se vezanje nukleotida opaža u ribosomima E. cuniculi i P. locustae, a ne u ribosomima V. necatrix, unatoč prisutnosti ostatka F170 u proteinima eL20 i K172 V. necatrix. Ovu deleciju može uzrokovati ostatak 43 uL6 (smješten uz džep za vezanje nukleotida), koji je tirozin u V. necatrix, a ne treonin u E. cuniculi i P. locustae. Glomazni aromatski bočni lanac Tyr43 može ometati vezanje nukleotida zbog sternog preklapanja. Alternativno, prividna delecija nukleotida može biti posljedica niske rezolucije krio-EM snimanja, što otežava modeliranje ribosomskih fragmenata V. necatrix.
S druge strane, naš rad sugerira da bi proces raspadanja genoma mogao biti inventivna sila. Konkretno, struktura ribosoma E. cuniculi sugerira da gubitak rRNA i proteinskih fragmenata u ribosomu mikrosporidija stvara evolucijski pritisak koji potiče promjene u strukturi ribosoma. Ove varijante javljaju se daleko od aktivnog mjesta ribosoma i čini se da pomažu u održavanju (ili obnavljanju) optimalnog sklopa ribosoma koji bi inače bio poremećen smanjenom rRNA. To sugerira da se čini da se glavna inovacija ribosoma mikrosporidija razvila u potrebu za ublažavanjem genskog drifta.
Možda je to najbolje ilustrirano vezanjem nukleotida, koje do sada nikada nije uočeno kod drugih organizama. Činjenica da su ostaci koji vežu nukleotide prisutni u tipičnim mikrosporidijama, ali ne i u drugim eukariotima, sugerira da mjesta vezanja nukleotida nisu samo ostaci koji čekaju da nestanu ili konačno mjesto za rRNA da se vrati u oblik pojedinačnih nukleotida. Umjesto toga, ovo mjesto čini se kao korisna značajka koja se mogla razviti tijekom nekoliko krugova pozitivne selekcije. Mjesta vezanja nukleotida mogu biti nusprodukt prirodne selekcije: nakon što se ES39L razgradi, mikrosporidije su prisiljene tražiti kompenzaciju kako bi obnovile optimalnu biogenezu ribosoma u odsutnosti ES39L. Budući da ovaj nukleotid može oponašati molekularne kontakte nukleotida A3186 u ES39L, molekula nukleotida postaje gradivni blok ribosoma, čije se vezanje dodatno poboljšava mutacijom sekvence eL30.
Što se tiče molekularne evolucije unutarstaničnih parazita, naša studija pokazuje da sile Darwinove prirodne selekcije i genetskog drifta raspadanja genoma ne djeluju paralelno, već osciliraju. Prvo, genetski drift eliminira važne značajke biomolekula, čineći kompenzaciju prijeko potrebnom. Tek kada paraziti zadovolje tu potrebu putem Darwinove prirodne selekcije, njihove makromolekule imat će priliku razviti svoje najimpresivnije i najinovativnije osobine. Važno je napomenuti da evolucija mjesta vezanja nukleotida u ribosomu E. cuniculi sugerira da ovaj obrazac molekularne evolucije "gubitak-dobitak" ne samo da amortizira štetne mutacije, već ponekad daje potpuno nove funkcije parazitskim makromolekulama.
Ova ideja je u skladu s teorijom pokretne ravnoteže Sewella Wrighta, koja tvrdi da strogi sustav prirodne selekcije ograničava sposobnost organizama za inovacije51,52,53. Međutim, ako genetički drift poremeti prirodnu selekciju, ti driftovi mogu proizvesti promjene koje same po sebi nisu adaptivne (ili čak štetne), ali vode do daljnjih promjena koje pružaju veću sposobnost prilagodbe ili novu biološku aktivnost. Naš okvir podupire ovu ideju ilustrirajući da se čini da je ista vrsta mutacije koja smanjuje nabor i funkciju biomolekule glavni okidač za njezino poboljšanje. U skladu s evolucijskim modelom u kojem svi dobivaju, naša studija pokazuje da je propadanje genoma, tradicionalno smatrano degenerativnim procesom, također glavni pokretač inovacija, ponekad, a možda čak i često, omogućujući makromolekulama da steknu nove parazitske aktivnosti. Mogu ih koristiti.