Σας ευχαριστούμε που επισκεφθήκατε το Nature.com. Η έκδοση του προγράμματος περιήγησης που χρησιμοποιείτε έχει περιορισμένη υποστήριξη CSS. Για την καλύτερη δυνατή εμπειρία, σας συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε ένα ενημερωμένο πρόγραμμα περιήγησης (ή να απενεργοποιήσετε τη Λειτουργία συμβατότητας στον Internet Explorer). Εν τω μεταξύ, για να διασφαλίσουμε τη συνεχή υποστήριξη, θα αποδώσουμε τον ιστότοπο χωρίς στυλ και JavaScript.
Η εξέλιξη των μικροβιακών παρασίτων περιλαμβάνει μια αντίδραση μεταξύ της φυσικής επιλογής, η οποία προκαλεί τη βελτίωση των παρασίτων, και της γενετικής παρέκκλισης, η οποία προκαλεί την απώλεια γονιδίων από τα παράσιτα και τη συσσώρευση επιβλαβών μεταλλάξεων. Εδώ, προκειμένου να κατανοήσουμε πώς συμβαίνει αυτή η αντίδραση στην κλίμακα ενός μόνο μακρομορίου, περιγράφουμε την κρυο-EM δομή του ριβοσώματος του Encephalitozoon cuniculi, ενός ευκαρυωτικού οργανισμού με ένα από τα μικρότερα γονιδιώματα στη φύση. Η ακραία μείωση του rRNA στα ριβοσώματα του E. cuniculi συνοδεύεται από πρωτοφανείς δομικές αλλαγές, όπως η εξέλιξη προηγουμένως άγνωστων συντηγμένων συνδέσμων rRNA και rRNA χωρίς εξογκώματα. Επιπλέον, το ριβόσωμα του E. cuniculi επέζησε της απώλειας θραυσμάτων rRNA και πρωτεϊνών αναπτύσσοντας την ικανότητα να χρησιμοποιεί μικρά μόρια ως δομικά μιμούμενα αποικοδομημένα θραύσματα rRNA και πρωτεϊνών. Συνολικά, δείχνουμε ότι οι μοριακές δομές που θεωρούνταν για καιρό μειωμένες, εκφυλισμένες και υποκείμενες σε εξουθενωτικές μεταλλάξεις έχουν έναν αριθμό αντισταθμιστικών μηχανισμών που τις διατηρούν ενεργές παρά τις ακραίες μοριακές συστολές.
Επειδή οι περισσότερες ομάδες μικροβιακών παρασίτων διαθέτουν μοναδικά μοριακά εργαλεία για να εκμεταλλευτούν τους ξενιστές τους, συχνά πρέπει να αναπτύξουμε διαφορετικές θεραπείες για διαφορετικές ομάδες παρασίτων1,2. Ωστόσο, νέα στοιχεία υποδηλώνουν ότι ορισμένες πτυχές της εξέλιξης των παρασίτων είναι συγκλίνουσες και σε μεγάλο βαθμό προβλέψιμες, υποδεικνύοντας μια πιθανή βάση για ευρείες θεραπευτικές παρεμβάσεις στα μικροβιακά παράσιτα3,4,5,6,7,8,9.
Προηγούμενη εργασία έχει εντοπίσει μια κοινή εξελικτική τάση στα μικροβιακά παράσιτα που ονομάζεται μείωση του γονιδιώματος ή φθορά του γονιδιώματος10,11,12,13. Η τρέχουσα έρευνα δείχνει ότι όταν οι μικροοργανισμοί εγκαταλείπουν τον ελεύθερο τρόπο ζωής τους και γίνονται ενδοκυτταρικά παράσιτα (ή ενδοσυμβιωτικά), τα γονιδιώματά τους υφίστανται αργές αλλά εκπληκτικές μεταμορφώσεις σε διάστημα εκατομμυρίων ετών9,11. Σε μια διαδικασία γνωστή ως φθορά του γονιδιώματος, τα μικροβιακά παράσιτα συσσωρεύουν επιβλαβείς μεταλλάξεις που μετατρέπουν πολλά προηγουμένως σημαντικά γονίδια σε ψευδογονίδια, οδηγώντας σε σταδιακή απώλεια γονιδίων και μεταλλακτική κατάρρευση14,15. Αυτή η κατάρρευση μπορεί να καταστρέψει έως και το 95% των γονιδίων στους παλαιότερους ενδοκυτταρικούς οργανισμούς σε σύγκριση με στενά συγγενικά είδη που ζουν ελεύθερα. Έτσι, η εξέλιξη των ενδοκυτταρικών παρασίτων είναι μια διελκυστίνδα μεταξύ δύο αντίπαλων δυνάμεων: της Δαρβινικής φυσικής επιλογής, που οδηγεί στη βελτίωση των παρασίτων, και της κατάρρευσης του γονιδιώματος, ρίχνοντας τα παράσιτα στη λήθη. Το πώς το παράσιτο κατάφερε να αναδυθεί από αυτή τη διελκυστίνδα και να διατηρήσει τη δραστηριότητα της μοριακής του δομής παραμένει ασαφές.
Αν και ο μηχανισμός της αποσύνθεσης του γονιδιώματος δεν είναι πλήρως κατανοητός, φαίνεται να συμβαίνει κυρίως λόγω συχνής γενετικής παρέκκλισης. Επειδή τα παράσιτα ζουν σε μικρούς, ασεξουαλικούς και γενετικά περιορισμένους πληθυσμούς, δεν μπορούν να εξαλείψουν αποτελεσματικά τις επιβλαβείς μεταλλάξεις που εμφανίζονται μερικές φορές κατά την αντιγραφή του DNA. Αυτό οδηγεί σε μη αναστρέψιμη συσσώρευση επιβλαβών μεταλλάξεων και μείωση του γονιδιώματος του παρασίτου. Ως αποτέλεσμα, το παράσιτο όχι μόνο χάνει γονίδια που δεν είναι πλέον απαραίτητα για την επιβίωσή του στο ενδοκυτταρικό περιβάλλον. Είναι η αδυναμία των πληθυσμών των παρασίτων να εξαλείψουν αποτελεσματικά τις σποραδικές επιβλαβείς μεταλλάξεις που προκαλεί τη συσσώρευση αυτών των μεταλλάξεων σε όλο το γονιδίωμα, συμπεριλαμβανομένων των πιο σημαντικών γονιδίων τους.
Μεγάλο μέρος της τρέχουσας κατανόησής μας σχετικά με τη μείωση του γονιδιώματος βασίζεται αποκλειστικά σε συγκρίσεις αλληλουχιών γονιδιώματος, με λιγότερη προσοχή στις αλλαγές στα πραγματικά μόρια που εκτελούν λειτουργίες οικιακής φροντίδας και χρησιμεύουν ως πιθανοί στόχοι φαρμάκων. Συγκριτικές μελέτες έχουν δείξει ότι το βάρος των επιβλαβών ενδοκυτταρικών μικροβιακών μεταλλάξεων φαίνεται να προδιαθέτει τις πρωτεΐνες και τα νουκλεϊκά οξέα να αναδιπλώνονται λανθασμένα και να συσσωματώνονται, καθιστώντας τα πιο εξαρτώμενα από τους συνοδούς και υπερευαίσθητα στη θερμότητα19,20,21,22,23. Επιπλέον, διάφορα παράσιτα - ανεξάρτητη εξέλιξη που μερικές φορές χωρίζεται σε απόσταση έως και 2,5 δισεκατομμύρια χρόνια - βίωσαν παρόμοια απώλεια κέντρων ελέγχου ποιότητας στη σύνθεση πρωτεϊνών5,6 και στους μηχανισμούς επιδιόρθωσης DNA24. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για την επίδραση του ενδοκυτταρικού τρόπου ζωής σε όλες τις άλλες ιδιότητες των κυτταρικών μακρομορίων, συμπεριλαμβανομένης της μοριακής προσαρμογής σε ένα αυξανόμενο βάρος επιβλαβών μεταλλάξεων.
Σε αυτή την εργασία, προκειμένου να κατανοήσουμε καλύτερα την εξέλιξη των πρωτεϊνών και των νουκλεϊκών οξέων των ενδοκυτταρικών μικροοργανισμών, προσδιορίσαμε τη δομή των ριβοσωμάτων του ενδοκυτταρικού παρασίτου Encephalitozoon cuniculi. Το E. cuniculi είναι ένας μυκητοειδής οργανισμός που ανήκει σε μια ομάδα παρασιτικών μικροσποριδίων που έχουν ασυνήθιστα μικρά ευκαρυωτικά γονιδιώματα και ως εκ τούτου χρησιμοποιούνται ως οργανισμοί-μοντέλα για τη μελέτη της αποσύνθεσης του γονιδιώματος25,26,27,28,29,30. Πρόσφατα, προσδιορίστηκε η δομή του κρυο-EM ριβοσώματος για μέτρια μειωμένα γονιδιώματα των Microsporidia, Paranosema locustae και Vairimorpha necatrix31,32 (γονιδίωμα ~3,2 Mb). Αυτές οι δομές υποδηλώνουν ότι κάποια απώλεια ενίσχυσης rRNA αντισταθμίζεται από την ανάπτυξη νέων επαφών μεταξύ γειτονικών ριβοσωμικών πρωτεϊνών ή την απόκτηση νέων ριβοσωμικών πρωτεϊνών msL131,32. Τα είδη Encephalitozoon (γονιδίωμα ~2,5 εκατομμύρια bp), μαζί με τον πλησιέστερο συγγενή τους Ordospora, επιδεικνύουν τον απόλυτο βαθμό μείωσης του γονιδιώματος στους ευκαρυώτες - έχουν λιγότερα από 2000 γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες και αναμένεται ότι τα ριβοσώματά τους όχι μόνο στερούνται θραυσμάτων επέκτασης rRNA (θραύσματα rRNA που διακρίνουν τα ευκαρυωτικά ριβοσώματα από τα βακτηριακά ριβοσώματα), αλλά έχουν επίσης τέσσερις ριβοσωμικές πρωτεΐνες λόγω της έλλειψης ομολόγων στο γονιδίωμα του E. cuniculi26,27,28. Επομένως, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι το ριβόσωμα E. cuniculi μπορεί να αποκαλύψει προηγουμένως άγνωστες στρατηγικές για μοριακή προσαρμογή στην αποσύνθεση του γονιδιώματος.
Η κρυο-EM δομή μας αντιπροσωπεύει το μικρότερο ευκαρυωτικό κυτταροπλασματικό ριβόσωμα που έχει χαρακτηριστεί και παρέχει πληροφορίες για το πώς ο τελικός βαθμός μείωσης του γονιδιώματος επηρεάζει τη δομή, τη συναρμολόγηση και την εξέλιξη του μοριακού μηχανισμού που είναι αναπόσπαστο μέρος του κυττάρου. Διαπιστώσαμε ότι το ριβόσωμα E. cuniculi παραβιάζει πολλές από τις ευρέως διατηρημένες αρχές της αναδίπλωσης του RNA και της συναρμολόγησης των ριβοσωμάτων και ανακαλύψαμε μια νέα, προηγουμένως άγνωστη ριβοσωμική πρωτεΐνη. Εντελώς απροσδόκητα, δείχνουμε ότι τα ριβοσώματα των μικροσποριδίων έχουν εξελίξει την ικανότητα να συνδέονται με μικρά μόρια και υποθέτουμε ότι οι περικοπές στο rRNA και τις πρωτεΐνες πυροδοτούν εξελικτικές καινοτομίες που μπορεί τελικά να προσδώσουν χρήσιμες ιδιότητες στο ριβόσωμα.
Για να βελτιώσουμε την κατανόησή μας σχετικά με την εξέλιξη των πρωτεϊνών και των νουκλεϊκών οξέων σε ενδοκυτταρικούς οργανισμούς, αποφασίσαμε να απομονώσουμε σπόρια E. cuniculi από καλλιέργειες μολυσμένων κυττάρων θηλαστικών, προκειμένου να καθαρίσουμε τα ριβοσώματά τους και να προσδιορίσουμε τη δομή αυτών των ριβοσωμάτων. Είναι δύσκολο να ληφθεί μεγάλος αριθμός παρασιτικών μικροσποριδίων, επειδή τα μικροσπορίδια δεν μπορούν να καλλιεργηθούν σε θρεπτικό μέσο. Αντίθετα, αναπτύσσονται και αναπαράγονται μόνο μέσα στο κύτταρο ξενιστή. Επομένως, για να λάβουμε βιομάζα E. cuniculi για καθαρισμό ριβοσωμάτων, μολύναμε την κυτταρική σειρά RK13 νεφρού θηλαστικού με σπόρια E. cuniculi και καλλιεργήσαμε αυτά τα μολυσμένα κύτταρα για αρκετές εβδομάδες, ώστε να επιτραπεί στο E. cuniculi να αναπτυχθεί και να πολλαπλασιαστεί. Χρησιμοποιώντας μια μονοστοιβάδα μολυσμένων κυττάρων περίπου μισού τετραγωνικού μέτρου, καταφέραμε να καθαρίσουμε περίπου 300 mg σπορίων Microsporidia και να τα χρησιμοποιήσουμε για την απομόνωση ριβοσωμάτων. Στη συνέχεια, διασπάσαμε τα καθαρισμένα σπόρια με γυάλινες χάντρες και απομονώσαμε τα ακατέργαστα ριβοσώματα χρησιμοποιώντας σταδιακή κλασμάτωση των λυμάτων με πολυαιθυλενογλυκόλη. Αυτό μας επέτρεψε να λάβουμε περίπου 300 μg ακατέργαστων ριβοσωμάτων E. cuniculi για δομική ανάλυση.
Στη συνέχεια, συλλέξαμε εικόνες κρυο-ΗΜ χρησιμοποιώντας τα προκύπτοντα δείγματα ριβοσωμάτων και επεξεργαστήκαμε αυτές τις εικόνες χρησιμοποιώντας μάσκες που αντιστοιχούν στη μεγάλη ριβοσωμική υπομονάδα, την κεφαλή μικρής υπομονάδας και τη μικρή υπομονάδα. Κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας, συλλέξαμε εικόνες περίπου 108.000 ριβοσωμικών σωματιδίων και υπολογίσαμε εικόνες κρυο-ΗΜ με ανάλυση 2,7 Å (Συμπληρωματικά Σχήματα 1-3). Στη συνέχεια, χρησιμοποιήσαμε εικόνες κρυο-ΗΜ για να μοντελοποιήσουμε το rRNA, την ριβοσωμική πρωτεΐνη και τον παράγοντα χειμερίας νάρκης Mdf1 που σχετίζεται με τα ριβοσώματα του E. cuniculi (Εικ. 1α, β).
α Δομή του ριβοσώματος E. cuniculi σε σύμπλοκο με τον παράγοντα χειμερίας νάρκης Mdf1 (pdb id 7QEP). β Χάρτης του παράγοντα χειμερίας νάρκης Mdf1 που σχετίζεται με το ριβόσωμα E. cuniculi. γ Χάρτης δευτερογενούς δομής που συγκρίνει το ανακτημένο rRNA σε είδη Μικροσποριδίων με γνωστές ριβοσωμικές δομές. Τα πάνελ δείχνουν τη θέση των ενισχυμένων θραυσμάτων rRNA (ES) και των ενεργών θέσεων των ριβοσωμάτων, συμπεριλαμβανομένης της θέσης αποκωδικοποίησης (DC), του βρόχου σαρκινικίνης (SRL) και του κέντρου πεπτιδυλοτρανσφεράσης (PTC). δ Η πυκνότητα ηλεκτρονίων που αντιστοιχεί στο κέντρο πεπτιδυλοτρανσφεράσης του ριβοσώματος E. cuniculi υποδηλώνει ότι αυτή η καταλυτική θέση έχει την ίδια δομή στο παράσιτο E. cuniculi και στους ξενιστές του, συμπεριλαμβανομένου του H. sapiens. e, f Η αντίστοιχη πυκνότητα ηλεκτρονίων του κέντρου αποκωδικοποίησης (e) και η σχηματική δομή του κέντρου αποκωδικοποίησης (f) υποδεικνύουν ότι το E. cuniculi έχει υπολείμματα U1491 αντί για A1491 (αρίθμηση E. coli) σε πολλά άλλα ευκαρυωτικά. Αυτή η αλλαγή υποδηλώνει ότι το E. cuniculi μπορεί να είναι ευαίσθητο σε αντιβιοτικά που στοχεύουν αυτό το ενεργό κέντρο.
Σε αντίθεση με τις προηγουμένως καθιερωμένες δομές των ριβοσωμάτων V. necatrix και P. locustae (και οι δύο δομές αντιπροσωπεύουν την ίδια οικογένεια μικροσποριδίων Nosematidae και είναι πολύ παρόμοιες μεταξύ τους), 31,32 τα ριβοσώματα E. cuniculi υφίστανται πολυάριθμες διεργασίες κατακερματισμού rRNA και πρωτεϊνών. Περαιτέρω μετουσίωση (Συμπληρωματικά Σχήματα 4-6). Στο rRNA, οι πιο εντυπωσιακές αλλαγές περιελάμβαναν την πλήρη απώλεια του ενισχυμένου θραύσματος 25S rRNA ES12L και τη μερική εκφύλιση των ελίκων h39, h41 και H18 (Εικόνα 1c, Συμπληρωματικό Σχήμα 4). Μεταξύ των ριβοσωμικών πρωτεϊνών, οι πιο εντυπωσιακές αλλαγές περιελάμβαναν την πλήρη απώλεια της πρωτεΐνης eS30 και τη βράχυνση των πρωτεϊνών eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 και eS7 (Συμπληρωματικά Σχήματα 4, 5).
Έτσι, η ακραία μείωση των γονιδιωμάτων των ειδών Encephalotozooon/Ordospora αντικατοπτρίζεται στη δομή των ριβοσωμάτων τους: Τα ριβοσώματα E. cuniculi βιώνουν την πιο δραματική απώλεια πρωτεϊνικής περιεκτικότητας στα ευκαρυωτικά κυτταροπλασματικά ριβοσώματα που υπόκεινται σε δομικό χαρακτηρισμό και δεν έχουν καν αυτά τα rRNA και τα θραύσματα πρωτεϊνών που είναι ευρέως συντηρημένα όχι μόνο στα ευκαρυωτικά, αλλά και στους τρεις τομείς της ζωής. Η δομή του ριβοσώματος E. cuniculi παρέχει το πρώτο μοριακό μοντέλο για αυτές τις αλλαγές και αποκαλύπτει εξελικτικά γεγονότα που έχουν παραβλεφθεί τόσο από τη συγκριτική γονιδιωματική όσο και από τις μελέτες της ενδοκυτταρικής βιομοριακής δομής (Συμπληρωματικό Σχήμα 7). Παρακάτω, περιγράφουμε καθένα από αυτά τα γεγονότα μαζί με την πιθανή εξελικτική τους προέλευση και τον πιθανό αντίκτυπό τους στη λειτουργία των ριβοσωμάτων.
Στη συνέχεια, διαπιστώσαμε ότι, εκτός από τις μεγάλες περικοπές του rRNA, τα ριβοσώματα E. cuniculi έχουν παραλλαγές rRNA σε μία από τις ενεργές θέσεις τους. Αν και το κέντρο πεπτιδυλοτρανσφεράσης του ριβοσώματος E. cuniculi έχει την ίδια δομή με άλλα ευκαρυωτικά ριβοσώματα (Εικ. 1δ), το κέντρο αποκωδικοποίησης διαφέρει λόγω της παραλλαγής αλληλουχίας στο νουκλεοτίδιο 1491 (αρίθμηση E. coli, Εικ. 1ε, στ). Αυτή η παρατήρηση είναι σημαντική επειδή η θέση αποκωδικοποίησης των ευκαρυωτικών ριβοσωμάτων συνήθως περιέχει υπολείμματα G1408 και A1491 σε σύγκριση με τα υπολείμματα βακτηριακού τύπου A1408 και G1491. Αυτή η παραλλαγή αποτελεί τη βάση της διαφορετικής ευαισθησίας των βακτηριακών και ευκαρυωτικών ριβοσωμάτων στην οικογένεια αμινογλυκοσιδών των ριβοσωμικών αντιβιοτικών και σε άλλα μικρά μόρια που στοχεύουν τη θέση αποκωδικοποίησης. Στη θέση αποκωδικοποίησης του ριβοσώματος E. cuniculi, το υπόλειμμα A1491 αντικαταστάθηκε με U1491, δημιουργώντας ενδεχομένως μια μοναδική διεπαφή σύνδεσης για μικρά μόρια που στοχεύουν αυτήν την ενεργή θέση. Η ίδια παραλλαγή A14901 υπάρχει επίσης σε άλλα μικροσπορίδια όπως τα P. locustae και V. necatrix, γεγονός που υποδηλώνει ότι είναι ευρέως διαδεδομένη μεταξύ των ειδών μικροσποριδίων (Εικ. 1f).
Επειδή τα δείγματα ριβοσωμάτων E. cuniculi απομονώθηκαν από μεταβολικά ανενεργά σπόρια, εξετάσαμε τον χάρτη κρυο-EM του E. cuniculi για προηγουμένως περιγραφείσα δέσμευση ριβοσωμάτων υπό συνθήκες στρες ή πείνας. Παράγοντες χειμερίας νάρκης 31,32,36,37, 38. Αντιστοιχίσαμε την προηγουμένως καθιερωμένη δομή του ριβοσώματος σε χειμερία νάρκη με τον χάρτη κρυο-EM του ριβοσώματος E. cuniculi. Για την πρόσδεση, χρησιμοποιήθηκαν ριβοσώματα S. cerevisiae σε σύμπλοκο με τον παράγοντα χειμερίας νάρκης Stm138, ριβοσώματα ακρίδας σε σύμπλοκο με τον παράγοντα Lso232 και ριβοσώματα V. necatrix σε σύμπλοκο με τους παράγοντες Mdf1 και Mdf231. Ταυτόχρονα, βρήκαμε την πυκνότητα κρυο-EM που αντιστοιχεί στον παράγοντα ηρεμίας Mdf1. Παρόμοια με τη σύνδεση του Mdf1 στο ριβόσωμα V. necatrix, το Mdf1 συνδέεται επίσης με το ριβόσωμα E. cuniculi, όπου μπλοκάρει την Ε θέση του ριβοσώματος, πιθανώς βοηθώντας στη διαθεσιμότητα των ριβοσωμάτων όταν τα σπόρια των παρασίτων καθίστανται μεταβολικά ανενεργά κατά την απενεργοποίηση του σώματος (Σχήμα 2).
Η Mdf1 μπλοκάρει την Ε θέση του ριβοσώματος, η οποία φαίνεται να βοηθά στην απενεργοποίηση του ριβοσώματος όταν τα σπόρια του παρασίτου καθίστανται μεταβολικά ανενεργά. Στη δομή του ριβοσώματος E. cuniculi, διαπιστώσαμε ότι η Mdf1 σχηματίζει μια προηγουμένως άγνωστη επαφή με το στέλεχος του ριβοσώματος L1, το τμήμα του ριβοσώματος που διευκολύνει την απελευθέρωση του αποακετυλιωμένου tRNA από το ριβόσωμα κατά τη διάρκεια της πρωτεϊνοσύνθεσης. Αυτές οι επαφές υποδηλώνουν ότι η Mdf1 αποσυνδέεται από το ριβόσωμα χρησιμοποιώντας τον ίδιο μηχανισμό με το αποακετυλιωμένο tRNA, παρέχοντας μια πιθανή εξήγηση για το πώς το ριβόσωμα απομακρύνει την Mdf1 για να επανενεργοποιήσει την πρωτεϊνοσύνθεση.
Ωστόσο, η δομή μας αποκάλυψε μια άγνωστη επαφή μεταξύ του Mdf1 και του σκέλους L1 του ριβοσώματος (το τμήμα του ριβοσώματος που βοηθά στην απελευθέρωση του αποακυλιωμένου tRNA από το ριβόσωμα κατά τη διάρκεια της πρωτεϊνοσύνθεσης). Συγκεκριμένα, το Mdf1 χρησιμοποιεί τις ίδιες επαφές με το τμήμα του αγκώνα του μορίου αποακυλιωμένου tRNA (Εικ. 2). Αυτή η προηγουμένως άγνωστη μοριακή μοντελοποίηση έδειξε ότι το Mdf1 αποσυνδέεται από το ριβόσωμα χρησιμοποιώντας τον ίδιο μηχανισμό με το αποακετυλιωμένο tRNA, γεγονός που εξηγεί πώς το ριβόσωμα απομακρύνει αυτόν τον παράγοντα χειμερίας νάρκης για να επανενεργοποιήσει την πρωτεϊνοσύνθεση.
Κατά την κατασκευή του μοντέλου rRNA, διαπιστώσαμε ότι το ριβόσωμα E. cuniculi έχει ασυνήθιστα διπλωμένα θραύσματα rRNA, τα οποία ονομάσαμε συγχωνευμένο rRNA (Εικ. 3). Στα ριβοσώματα που εκτείνονται και στους τρεις τομείς της ζωής, το rRNA διπλώνεται σε δομές στις οποίες τα περισσότερα rRNA είτε σχηματίζουν ζεύγη βάσεων και διπλώνονται μεταξύ τους είτε αλληλεπιδρούν με ριβοσωμικές πρωτεΐνες38,39,40. Ωστόσο, στα ριβοσώματα E. cuniculi, τα rRNA φαίνεται να παραβιάζουν αυτήν την αρχή αναδίπλωσης μετατρέποντας ορισμένες από τις έλικες τους σε ξεδιπλωμένες περιοχές rRNA.
Δομή της έλικας του rRNA H18 25S στα S. cerevisiae, V. necatrix και E. cuniculi. Συνήθως, στα ριβοσώματα που εκτείνονται στους τρεις τομείς ζωής, αυτός ο συνδετήρας περιελίσσεται σε μια έλικα RNA που περιέχει 24 έως 34 υπολείμματα. Στα Μικροσπορίδια, αντίθετα, αυτός ο συνδετήρας rRNA μειώνεται σταδιακά σε δύο μονόκλωνους συνδετήρες πλούσιους σε ουριδίνη που περιέχουν μόνο 12 υπολείμματα. Τα περισσότερα από αυτά τα υπολείμματα εκτίθενται σε διαλύτες. Το σχήμα δείχνει ότι τα παρασιτικά μικροσπορίδια φαίνεται να παραβιάζουν τις γενικές αρχές της αναδίπλωσης του rRNA, όπου οι βάσεις του rRNA συνήθως συνδέονται με άλλες βάσεις ή εμπλέκονται σε αλληλεπιδράσεις rRNA-πρωτεΐνης. Στα μικροσπορίδια, ορισμένα θραύσματα rRNA αναδιπλώνονται δυσμενώς, όπου η προηγούμενη έλικα του rRNA γίνεται ένα μονόκλωνο θραύσμα επιμηκυμένο σχεδόν σε ευθεία γραμμή. Η παρουσία αυτών των ασυνήθιστων περιοχών επιτρέπει στο rRNA των μικροσποριδίων να συνδέεται με μακρινά θραύσματα rRNA χρησιμοποιώντας έναν ελάχιστο αριθμό βάσεων RNA.
Το πιο εντυπωσιακό παράδειγμα αυτής της εξελικτικής μετάβασης μπορεί να παρατηρηθεί στην έλικα rRNA H18 25S (Εικ. 3). Σε είδη από το E. coli έως τον άνθρωπο, οι βάσεις αυτής της έλικας rRNA περιέχουν 24-32 νουκλεοτίδια, σχηματίζοντας μια ελαφρώς ακανόνιστη έλικα. Σε προηγουμένως ταυτοποιημένες ριβοσωμικές δομές από V. necatrix και P. locustae,31,32 οι βάσεις της έλικας H18 είναι μερικώς ξετυλιγμένες, αλλά το ζεύγος νουκλεοτιδικών βάσεων διατηρείται. Ωστόσο, στο E. cuniculi αυτό το θραύσμα rRNA γίνεται ο βραχύτερος σύνδεσμος 228UUUGU232 και 301UUUUUUUUU307. Σε αντίθεση με τα τυπικά θραύσματα rRNA, αυτοί οι σύνδεσμοι πλούσιοι σε ουριδίνη δεν σπειρώνονται ούτε έρχονται σε εκτεταμένη επαφή με ριβοσωμικές πρωτεΐνες. Αντ' αυτού, υιοθετούν δομές ανοιχτές σε διαλύτη και πλήρως ξεδιπλωμένες στις οποίες οι κλώνοι rRNA εκτείνονται σχεδόν ευθεία. Αυτή η τεντωμένη διαμόρφωση εξηγεί πώς το E. cuniculi χρησιμοποιεί μόνο 12 βάσεις RNA για να γεμίσει το κενό των 33 Å μεταξύ των ελίκων rRNA H16 και H18, ενώ άλλα είδη απαιτούν τουλάχιστον διπλάσιες βάσεις rRNA για να γεμίσουν το κενό.
Έτσι, μπορούμε να αποδείξουμε ότι, μέσω της ενεργειακά δυσμενούς αναδίπλωσης, τα παρασιτικά μικροσπορίδια έχουν αναπτύξει μια στρατηγική για τη συστολή ακόμη και εκείνων των τμημάτων rRNA που παραμένουν ευρέως διατηρημένα σε όλα τα είδη και στους τρεις τομείς της ζωής. Προφανώς, συσσωρεύοντας μεταλλάξεις που μετασχηματίζουν τις έλικες rRNA σε μικρούς πολυ-U συνδετήρες, το E. cuniculi μπορεί να σχηματίσει ασυνήθιστα θραύσματα rRNA που περιέχουν όσο το δυνατόν λιγότερα νουκλεοτίδια για σύνδεση των περιφερικών θραυσμάτων rRNA. Αυτό βοηθά να εξηγηθεί πώς τα μικροσπορίδια πέτυχαν μια δραματική μείωση της βασικής μοριακής τους δομής χωρίς να χάσουν τη δομική και λειτουργική τους ακεραιότητα.
Ένα άλλο ασυνήθιστο χαρακτηριστικό του rRNA του E. cuniculi είναι η εμφάνιση του rRNA χωρίς πάχυνση (Εικ. 4). Τα εξογκώματα είναι νουκλεοτίδια χωρίς ζεύγη βάσεων που στρίβουν έξω από την έλικα του RNA αντί να κρύβονται μέσα σε αυτήν. Οι περισσότερες προεξοχές του rRNA λειτουργούν ως μοριακές συγκολλητικές ουσίες, βοηθώντας στη σύνδεση γειτονικών ριβοσωμικών πρωτεϊνών ή άλλων θραυσμάτων rRNA. Ορισμένες από τις εξογκώματα λειτουργούν ως αρθρώσεις, επιτρέποντας στην έλικα του rRNA να κάμπτεται και να διπλώνεται βέλτιστα για παραγωγική πρωτεϊνοσύνθεση 41.
α Μια προεξοχή rRNA (αρίθμηση S. cerevisiae) απουσιάζει από τη δομή του ριβοσώματος του E. cuniculi, αλλά υπάρχει στα περισσότερα άλλα ευκαρυωτικά β εσωτερικά ριβοσώματα των E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens και E. cuniculi. Τα παράσιτα δεν διαθέτουν πολλά από τα αρχαία, ιδιαίτερα συντηρημένα εξογκώματα rRNA. Αυτές οι πάχυνσεις σταθεροποιούν τη δομή του ριβοσώματος. Επομένως, η απουσία τους στα μικροσπορίδια υποδηλώνει μειωμένη σταθερότητα της αναδίπλωσης του rRNA στα παράσιτα μικροσποριδίων. Η σύγκριση με τα στελέχη P (στελέχη L7/L12 στα βακτήρια) δείχνει ότι η απώλεια των εξογκωμάτων rRNA μερικές φορές συμπίπτει με την εμφάνιση νέων εξογκωμάτων δίπλα στα χαμένα εξογκώματα. Η έλικα H42 στο rRNA 23S/28S έχει μια αρχαία εξογκώματα (U1206 στο Saccharomyces cerevisiae) που εκτιμάται ότι είναι τουλάχιστον 3,5 δισεκατομμυρίων ετών λόγω της προστασίας της σε τρεις τομείς της ζωής. Στα μικροσπορίδια, αυτή η εξογκώματα εξαλείφεται. Ωστόσο, ένα νέο εξόγκωμα εμφανίστηκε δίπλα στο χαμένο εξόγκωμα (A1306 στο E. cuniculi).
Είναι εντυπωσιακό ότι διαπιστώσαμε ότι τα ριβοσώματα του E. cuniculi δεν έχουν τα περισσότερα από τα εξογκώματα rRNA που βρίσκονται σε άλλα είδη, συμπεριλαμβανομένων περισσότερων από 30 εξογκωμάτων που διατηρούνται σε άλλα ευκαρυωτικά (Εικ. 4α). Αυτή η απώλεια εξαλείφει πολλές επαφές μεταξύ των ριβοσωμικών υπομονάδων και των γειτονικών ελίκων rRNA, δημιουργώντας μερικές φορές μεγάλα κοίλα κενά μέσα στο ριβόσωμα, καθιστώντας το ριβόσωμα του E. cuniculi πιο πορώδες σε σύγκριση με τα πιο παραδοσιακά ριβοσώματα (Εικ. 4β). Αξιοσημείωτα, διαπιστώσαμε ότι τα περισσότερα από αυτά τα εξογκώματα χάθηκαν επίσης στις προηγουμένως αναγνωρισμένες δομές ριβοσωμάτων V. necatrix και P. locustae, οι οποίες είχαν παραβλεφθεί από προηγούμενες δομικές αναλύσεις31,32.
Μερικές φορές η απώλεια των εξογκωμάτων του rRNA συνοδεύεται από την ανάπτυξη νέων εξογκωμάτων δίπλα στο χαμένο εξόγκωμα. Για παράδειγμα, το ριβοσωμικό P-στέλεχος περιέχει ένα εξόγκωμα U1208 (στο Saccharomyces cerevisiae) που επέζησε από το E. coli στους ανθρώπους και επομένως εκτιμάται ότι είναι 3,5 δισεκατομμυρίων ετών. Κατά τη διάρκεια της πρωτεϊνοσύνθεσης, αυτό το εξόγκωμα βοηθά το P στέλεχος να κινείται μεταξύ ανοιχτών και κλειστών διαμορφώσεων, έτσι ώστε το ριβόσωμα να μπορεί να στρατολογήσει μεταφραστικούς παράγοντες και να τους μεταφέρει στην ενεργό θέση. Στα ριβοσώματα του E. cuniculi, αυτή η πάχυνση απουσιάζει. Ωστόσο, μια νέα πάχυνση (G883) που βρίσκεται μόνο σε τρία ζεύγη βάσεων μπορεί να συμβάλει στην αποκατάσταση της βέλτιστης ευκαμψίας του P στελέχους (Εικ. 4c).
Τα δεδομένα μας για το rRNA χωρίς εξογκώματα υποδηλώνουν ότι η ελαχιστοποίηση του rRNA δεν περιορίζεται στην απώλεια στοιχείων rRNA στην επιφάνεια του ριβοσώματος, αλλά μπορεί επίσης να περιλαμβάνει τον πυρήνα του ριβοσώματος, δημιουργώντας ένα μοριακό ελάττωμα ειδικό για το παράσιτο που δεν έχει περιγραφεί σε ελεύθερα ζωντανά κύτταρα. Παρατηρούνται ζωντανά είδη.
Μετά την μοντελοποίηση των κανονικών ριβοσωμικών πρωτεϊνών και του rRNA, διαπιστώσαμε ότι τα συμβατικά ριβοσωμικά συστατικά δεν μπορούν να εξηγήσουν τα τρία μέρη της κρυο-EM εικόνας. Δύο από αυτά τα θραύσματα είναι μικρά μόρια σε μέγεθος (Εικ. 5, Συμπληρωματικό Σχήμα 8). Το πρώτο τμήμα βρίσκεται ανάμεσα στις ριβοσωμικές πρωτεΐνες uL15 και eL18 σε μια θέση που συνήθως καταλαμβάνεται από το C-τελικό άκρο του eL18, το οποίο είναι βραχύτερο στο E. cuniculi. Αν και δεν μπορούμε να προσδιορίσουμε την ταυτότητα αυτού του μορίου, το μέγεθος και το σχήμα αυτής της νησίδας πυκνότητας εξηγούνται καλά από την παρουσία μορίων σπερμιδίνης. Η σύνδεσή της με το ριβόσωμα σταθεροποιείται από μεταλλάξεις ειδικές για μικροσπορίδια στις πρωτεΐνες uL15 (Asp51 και Arg56), οι οποίες φαίνεται να αυξάνουν τη συγγένεια του ριβοσώματος για αυτό το μικρό μόριο, καθώς επιτρέπουν στο uL15 να τυλίξει το μικρό μόριο σε μια ριβοσωμική δομή. Συμπληρωματικό Σχήμα 2). 8, πρόσθετα δεδομένα 1, 2).
Κρυο-ΗΜ απεικόνιση που δείχνει την παρουσία νουκλεοτιδίων εκτός της ριβόζης που είναι συνδεδεμένη με το ριβόσωμα E. cuniculi. Στο ριβόσωμα E. cuniculi, αυτό το νουκλεοτίδιο καταλαμβάνει την ίδια θέση με το νουκλεοτίδιο A3186 του 25S rRNA (αρίθμηση Saccharomyces cerevisiae) στα περισσότερα άλλα ευκαρυωτικά ριβοσώματα. β Στη ριβοσωμική δομή του E. cuniculi, αυτό το νουκλεοτίδιο βρίσκεται μεταξύ των ριβοσωμικών πρωτεϊνών uL9 και eL20, σταθεροποιώντας έτσι την επαφή μεταξύ των δύο πρωτεϊνών. cd ανάλυση διατήρησης αλληλουχίας eL20 μεταξύ ειδών μικροσποριδίων. Το φυλογενετικό δέντρο των ειδών Microsporidia (c) και η πολλαπλή ευθυγράμμιση αλληλουχίας της πρωτεΐνης eL20 (d) δείχνουν ότι τα υπολείμματα σύνδεσης νουκλεοτιδίων F170 και K172 είναι διατηρημένα στα περισσότερα τυπικά Μικροσπορίδια, με εξαίρεση το S. lophii, με εξαίρεση τα πρώιμα διακλαδούμενα Μικροσπορίδια, τα οποία διατήρησαν την επέκταση rRNA ES39L. ε Αυτό το σχήμα δείχνει ότι τα υπολείμματα σύνδεσης νουκλεοτιδίων F170 και K172 υπάρχουν μόνο στο eL20 του γονιδιώματος των μικροσποριδίων με υψηλή αναγωγή, αλλά όχι σε άλλα ευκαρυωτικά. Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι τα ριβοσώματα των μικροσποριδίων έχουν αναπτύξει μια θέση σύνδεσης νουκλεοτιδίων που φαίνεται να συνδέεται με μόρια AMP και να τα χρησιμοποιεί για να σταθεροποιήσει τις αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης στη ριβοσωμική δομή. Η υψηλή διατήρηση αυτής της θέσης σύνδεσης στα μικροσπορίδια και η απουσία της σε άλλα ευκαρυωτικά υποδηλώνει ότι αυτή η θέση μπορεί να παρέχει ένα επιλεκτικό πλεονέκτημα επιβίωσης για τα μικροσπορίδια. Έτσι, η θήκη σύνδεσης νουκλεοτιδίων στο ριβόσωμα των μικροσποριδίων δεν φαίνεται να είναι ένα εκφυλισμένο χαρακτηριστικό ή μια τελική μορφή αποικοδόμησης του rRNA όπως περιγράφηκε προηγουμένως, αλλά μάλλον μια χρήσιμη εξελικτική καινοτομία που επιτρέπει στο ριβόσωμα των μικροσποριδίων να συνδέεται απευθείας με μικρά μόρια, χρησιμοποιώντας τα ως μοριακά δομικά στοιχεία. Αυτή η ανακάλυψη καθιστά το ριβόσωμα των μικροσποριδίων το μόνο ριβόσωμα που είναι γνωστό ότι χρησιμοποιεί ένα μόνο νουκλεοτίδιο ως δομικό του στοιχείο. στ Υποθετική εξελικτική οδός που προέρχεται από τη σύνδεση νουκλεοτιδίων.
Η δεύτερη πυκνότητα χαμηλού μοριακού βάρους βρίσκεται στη διεπαφή μεταξύ των ριβοσωμικών πρωτεϊνών uL9 και eL30 (Εικ. 5α). Αυτή η διεπαφή περιγράφηκε προηγουμένως στη δομή του ριβοσώματος Saccharomyces cerevisiae ως θέση σύνδεσης για το 25S νουκλεοτίδιο του rRNA A3186 (μέρος της επέκτασης ES39L rRNA)38. Αποδείχθηκε ότι σε εκφυλισμένα ριβοσώματα ES39L του P. locustae, αυτή η διεπαφή συνδέεται με ένα άγνωστο μοναδικό νουκλεοτίδιο 31, και θεωρείται ότι αυτό το νουκλεοτίδιο είναι μια μειωμένη τελική μορφή του rRNA, στην οποία το μήκος του rRNA είναι ~130-230 βάσεις. Το ES39L ανάγεται σε ένα μόνο νουκλεοτίδιο 32,43. Οι εικόνες κρυο-EM μας υποστηρίζουν την ιδέα ότι η πυκνότητα μπορεί να εξηγηθεί από τα νουκλεοτίδια. Ωστόσο, η υψηλότερη ανάλυση της δομής μας έδειξε ότι αυτό το νουκλεοτίδιο είναι ένα εξωριβοσωμικό μόριο, πιθανώς AMP (Εικ. 5α, β).
Στη συνέχεια, ρωτήσαμε αν η θέση σύνδεσης νουκλεοτιδίων εμφανιζόταν στο ριβόσωμα E. cuniculi ή αν υπήρχε προηγουμένως. Δεδομένου ότι η σύνδεση νουκλεοτιδίων προκαλείται κυρίως από τα υπολείμματα Phe170 και Lys172 στην ριβοσωμική πρωτεΐνη eL30, αξιολογήσαμε τη διατήρηση αυτών των υπολειμμάτων σε 4396 αντιπροσωπευτικούς ευκαρυώτες. Όπως στην περίπτωση του uL15 παραπάνω, διαπιστώσαμε ότι τα υπολείμματα Phe170 και Lys172 είναι ιδιαίτερα συντηρημένα μόνο σε τυπικά Μικροσπορίδια, αλλά απουσιάζουν σε άλλα ευκαρυωτικά, συμπεριλαμβανομένων των άτυπων Μικροσποριδίων Mitosporidium και Amphiamblys, στα οποία το θραύσμα rRNA ES39L δεν είναι αναγμένο 44, 45, 46 (Εικ. 5c). -e).
Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν την ιδέα ότι το E. cuniculi και πιθανώς άλλα κανονικά μικροσπορίδια έχουν αναπτύξει την ικανότητα να συλλαμβάνουν αποτελεσματικά μεγάλο αριθμό μικρών μεταβολιτών στη δομή του ριβοσώματος για να αντισταθμίσουν τη μείωση των επιπέδων rRNA και πρωτεΐνης. Με αυτόν τον τρόπο, έχουν αναπτύξει μια μοναδική ικανότητα να δεσμεύουν νουκλεοτίδια εκτός του ριβοσώματος, δείχνοντας ότι οι παρασιτικές μοριακές δομές αντισταθμίζουν τη σύλληψη άφθονων μικρών μεταβολιτών και τη χρήση τους ως δομικά μιμούμενα αποικοδομημένα θραύσματα RNA και πρωτεΐνης.
Το τρίτο μη προσομοιωμένο μέρος του κρυο-EM χάρτη μας, που βρίσκεται στη μεγάλη ριβοσωμική υπομονάδα. Η σχετικά υψηλή ανάλυση (2,6 Å) του χάρτη μας υποδηλώνει ότι αυτή η πυκνότητα ανήκει σε πρωτεΐνες με μοναδικούς συνδυασμούς μεγάλων υπολειμμάτων πλευρικής αλυσίδας, γεγονός που μας επέτρεψε να αναγνωρίσουμε αυτήν την πυκνότητα ως μια προηγουμένως άγνωστη ριβοσωμική πρωτεΐνη που αναγνωρίσαμε ως . Ονομάστηκε msL2 (Microsporidia-specific protein L2) (μέθοδοι, σχήμα 6). Η αναζήτηση ομολογίας έδειξε ότι η msL2 διατηρείται στην ομάδα Microsporidia του γένους Encephaliter και Orosporidium, αλλά απουσιάζει σε άλλα είδη, συμπεριλαμβανομένων άλλων Microsporidia. Στη ριβοσωμική δομή, η msL2 καταλαμβάνει ένα κενό που σχηματίζεται από την απώλεια του εκτεταμένου rRNA του ES31L. Σε αυτό το κενό, η msL2 βοηθά στη σταθεροποίηση της αναδίπλωσης του rRNA και μπορεί να αντισταθμίσει την απώλεια του ES31L (Σχήμα 6).
α Ηλεκτρονική πυκνότητα και μοντέλο της ειδικής για τα μικροσπορίδια ριβοσωμικής πρωτεΐνης msL2 που βρίσκεται στα ριβοσώματα του E. cuniculi. β Τα περισσότερα ευκαρυωτικά ριβοσώματα, συμπεριλαμβανομένου του ριβοσώματος 80S του Saccharomyces cerevisiae, έχουν απώλεια ενίσχυσης rRNA ES19L στα περισσότερα μικροσποριδιακά είδη. Η προηγουμένως καθιερωμένη δομή του ριβοσώματος V. necatrix microsporidia υποδηλώνει ότι η απώλεια ES19L σε αυτά τα παράσιτα αντισταθμίζεται από την εξέλιξη της νέας ριβοσωμικής πρωτεΐνης msL1. Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι το ριβόσωμα του E. cuniculi ανέπτυξε επίσης μια επιπλέον πρωτεΐνη που μιμείται το ριβοσωμικό RNA ως φαινομενική αντιστάθμιση για την απώλεια της ES19L. Ωστόσο, η msL2 (που επί του παρόντος σχολιάζεται ως η υποθετική πρωτεΐνη ECU06_1135) και η msL1 έχουν διαφορετική δομική και εξελικτική προέλευση. Αυτή η ανακάλυψη της δημιουργίας εξελικτικά άσχετων ριβοσωμικών πρωτεϊνών msL1 και msL2 υποδηλώνει ότι εάν τα ριβοσώματα συσσωρεύουν επιβλαβείς μεταλλάξεις στο rRNA τους, μπορούν να επιτύχουν πρωτοφανή επίπεδα συνθετικής ποικιλομορφίας ακόμη και σε ένα μικρό υποσύνολο στενά συγγενικών ειδών. Αυτή η ανακάλυψη θα μπορούσε να βοηθήσει στην αποσαφήνιση της προέλευσης και της εξέλιξης του μιτοχονδριακού ριβοσώματος, το οποίο είναι γνωστό για το εξαιρετικά μειωμένο rRNA του και την ανώμαλη μεταβλητότητα στη σύνθεση των πρωτεϊνών μεταξύ των ειδών.
Στη συνέχεια, συγκρίναμε την πρωτεΐνη msL2 με την προηγουμένως περιγραφείσα πρωτεΐνη msL1, τη μόνη γνωστή ριβοσωμική πρωτεΐνη ειδική για μικροσπορίδια που βρίσκεται στο ριβόσωμα V. necatrix. Θέλαμε να ελέγξουμε εάν η msL1 και η msL2 σχετίζονται εξελικτικά. Η ανάλυσή μας έδειξε ότι η msL1 και η msL2 καταλαμβάνουν την ίδια κοιλότητα στη ριβοσωμική δομή, αλλά έχουν διαφορετικές πρωτοταγείς και τριτοταγείς δομές, γεγονός που υποδηλώνει την ανεξάρτητη εξελικτική τους προέλευση (Εικ. 6). Έτσι, η ανακάλυψή μας της msL2 παρέχει στοιχεία ότι ομάδες συμπαγών ευκαρυωτικών ειδών μπορούν να εξελίξουν ανεξάρτητα δομικά διακριτές ριβοσωμικές πρωτεΐνες για να αντισταθμίσουν την απώλεια θραυσμάτων rRNA. Αυτό το εύρημα είναι αξιοσημείωτο στο ότι τα περισσότερα κυτταροπλασματικά ευκαρυωτικά ριβοσώματα περιέχουν μια αμετάβλητη πρωτεΐνη, συμπεριλαμβανομένης της ίδιας οικογένειας 81 ριβοσωμικών πρωτεϊνών. Η εμφάνιση της msL1 και της msL2 σε διάφορες ομάδες μικροσποριδίων σε απόκριση στην απώλεια εκτεταμένων τμημάτων rRNA υποδηλώνει ότι η αποικοδόμηση της μοριακής αρχιτεκτονικής του παρασίτου προκαλεί τα παράσιτα να αναζητήσουν αντισταθμιστικές μεταλλάξεις, οι οποίες μπορεί τελικά να οδηγήσουν στην απόκτησή τους σε διαφορετικούς πληθυσμούς παρασίτων.
Τέλος, όταν ολοκληρώθηκε το μοντέλο μας, συγκρίναμε τη σύνθεση του ριβοσώματος του E. cuniculi με αυτήν που προβλεπόταν από την αλληλουχία του γονιδιώματος. Αρκετές ριβοσωμικές πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένων των eL14, eL38, eL41 και eS30, θεωρούνταν προηγουμένως ότι έλειπαν από το γονιδίωμα του E. cuniculi λόγω της φαινομενικής απουσίας των ομολόγων τους από το γονιδίωμα του E. cuniculi. Απώλεια πολλών ριβοσωμικών πρωτεϊνών προβλέπεται επίσης στα περισσότερα άλλα εξαιρετικά μειωμένα ενδοκυτταρικά παράσιτα και ενδοσυμβιωτικά. Για παράδειγμα, αν και τα περισσότερα ελεύθερα ζώντα βακτήρια περιέχουν την ίδια οικογένεια 54 ριβοσωμικών πρωτεϊνών, μόνο 11 από αυτές τις οικογένειες πρωτεϊνών έχουν ανιχνεύσιμα ομόλογα σε κάθε αναλυμένο γονιδίωμα βακτηρίων περιορισμένων από τον ξενιστή. Προς υποστήριξη αυτής της άποψης, έχει παρατηρηθεί πειραματικά απώλεια ριβοσωμικών πρωτεϊνών σε μικροσπορίδια V. necatrix και P. locustae, τα οποία δεν διαθέτουν τις πρωτεΐνες eL38 και eL4131,32.
Ωστόσο, οι δομές μας δείχνουν ότι μόνο οι eL38, eL41 και eS30 χάνονται στην πραγματικότητα στο ριβόσωμα E. cuniculi. Η πρωτεΐνη eL14 διατηρήθηκε και η δομή μας έδειξε γιατί αυτή η πρωτεΐνη δεν μπορούσε να βρεθεί στην αναζήτηση ομολογίας (Εικ. 7). Στα ριβοσώματα E. cuniculi, το μεγαλύτερο μέρος της θέσης σύνδεσης eL14 χάνεται λόγω της αποικοδόμησης του ενισχυμένου με rRNA ES39L. Απουσία του ES39L, το eL14 έχασε το μεγαλύτερο μέρος της δευτεροταγούς δομής του και μόνο το 18% της αλληλουχίας eL14 ήταν πανομοιότυπο στο E. cuniculi και το S. cerevisiae. Αυτή η κακή διατήρηση της αλληλουχίας είναι αξιοσημείωτη επειδή ακόμη και ο Saccharomyces cerevisiae και ο Homo sapiens - οργανισμοί που εξελίχθηκαν με διαφορά 1,5 δισεκατομμυρίων ετών - μοιράζονται περισσότερο από το 51% των ίδιων υπολειμμάτων στο eL14. Αυτή η ανώμαλη απώλεια διατήρησης εξηγεί γιατί το E. cuniculi eL14 σχολιάζεται επί του παρόντος ως η υποτιθέμενη πρωτεΐνη M970_061160 και όχι ως η ριβοσωμική πρωτεΐνη eL1427.
και Το ριβόσωμα Microsporidia έχασε την επέκταση rRNA ES39L, η οποία εξάλειψε μερικώς τη θέση δέσμευσης της ριβοσωμικής πρωτεΐνης eL14. Ελλείψει ES39L, η πρωτεΐνη μικροσπορίων eL14 υφίσταται απώλεια δευτεροταγούς δομής, στην οποία η πρώην α-έλικα δέσμευσης rRNA εκφυλίζεται σε έναν βρόχο ελάχιστου μήκους. β Η πολλαπλή ευθυγράμμιση αλληλουχίας δείχνει ότι η πρωτεΐνη eL14 είναι ιδιαίτερα συντηρημένη σε ευκαρυωτικά είδη (57% ταυτότητα αλληλουχίας μεταξύ ομολόγων ζύμης και ανθρώπου), αλλά κακώς συντηρημένη και αποκλίνουσα σε μικροσπορίδια (στα οποία όχι περισσότερο από 24% των υπολειμμάτων είναι πανομοιότυπα με το ομόλογο eL14). από S. cerevisiae ή H. sapiens). Αυτή η κακή διατήρηση αλληλουχίας και η μεταβλητότητα της δευτεροταγούς δομής εξηγούν γιατί το ομόλογο eL14 δεν έχει βρεθεί ποτέ στο E. cuniculi και γιατί αυτή η πρωτεΐνη πιστεύεται ότι έχει χαθεί στο E. cuniculi. Αντίθετα, η E. cuniculi eL14 είχε προηγουμένως σχολιαστεί ως μια υποτιθέμενη πρωτεΐνη M970_061160. Αυτή η παρατήρηση υποδηλώνει ότι η ποικιλομορφία του γονιδιώματος των μικροσποριδίων υπερεκτιμάται επί του παρόντος: ορισμένα γονίδια που πιστεύεται ότι χάνονται στα μικροσπορίδια στην πραγματικότητα διατηρούνται, αν και σε ιδιαίτερα διαφοροποιημένες μορφές. Αντίθετα, ορισμένα πιστεύεται ότι κωδικοποιούν γονίδια μικροσποριδίων για πρωτεΐνες ειδικές για σκώληκες (π.χ., η υποθετική πρωτεΐνη M970_061160) στην πραγματικότητα κωδικοποιεί τις πολύ διαφορετικές πρωτεΐνες που βρίσκονται σε άλλα ευκαρυωτικά.
Αυτό το εύρημα υποδηλώνει ότι η μετουσίωση του rRNA μπορεί να οδηγήσει σε δραματική απώλεια διατήρησης της αλληλουχίας σε γειτονικές ριβοσωμικές πρωτεΐνες, καθιστώντας αυτές τις πρωτεΐνες μη ανιχνεύσιμες για αναζητήσεις ομολογίας. Έτσι, μπορεί να υπερεκτιμήσουμε τον πραγματικό βαθμό μοριακής αποικοδόμησης σε οργανισμούς μικρού γονιδιώματος, καθώς ορισμένες πρωτεΐνες που πιστεύεται ότι έχουν χαθεί στην πραγματικότητα επιμένουν, αν και σε πολύ τροποποιημένες μορφές.
Πώς μπορούν τα παράσιτα να διατηρήσουν τη λειτουργία των μοριακών τους μηχανών υπό συνθήκες ακραίας μείωσης του γονιδιώματος; Η μελέτη μας απαντά σε αυτό το ερώτημα περιγράφοντας τη σύνθετη μοριακή δομή (ριβόσωμα) του E. cuniculi, ενός οργανισμού με ένα από τα μικρότερα ευκαρυωτικά γονιδιώματα.
Είναι γνωστό εδώ και σχεδόν δύο δεκαετίες ότι τα μόρια πρωτεϊνών και RNA στα μικροβιακά παράσιτα συχνά διαφέρουν από τα ομόλογα μόριά τους στα ελεύθερα ζώντα είδη επειδή δεν έχουν κέντρα ποιοτικού ελέγχου, έχουν μειωμένο μέγεθος στο 50% του μεγέθους τους στα ελεύθερα ζώντα μικρόβια κ.λπ. πολλές εξουθενωτικές μεταλλάξεις που επηρεάζουν την αναδίπλωση και τη λειτουργία. Για παράδειγμα, τα ριβοσώματα των μικρών γονιδιωματικών οργανισμών, συμπεριλαμβανομένων πολλών ενδοκυτταρικών παρασίτων και ενδοσυμβιωτικών οργανισμών, αναμένεται να μην έχουν αρκετές ριβοσωμικές πρωτεΐνες και έως και το ένα τρίτο των νουκλεοτιδίων rRNA σε σύγκριση με τα ελεύθερα ζώντα είδη 27, 29, 30, 49. Ωστόσο, ο τρόπος με τον οποίο λειτουργούν αυτά τα μόρια στο παράσιτο παραμένει σε μεγάλο βαθμό ένα μυστήριο, που μελετάται κυρίως μέσω της συγκριτικής γονιδιωματικής.
Η μελέτη μας δείχνει ότι η δομή των μακρομορίων μπορεί να αποκαλύψει πολλές πτυχές της εξέλιξης που είναι δύσκολο να εξαχθούν από τις παραδοσιακές συγκριτικές γονιδιωματικές μελέτες ενδοκυτταρικών παρασίτων και άλλων οργανισμών περιορισμένων από τον ξενιστή (Συμπληρωματικό Σχήμα 7). Για παράδειγμα, το παράδειγμα της πρωτεΐνης eL14 δείχνει ότι μπορούμε να υπερεκτιμήσουμε τον πραγματικό βαθμό υποβάθμισης της μοριακής συσκευής σε παρασιτικά είδη. Πιστεύεται πλέον ότι τα εγκεφαλιτικά παράσιτα έχουν εκατοντάδες γονίδια ειδικά για μικροσπορίδια. Ωστόσο, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ορισμένα από αυτά τα φαινομενικά ειδικά γονίδια είναι στην πραγματικότητα απλώς πολύ διαφορετικές παραλλαγές γονιδίων που είναι κοινά σε άλλους ευκαρυώτες. Επιπλέον, το παράδειγμα της πρωτεΐνης msL2 δείχνει πώς παραβλέπουμε τις νέες ριβοσωμικές πρωτεΐνες και υποτιμούμε το περιεχόμενο των παρασιτικών μοριακών μηχανών. Το παράδειγμα των μικρών μορίων δείχνει πώς μπορούμε να παραβλέπουμε τις πιο έξυπνες καινοτομίες στις παρασιτικές μοριακές δομές που μπορούν να τους δώσουν νέα βιολογική δραστηριότητα.
Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα βελτιώνουν την κατανόησή μας για τις διαφορές μεταξύ των μοριακών δομών των οργανισμών που περιορίζονται από τον ξενιστή και των αντίστοιχων οργανισμών σε ελεύθερους οργανισμούς. Δείχνουμε ότι οι μοριακές μηχανές, που για καιρό θεωρούνταν μειωμένες, εκφυλισμένες και υποκείμενες σε διάφορες εξουθενωτικές μεταλλάξεις, έχουν αντ' αυτού ένα σύνολο συστηματικά παραβλεπόμενων ασυνήθιστων δομικών χαρακτηριστικών.
Από την άλλη πλευρά, τα μη ογκώδη θραύσματα rRNA και τα συγχωνευμένα θραύσματα που βρήκαμε στα ριβοσώματα του E. cuniculi υποδηλώνουν ότι η μείωση του γονιδιώματος μπορεί να αλλάξει ακόμη και εκείνα τα μέρη του βασικού μοριακού μηχανισμού που διατηρούνται στους τρεις τομείς της ζωής - μετά από σχεδόν 3,5 δισεκατομμύρια χρόνια - ανεξάρτητης εξέλιξης των ειδών.
Τα θραύσματα rRNA χωρίς εξογκώματα και συγχωνευμένα σε ριβοσώματα E. cuniculi παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον υπό το πρίσμα προηγούμενων μελετών μορίων RNA σε ενδοσυμβιωτικά βακτήρια. Για παράδειγμα, στο ενδοσυμβιωτικό της αφίδας Buchnera aphidicola, τα μόρια rRNA και tRNA έχουν αποδειχθεί ότι έχουν δομές ευαίσθητες στη θερμοκρασία λόγω της μεροληψίας σύνθεσης A+T και ενός υψηλού ποσοστού μη κανονικών ζευγών βάσεων20,50. Αυτές οι αλλαγές στο RNA, καθώς και οι αλλαγές στα πρωτεϊνικά μόρια, πιστεύεται πλέον ότι ευθύνονται για την υπερβολική εξάρτηση των ενδοσυμβιωτικών από τους εταίρους και την αδυναμία των ενδοσυμβιωτικών να μεταφέρουν θερμότητα21, 23. Αν και το rRNA των παρασιτικών μικροσποριδίων έχει δομικά διακριτές αλλαγές, η φύση αυτών των αλλαγών υποδηλώνει ότι η μειωμένη θερμική σταθερότητα και η υψηλότερη εξάρτηση από τις πρωτεΐνες συνοδούς μπορεί να είναι κοινά χαρακτηριστικά των μορίων RNA σε οργανισμούς με μειωμένα γονιδιώματα.
Από την άλλη πλευρά, οι δομές μας δείχνουν ότι τα μικροσπορίδια των παρασίτων έχουν αναπτύξει μια μοναδική ικανότητα να αντιστέκονται σε ευρέως διατηρημένα rRNA και πρωτεϊνικά θραύσματα, αναπτύσσοντας την ικανότητα να χρησιμοποιούν άφθονους και άμεσα διαθέσιμους μικρούς μεταβολίτες ως δομικά μιμητές του εκφυλισμένου rRNA και πρωτεϊνικών θραυσμάτων. Αποικοδόμηση μοριακής δομής. . Αυτή η άποψη υποστηρίζεται από το γεγονός ότι μικρά μόρια που αντισταθμίζουν την απώλεια πρωτεϊνικών θραυσμάτων στο rRNA και τα ριβοσώματα του E. cuniculi συνδέονται με υπολείμματα ειδικά για τα μικροσπορίδια στις πρωτεΐνες uL15 και eL30. Αυτό υποδηλώνει ότι η σύνδεση μικρών μορίων με ριβοσώματα μπορεί να είναι προϊόν θετικής επιλογής, στην οποία μεταλλάξεις ειδικές για τα μικροσπορίδια σε ριβοσωμικές πρωτεΐνες έχουν επιλεγεί για την ικανότητά τους να αυξάνουν τη συγγένεια των ριβοσωμάτων για μικρά μόρια, γεγονός που μπορεί να οδηγήσει σε πιο αποτελεσματικούς ριβοσωμικούς οργανισμούς. Η ανακάλυψη αποκαλύπτει μια έξυπνη καινοτομία στη μοριακή δομή των μικροβιακών παρασίτων και μας δίνει μια καλύτερη κατανόηση του πώς οι μοριακές δομές των παρασίτων διατηρούν τη λειτουργία τους παρά την αναγωγική εξέλιξη.
Προς το παρόν, η ταυτοποίηση αυτών των μικρών μορίων παραμένει ασαφής. Δεν είναι σαφές γιατί η εμφάνιση αυτών των μικρών μορίων στη ριβοσωμική δομή διαφέρει μεταξύ των ειδών μικροσποριδίων. Συγκεκριμένα, δεν είναι σαφές γιατί παρατηρείται σύνδεση νουκλεοτιδίων στα ριβοσώματα των E. cuniculi και P. locustae, και όχι στα ριβοσώματα του V. necatrix, παρά την παρουσία του υπολείμματος F170 στις πρωτεΐνες eL20 και K172 του V. necatrix. Αυτή η διαγραφή μπορεί να οφείλεται στο υπόλειμμα 43 uL6 (που βρίσκεται δίπλα στον θύλακα σύνδεσης νουκλεοτιδίων), το οποίο είναι τυροσίνη στο V. necatrix και όχι θρεονίνη στο E. cuniculi και το P. locustae. Η ογκώδης αρωματική πλευρική αλυσίδα του Tyr43 μπορεί να επηρεάσει τη σύνδεση νουκλεοτιδίων λόγω στερεοχημικής επικάλυψης. Εναλλακτικά, η φαινομενική διαγραφή νουκλεοτιδίων μπορεί να οφείλεται στη χαμηλή ανάλυση της κρυο-ΗΜ απεικόνισης, η οποία εμποδίζει τη μοντελοποίηση των ριβοσωμικών θραυσμάτων του V. necatrix.
Από την άλλη πλευρά, η εργασία μας υποδηλώνει ότι η διαδικασία της αποσύνθεσης του γονιδιώματος μπορεί να είναι μια εφευρετική δύναμη. Συγκεκριμένα, η δομή του ριβοσώματος E. cuniculi υποδηλώνει ότι η απώλεια rRNA και πρωτεϊνικών θραυσμάτων στο ριβόσωμα των μικροσποριδίων δημιουργεί εξελικτική πίεση που προάγει αλλαγές στη δομή του ριβοσώματος. Αυτές οι παραλλαγές εμφανίζονται μακριά από την ενεργό θέση του ριβοσώματος και φαίνεται να βοηθούν στη διατήρηση (ή την αποκατάσταση) της βέλτιστης συναρμολόγησης των ριβοσωμάτων, η οποία διαφορετικά θα διαταρασσόταν από το μειωμένο rRNA. Αυτό υποδηλώνει ότι μια σημαντική καινοτομία του ριβοσώματος των μικροσποριδίων φαίνεται να έχει εξελιχθεί σε μια ανάγκη για την αντιμετώπιση της μετατόπισης γονιδίων.
Ίσως αυτό να αποδεικνύεται καλύτερα από τη σύνδεση νουκλεοτιδίων, η οποία δεν έχει παρατηρηθεί ποτέ σε άλλους οργανισμούς μέχρι στιγμής. Το γεγονός ότι τα υπολείμματα σύνδεσης νουκλεοτιδίων υπάρχουν σε τυπικά μικροσπορίδια, αλλά όχι σε άλλα ευκαρυωτικά, υποδηλώνει ότι οι θέσεις σύνδεσης νουκλεοτιδίων δεν είναι απλώς λείψανα που περιμένουν να εξαφανιστούν ή η τελική θέση για να αποκατασταθεί το rRNA στη μορφή μεμονωμένων νουκλεοτιδίων. Αντίθετα, αυτή η θέση φαίνεται σαν ένα χρήσιμο χαρακτηριστικό που θα μπορούσε να έχει εξελιχθεί σε διάφορους γύρους θετικής επιλογής. Οι θέσεις σύνδεσης νουκλεοτιδίων μπορεί να είναι ένα υποπροϊόν της φυσικής επιλογής: μόλις αποικοδομηθεί το ES39L, τα μικροσπορίδια αναγκάζονται να αναζητήσουν αντιστάθμιση για να αποκαταστήσουν τη βέλτιστη βιογένεση ριβοσωμάτων απουσία του ES39L. Δεδομένου ότι αυτό το νουκλεοτίδιο μπορεί να μιμηθεί τις μοριακές επαφές του νουκλεοτιδίου A3186 στο ES39L, το μόριο νουκλεοτιδίων γίνεται δομικό στοιχείο του ριβοσώματος, η σύνδεση του οποίου βελτιώνεται περαιτέρω με μετάλλαξη της αλληλουχίας eL30.
Όσον αφορά τη μοριακή εξέλιξη των ενδοκυτταρικών παρασίτων, η μελέτη μας δείχνει ότι οι δυνάμεις της Δαρβινικής φυσικής επιλογής και της γενετικής παρέκκλισης της αποσύνθεσης του γονιδιώματος δεν λειτουργούν παράλληλα, αλλά ταλαντεύονται. Πρώτον, η γενετική παρέκκλιση εξαλείφει σημαντικά χαρακτηριστικά των βιομορίων, καθιστώντας την αντιστάθμιση απολύτως απαραίτητη. Μόνο όταν τα παράσιτα ικανοποιήσουν αυτήν την ανάγκη μέσω της Δαρβινικής φυσικής επιλογής, τα μακρομόριά τους θα έχουν την ευκαιρία να αναπτύξουν τα πιο εντυπωσιακά και καινοτόμα χαρακτηριστικά τους. Είναι σημαντικό ότι η εξέλιξη των θέσεων δέσμευσης νουκλεοτιδίων στο ριβόσωμα του E. cuniculi υποδηλώνει ότι αυτό το μοτίβο απώλειας-κέρδους της μοριακής εξέλιξης όχι μόνο αποσβένει τις επιβλαβείς μεταλλάξεις, αλλά μερικές φορές προσδίδει εντελώς νέες λειτουργίες στα παρασιτικά μακρομόρια.
Αυτή η ιδέα είναι σύμφωνη με τη θεωρία της κινούμενης ισορροπίας του Sewell Wright, η οποία δηλώνει ότι ένα αυστηρό σύστημα φυσικής επιλογής περιορίζει την ικανότητα των οργανισμών να καινοτομούν51,52,53. Ωστόσο, εάν η γενετική παρέκκλιση διαταράσσει τη φυσική επιλογή, αυτές οι παρεκκλίσεις μπορούν να προκαλέσουν αλλαγές που δεν είναι από μόνες τους προσαρμοστικές (ή ακόμη και επιζήμιες) αλλά οδηγούν σε περαιτέρω αλλαγές που παρέχουν υψηλότερη φυσική κατάσταση ή νέα βιολογική δραστηριότητα. Το πλαίσιό μας υποστηρίζει αυτήν την ιδέα καταδεικνύοντας ότι ο ίδιος τύπος μετάλλαξης που μειώνει την αναδίπλωση και τη λειτουργία ενός βιομορίου φαίνεται να είναι η κύρια αιτία για τη βελτίωσή του. Σύμφωνα με το εξελικτικό μοντέλο win-win, η μελέτη μας δείχνει ότι η αποσύνθεση του γονιδιώματος, που παραδοσιακά θεωρείται ως μια εκφυλιστική διαδικασία, είναι επίσης ένας σημαντικός μοχλός καινοτομίας, μερικές φορές και ίσως ακόμη και συχνά επιτρέποντας στα μακρομόρια να αποκτήσουν νέες παρασιτικές δραστηριότητες.