Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com. De browserversie die u gebruikt, biedt beperkte CSS-ondersteuning. Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen). Om de ondersteuning te kunnen blijven garanderen, zullen we de site in de tussentijd zonder stijlen en JavaScript weergeven.
De evolutie van microbiële parasieten omvat een tegenwerking tussen natuurlijke selectie, waardoor parasieten zich verbeteren, en genetische drift, waardoor parasieten genen verliezen en schadelijke mutaties accumuleren. Om te begrijpen hoe deze tegenwerking plaatsvindt op de schaal van een enkel macromolecuul, beschrijven we hier de cryo-EM-structuur van het ribosoom van Encephalitozoon cuniculi, een eukaryoot organisme met een van de kleinste genomen in de natuur. De extreme reductie van rRNA in de ribosomen van E. cuniculi gaat gepaard met ongekende structurele veranderingen, zoals de evolutie van voorheen onbekende gefuseerde rRNA-linkers en rRNA zonder uitstulpingen. Bovendien overleefde het ribosoom van E. cuniculi het verlies van rRNA-fragmenten en eiwitten door de mogelijkheid te ontwikkelen om kleine moleculen te gebruiken als structurele nabootsers van afgebroken rRNA-fragmenten en eiwitten. Samenvattend tonen we aan dat moleculaire structuren waarvan lang werd gedacht dat ze gereduceerd, gedegenereerd en onderhevig aan slopende mutaties waren, een aantal compensatiemechanismen hebben die ze actief houden ondanks extreme moleculaire contracties.
Omdat de meeste groepen microbiële parasieten over unieke moleculaire middelen beschikken om hun gastheren uit te buiten, moeten we vaak verschillende therapieën ontwikkelen voor verschillende groepen parasieten1,2. Nieuw bewijs suggereert echter dat sommige aspecten van de evolutie van parasieten convergerend en grotendeels voorspelbaar zijn, wat wijst op een mogelijke basis voor brede therapeutische interventies bij microbiële parasieten3,4,5,6,7,8,9.
Eerder onderzoek heeft een gemeenschappelijke evolutionaire trend in microbiële parasieten geïdentificeerd, genaamd genoomreductie of genoomverval10,11,12,13. Huidig ​​onderzoek toont aan dat wanneer micro-organismen hun vrijlevende levensstijl opgeven en intracellulaire parasieten (of endosymbionten) worden, hun genoom gedurende miljoenen jaren langzame maar verbazingwekkende metamorfoses ondergaat9,11. In een proces dat bekend staat als genoomverval, accumuleren microbiële parasieten schadelijke mutaties die veel voorheen belangrijke genen in pseudogenen veranderen, wat leidt tot geleidelijk genverlies en mutatie-instorting14,15. Deze instorting kan tot 95% van de genen in de oudste intracellulaire organismen vernietigen in vergelijking met nauw verwante vrijlevende soorten. De evolutie van intracellulaire parasieten is dus een touwtrekkerij tussen twee tegengestelde krachten: Darwinistische natuurlijke selectie, die leidt tot de verbetering van parasieten, en de instorting van het genoom, waardoor parasieten in de vergetelheid raken. Hoe de parasiet uit deze touwtrekkerij is gekomen en de activiteit van zijn moleculaire structuur heeft weten te behouden, blijft onduidelijk.
Hoewel het mechanisme van genoomverval niet volledig wordt begrepen, lijkt het voornamelijk te wijten te zijn aan frequente genetische drift. Omdat parasieten in kleine, aseksuele en genetisch beperkte populaties leven, kunnen ze schadelijke mutaties die soms optreden tijdens DNA-replicatie niet effectief elimineren. Dit leidt tot een onomkeerbare accumulatie van schadelijke mutaties en een afname van het parasietgenoom. Hierdoor verliest de parasiet niet alleen genen die niet langer nodig zijn voor zijn overleving in de intracellulaire omgeving, maar is het ook het onvermogen van parasietpopulaties om sporadische schadelijke mutaties effectief te elimineren, waardoor deze mutaties zich in het hele genoom ophopen, inclusief hun belangrijkste genen.
Veel van ons huidige begrip van genoomreductie is uitsluitend gebaseerd op vergelijkingen van genoomsequenties, met minder aandacht voor veranderingen in daadwerkelijke moleculen die huishoudelijke functies vervullen en dienen als potentiële doelwitten voor geneesmiddelen. Vergelijkende studies hebben aangetoond dat de last van schadelijke intracellulaire microbiële mutaties eiwitten en nucleïnezuren vatbaarder lijkt te maken voor misvouwing en aggregatie, waardoor ze meer chaperonne-afhankelijk en overgevoelig voor hitte worden19,20,21,22,23. Bovendien ondervonden verschillende parasieten – onafhankelijke evolutie, soms met een tussenpoos van wel 2,5 miljard jaar – een vergelijkbaar verlies van kwaliteitscontrolecentra in hun eiwitsynthese5,6 en DNA-herstelmechanismen24. Er is echter weinig bekend over de impact van de intracellulaire levensstijl op alle andere eigenschappen van cellulaire macromoleculen, waaronder de moleculaire adaptatie aan een toenemende last van schadelijke mutaties.
In dit werk hebben we de structuur van ribosomen van de intracellulaire parasiet Encephalitozoon cuniculi bepaald om de evolutie van eiwitten en nucleïnezuren van intracellulaire micro-organismen beter te begrijpen. E. cuniculi is een schimmelachtig organisme dat behoort tot een groep parasitaire microsporidia met ongewoon kleine eukaryotische genomen en daarom wordt gebruikt als modelorganismen om genoomafbraak te bestuderen25,26,27,28,29,30. Onlangs werd de cryo-EM ribosoomstructuur bepaald voor matig gereduceerde genomen van Microsporidia, Paranosema locustae en Vairimorpha necatrix31,32 (~3,2 Mb genoom). Deze structuren suggereren dat een deel van het verlies aan rRNA-amplificatie wordt gecompenseerd door de ontwikkeling van nieuwe contacten tussen aangrenzende ribosomale eiwitten of de verwerving van nieuwe msL131,32 ribosomale eiwitten. De soort Encephalitozoon (genoom ~2,5 miljoen bp), samen met zijn naaste verwant Ordospora, vertoont de ultieme mate van genoomreductie bij eukaryoten – ze hebben minder dan 2000 eiwitcoderende genen, en naar verwachting zijn hun ribosomen niet alleen verstoken van rRNA-expansiefragmenten (rRNA-fragmenten die eukaryotische ribosomen onderscheiden van bacteriële ribosomen), maar hebben ze ook vier ribosomale eiwitten vanwege hun gebrek aan homologen in het E. cuniculi-genoom26,27,28. Daarom concludeerden we dat het E. cuniculi-ribosoom voorheen onbekende strategieën voor moleculaire aanpassing aan genoomverval kan onthullen.
Onze cryo-EM-structuur vertegenwoordigt het kleinste eukaryote cytoplasmatisch ribosoom dat gekarakteriseerd moet worden en biedt inzicht in hoe de uiteindelijke mate van genoomreductie de structuur, assemblage en evolutie van de moleculaire machinerie die integraal deel uitmaakt van de cel beïnvloedt. We ontdekten dat het E. cuniculi-ribosoom veel van de algemeen geconserveerde principes van RNA-vouwing en ribosoomassemblage schendt, en ontdekten een nieuw, voorheen onbekend ribosomaal eiwit. Vrij onverwacht tonen we aan dat microsporidia-ribosomen het vermogen hebben ontwikkeld om kleine moleculen te binden, en veronderstellen we dat afknottingen in rRNA en eiwitten evolutionaire innovaties in gang zetten die uiteindelijk nuttige eigenschappen aan het ribosoom kunnen verlenen.
Om ons begrip van de evolutie van eiwitten en nucleïnezuren in intracellulaire organismen te verbeteren, besloten we E. cuniculi-sporen te isoleren uit culturen van geïnfecteerde zoogdiercellen om hun ribosomen te zuiveren en de structuur van deze ribosomen te bepalen. Het is moeilijk om een ​​groot aantal parasitaire microsporidia te verkrijgen, omdat microsporidia niet in een voedingsmedium kunnen worden gekweekt. In plaats daarvan groeien en reproduceren ze alleen in de gastheercel. Om E. cuniculi-biomassa te verkrijgen voor ribosomenzuivering, infecteerden we daarom de zoogdierniercellijn RK13 met E. cuniculi-sporen en kweekten we deze geïnfecteerde cellen enkele weken om E. cuniculi de kans te geven te groeien en zich te vermenigvuldigen. Met behulp van een geïnfecteerde celmonolaag van ongeveer een halve vierkante meter konden we ongeveer 300 mg Microsporidia-sporen zuiveren en gebruiken om ribosomen te isoleren. Vervolgens hebben we de gezuiverde sporen met glasparels gebroken en de ruwe ribosomen geïsoleerd door stapsgewijze fractionering van de lysaten met polyethyleenglycol. Dit stelde ons in staat om ongeveer 300 µg ruwe ribosomen van E. cuniculi te verkrijgen voor structuuranalyse.
Vervolgens verzamelden we cryo-EM-beelden van de resulterende ribosomale monsters en verwerkten deze beelden met maskers die correspondeerden met de grote ribosomale subeenheid, de kop van de kleine subeenheid en de kleine subeenheid. Tijdens dit proces verzamelden we beelden van ongeveer 108.000 ribosomale deeltjes en berekenden we cryo-EM-beelden met een resolutie van 2,7 Å (aanvullende figuren 1-3). Vervolgens gebruikten we cryo-EM-beelden om rRNA, ribosomaal eiwit en hibernatiefactor Mdf1 te modelleren die geassocieerd zijn met E. cuniculi-ribosomen (Fig. 1a, b).
a Structuur van het ribosoom van E. cuniculi in complex met de hibernatiefactor Mdf1 (pdb id 7QEP). b Kaart van hibernatiefactor Mdf1 geassocieerd met het ribosoom van E. cuniculi. c Secundaire structuurkaart die het teruggevonden rRNA in Microsporidian-soorten vergelijkt met bekende ribosomale structuren. De panelen tonen de locatie van de versterkte rRNA-fragmenten (ES) en actieve locaties van het ribosoom, waaronder de decoderingsplaats (DC), de sarcinicine-lus (SRL) en het peptidyltransferasecentrum (PTC). d De elektronendichtheid die overeenkomt met het peptidyltransferasecentrum van het ribosoom van E. cuniculi suggereert dat deze katalytische locatie dezelfde structuur heeft in de E. cuniculi-parasiet en zijn gastheren, waaronder H. sapiens. e, f De corresponderende elektronendichtheid van het decoderingscentrum (e) en de schematische structuur van het decoderingscentrum (f) geven aan dat E. cuniculi residuen U1491 heeft in plaats van A1491 (E. coli-nummering) in veel andere eukaryoten. Deze verandering suggereert dat E. cuniculi mogelijk gevoelig is voor antibiotica die op deze actieve plaats gericht zijn.
In tegenstelling tot de eerder vastgestelde structuren van V. necatrix en P. locustae ribosomen (beide structuren vertegenwoordigen dezelfde microsporidia-familie Nosematidae en lijken sterk op elkaar), ondergaan 31,32 E. cuniculi ribosomen talrijke processen van rRNA- en eiwitfragmentatie. Verdere denaturatie (aanvullende figuren 4-6). In rRNA omvatten de meest opvallende veranderingen het volledige verlies van het versterkte 25S rRNA-fragment ES12L en gedeeltelijke degeneratie van de h39-, h41- en H18-helices (Fig. 1c, aanvullende figuur 4). Onder de ribosomale eiwitten omvatten de meest opvallende veranderingen het volledige verlies van het eS30-eiwit en de verkorting van de eiwitten eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 en eS7 (aanvullende figuren 4, 5).
De extreme reductie van het genoom van Encephalotozoön/Ordospora-soorten wordt dus weerspiegeld in hun ribosoomstructuur: E. cuniculi-ribosomen ondergaan het meest dramatische verlies aan eiwitgehalte in eukaryote cytoplasmatische ribosomen die onderhevig zijn aan structurele karakterisering, en ze missen zelfs de rRNA- en eiwitfragmenten die niet alleen in eukaryoten, maar ook in de drie domeinen van het leven, wijdverbreid geconserveerd zijn. De structuur van het E. cuniculi-ribosoom biedt het eerste moleculaire model voor deze veranderingen en onthult evolutionaire gebeurtenissen die over het hoofd zijn gezien in zowel vergelijkende genomica als studies naar intracellulaire biomoleculaire structuur (Aanvullende figuur 7). Hieronder beschrijven we elk van deze gebeurtenissen, samen met hun waarschijnlijke evolutionaire oorsprong en hun mogelijke impact op de ribosoomfunctie.
Vervolgens ontdekten we dat E. cuniculi-ribosomen, naast grote rRNA-afkappingen, rRNA-variaties vertonen op een van hun actieve plaatsen. Hoewel het peptidyltransferasecentrum van het E. cuniculi-ribosoom dezelfde structuur heeft als andere eukaryote ribosomen (Fig. 1d), verschilt het decoderingscentrum door sequentievariatie op nucleotide 1491 (nummering van E. coli, Fig. 1e, f). Deze observatie is belangrijk omdat de decoderingsplaats van eukaryote ribosomen doorgaans residuen G1408 en A1491 bevat in vergelijking met bacteriële residuen A1408 en G1491. Deze variatie ligt ten grondslag aan de verschillende gevoeligheid van bacteriële en eukaryote ribosomen voor de aminoglycosidefamilie van ribosomale antibiotica en andere kleine moleculen die zich op de decoderingsplaats richten. Op de decoderingsplaats van het ribosoom van E. cuniculi is residu A1491 vervangen door U1491, wat mogelijk een unieke bindingsinterface creëert voor kleine moleculen die zich op deze actieve plaats richten. Dezelfde A14901-variant is ook aanwezig in andere microsporidia, zoals P. locustae en V. necatrix, wat suggereert dat deze wijdverspreid is onder microsporidia-soorten (Fig. 1f).
Omdat onze E. cuniculi-ribosoommonsters geïsoleerd waren uit metabolisch inactieve sporen, hebben we de cryo-EM-kaart van E. cuniculi getest op eerder beschreven ribosoombinding onder stress- of hongeromstandigheden. Hibernatiefactoren 31, 32, 36, 37, 38. We hebben de eerder vastgestelde structuur van het hibernerende ribosoom vergeleken met de cryo-EM-kaart van het E. cuniculi-ribosoom. Voor de koppeling werden ribosomen van S. cerevisiae gebruikt in complex met hibernatiefactor Stm138, ribosomen van sprinkhanen in complex met factor Lso232 en ribosomen van V. necatrix in complex met factoren Mdf1 en Mdf231. Tegelijkertijd vonden we de cryo-EM-dichtheid die overeenkomt met de restfactor Mdf1. Op dezelfde manier als Mdf1 zich bindt aan het V. necatrix-ribosoom, bindt Mdf1 zich ook aan het E. cuniculi-ribosoom, waar het de E-plaats van het ribosoom blokkeert, wat mogelijk helpt om ribosomen beschikbaar te maken wanneer parasietsporen metabolisch inactief worden door inactivatie van het lichaam (Figuur 2).).
Mdf1 blokkeert de E-site van het ribosoom, wat lijkt te helpen bij het inactiveren van het ribosoom wanneer parasietsporen metabolisch inactief worden. In de structuur van het E. cuniculi-ribosoom ontdekten we dat Mdf1 een tot nu toe onbekend contact vormt met de L1-ribosoomstam, het deel van het ribosoom dat de afgifte van gedeacetyleerd tRNA uit het ribosoom tijdens de eiwitsynthese faciliteert. Deze contacten suggereren dat Mdf1 zich van het ribosoom losmaakt via hetzelfde mechanisme als gedeacetyleerd tRNA, wat een mogelijke verklaring biedt voor hoe het ribosoom Mdf1 verwijdert om de eiwitsynthese te reactiveren.
Onze structuur onthulde echter een onbekend contact tussen Mdf1 en de L1-ribosomale poot (het deel van het ribosoom dat helpt bij het vrijmaken van gedeacetyleerd tRNA uit het ribosoom tijdens de eiwitsynthese). Mdf1 gebruikt met name dezelfde contacten als het elleboogsegment van het gedeacetyleerde tRNA-molecuul (fig. 2). Deze voorheen onbekende moleculaire modellering toonde aan dat Mdf1 zich van het ribosoom losmaakt via hetzelfde mechanisme als gedeacetyleerd tRNA, wat verklaart hoe het ribosoom deze hibernatiefactor verwijdert om de eiwitsynthese te reactiveren.
Bij het construeren van het rRNA-model ontdekten we dat het ribosoom van E. cuniculi abnormaal gevouwen rRNA-fragmenten bevat, die we gefuseerd rRNA noemden (fig. 3). In ribosomen die de drie domeinen van het leven bestrijken, vouwt rRNA zich in structuren waarin de meeste rRNA-basen ofwel basenparen en met elkaar vouwen, ofwel interacteren met ribosomale eiwitten38,39,40. In ribosomen van E. cuniculi lijken rRNA's dit vouwprincipe echter te schenden door sommige van hun helices om te zetten in ontvouwde rRNA-regio's.
Structuur van de H18 25S rRNA-helix in S. cerevisiae, V. necatrix en E. cuniculi. In ribosomen die de drie levensdomeinen omspannen, vormt deze linker doorgaans een RNA-helix met 24 tot 34 residuen. In microsporidia daarentegen wordt deze rRNA-linker geleidelijk gereduceerd tot twee enkelstrengs uridinerijke linkers met slechts 12 residuen. De meeste van deze residuen worden blootgesteld aan oplosmiddelen. De afbeelding laat zien dat parasitaire microsporidia de algemene principes van rRNA-vouwing lijken te schenden, waarbij rRNA-basen meestal gekoppeld zijn aan andere basen of betrokken zijn bij rRNA-eiwitinteracties. In microsporidia nemen sommige rRNA-fragmenten een ongunstige vouwing aan, waarbij de voormalige rRNA-helix een enkelstrengs fragment wordt dat bijna in een rechte lijn is uitgerekt. De aanwezigheid van deze ongewone regio's zorgt ervoor dat microsporidia-rRNA zich kan binden aan verre rRNA-fragmenten met behulp van een minimaal aantal RNA-basen.
Het meest opvallende voorbeeld van deze evolutionaire transitie is te zien in de H18 25S rRNA-helix (Fig. 3). Bij soorten van E. coli tot mensen bevatten de basen van deze rRNA-helix 24-32 nucleotiden, waardoor een licht onregelmatige helix ontstaat. In eerder geïdentificeerde ribosomale structuren van V. necatrix en P. locustae,31,32 zijn de basen van de H18-helix gedeeltelijk ontrold, maar blijft de nucleotidebasenparing behouden. In E. cuniculi vormt dit rRNA-fragment echter de kortste linkers 228UUUGU232 en 301UUUUUUUUU307. In tegenstelling tot typische rRNA-fragmenten wikkelen deze uridinerijke linkers zich niet op en maken ze geen uitgebreid contact met ribosomale eiwitten. In plaats daarvan nemen ze oplosmiddelopen en volledig ontvouwde structuren aan waarin de rRNA-strengen bijna recht zijn uitgerekt. Deze uitgerekte conformatie verklaart hoe E. cuniculi slechts 12 RNA-basen gebruikt om de 33 Å ruimte tussen de H16 en H18 rRNA-helices te vullen, terwijl andere soorten minstens twee keer zoveel rRNA-basen nodig hebben om de ruimte te vullen.
Zo kunnen we aantonen dat parasitaire microsporidia, door middel van energetisch ongunstige vouwing, een strategie hebben ontwikkeld om zelfs die rRNA-segmenten te contracteren die grotendeels behouden blijven in alle soorten binnen de drie domeinen van het leven. Blijkbaar kan E. cuniculi, door mutaties te accumuleren die rRNA-helices transformeren tot korte poly-U-linkers, ongebruikelijke rRNA-fragmenten vormen met zo min mogelijk nucleotiden voor ligatie van distale rRNA-fragmenten. Dit helpt verklaren hoe microsporidia een dramatische reductie in hun basismoleculaire structuur hebben bereikt zonder hun structurele en functionele integriteit te verliezen.
Een ander ongewoon kenmerk van E. cuniculi rRNA is de aanwezigheid van rRNA zonder verdikkingen (Fig. 4). Uitstulpingen zijn nucleotiden zonder basenparen die uit de RNA-helix draaien in plaats van zich erin te verstoppen. De meeste rRNA-uitstulpingen fungeren als moleculaire kleefstoffen en helpen bij het binden van aangrenzende ribosomale eiwitten of andere rRNA-fragmenten. Sommige uitstulpingen fungeren als scharnieren, waardoor de rRNA-helix optimaal kan buigen en vouwen voor productieve eiwitsynthese 41 .
a Een rRNA-uitstulping (nummering van S. cerevisiae) ontbreekt in de ribosoomstructuur van E. cuniculi, maar is wel aanwezig in de meeste andere eukaryoten b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens en de interne ribosomen van E. cuniculi. parasieten missen veel van de oude, zeer goed bewaard gebleven rRNA-uitstulpingen. Deze verdikkingen stabiliseren de ribosoomstructuur; hun afwezigheid in microsporidia wijst daarom op een verminderde stabiliteit van de rRNA-vouwing in microsporidiaparasieten. Vergelijking met P-stammen (L7/L12-stammen in bacteriën) laat zien dat het verlies van rRNA-bultjes soms samenvalt met het verschijnen van nieuwe bultjes naast de verloren bultjes. De H42-helix in het 23S/28S rRNA heeft een oude uitstulping (U1206 in Saccharomyces cerevisiae) die naar schatting minstens 3,5 miljard jaar oud is vanwege de bescherming die het biedt in drie levensdomeinen. Bij microsporidia is deze uitstulping verdwenen. Er is echter een nieuwe uitstulping ontstaan ​​naast de verdwenen uitstulping (A1306 in E. cuniculi).
Opvallend genoeg ontdekten we dat de ribosomen van E. cuniculi de meeste rRNA-uitstulpingen missen die bij andere soorten voorkomen, waaronder meer dan 30 uitstulpingen die wel in andere eukaryoten voorkomen (Fig. 4a). Dit verlies elimineert veel contacten tussen ribosomale subeenheden en aangrenzende rRNA-helices, waardoor soms grote holle ruimtes in het ribosoom ontstaan. Hierdoor is het ribosoom van E. cuniculi poreuzer dan meer traditionele ribosomen (Fig. 4b). Opvallend was dat de meeste van deze uitstulpingen ook verloren gingen in de eerder geïdentificeerde ribosoomstructuren van V. necatrix en P. locustae, die in eerdere structuuranalyses over het hoofd waren gezien31,32.
Soms gaat het verlies van rRNA-uitstulpingen gepaard met de ontwikkeling van nieuwe uitstulpingen naast de verloren uitstulping. Zo bevat de ribosomale P-stam een ​​U1208-uitstulping (in Saccharomyces cerevisiae) die van E. coli tot de mens is overgegaan en daarom naar schatting 3,5 miljard jaar oud is. Tijdens de eiwitsynthese helpt deze uitstulping de P-stam om te bewegen tussen open en gesloten conformaties, zodat het ribosoom translatiefactoren kan rekruteren en deze naar de actieve plaats kan transporteren. Bij E. cuniculi-ribosomen ontbreekt deze verdikking; een nieuwe verdikking (G883) die zich slechts in drie basenparen bevindt, kan echter bijdragen aan het herstel van de optimale flexibiliteit van de P-stam (Fig. 4c).
Onze gegevens over rRNA zonder uitstulpingen suggereren dat rRNA-minimalisatie niet beperkt blijft tot het verlies van rRNA-elementen op het oppervlak van het ribosoom, maar mogelijk ook de ribosomenkern aantast, waardoor een parasietspecifiek moleculair defect ontstaat dat nog niet is beschreven in vrijlevende cellen. levende soorten worden waargenomen.
Na het modelleren van canonieke ribosomale eiwitten en rRNA ontdekten we dat conventionele ribosomale componenten de drie delen van de cryo-EM-afbeelding niet kunnen verklaren. Twee van deze fragmenten zijn kleine moleculen (Fig. 5, Aanvullende Fig. 8). Het eerste segment bevindt zich tussen de ribosomale eiwitten uL15 en eL18, op een positie die normaal gesproken wordt ingenomen door de C-terminus van eL18, die verkort is in E. cuniculi. Hoewel we de identiteit van dit molecuul niet kunnen bepalen, worden de grootte en vorm van dit dichtheidseiland goed verklaard door de aanwezigheid van spermidinemoleculen. De binding ervan aan het ribosoom wordt gestabiliseerd door microsporidia-specifieke mutaties in de uL15-eiwitten (Asp51 en Arg56), die de affiniteit van het ribosoom voor dit kleine molecuul lijken te verhogen, omdat ze uL15 in staat stellen het kleine molecuul in een ribosomale structuur te wikkelen. Aanvullende Figuur 2). 8, aanvullende gegevens 1, 2).
Cryo-EM-beeldvorming toont de aanwezigheid van nucleotiden buiten de ribose die gebonden is aan het ribosoom van E. cuniculi. In het ribosoom van E. cuniculi neemt dit nucleotide dezelfde plaats in als het 25S rRNA A3186-nucleotide (nummering Saccharomyces cerevisiae) in de meeste andere eukaryotische ribosomen. b In de ribosomale structuur van E. cuniculi bevindt dit nucleotide zich tussen de ribosomale eiwitten uL9 en eL20, waardoor het contact tussen de twee eiwitten wordt gestabiliseerd. cd sequentieconservatieanalyse van eL20 tussen microsporidia-soorten. De fylogenetische stamboom van Microsporidia-soorten (c) en meervoudige sequentie-uitlijning van het eL20-eiwit (d) laten zien dat de nucleotide-bindende residuen F170 en K172 geconserveerd zijn in de meeste typische Microsporidia, met uitzondering van S. lophii, met uitzondering van vroeg vertakkende Microsporidia, die de ES39L-rRNA-extensie behielden. e Deze afbeelding laat zien dat de nucleotide-bindende residuen F170 en K172 alleen aanwezig zijn in eL20 van het sterk gereduceerde microsporidia-genoom, maar niet in andere eukaryoten. Over het algemeen suggereren deze gegevens dat Microsporidische ribosomen een nucleotide-bindingsplaats hebben ontwikkeld die AMP-moleculen lijkt te binden en deze te gebruiken om eiwit-eiwitinteracties in de ribosomale structuur te stabiliseren. De hoge conservering van deze bindingsplaats in Microsporidia en de afwezigheid ervan in andere eukaryoten suggereert dat deze plaats een selectief overlevingsvoordeel voor Microsporidia kan bieden. De nucleotide-bindende pocket in het microsporidia-ribosoom lijkt dus geen gedegenereerd kenmerk of eindpunt van rRNA-afbraak te zijn zoals eerder beschreven, maar eerder een nuttige evolutionaire innovatie die het microsporidia-ribosoom in staat stelt om kleine moleculen direct te binden en deze te gebruiken als moleculaire bouwstenen voor ribosomen. Deze ontdekking maakt het microsporidia-ribosoom het enige ribosoom waarvan bekend is dat het één nucleotide als structurele bouwsteen gebruikt. f Hypothetisch evolutionair pad afgeleid van nucleotidebinding.
De tweede laagmoleculaire dichtheid bevindt zich op het grensvlak tussen de ribosomale eiwitten uL9 en eL30 (Fig. 5a). Dit grensvlak werd eerder beschreven in de structuur van het ribosoom van Saccharomyces cerevisiae als bindingsplaats voor de 25S-nucleotide van rRNA A3186 (onderdeel van de ES39L-rRNA-extensie)38. Er werd aangetoond dat dit grensvlak in gedegenereerde ES39L-ribosomen van P. locustae bindt aan een onbekende enkele nucleotide 31, en er wordt aangenomen dat dit nucleotide een gereduceerde eindvorm van rRNA is, waarbij de lengte van rRNA ongeveer 130-230 basen bedraagt. ES39L is gereduceerd tot een enkele nucleotide 32,43. Onze cryo-EM-beelden ondersteunen het idee dat de dichtheid kan worden verklaard door nucleotiden. De hogere resolutie van onze structuur toonde echter aan dat dit nucleotide een extraribosomaal molecuul is, mogelijk AMP (Fig. 5a, b).
Vervolgens vroegen we ons af of de nucleotide-bindingsplaats in het ribosoom van E. cuniculi voorkwam of dat deze al eerder bestond. Omdat nucleotide-binding voornamelijk wordt gemedieerd door de Phe170- en Lys172-residuen in het ribosomale eiwit eL30, hebben we de conservering van deze residuen in 4396 representatieve eukaryoten beoordeeld. Net als in het geval van uL15 hierboven, ontdekten we dat de Phe170- en Lys172-residuen alleen in typische Microsporidia sterk geconserveerd zijn, maar afwezig in andere eukaryoten, waaronder atypische Microsporidia Mitosporidium en Amphiamblys, waarin het ES39L-rRNA-fragment niet gereduceerd is (Fig. 5c). -e).
Samengevat ondersteunen deze gegevens het idee dat E. cuniculi en mogelijk andere bekende microsporidia het vermogen hebben ontwikkeld om efficiënt grote aantallen kleine metabolieten in de ribosoomstructuur te vangen om de daling van rRNA- en eiwitniveaus te compenseren. Daarbij hebben ze een uniek vermogen ontwikkeld om nucleotiden buiten het ribosoom te binden, wat aantoont dat parasitaire moleculaire structuren compenseren door grote hoeveelheden kleine metabolieten te vangen en deze te gebruiken als structurele nabootsers van afgebroken RNA- en eiwitfragmenten.
Het derde ongesimuleerde deel van onze cryo-EM-kaart, gevonden in de grote ribosomale subeenheid. De relatief hoge resolutie (2,6 Å) van onze kaart suggereert dat deze dichtheid toebehoort aan eiwitten met unieke combinaties van grote zijketenresiduen, waardoor we deze dichtheid konden identificeren als een voorheen onbekend ribosomaal eiwit dat we identificeerden als msL2 (Microsporidia-specifiek eiwit L2) (methoden, figuur 6). Ons homologieonderzoek toonde aan dat msL2 geconserveerd is in de Microsporidia-clade van het geslacht Encephaliter en Orosporidium, maar afwezig is in andere soorten, waaronder andere Microsporidia. In de ribosomale structuur neemt msL2 een gat in dat is ontstaan ​​door het verlies van het uitgebreide ES31L-rRNA. In deze leegte helpt msL2 de rRNA-vouwing te stabiliseren en kan het verlies van ES31L compenseren (figuur 6).
a Elektronendichtheid en model van het Microsporidia-specifieke ribosomale eiwit msL2 dat voorkomt in E. cuniculi ribosomen. b De meeste eukaryote ribosomen, waaronder het 80S ribosoom van Saccharomyces cerevisiae, hebben een verlies van ES19L rRNA-amplificatie in de meeste Microsporidian soorten. De eerder vastgestelde structuur van het V. necatrix microsporidia ribosoom suggereert dat het verlies van ES19L in deze parasieten wordt gecompenseerd door de evolutie van het nieuwe msL1 ribosomale eiwit. In deze studie ontdekten we dat het E. cuniculi ribosoom ook een extra ribosomaal RNA-mimisch eiwit ontwikkelde als een schijnbare compensatie voor het verlies van ES19L. msL2 (momenteel geannoteerd als het hypothetische ECU06_1135 eiwit) en msL1 hebben echter verschillende structurele en evolutionaire oorsprongen. c Deze ontdekking van de generatie van evolutionair niet-verwante msL1- en msL2-ribosomale eiwitten suggereert dat ribosomen, als ze schadelijke mutaties in hun rRNA accumuleren, een ongekend niveau van compositionele diversiteit kunnen bereiken, zelfs in een kleine subgroep van nauw verwante soorten. Deze ontdekking zou kunnen bijdragen aan het verhelderen van de oorsprong en evolutie van het mitochondriale ribosoom, dat bekendstaat om zijn sterk gereduceerde rRNA en abnormale variabiliteit in eiwitsamenstelling tussen soorten.
Vervolgens vergeleken we het msL2-eiwit met het eerder beschreven msL1-eiwit, het enige bekende microsporidia-specifieke ribosomale eiwit dat in het V. necatrix-ribosoom wordt aangetroffen. We wilden testen of msL1 en msL2 evolutionair verwant zijn. Onze analyse toonde aan dat msL1 en msL2 dezelfde holte in de ribosomale structuur innemen, maar verschillende primaire en tertiaire structuren hebben, wat wijst op hun onafhankelijke evolutionaire oorsprong (fig. 6). Onze ontdekking van msL2 bewijst dus dat groepen compacte eukaryotische soorten onafhankelijk van elkaar structureel verschillende ribosomale eiwitten kunnen ontwikkelen om het verlies van rRNA-fragmenten te compenseren. Deze bevinding is opmerkelijk omdat de meeste cytoplasmatische eukaryotische ribosomen een invariant eiwit bevatten, waaronder dezelfde familie van 81 ribosomale eiwitten. Het verschijnen van msL1 en msL2 in verschillende clades van microsporidia als reactie op het verlies van uitgebreide rRNA-segmenten suggereert dat degradatie van de moleculaire architectuur van de parasiet ervoor zorgt dat parasieten op zoek gaan naar compenserende mutaties, die uiteindelijk kunnen leiden tot de verwerving ervan in verschillende parasietenpopulaties. structuren.
Ten slotte, toen ons model voltooid was, vergeleken we de samenstelling van het ribosoom van E. cuniculi met die voorspeld op basis van de genoomsequentie. Van verschillende ribosomale eiwitten, waaronder eL14, eL38, eL41 en eS30, werd eerder gedacht dat ze ontbraken in het genoom van E. cuniculi vanwege de schijnbare afwezigheid van hun homologen in het genoom van E. cuniculi. Verlies van veel ribosomale eiwitten wordt ook voorspeld in de meeste andere sterk gereduceerde intracellulaire parasieten en endosymbionten. Hoewel de meeste vrijlevende bacteriën bijvoorbeeld dezelfde familie van 54 ribosomale eiwitten bevatten, hebben slechts 11 van deze eiwitfamilies detecteerbare homologen in elk geanalyseerd genoom van gastheer-beperkte bacteriën. Ter ondersteuning van deze stelling is experimenteel een verlies van ribosomale eiwitten waargenomen in V. necatrix en P. locustae microsporidia, die de eiwitten eL38 en eL4131,32 missen.
Onze structuren laten echter zien dat alleen eL38, eL41 en eS30 daadwerkelijk verloren gaan in het ribosoom van E. cuniculi. Het eL14-eiwit was geconserveerd en onze structuur toonde aan waarom dit eiwit niet kon worden gevonden in de homologiezoektocht (Fig. 7). In ribosomen van E. cuniculi gaat het grootste deel van de eL14-bindingsplaats verloren door de afbraak van het met rRNA versterkte ES39L. Bij afwezigheid van ES39L verloor eL14 het grootste deel van zijn secundaire structuur en was slechts 18% van de eL14-sequentie identiek in E. cuniculi en S. cerevisiae. Deze slechte sequentieconservering is opmerkelijk, omdat zelfs Saccharomyces cerevisiae en Homo sapiens – organismen die 1,5 miljard jaar na elkaar zijn geëvolueerd – meer dan 51% van dezelfde residuen in eL14 delen. Dit afwijkende verlies van behoud verklaart waarom E. cuniculi eL14 momenteel wordt geannoteerd als het veronderstelde M970_061160-eiwit en niet als het ribosomale eiwit eL1427.
en Het Microsporidia-ribosoom verloor de ES39L rRNA-extensie, waardoor de eL14 ribosomale eiwitbindingsplaats gedeeltelijk verdween. Bij afwezigheid van ES39L ondergaat het eL14 microspore-eiwit een verlies van secundaire structuur, waarbij de voormalige rRNA-bindende α-helix degenereert tot een lus met minimale lengte. b Meervoudige sequentie-uitlijning laat zien dat het eL14-eiwit sterk geconserveerd is in eukaryotische soorten (57% sequentie-identiteit tussen gist- en humane homologen), maar slecht geconserveerd en divergent in microsporidia (waarin niet meer dan 24% van de residuen identiek is aan de eL14-homoloog). van S. cerevisiae of H. sapiens). Deze slechte sequentieconservatie en variatie in secundaire structuur verklaren waarom de eL14-homoloog nooit is gevonden in E. cuniculi en waarom men denkt dat dit eiwit verloren is gegaan in E. cuniculi. E. cuniculi eL14 daarentegen werd eerder geannoteerd als een vermoedelijk M970_061160-eiwit. Deze observatie suggereert dat de genoomdiversiteit van microsporidia momenteel wordt overschat: sommige genen waarvan momenteel wordt gedacht dat ze verloren zijn gegaan in microsporidia, zijn in feite bewaard gebleven, zij het in sterk gedifferentieerde vormen; in plaats daarvan wordt gedacht dat sommige coderen voor microsporidia-genen voor wormspecifieke eiwitten (bijvoorbeeld het hypothetische eiwit M970_061160), maar in werkelijkheid codeert voor de zeer diverse eiwitten die in andere eukaryoten worden aangetroffen.
Deze bevinding suggereert dat rRNA-denaturatie kan leiden tot een dramatisch verlies van sequentiebehoud in aangrenzende ribosomale eiwitten, waardoor deze eiwitten niet meer detecteerbaar zijn voor homologieonderzoek. We overschatten dus mogelijk de werkelijke mate van moleculaire degradatie in kleine genoomorganismen, aangezien sommige eiwitten waarvan men dacht dat ze verloren waren gegaan, in werkelijkheid aanwezig blijven, zij het in sterk veranderde vormen.
Hoe kunnen parasieten de functie van hun moleculaire machines behouden onder omstandigheden van extreme genoomreductie? Onze studie beantwoordt deze vraag door de complexe moleculaire structuur (ribosoom) te beschrijven van E. cuniculi, een organisme met een van de kleinste eukaryotische genomen.
Het is al bijna twintig jaar bekend dat eiwit- en RNA-moleculen in microbiële parasieten vaak verschillen van hun homologe moleculen in vrijlevende soorten, omdat ze geen kwaliteitscontrolecentra hebben, in vrijlevende microben tot 50% van hun oorspronkelijke grootte zijn gereduceerd, enz., en er vele slopende mutaties zijn die de vouwing en functie belemmeren. Zo wordt bijvoorbeeld verwacht dat de ribosomen van organismen met een klein genoom, waaronder veel intracellulaire parasieten en endosymbionten, verschillende ribosomale eiwitten en tot een derde van de rRNA-nucleotiden missen in vergelijking met vrijlevende soorten 27, 29, 30, 49. De manier waarop deze moleculen in parasieten functioneren, blijft echter grotendeels een mysterie, dat voornamelijk wordt bestudeerd via vergelijkende genomica.
Onze studie toont aan dat de structuur van macromoleculen veel aspecten van evolutie kan onthullen die moeilijk te extraheren zijn uit traditionele vergelijkende genomische studies van intracellulaire parasieten en andere gastheergebonden organismen (aanvullende figuur 7). Het voorbeeld van het eL14-eiwit laat bijvoorbeeld zien dat we de werkelijke mate van degradatie van het moleculaire apparaat in parasitaire soorten kunnen overschatten. Men denkt nu dat encefalitische parasieten honderden microsporidia-specifieke genen hebben. Onze resultaten laten echter zien dat sommige van deze schijnbaar specifieke genen in feite slechts zeer verschillende varianten zijn van genen die veel voorkomen in andere eukaryoten. Bovendien laat het voorbeeld van het msL2-eiwit zien hoe we nieuwe ribosomale eiwitten over het hoofd zien en de inhoud van parasitaire moleculaire machines onderschatten. Het voorbeeld van kleine moleculen laat zien hoe we de meest ingenieuze innovaties in parasitaire moleculaire structuren die hen nieuwe biologische activiteit kunnen geven, over het hoofd kunnen zien.
Samengevat verbeteren deze resultaten ons begrip van de verschillen tussen de moleculaire structuren van door de gastheer beperkte organismen en hun tegenhangers in vrijlevende organismen. We tonen aan dat moleculaire machines, waarvan lang werd gedacht dat ze gereduceerd, gedegenereerd en onderhevig aan diverse slopende mutaties waren, in plaats daarvan een reeks systematisch over het hoofd geziene, ongewone structurele kenmerken hebben.
Aan de andere kant suggereren de niet-omvangrijke rRNA-fragmenten en gefuseerde fragmenten die we vonden in de ribosomen van E. cuniculi dat genoomreductie zelfs die delen van de fundamentele moleculaire machinerie kan veranderen die bewaard zijn gebleven in de drie domeinen van het leven – na bijna 3,5 miljard jaar onafhankelijke evolutie van soorten.
De bulge-vrije en gefuseerde rRNA-fragmenten in E. cuniculi ribosomen zijn van bijzonder belang in het licht van eerdere studies van RNA-moleculen in endosymbiotische bacteriën. Zo is bijvoorbeeld in de bladluis-endosymbiont Buchnera aphidicola aangetoond dat rRNA- en tRNA-moleculen temperatuurgevoelige structuren hebben vanwege A+T-compositiebias en een hoog aandeel niet-canonieke basenparen20,50. Men denkt nu dat deze veranderingen in RNA, evenals veranderingen in eiwitmoleculen, verantwoordelijk zijn voor de overmatige afhankelijkheid van endosymbionten van partners en het onvermogen van endosymbionten om warmte over te dragen21, 23. Hoewel parasitaire microsporidia-rRNA structureel verschillende veranderingen vertoont, suggereert de aard van deze veranderingen dat verminderde thermische stabiliteit en hogere afhankelijkheid van chaperonne-eiwitten gemeenschappelijke kenmerken kunnen zijn van RNA-moleculen in organismen met gereduceerde genomen.
Aan de andere kant laten onze structuren zien dat parasietmicrosporidia een uniek vermogen hebben ontwikkeld om weerstand te bieden aan breed geconserveerde rRNA- en eiwitfragmenten, en zo de mogelijkheid hebben ontwikkeld om overvloedige en gemakkelijk beschikbare kleine metabolieten te gebruiken als structurele nabootsers van gedegenereerde rRNA- en eiwitfragmenten. Degradatie van de moleculaire structuur. Deze mening wordt ondersteund door het feit dat kleine moleculen die het verlies van eiwitfragmenten in het rRNA en de ribosomen van E. cuniculi compenseren, zich binden aan microsporidia-specifieke residuen in de uL15- en eL30-eiwitten. Dit suggereert dat de binding van kleine moleculen aan ribosomen mogelijk het gevolg is van positieve selectie, waarbij microsporidia-specifieke mutaties in ribosomale eiwitten zijn geselecteerd op hun vermogen om de affiniteit van ribosomen voor kleine moleculen te verhogen, wat kan leiden tot efficiëntere ribosomale organismen. De ontdekking onthult een slimme innovatie in de moleculaire structuur van microbiële parasieten en geeft ons een beter begrip van hoe moleculaire structuren van parasieten hun functie behouden ondanks reductieve evolutie.
De identificatie van deze kleine moleculen blijft momenteel onduidelijk. Het is onduidelijk waarom de aanwezigheid van deze kleine moleculen in de ribosomale structuur verschilt tussen microsporidia-soorten. Het is met name onduidelijk waarom nucleotidebinding wordt waargenomen in de ribosomen van E. cuniculi en P. locustae, en niet in de ribosomen van V. necatrix, ondanks de aanwezigheid van het F170-residu in de eL20- en K172-eiwitten van V. necatrix. Deze deletie kan worden veroorzaakt door residu 43 uL6 (gelegen naast de nucleotidebindingsholte), dat tyrosine is in V. necatrix en niet threonine in E. cuniculi en P. locustae. De omvangrijke aromatische zijketen van Tyr43 kan de nucleotidebinding verstoren door sterische overlap. Een andere mogelijkheid is dat de schijnbare nucleotidedeletie te wijten is aan de lage resolutie van cryo-EM-beeldvorming, wat de modellering van ribosomale fragmenten van V. necatrix belemmert.
Aan de andere kant suggereert ons werk dat het proces van genoomverval een inventieve kracht kan zijn. Met name de structuur van het E. cuniculi-ribosoom suggereert dat het verlies van rRNA en eiwitfragmenten in het microsporidia-ribosoom evolutionaire druk creëert die veranderingen in de ribosoomstructuur bevordert. Deze varianten komen ver van de actieve plaats van het ribosoom voor en lijken te helpen bij het behouden (of herstellen) van een optimale ribosoomsamenstelling, die anders verstoord zou worden door een verminderd rRNA. Dit suggereert dat een belangrijke innovatie van het microsporidia-ribosoom lijkt te zijn geëvolueerd tot de behoefte om gendrift te bufferen.
Dit wordt misschien het best geïllustreerd door nucleotidebinding, die tot nu toe nog nooit in andere organismen is waargenomen. Het feit dat nucleotidebindingsresiduen aanwezig zijn in typische microsporidia, maar niet in andere eukaryoten, suggereert dat nucleotidebindingsplaatsen niet slechts overblijfselen zijn die wachten om te verdwijnen, of de uiteindelijke plaats waar rRNA wordt hersteld tot de vorm van individuele nucleotiden. In plaats daarvan lijkt deze plaats een nuttige eigenschap die zich mogelijk heeft ontwikkeld gedurende meerdere ronden van positieve selectie. Nucleotidebindingsplaatsen zijn mogelijk een bijproduct van natuurlijke selectie: zodra ES39L is afgebroken, worden microsporidia gedwongen compensatie te zoeken om de optimale ribosoombiogenese te herstellen bij afwezigheid van ES39L. Omdat deze nucleotide de moleculaire contacten van de A3186-nucleotide in ES39L kan nabootsen, wordt het nucleotidemolecuul een bouwsteen van het ribosoom, waarvan de binding verder wordt verbeterd door mutatie van de eL30-sequentie.
Wat betreft de moleculaire evolutie van intracellulaire parasieten, toont onze studie aan dat de krachten van Darwinistische natuurlijke selectie en genetische drift van genoomverval niet parallel werken, maar oscilleren. Ten eerste elimineert genetische drift belangrijke kenmerken van biomoleculen, waardoor compensatie hard nodig is. Alleen wanneer parasieten aan deze behoefte voldoen door middel van Darwinistische natuurlijke selectie, krijgen hun macromoleculen de kans om hun meest indrukwekkende en innovatieve eigenschappen te ontwikkelen. Belangrijk is dat de evolutie van nucleotidebindingsplaatsen in het ribosoom van E. cuniculi suggereert dat dit verlies-voor-winstpatroon van moleculaire evolutie niet alleen schadelijke mutaties compenseert, maar soms ook volledig nieuwe functies verleent aan parasitaire macromoleculen.
Dit idee is consistent met Sewell Wrights theorie van het bewegende evenwicht, die stelt dat een strikt systeem van natuurlijke selectie het vermogen van organismen om te innoveren beperkt51,52,53. Wanneer genetische drift de natuurlijke selectie echter verstoort, kunnen deze driften veranderingen teweegbrengen die op zichzelf niet adaptief (of zelfs schadelijk) zijn, maar leiden tot verdere veranderingen die zorgen voor een hogere fitness of nieuwe biologische activiteit. Ons raamwerk ondersteunt dit idee door te illustreren dat hetzelfde type mutatie dat de vouw en functie van een biomolecuul vermindert, de belangrijkste trigger lijkt te zijn voor de verbetering ervan. In lijn met het win-win evolutionaire model laat onze studie zien dat genoomverval, traditioneel beschouwd als een degeneratief proces, ook een belangrijke drijfveer is voor innovatie, waardoor macromoleculen soms, en misschien zelfs vaak, nieuwe parasitaire activiteiten kunnen verwerven.