Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com. De browserversie die u gebruikt, biedt beperkte CSS-ondersteuning. Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen). Om de ondersteuning te blijven garanderen, zullen we de site in de tussentijd zonder stijlen en JavaScript weergeven.
De evolutie van microbiële parasieten omvat een wisselwerking tussen natuurlijke selectie, die ervoor zorgt dat parasieten verbeteren, en genetische drift, die ervoor zorgt dat parasieten genen verliezen en schadelijke mutaties accumuleren. Om te begrijpen hoe deze wisselwerking plaatsvindt op de schaal van een enkel macromolecuul, beschrijven we hier de cryo-EM-structuur van het ribosoom van Encephalitozoon cuniculi, een eukaryoot organisme met een van de kleinste genomen in de natuur. De extreme reductie van rRNA in E. cuniculi-ribosomen gaat gepaard met ongekende structurele veranderingen, zoals de evolutie van voorheen onbekende gefuseerde rRNA-linkers en rRNA zonder uitstulpingen. Bovendien heeft het E. cuniculi-ribosoom het verlies van rRNA-fragmenten en eiwitten overleefd door het vermogen te ontwikkelen om kleine moleculen te gebruiken als structurele nabootsingen van afgebroken rRNA-fragmenten en eiwitten. Samenvattend tonen we aan dat moleculaire structuren waarvan lange tijd werd gedacht dat ze gereduceerd, gedegenereerd en onderhevig aan verzwakkende mutaties waren, een aantal compensatiemechanismen bezitten die ervoor zorgen dat ze actief blijven ondanks extreme moleculaire contracties.
Omdat de meeste groepen microbiële parasieten unieke moleculaire instrumenten hebben om hun gastheren te exploiteren, moeten we vaak verschillende therapieën ontwikkelen voor verschillende groepen parasieten1,2. Nieuwe bewijzen suggereren echter dat sommige aspecten van de evolutie van parasieten convergent en grotendeels voorspelbaar zijn, wat een potentiële basis vormt voor brede therapeutische interventies bij microbiële parasieten3,4,5,6,7,8,9.
Eerder onderzoek heeft een gemeenschappelijke evolutionaire trend bij microbiële parasieten geïdentificeerd, namelijk genoomreductie of genoomverval10,11,12,13. Huidig ​​onderzoek toont aan dat wanneer micro-organismen hun vrijlevende levensstijl opgeven en intracellulaire parasieten (of endosymbionten) worden, hun genomen een langzame maar verbazingwekkende metamorfose ondergaan gedurende miljoenen jaren9,11. In een proces dat bekend staat als genoomverval, accumuleren microbiële parasieten schadelijke mutaties die veel voorheen belangrijke genen in pseudogenen veranderen, wat leidt tot geleidelijk genverlies en mutationele ineenstorting14,15. Deze ineenstorting kan tot 95% van de genen in de oudste intracellulaire organismen vernietigen in vergelijking met nauw verwante vrijlevende soorten. De evolutie van intracellulaire parasieten is dus een touwtrekkerij tussen twee tegengestelde krachten: Darwinistische natuurlijke selectie, die leidt tot de verbetering van parasieten, en de ineenstorting van het genoom, die parasieten in de vergetelheid doet raken. Hoe de parasiet erin is geslaagd om aan dit touwtrekken te ontsnappen en de activiteit van zijn moleculaire structuur te behouden, blijft onduidelijk.
Hoewel het mechanisme van genoomverval nog niet volledig begrepen is, lijkt het voornamelijk te worden veroorzaakt door frequente genetische drift. Omdat parasieten in kleine, aseksuele en genetisch beperkte populaties leven, kunnen ze schadelijke mutaties die soms tijdens DNA-replicatie optreden niet effectief elimineren. Dit leidt tot een onomkeerbare accumulatie van schadelijke mutaties en een reductie van het parasietgenoom. Als gevolg hiervan verliest de parasiet niet alleen genen die niet langer nodig zijn voor zijn overleving in de intracellulaire omgeving. Het is het onvermogen van parasietenpopulaties om sporadische schadelijke mutaties effectief te elimineren dat ervoor zorgt dat deze mutaties zich door het hele genoom ophopen, inclusief hun belangrijkste genen.
Veel van onze huidige kennis over genoomreductie is uitsluitend gebaseerd op vergelijkingen van genoomsequenties, met minder aandacht voor veranderingen in de moleculen zelf die essentiële functies vervullen en als potentiële aangrijpingspunten voor geneesmiddelen kunnen dienen. Vergelijkende studies hebben aangetoond dat de belasting van schadelijke intracellulaire microbiële mutaties eiwitten en nucleïnezuren vatbaarder lijkt te maken voor verkeerde vouwing en aggregatie, waardoor ze meer afhankelijk worden van chaperones en hypersensitief voor hitte19,20,21,22,23. Daarnaast hebben verschillende parasieten – onafhankelijke evolutie soms gescheiden door wel 2,5 miljard jaar – een vergelijkbaar verlies van kwaliteitscontrolecentra in hun eiwitsynthese5,6 en DNA-reparatiemechanismen ervaren24. Er is echter weinig bekend over de impact van de intracellulaire levensstijl op alle andere eigenschappen van cellulaire macromoleculen, inclusief moleculaire aanpassing aan een toenemende belasting van schadelijke mutaties.
In dit onderzoek hebben we, om de evolutie van eiwitten en nucleïnezuren van intracellulaire micro-organismen beter te begrijpen, de structuur van ribosomen van de intracellulaire parasiet Encephalitozoon cuniculi bepaald. E. cuniculi is een schimmelachtig organisme dat behoort tot een groep parasitaire microsporidia met ongewoon kleine eukaryotische genomen en wordt daarom gebruikt als modelorganisme om genoomverval te bestuderen25,26,27,28,29,30. Recentelijk is de cryo-EM-ribosoomstructuur bepaald voor matig gereduceerde genomen van Microsporidia, Paranosema locustae en Vairimorpha necatrix31,32 (~3,2 Mb genoom). Deze structuren suggereren dat een deel van het verlies aan rRNA-amplificatie wordt gecompenseerd door de ontwikkeling van nieuwe contacten tussen naburige ribosomale eiwitten of de verwerving van nieuwe msL131,32 ribosomale eiwitten. De soort Encephalitozoon (genoom ~2,5 miljoen bp), samen met hun naaste verwant Ordospora, demonstreert de ultieme mate van genoomreductie bij eukaryoten – ze hebben minder dan 2000 eiwitcoderende genen, en naar verwachting bevatten hun ribosomen niet alleen geen rRNA-expansiefragmenten (rRNA-fragmenten die eukaryotische ribosomen onderscheiden van bacteriële ribosomen), maar ook slechts vier ribosomale eiwitten vanwege het ontbreken van homologen in het E. cuniculi-genoom26,27,28. Daarom concludeerden we dat het E. cuniculi-ribosoom mogelijk voorheen onbekende strategieën voor moleculaire aanpassing aan genoomverval kan onthullen.
Onze cryo-EM-structuur vertegenwoordigt het kleinste eukaryotische cytoplasmatische ribosoom dat tot nu toe is gekarakteriseerd en biedt inzicht in hoe de uiteindelijke mate van genoomreductie de structuur, assemblage en evolutie beïnvloedt van de moleculaire machinerie die essentieel is voor de cel. We ontdekten dat het E. cuniculi-ribosoom veel van de algemeen aanvaarde principes van RNA-vouwing en ribosoomassemblage schendt, en ontdekten een nieuw, voorheen onbekend ribosomaal eiwit. Heel onverwacht tonen we aan dat microsporidia-ribosomen het vermogen hebben ontwikkeld om kleine moleculen te binden, en we veronderstellen dat truncaties in rRNA en eiwitten evolutionaire innovaties teweegbrengen die uiteindelijk nuttige eigenschappen aan het ribosoom kunnen verlenen.
Om ons begrip van de evolutie van eiwitten en nucleïnezuren in intracellulaire organismen te verbeteren, besloten we E. cuniculi-sporen te isoleren uit culturen van geïnfecteerde zoogdiercellen om hun ribosomen te zuiveren en de structuur van deze ribosomen te bepalen. Het is moeilijk om een ​​groot aantal parasitaire microsporidia te verkrijgen, omdat microsporidia niet in een voedingsmedium gekweekt kunnen worden. In plaats daarvan groeien en vermenigvuldigen ze zich alleen in de gastheercel. Om E. cuniculi-biomassa te verkrijgen voor ribosoomzuivering, infecteerden we daarom de zoogdierniercellijn RK13 met E. cuniculi-sporen en kweekten we deze geïnfecteerde cellen enkele weken om E. cuniculi te laten groeien en vermenigvuldigen. Met behulp van een geïnfecteerde celmonolaag van ongeveer een halve vierkante meter konden we ongeveer 300 mg microsporidia-sporen zuiveren en deze gebruiken om ribosomen te isoleren. Vervolgens verstoorden we de gezuiverde sporen met glasparels en isoleerden we de ruwe ribosomen door middel van stapsgewijze fractionering van de lysaten met polyethyleenglycol. Hierdoor konden we ongeveer 300 µg ruwe E. cuniculi-ribosomen verkrijgen voor structurele analyse.
Vervolgens hebben we cryo-EM-beelden verzameld met behulp van de verkregen ribosoommonsters en deze beelden verwerkt met behulp van maskers die overeenkomen met de grote ribosomale subeenheid, de kop van de kleine subeenheid en de kleine subeenheid zelf. Tijdens dit proces hebben we beelden verzameld van ongeveer 108.000 ribosomale deeltjes en cryo-EM-beelden berekend met een resolutie van 2,7 Å (aanvullende figuren 1-3). Vervolgens hebben we de cryo-EM-beelden gebruikt om rRNA, ribosomaal eiwit en de hibernatiefactor Mdf1 te modelleren die geassocieerd zijn met de ribosomen van E. cuniculi (figuur 1a, b).
a Structuur van het E. cuniculi-ribosoom in complex met de hibernatiefactor Mdf1 (pdb-id 7QEP). b Kaart van hibernatiefactor Mdf1 geassocieerd met het E. cuniculi-ribosoom. c Secundaire structuurkaart die het teruggevonden rRNA in Microsporidia-soorten vergelijkt met bekende ribosomale structuren. De panelen tonen de locatie van de geamplificeerde rRNA-fragmenten (ES) en de actieve plaatsen van het ribosoom, waaronder de decoderingsplaats (DC), de sarcinicine-lus (SRL) en het peptidyltransferasecentrum (PTC). d De elektronendichtheid die overeenkomt met het peptidyltransferasecentrum van het E. cuniculi-ribosoom suggereert dat deze katalytische plaats dezelfde structuur heeft in de E. cuniculi-parasiet en zijn gastheren, waaronder H. sapiens. e, f De corresponderende elektronendichtheid van het decoderingscentrum (e) en de schematische structuur van het decoderingscentrum (f) geven aan dat E. cuniculi de residuen U1491 heeft in plaats van A1491 (nummering volgens E. coli) zoals in veel andere eukaryoten. Deze verandering suggereert dat E. cuniculi mogelijk gevoelig is voor antibiotica die zich richten op deze actieve plaats.
In tegenstelling tot de eerder vastgestelde structuren van V. necatrix- en P. locustae-ribosomen (beide structuren vertegenwoordigen dezelfde microsporidia-familie Nosematidae en lijken sterk op elkaar), 31,32 ondergaan E. cuniculi-ribosomen talrijke processen van rRNA- en eiwitfragmentatie. Verdere denaturatie (aanvullende figuren 4-6). In rRNA waren de meest opvallende veranderingen het volledige verlies van het geamplificeerde 25S rRNA-fragment ES12L en de gedeeltelijke degeneratie van de h39-, h41- en H18-helices (figuur 1c, aanvullende figuur 4). Onder de ribosomale eiwitten waren de meest opvallende veranderingen het volledige verlies van het eS30-eiwit en de verkorting van de eiwitten eL8, eL13, eL18, eL22, eL29, eL40, uS3, uS9, uS14, uS17 en eS7 (aanvullende figuren 4 en 5).
De extreme reductie van de genomen van Encephalotozoon/Ordospora-soorten wordt dus weerspiegeld in hun ribosoomstructuur: de ribosomen van E. cuniculi vertonen het meest dramatische verlies aan eiwitgehalte van alle eukaryotische cytoplasmatische ribosomen die aan structurele karakterisering zijn onderworpen, en ze bevatten zelfs niet die rRNA- en eiwitfragmenten die niet alleen wijdverspreid geconserveerd zijn in eukaryoten, maar ook in de drie domeinen van het leven. De structuur van het E. cuniculi-ribosoom biedt het eerste moleculaire model voor deze veranderingen en onthult evolutionaire gebeurtenissen die over het hoofd zijn gezien door zowel vergelijkende genomica als studies van intracellulaire biomoleculaire structuren (aanvullende figuur 7). Hieronder beschrijven we elk van deze gebeurtenissen, samen met hun waarschijnlijke evolutionaire oorsprong en hun potentiële impact op de ribosoomfunctie.
We ontdekten vervolgens dat E. cuniculi-ribosomen, naast grote rRNA-truncaties, ook rRNA-variaties vertonen op een van hun actieve centra. Hoewel het peptidyltransferasecentrum van het E. cuniculi-ribosoom dezelfde structuur heeft als andere eukaryotische ribosomen (Fig. 1d), verschilt het decoderingscentrum door een sequentievariatie op nucleotide 1491 (E. coli-nummering, Fig. 1e, f). Deze observatie is belangrijk omdat de decoderingsplaats van eukaryotische ribosomen doorgaans de residuen G1408 en A1491 bevat, in tegenstelling tot de bacteriële residuen A1408 en G1491. Deze variatie ligt ten grondslag aan de verschillende gevoeligheid van bacteriële en eukaryotische ribosomen voor de aminoglycosidefamilie van ribosomale antibiotica en andere kleine moleculen die zich richten op de decoderingsplaats. Op de decoderingsplaats van het E. cuniculi-ribosoom werd residu A1491 vervangen door U1491, waardoor mogelijk een unieke bindingsinterface ontstaat voor kleine moleculen die zich op deze actieve plaats richten. Dezelfde A14901-variant is ook aanwezig in andere microsporidia zoals P. locustae en V. necatrix, wat suggereert dat deze variant wijdverspreid is onder microsporidia-soorten (Fig. 1f).
Omdat onze E. cuniculi-ribosoommonsters werden geïsoleerd uit metabolisch inactieve sporen, hebben we de cryo-EM-kaart van E. cuniculi getest op eerder beschreven ribosoombinding onder stress- of hongeromstandigheden. Hibernatiefactoren 31, 32, 36, 37, 38. We hebben de eerder vastgestelde structuur van het hibernerende ribosoom vergeleken met de cryo-EM-kaart van het E. cuniculi-ribosoom. Voor de docking werden S. cerevisiae-ribosomen gebruikt in complex met hibernatiefactor Stm138, sprinkhaanribosomen in complex met factor Lso232 en V. necatrix-ribosomen in complex met de factoren Mdf1 en Mdf231. Tegelijkertijd vonden we de cryo-EM-dichtheid die overeenkomt met de rustfactor Mdf1. Net zoals Mdf1 zich bindt aan het ribosoom van V. necatrix, bindt Mdf1 zich ook aan het ribosoom van E. cuniculi, waar het de E-site van het ribosoom blokkeert. Dit helpt mogelijk om ribosomen beschikbaar te maken wanneer parasietsporen metabolisch inactief worden na inactivatie van het lichaam (Figuur 2).
Mdf1 blokkeert de E-site van het ribosoom, wat blijkbaar bijdraagt ​​aan de inactivatie van het ribosoom wanneer parasietsporen metabolisch inactief worden. In de structuur van het E. cuniculi-ribosoom ontdekten we dat Mdf1 een voorheen onbekend contact vormt met de L1-ribosoomstam, het deel van het ribosoom dat de afgifte van gedeacetyleerd tRNA van het ribosoom tijdens de eiwitsynthese mogelijk maakt. Deze contacten suggereren dat Mdf1 loskomt van het ribosoom via hetzelfde mechanisme als gedeacetyleerd tRNA, wat een mogelijke verklaring biedt voor hoe het ribosoom Mdf1 verwijdert om de eiwitsynthese te reactiveren.
Onze structuur onthulde echter een onbekend contact tussen Mdf1 en de L1-ribosoompoot (het deel van het ribosoom dat helpt bij het vrijmaken van gedeacetyleerd tRNA van het ribosoom tijdens de eiwitsynthese). In het bijzonder gebruikt Mdf1 dezelfde contacten als het elleboogsegment van het gedeacetyleerde tRNA-molecuul (Fig. 2). Deze voorheen onbekende moleculaire modellering toonde aan dat Mdf1 loskomt van het ribosoom via hetzelfde mechanisme als gedeacetyleerd tRNA, wat verklaart hoe het ribosoom deze hibernatiefactor verwijdert om de eiwitsynthese te reactiveren.
Bij het construeren van het rRNA-model ontdekten we dat het ribosoom van E. cuniculi abnormaal gevouwen rRNA-fragmenten bevat, die we gefuseerd rRNA noemden (Fig. 3). In ribosomen die de drie domeinen van het leven omvatten, vouwt rRNA zich tot structuren waarin de meeste rRNA-basen ofwel basenparen vormen en met elkaar vouwen, ofwel interageren met ribosomale eiwitten38,39,40. In de ribosomen van E. cuniculi lijken de rRNA's dit vouwprincipe echter te schenden door sommige van hun helices om te zetten in ongevouwen rRNA-regio's.
Structuur van de H18 25S rRNA-helix in S. cerevisiae, V. necatrix en E. cuniculi. Normaal gesproken rolt deze linker in ribosomen van de drie levensdomeinen zich op tot een RNA-helix met 24 tot 34 residuen. In Microsporidia daarentegen wordt deze rRNA-linker geleidelijk gereduceerd tot twee enkelstrengs, uridine-rijke linkers met slechts 12 residuen. De meeste van deze residuen zijn blootgesteld aan oplosmiddelen. De afbeelding laat zien dat parasitaire microsporidia de algemene principes van rRNA-vouwing lijken te schenden, waarbij rRNA-basen gewoonlijk gekoppeld zijn aan andere basen of betrokken zijn bij rRNA-eiwitinteracties. In microsporidia nemen sommige rRNA-fragmenten een ongunstige vouwing aan, waarbij de voormalige rRNA-helix een enkelstrengs fragment wordt dat bijna in een rechte lijn is uitgerekt. De aanwezigheid van deze ongebruikelijke regio's stelt microsporidia-rRNA in staat om zich met een minimaal aantal RNA-basen te binden aan verre rRNA-fragmenten.
Het meest opvallende voorbeeld van deze evolutionaire overgang is te zien in de H18 25S rRNA-helix (Fig. 3). In soorten van E. coli tot de mens bevatten de basen van deze rRNA-helix 24-32 nucleotiden, waardoor een licht onregelmatige helix ontstaat. In eerder geïdentificeerde ribosomale structuren van V. necatrix en P. locustae,31,32 zijn de basen van de H18-helix gedeeltelijk ontward, maar blijft de nucleotide-basenparing behouden. In E. cuniculi wordt dit rRNA-fragment echter de kortste linkers 228UUUGU232 en 301UUUUUUUUU307. In tegenstelling tot typische rRNA-fragmenten rollen deze uridine-rijke linkers niet op en maken ze geen uitgebreid contact met ribosomale eiwitten. In plaats daarvan nemen ze oplosmiddel-open en volledig ontvouwen structuren aan waarin de rRNA-strengen bijna recht uitgestrekt zijn. Deze uitgerekte conformatie verklaart hoe E. cuniculi slechts 12 RNA-basen gebruikt om de 33 Å grote opening tussen de H16- en H18-rRNA-helices te vullen, terwijl andere soorten minstens twee keer zoveel rRNA-basen nodig hebben om die opening te vullen.
Zo kunnen we aantonen dat parasitaire microsporidia, door middel van energetisch ongunstige vouwing, een strategie hebben ontwikkeld om zelfs die rRNA-segmenten te verkorten die in grote lijnen behouden zijn gebleven in soorten binnen de drie domeinen van het leven. Blijkbaar kan E. cuniculi, door het accumuleren van mutaties die rRNA-helices transformeren in korte poly-U-linkers, ongebruikelijke rRNA-fragmenten vormen die zo min mogelijk nucleotiden bevatten voor de ligatie van distale rRNA-fragmenten. Dit helpt verklaren hoe microsporidia een drastische reductie in hun basismoleculaire structuur hebben bereikt zonder hun structurele en functionele integriteit te verliezen.
Een ander ongebruikelijk kenmerk van E. cuniculi rRNA is het voorkomen van rRNA zonder verdikkingen (Fig. 4). Uitstulpingen zijn nucleotiden zonder basenparen die uit de RNA-helix draaien in plaats van erin verborgen te zijn. De meeste rRNA-uitstulpingen fungeren als moleculaire kleefstoffen en helpen bij het binden van aangrenzende ribosomale eiwitten of andere rRNA-fragmenten. Sommige uitstulpingen fungeren als scharnieren, waardoor de rRNA-helix optimaal kan buigen en vouwen voor een productieve eiwitsynthese 41.
a Een rRNA-uitstulping (nummering volgens S. cerevisiae) ontbreekt in de ribosoomstructuur van E. cuniculi, maar is wel aanwezig in de meeste andere eukaryoten. b E. coli, S. cerevisiae, H. sapiens en E. cuniculi interne ribosomen. Parasieten missen veel van de oude, sterk geconserveerde rRNA-uitstulpingen. Deze verdikkingen stabiliseren de ribosoomstructuur; daarom duidt hun afwezigheid in microsporidia op een verminderde stabiliteit van de rRNA-vouwing in microsporidia-parasieten. Vergelijking met P-stengels (L7/L12-stengels in bacteriën) laat zien dat het verlies van rRNA-uitstulpingen soms samenvalt met het verschijnen van nieuwe uitstulpingen naast de verdwenen uitstulpingen. De H42-helix in het 23S/28S rRNA heeft een oeroude uitstulping (U1206 in Saccharomyces cerevisiae) die naar schatting minstens 3,5 miljard jaar oud is vanwege de bescherming die deze in drie levensdomeinen biedt. In microsporidia is deze uitstulping verdwenen. Er is echter een nieuwe uitstulping verschenen naast de verdwenen uitstulping (A1306 in E. cuniculi).
Opvallend genoeg ontdekten we dat de ribosomen van E. cuniculi de meeste rRNA-uitstulpingen missen die in andere soorten voorkomen, waaronder meer dan 30 uitstulpingen die in andere eukaryoten behouden zijn gebleven (Fig. 4a). Dit verlies elimineert veel contacten tussen ribosomale subeenheden en aangrenzende rRNA-helices, waardoor soms grote holle ruimtes in het ribosoom ontstaan. Hierdoor is het ribosoom van E. cuniculi poreuzer dan meer traditionele ribosomen (Fig. 4b). Opmerkelijk is dat we ontdekten dat de meeste van deze uitstulpingen ook ontbraken in de eerder geïdentificeerde ribosoomstructuren van V. necatrix en P. locustae, die over het hoofd waren gezien bij eerdere structurele analyses31,32.
Soms gaat het verlies van rRNA-uitstulpingen gepaard met de ontwikkeling van nieuwe uitstulpingen naast de verdwenen uitstulping. Zo bevat de ribosomale P-stam een ​​U1208-uitstulping (in Saccharomyces cerevisiae) die van E. coli tot de mens is overgeërfd en daarom naar schatting 3,5 miljard jaar oud is. Tijdens de eiwitsynthese helpt deze uitstulping de P-stam te bewegen tussen open en gesloten conformaties, zodat het ribosoom translatiefactoren kan rekruteren en naar de actieve plaats kan brengen. In E. cuniculi-ribosomen ontbreekt deze verdikking; een nieuwe verdikking (G883) van slechts drie basenparen kan echter bijdragen aan het herstel van de optimale flexibiliteit van de P-stam (Fig. 4c).
Onze gegevens over rRNA zonder uitstulpingen suggereren dat rRNA-minimalisatie niet beperkt is tot het verlies van rRNA-elementen aan het oppervlak van het ribosoom, maar mogelijk ook de ribosoomkern betreft, waardoor een parasiet-specifiek moleculair defect ontstaat dat nog niet is beschreven in vrijlevende cellen.
Na het modelleren van canonieke ribosomale eiwitten en rRNA, ontdekten we dat conventionele ribosomale componenten de drie delen van het cryo-EM-beeld niet kunnen verklaren. Twee van deze fragmenten zijn kleine moleculen (Fig. 5, Aanvullende Fig. 8). Het eerste segment bevindt zich ingeklemd tussen de ribosomale eiwitten uL15 en eL18 op een positie die normaal gesproken wordt ingenomen door het C-uiteinde van eL18, dat verkort is in E. cuniculi. Hoewel we de identiteit van dit molecuul niet kunnen vaststellen, worden de grootte en vorm van dit dichtheidseiland goed verklaard door de aanwezigheid van spermidinemoleculen. De binding ervan aan het ribosoom wordt gestabiliseerd door microsporidia-specifieke mutaties in de uL15-eiwitten (Asp51 en Arg56), die de affiniteit van het ribosoom voor dit kleine molecuul lijken te verhogen, doordat ze uL15 in staat stellen het kleine molecuul in een ribosomale structuur te wikkelen (Aanvullende Figuur 2). 8, aanvullende gegevens 1, 2).
Cryo-EM-beelden tonen de aanwezigheid van nucleotiden buiten de ribose die gebonden is aan het ribosoom van E. cuniculi. In het ribosoom van E. cuniculi neemt deze nucleotide dezelfde plaats in als de 25S rRNA A3186-nucleotide (nummering volgens Saccharomyces cerevisiae) in de meeste andere eukaryotische ribosomen. b In de ribosomale structuur van E. cuniculi bevindt deze nucleotide zich tussen de ribosomale eiwitten uL9 en eL20, waardoor het contact tussen de twee eiwitten wordt gestabiliseerd. cd Analyse van de sequentieconservering van eL20 tussen microsporidia-soorten. De fylogenetische boom van Microsporidia-soorten (c) en de meervoudige sequentie-uitlijning van het eL20-eiwit (d) laten zien dat de nucleotidebindende residuen F170 en K172 geconserveerd zijn in de meeste typische Microsporidia, met uitzondering van S. lophii, en met uitzondering van vroeg vertakkende Microsporidia, die de ES39L rRNA-extensie behielden. e Deze figuur laat zien dat de nucleotidebindende residuen F170 en K172 alleen aanwezig zijn in eL20 van het sterk gereduceerde Microsporidia-genoom, maar niet in andere eukaryoten. Over het geheel genomen suggereren deze gegevens dat Microsporidische ribosomen een nucleotidebindingsplaats hebben ontwikkeld die AMP-moleculen lijkt te binden en deze gebruikt om eiwit-eiwitinteracties in de ribosomale structuur te stabiliseren. De hoge mate van conservering van deze bindingsplaats in Microsporidia en de afwezigheid ervan in andere eukaryoten suggereert dat deze plaats een selectief overlevingsvoordeel voor Microsporidia kan bieden. Het nucleotidebindende zakje in het microsporidia-ribosoom lijkt dus geen gedegenereerd kenmerk of eindvorm van rRNA-afbraak te zijn, zoals eerder beschreven, maar eerder een nuttige evolutionaire innovatie die het microsporidia-ribosoom in staat stelt kleine moleculen direct te binden en ze als moleculaire bouwstenen voor ribosomen te gebruiken. Deze ontdekking maakt het microsporidia-ribosoom het enige ribosoom waarvan bekend is dat het een enkel nucleotide als structurele bouwsteen gebruikt. f Hypothetisch evolutionair pad afgeleid van nucleotidebinding.
De tweede dichtheid met een laag moleculair gewicht bevindt zich op het grensvlak tussen de ribosomale eiwitten uL9 en eL30 (Fig. 5a). Dit grensvlak werd eerder beschreven in de structuur van het Saccharomyces cerevisiae-ribosoom als een bindingsplaats voor het 25S-nucleotide van rRNA A3186 (onderdeel van de ES39L rRNA-extensie)38. Er werd aangetoond dat in gedegenereerde P. locustae ES39L-ribosomen dit grensvlak een onbekend enkelvoudig nucleotide bindt31, en men neemt aan dat dit nucleotide een gereduceerde eindvorm van rRNA is, waarbij de lengte van het rRNA ongeveer 130-230 basen bedraagt. ES39L is gereduceerd tot een enkelvoudig nucleotide 32.43. Onze cryo-EM-beelden ondersteunen het idee dat de dichtheid kan worden verklaard door nucleotiden. De hogere resolutie van onze structuur toonde echter aan dat dit nucleotide een extraribosomaal molecuul is, mogelijk AMP (Fig. 5a, b).
Vervolgens vroegen we ons af of de nucleotidebindingsplaats in het ribosoom van E. cuniculi verscheen of dat deze al eerder bestond. Aangezien nucleotidebinding voornamelijk wordt gemedieerd door de Phe170- en Lys172-residuen in het ribosomale eiwit eL30, hebben we de conservering van deze residuen in 4396 representatieve eukaryoten onderzocht. Net als bij uL15 hierboven, vonden we dat de Phe170- en Lys172-residuen alleen sterk geconserveerd zijn in typische Microsporidia, maar afwezig zijn in andere eukaryoten, waaronder atypische Microsporidia zoals Mitosporidium en Amphiamblys, waarin het ES39L rRNA-fragment niet gereduceerd is 44, 45, 46 (Fig. 5c). -e).
Samengevat ondersteunen deze gegevens het idee dat E. cuniculi en mogelijk andere canonieke microsporidia het vermogen hebben ontwikkeld om efficiënt grote aantallen kleine metabolieten in de ribosoomstructuur op te nemen ter compensatie van de afname van rRNA- en eiwitniveaus. Daarbij hebben ze een uniek vermogen ontwikkeld om nucleotiden buiten het ribosoom te binden, wat aantoont dat parasitaire moleculaire structuren compenseren door overvloedige kleine metabolieten op te nemen en deze te gebruiken als structurele nabootsingen van afgebroken RNA- en eiwitfragmenten.
Het derde niet-gesimuleerde deel van onze cryo-EM-kaart werd gevonden in de grote ribosomale subeenheid. De relatief hoge resolutie (2,6 Å) van onze kaart suggereert dat deze dichtheid toebehoort aan eiwitten met unieke combinaties van grote zijketenresiduen. Hierdoor konden we deze dichtheid identificeren als een voorheen onbekend ribosomaal eiwit, dat we msL2 (Microsporidia-specifiek eiwit L2) hebben genoemd (methoden, figuur 6). Ons homologieonderzoek toonde aan dat msL2 geconserveerd is in de Microsporidia-clade van de geslachten Encephaliter en Orosporidium, maar afwezig is in andere soorten, waaronder andere Microsporidia. In de ribosomale structuur vult msL2 een gat op dat is ontstaan ​​door het verlies van het verlengde ES31L rRNA. In deze leegte helpt msL2 de rRNA-vouwing te stabiliseren en kan het het verlies van ES31L compenseren (figuur 6).
a Elektronendichtheid en model van het Microsporidia-specifieke ribosomale eiwit msL2, gevonden in E. cuniculi-ribosomen. b De meeste eukaryotische ribosomen, waaronder het 80S-ribosoom van Saccharomyces cerevisiae, hebben ES19L rRNA-amplificatie verloren laten gaan in de meeste Microsporidia-soorten. De eerder vastgestelde structuur van het V. necatrix microsporidia-ribosoom suggereert dat het verlies van ES19L in deze parasieten wordt gecompenseerd door de evolutie van het nieuwe ribosomale eiwit msL1. In deze studie ontdekten we dat het E. cuniculi-ribosoom ook een extra ribosomaal RNA-nabootsend eiwit ontwikkelde als een schijnbare compensatie voor het verlies van ES19L. msL2 (momenteel geannoteerd als het hypothetische ECU06_1135-eiwit) en msL1 hebben echter verschillende structurele en evolutionaire oorsprongen. c Deze ontdekking van de generatie van evolutionair niet-verwante ribosomale eiwitten msL1 en msL2 suggereert dat als ribosomen schadelijke mutaties in hun rRNA accumuleren, ze ongekende niveaus van compositionele diversiteit kunnen bereiken, zelfs in een kleine subset van nauw verwante soorten. Deze ontdekking zou kunnen helpen de oorsprong en evolutie van het mitochondriale ribosoom te verduidelijken, dat bekendstaat om zijn sterk gereduceerde rRNA en abnormale variabiliteit in eiwitsamenstelling tussen soorten.
Vervolgens vergeleken we het msL2-eiwit met het eerder beschreven msL1-eiwit, het enige bekende microsporidia-specifieke ribosomale eiwit dat in het ribosoom van V. necatrix voorkomt. We wilden onderzoeken of msL1 en msL2 evolutionair verwant zijn. Onze analyse toonde aan dat msL1 en msL2 dezelfde holte in de ribosomale structuur innemen, maar verschillende primaire en tertiaire structuren hebben, wat wijst op een onafhankelijke evolutionaire oorsprong (Fig. 6). Onze ontdekking van msL2 levert dus bewijs dat groepen compacte eukaryotische soorten onafhankelijk van elkaar structureel verschillende ribosomale eiwitten kunnen ontwikkelen om het verlies van rRNA-fragmenten te compenseren. Deze bevinding is opmerkelijk, aangezien de meeste cytoplasmatische eukaryotische ribosomen een invariant eiwit bevatten, waaronder dezelfde familie van 81 ribosomale eiwitten. Het verschijnen van msL1 en msL2 in verschillende clades van microsporidia als reactie op het verlies van verlengde rRNA-segmenten suggereert dat de afbraak van de moleculaire architectuur van de parasiet ertoe leidt dat parasieten compenserende mutaties zoeken, wat uiteindelijk kan leiden tot de verwerving ervan in verschillende parasietenpopulaties.
Ten slotte, toen ons model voltooid was, vergeleken we de samenstelling van het E. cuniculi-ribosoom met de samenstelling die voorspeld werd op basis van de genoomsequentie. Verschillende ribosomale eiwitten, waaronder eL14, eL38, eL41 en eS30, werden eerder verondersteld te ontbreken in het E. cuniculi-genoom vanwege de kennelijke afwezigheid van hun homologen in het E. cuniculi-genoom. Verlies van veel ribosomale eiwitten wordt ook voorspeld bij de meeste andere sterk gereduceerde intracellulaire parasieten en endosymbionten. Hoewel de meeste vrijlevende bacteriën bijvoorbeeld dezelfde familie van 54 ribosomale eiwitten bevatten, hebben slechts 11 van deze eiwitfamilies detecteerbare homologen in elk geanalyseerd genoom van gastheergebonden bacteriën. Ter ondersteuning van dit idee is experimenteel een verlies van ribosomale eiwitten waargenomen in V. necatrix en P. locustae microsporidia, die de eiwitten eL38 en eL41 missen31,32.
Onze structuren laten echter zien dat alleen eL38, eL41 en eS30 daadwerkelijk verloren gaan in het ribosoom van E. cuniculi. Het eL14-eiwit bleef behouden en onze structuur toonde aan waarom dit eiwit niet gevonden kon worden in de homologiezoektocht (Fig. 7). In ribosomen van E. cuniculi gaat het grootste deel van de eL14-bindingsplaats verloren door de afbraak van het rRNA-geamplificeerde ES39L. Bij afwezigheid van ES39L verloor eL14 het grootste deel van zijn secundaire structuur, en slechts 18% van de eL14-sequentie was identiek in E. cuniculi en S. cerevisiae. Deze geringe sequentieconservering is opmerkelijk, omdat zelfs Saccharomyces cerevisiae en Homo sapiens – organismen die 1,5 miljard jaar van elkaar gescheiden zijn – meer dan 51% van dezelfde residuen in eL14 delen. Dit afwijkende verlies aan conservering verklaart waarom E. cuniculi eL14 momenteel is geannoteerd als het vermoedelijke M970_061160-eiwit en niet als het ribosomale eiwit eL1427.
Het Microsporidia-ribosoom verloor de ES39L rRNA-extensie, waardoor de bindingsplaats voor het ribosomale eiwit eL14 gedeeltelijk verdween. Bij afwezigheid van ES39L ondergaat het eL14-microspore-eiwit een verlies van secundaire structuur, waarbij de voormalige rRNA-bindende α-helix degenereert tot een lus van minimale lengte. b Meervoudige sequentie-uitlijning toont aan dat het eL14-eiwit sterk geconserveerd is in eukaryotische soorten (57% sequentie-identiteit tussen gist- en menselijke homologen), maar slecht geconserveerd en divergent in microsporidia (waarin niet meer dan 24% van de residuen identiek is aan het eL14-homoloog). van S. cerevisiae of H. sapiens). Deze geringe sequentieconservering en variabiliteit in secundaire structuur verklaren waarom het eL14-homoloog nooit in E. cuniculi is gevonden en waarom wordt aangenomen dat dit eiwit in E. cuniculi verloren is gegaan. Daarentegen werd E. cuniculi eL14 eerder geannoteerd als een vermoedelijk M970_061160-eiwit. Deze observatie suggereert dat de genetische diversiteit van microsporidia momenteel wordt overschat: sommige genen waarvan momenteel wordt aangenomen dat ze verloren zijn gegaan in microsporidia, zijn in feite bewaard gebleven, zij het in sterk gedifferentieerde vormen; in plaats daarvan coderen sommige genen waarvan wordt aangenomen dat ze coderen voor microsporidia-genen voor wormspecifieke eiwitten (bijvoorbeeld het hypothetische eiwit M970_061160) in werkelijkheid voor de zeer diverse eiwitten die in andere eukaryoten voorkomen.
Deze bevinding suggereert dat denaturatie van rRNA kan leiden tot een dramatisch verlies van sequentieconservering in aangrenzende ribosomale eiwitten, waardoor deze eiwitten niet meer detecteerbaar zijn bij homologiezoekacties. We overschatten dus mogelijk de werkelijke mate van moleculaire degradatie in organismen met een klein genoom, aangezien sommige eiwitten waarvan gedacht werd dat ze verloren gingen, in werkelijkheid blijven bestaan, zij het in sterk gewijzigde vormen.
Hoe kunnen parasieten de functie van hun moleculaire machines behouden onder omstandigheden van extreme genoomreductie? Onze studie beantwoordt deze vraag door de complexe moleculaire structuur (ribosoom) van E. cuniculi te beschrijven, een organisme met een van de kleinste eukaryotische genomen.
Het is al bijna twee decennia bekend dat eiwit- en RNA-moleculen in microbiële parasieten vaak verschillen van hun homologe moleculen in vrijlevende soorten, omdat ze geen kwaliteitscontrolecentra hebben, tot 50% van hun grootte in vrijlevende microben zijn gereduceerd, enzovoort. Veel van deze mutaties belemmeren de vouwing en functie. Zo wordt bijvoorbeeld verwacht dat de ribosomen van organismen met een klein genoom, waaronder veel intracellulaire parasieten en endosymbionten, verschillende ribosomale eiwitten en tot een derde van de rRNA-nucleotiden missen in vergelijking met vrijlevende soorten 27, 29, 30, 49. De manier waarop deze moleculen functioneren in parasieten blijft echter grotendeels een mysterie en wordt voornamelijk bestudeerd door middel van vergelijkende genomica.
Onze studie toont aan dat de structuur van macromoleculen veel aspecten van evolutie kan onthullen die moeilijk te achterhalen zijn met traditionele vergelijkende genomische studies van intracellulaire parasieten en andere gastheergebonden organismen (Aanvullende figuur 7). Het voorbeeld van het eL14-eiwit laat bijvoorbeeld zien dat we de werkelijke mate van afbraak van het moleculaire apparaat in parasitaire soorten kunnen overschatten. Men neemt nu aan dat encefalitische parasieten honderden microsporidia-specifieke genen bezitten. Onze resultaten tonen echter aan dat sommige van deze ogenschijnlijk specifieke genen in werkelijkheid slechts zeer verschillende varianten zijn van genen die veel voorkomen in andere eukaryoten. Bovendien laat het voorbeeld van het msL2-eiwit zien hoe we nieuwe ribosomale eiwitten over het hoofd zien en de inhoud van parasitaire moleculaire machines onderschatten. Het voorbeeld van kleine moleculen laat zien hoe we de meest ingenieuze innovaties in parasitaire moleculaire structuren, die hen nieuwe biologische activiteit kunnen geven, kunnen missen.
Samengevat verbeteren deze resultaten ons begrip van de verschillen tussen de moleculaire structuren van gastheergebonden organismen en hun tegenhangers in vrijlevende organismen. We laten zien dat moleculaire machines, waarvan lange tijd werd gedacht dat ze gereduceerd, gedegenereerd en onderhevig aan diverse verzwakkende mutaties waren, in werkelijkheid een reeks systematisch over het hoofd geziene ongebruikelijke structurele kenmerken bezitten.
Aan de andere kant suggereren de niet-omvangrijke rRNA-fragmenten en gefuseerde fragmenten die we in de ribosomen van E. cuniculi aantroffen, dat genoomreductie zelfs die delen van de fundamentele moleculaire machinerie kan veranderen die bewaard zijn gebleven in de drie domeinen van het leven – na bijna 3,5 miljard jaar onafhankelijke evolutie van soorten.
De rRNA-fragmenten zonder uitstulpingen en de gefuseerde rRNA-fragmenten in de ribosomen van E. cuniculi zijn van bijzonder belang in het licht van eerdere studies naar RNA-moleculen in endosymbiotische bacteriën. Zo is bijvoorbeeld aangetoond dat rRNA- en tRNA-moleculen in de bladluis-endosymbiont Buchnera aphidicola temperatuurgevoelige structuren hebben als gevolg van een voorkeur voor A+T-basenparen en een hoog percentage niet-canonieke basenparen20,50. Men denkt nu dat deze veranderingen in RNA, evenals veranderingen in eiwitmoleculen, verantwoordelijk zijn voor de overmatige afhankelijkheid van endosymbionten van partners en het onvermogen van endosymbionten om warmte over te dragen21, 23. Hoewel parasitaire microsporidia-rRNA structureel verschillende veranderingen vertoont, suggereert de aard van deze veranderingen dat verminderde thermische stabiliteit en een grotere afhankelijkheid van chaperone-eiwitten gemeenschappelijke kenmerken kunnen zijn van RNA-moleculen in organismen met gereduceerde genomen.
Aan de andere kant laten onze structuren zien dat parasitaire microsporidia een uniek vermogen hebben ontwikkeld om zich te verzetten tegen breed geconserveerde rRNA- en eiwitfragmenten. Ze hebben het vermogen ontwikkeld om overvloedige en gemakkelijk verkrijgbare kleine metabolieten te gebruiken als structurele nabootsingen van gedegenereerde rRNA- en eiwitfragmenten. Dit leidt tot afbraak van de moleculaire structuur. Deze hypothese wordt ondersteund door het feit dat kleine moleculen die het verlies van eiwitfragmenten in de rRNA en ribosomen van E. cuniculi compenseren, binden aan microsporidia-specifieke residuen in de uL15- en eL30-eiwitten. Dit suggereert dat de binding van kleine moleculen aan ribosomen een product kan zijn van positieve selectie, waarbij microsporidia-specifieke mutaties in ribosomale eiwitten zijn geselecteerd op hun vermogen om de affiniteit van ribosomen voor kleine moleculen te verhogen, wat kan leiden tot efficiëntere ribosomale organismen. De ontdekking onthult een slimme innovatie in de moleculaire structuur van microbiële parasieten en geeft ons een beter begrip van hoe parasitaire moleculaire structuren hun functie behouden ondanks reductieve evolutie.
De identificatie van deze kleine moleculen is momenteel nog onduidelijk. Het is niet duidelijk waarom de aanwezigheid van deze kleine moleculen in de ribosomale structuur verschilt tussen microsporidia-soorten. In het bijzonder is het onduidelijk waarom nucleotidebinding wordt waargenomen in de ribosomen van E. cuniculi en P. locustae, en niet in de ribosomen van V. necatrix, ondanks de aanwezigheid van het F170-residu in de eL20- en K172-eiwitten van V. necatrix. Deze deletie kan worden veroorzaakt door residu 43 uL6 (gelegen naast de nucleotidebindingsholte), dat tyrosine is in V. necatrix en geen threonine in E. cuniculi en P. locustae. De omvangrijke aromatische zijketen van Tyr43 kan de nucleotidebinding verstoren door sterische hindering. Een andere mogelijkheid is dat de schijnbare nucleotide-deletie te wijten is aan de lage resolutie van cryo-EM-beelden, waardoor het modelleren van ribosomale fragmenten van V. necatrix wordt bemoeilijkt.
Aan de andere kant suggereert ons onderzoek dat het proces van genoomverval een inventieve kracht kan zijn. In het bijzonder wijst de structuur van het E. cuniculi-ribosoom erop dat het verlies van rRNA- en eiwitfragmenten in het microsporidia-ribosoom evolutionaire druk creëert die veranderingen in de ribosoomstructuur bevordert. Deze varianten bevinden zich ver van de actieve plaats van het ribosoom en lijken te helpen bij het behouden (of herstellen) van een optimale ribosoomassemblage die anders verstoord zou worden door verminderd rRNA. Dit suggereert dat een belangrijke innovatie van het microsporidia-ribosoom zich lijkt te hebben ontwikkeld tot een behoefte om gendrift te bufferen.
Dit wordt wellicht het best geïllustreerd door nucleotidebinding, iets wat tot nu toe nog nooit bij andere organismen is waargenomen. Het feit dat nucleotidebindende residuen aanwezig zijn in typische microsporidia, maar niet in andere eukaryoten, suggereert dat nucleotidebindingsplaatsen niet zomaar overblijfselen zijn die wachten om te verdwijnen, of de laatste plek waar rRNA wordt hersteld tot de vorm van individuele nucleotiden. In plaats daarvan lijkt deze plaats een nuttige eigenschap te zijn die zich in de loop van meerdere rondes van positieve selectie zou kunnen hebben ontwikkeld. Nucleotidebindingsplaatsen zijn mogelijk een bijproduct van natuurlijke selectie: zodra ES39L is afgebroken, worden microsporidia gedwongen compensatie te zoeken om de optimale ribosoombiogenese te herstellen in afwezigheid van ES39L. Omdat dit nucleotide de moleculaire contacten van het A3186-nucleotide in ES39L kan nabootsen, wordt het nucleotidemolecuul een bouwsteen van het ribosoom, waarvan de binding verder wordt verbeterd door mutatie van de eL30-sequentie.
Wat betreft de moleculaire evolutie van intracellulaire parasieten, toont ons onderzoek aan dat de krachten van Darwinistische natuurlijke selectie en genetische drift (genoomverval) niet parallel lopen, maar elkaar afwisselen. Ten eerste elimineert genetische drift belangrijke kenmerken van biomoleculen, waardoor compensatie hard nodig is. Pas wanneer parasieten aan deze behoefte voldoen door middel van Darwinistische natuurlijke selectie, krijgen hun macromoleculen de kans om hun meest indrukwekkende en innovatieve eigenschappen te ontwikkelen. Belangrijk is dat de evolutie van nucleotidebindingsplaatsen in het ribosoom van E. cuniculi suggereert dat dit patroon van verlies-naar-winst in de moleculaire evolutie niet alleen schadelijke mutaties amortiseert, maar soms ook geheel nieuwe functies verleent aan parasitaire macromoleculen.
Dit idee sluit aan bij Sewell Wrights theorie van het bewegende evenwicht, die stelt dat een strikt systeem van natuurlijke selectie het vermogen van organismen om te innoveren beperkt51,52,53. Als genetische drift echter de natuurlijke selectie verstoort, kunnen deze drifts veranderingen teweegbrengen die op zichzelf niet adaptief (of zelfs schadelijk) zijn, maar leiden tot verdere veranderingen die een hogere fitness of nieuwe biologische activiteit opleveren. Ons raamwerk ondersteunt dit idee door te illustreren dat hetzelfde type mutatie dat de vouwing en functie van een biomolecule vermindert, de belangrijkste trigger lijkt te zijn voor de verbetering ervan. In lijn met het win-win evolutionaire model laat onze studie zien dat genoomverval, traditioneel beschouwd als een degeneratief proces, ook een belangrijke drijfveer is voor innovatie, waardoor macromoleculen soms, en misschien zelfs vaak, nieuwe parasitaire activiteiten kunnen verwerven.