Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz. Kullandığınız tarayıcı sürümünün CSS desteği sınırlıdır. En iyi deneyim için, güncel bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da Uyumluluk Modunu devre dışı bırakmanızı) öneririz. Ayrıca, sürekli destek sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan gösteriyoruz.
Son zamanlarda, yapay su nanoyapıları (EWNS) kullanan nanoteknolojiye dayalı, kimyasal içermeyen bir antimikrobiyal platform geliştirilmiştir. EWNS'ler yüksek yüzey yüküne sahiptir ve gıda kaynaklı patojenler de dahil olmak üzere birçok mikroorganizmayla etkileşime girip onları etkisiz hale getirebilen reaktif oksijen türleri (ROS) bakımından zengindir. Burada, sentez sırasında özelliklerinin ince ayarlanarak antibakteriyel potansiyellerinin daha da artırılabileceği gösterilmiştir. EWNS laboratuvar platformu, sentez parametreleri değiştirilerek EWNS'lerin özelliklerinin ince ayarlanması için tasarlanmıştır. EWNS özelliklerinin (yük, boyut ve ROS içeriği) karakterizasyonu modern analitik yöntemler kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Ek olarak, Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocua, Mycobacterium para fortitum ve Saccharomyces cerevisiae gibi gıda mikroorganizmaları, mikrobiyal etkisizleştirme potansiyellerini değerlendirmek için organik üzüm domateslerinin yüzeyine aşılanmıştır. Burada sunulan sonuçlar, EWNS'nin özelliklerinin sentez sırasında ince ayarlanabileceğini ve bunun da inaktivasyon verimliliğinde üstel bir artışa yol açtığını göstermektedir. Özellikle, yüzey yükü dört kat artmış ve ROS içeriği de artmıştır. Mikrobiyal uzaklaştırma oranı mikrobiyal türe bağlıydı ve 40.000 #/cm3 EWNS aerosol dozuna 45 dakika maruz kaldıktan sonra 1,0 ile 3,8 log arasında değişmiştir.
Mikrobiyal kontaminasyon, patojenlerin veya toksinlerinin yutulması sonucu oluşan gıda kaynaklı hastalıkların ana nedenidir. Yalnızca Amerika Birleşik Devletleri'nde her yıl yaklaşık 76 milyon hastalık, 325.000 hastaneye yatış ve 5.000 ölüm gıda kaynaklı hastalıklardan kaynaklanmaktadır¹. Ayrıca, Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı (USDA), taze ürün tüketimindeki artışın Amerika Birleşik Devletleri'nde bildirilen tüm gıda kaynaklı hastalıkların %48'inden sorumlu olduğunu tahmin etmektedir². Amerika Birleşik Devletleri'nde gıda kaynaklı patojenlerden kaynaklanan hastalık ve ölümlerin maliyeti çok yüksektir; Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri (CDC) tarafından yılda 15,6 milyar ABD dolarından fazla olarak tahmin edilmektedir³.
Şu anda, gıda güvenliğini sağlamak için kimyasal4, radyasyon5 ve termal6 antimikrobiyal müdahaleler, taze ürünlerin çapraz kontaminasyona maruz kalmasına neden olacak şekilde sürekli olarak uygulanmak yerine, üretim zincirindeki sınırlı kritik kontrol noktalarında (genellikle hasattan sonra ve/veya paketleme sırasında) uygulanmaktadır.7 Gıda kaynaklı hastalıkları ve gıda bozulmasını daha iyi kontrol etmek için antimikrobiyal müdahalelere ihtiyaç duyulmaktadır ve bu müdahaleler, çiftlikten sofraya kadar olan tüm süreçte uygulanma potansiyeline sahiptir. Daha az etki ve maliyet.
Son zamanlarda, yapay su nanoyapıları (EWNS) kullanılarak yüzeylerde ve havada bulunan bakterileri etkisiz hale getirmek için nanoteknoloji tabanlı, kimyasal içermeyen bir antimikrobiyal platform geliştirilmiştir. EWNS sentezi için iki paralel işlem kullanılmıştır: elektrosprey ve su iyonizasyonu (Şekil 1a). EWNS'lerin daha önce benzersiz bir dizi fiziksel ve biyolojik özelliğe sahip olduğu gösterilmiştir8,9,10. EWNS'ler yapı başına ortalama 10 elektrona ve ortalama 25 nm nanometre boyutuna sahiptir (Şekil 1b,c)8,9,10. Ek olarak, elektron spin rezonansı (ESR), EWNS'lerin büyük miktarda reaktif oksijen türü (ROS), esas olarak hidroksil (OH•) ve süperoksit (O2-) radikalleri içerdiğini göstermiştir (Şekil 1c)8. EWNS uzun süre havada kalabiliyor ve havada asılı bulunan ve yüzeylerde bulunan mikroplarla çarpışarak ROS yüklerini iletebiliyor ve mikrobiyal inaktivasyona neden olabiliyor (Şekil 1d). Bu önceki çalışmalar ayrıca EWNS'nin, yüzeylerde ve havada bulunan mikobakteriler de dahil olmak üzere, halk sağlığı açısından önemli çeşitli gram-negatif ve gram-pozitif bakterilerle etkileşime girip onları inaktive edebildiğini göstermiştir8,9. İletim elektron mikroskobu, inaktivasyonun hücre zarının bozulmasından kaynaklandığını göstermiştir. Ek olarak, akut inhalasyon çalışmaları, yüksek dozda EWNS'nin akciğer hasarına veya inflamasyona neden olmadığını göstermiştir8.
(a) Sıvı içeren bir kılcal boru ile karşı elektrot arasına yüksek voltaj uygulandığında elektrosprey oluşur. (b) Yüksek voltaj uygulanması iki farklı olaya yol açar: (i) suyun elektrospreylenmesi ve (ii) EWNS'de hapsolmuş reaktif oksijen türlerinin (iyonların) oluşumu. (c) EWNS'nin benzersiz yapısı. (d) EWNS, nano ölçekli yapısı nedeniyle oldukça hareketlidir ve havada bulunan patojenlerle etkileşime girebilir.
EWNS antimikrobiyal platformunun, taze gıdaların yüzeyindeki gıda kaynaklı mikroorganizmaları etkisiz hale getirme yeteneği de yakın zamanda gösterilmiştir. Ayrıca, EWNS yüzey yükünün, hedefli dağıtım için elektrik alanı ile birlikte kullanılabileceği de gösterilmiştir. Daha da önemlisi, yaklaşık 50.000#/cm311 konsantrasyonunda EWNS'ye maruz kalmanın 90 dakikası içinde, E. coli ve Listeria gibi çeşitli gıda mikroorganizmalarına karşı organik domates aktivitesinde yaklaşık 1,4 log azalma şeklinde umut verici bir ilk sonuç gözlemlenmiştir. Ek olarak, ön değerlendirme testleri, kontrol domatesine kıyasla herhangi bir organoleptik etki göstermemiştir. Bu ilk etkisizleştirme sonuçları, 50.000#/cm3 gibi çok düşük EWNS dozlarında bile gıda güvenliğini vaat etse de, enfeksiyon ve bozulma riskini daha da azaltmak için daha yüksek bir etkisizleştirme potansiyelinin daha faydalı olacağı açıktır.
Burada, antibakteriyel potansiyellerini artırmak için EWNS sentez parametrelerini hassas bir şekilde ayarlamak ve fizikokimyasal özelliklerini optimize etmek amacıyla bir EWNS üretim platformunun geliştirilmesine odaklanacağız. Özellikle, optimizasyon, yüzey yüklerini (hedefli dağıtımı iyileştirmek için) ve ROS içeriğini (inaktivasyon verimliliğini iyileştirmek için) artırmaya odaklanmıştır. Optimize edilmiş fizikokimyasal özelliklerin (boyut, yük ve ROS içeriği) karakterizasyonu, E. coli, S. enterica, L. innocua, S. cerevisiae ve M. parafortuitum gibi yaygın gıda mikroorganizmaları kullanılarak modern analitik yöntemlerle gerçekleştirilecektir.
EVNS, yüksek saflıktaki suyun (18 MΩ cm–1) eş zamanlı elektro püskürtme ve iyonizasyonu ile sentezlendi. Elektrikli atomizör 12, tipik olarak sıvıları ve kontrollü boyuttaki sentetik polimer ve seramik parçacıkları 13 ve lifleri 14 atomize etmek için kullanılır.
Önceki yayınlarda 8, 9, 10, 11 ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, tipik bir deneyde, metal bir kılcal boru ile topraklanmış bir karşı elektrot arasına yüksek bir voltaj uygulanır. Bu işlem sırasında iki farklı olay meydana gelir: 1) elektrosprey ve 2) suyun iyonizasyonu. İki elektrot arasındaki güçlü bir elektrik alanı, yoğunlaşmış suyun yüzeyinde negatif yüklerin birikmesine neden olarak Taylor konilerinin oluşmasına yol açar. Sonuç olarak, Rayleigh teorisine göre 16 daha küçük parçacıklara ayrılmaya devam eden yüksek yüklü su damlacıkları oluşur. Aynı zamanda, güçlü bir elektrik alanı, su moleküllerinin bir kısmının parçalanmasına ve elektronlarını koparmasına (iyonizasyon) neden olarak büyük miktarda reaktif oksijen türü (ROS) 17 üretir. Eş zamanlı olarak üretilen ROS 18 paketleri EWNS'ye kapsüllenmiştir (Şekil 1c).
Şekil 2a'da, bu çalışmada EWNS sentezinde geliştirilen ve kullanılan EWNS üretim sistemi gösterilmektedir. Kapalı bir şişede depolanan saflaştırılmış su, bir Teflon tüp (2 mm iç çap) aracılığıyla 30G paslanmaz çelik bir iğneye (metal kılcal boru) beslenmiştir. Şekil 2b'de gösterildiği gibi, su akışı şişenin içindeki hava basıncı ile kontrol edilmektedir. İğne, karşı elektrottan belirli bir mesafeye manuel olarak ayarlanabilen bir Teflon konsola bağlıdır. Karşı elektrot, ortasında örnekleme için bir delik bulunan cilalı bir alüminyum disktir. Karşı elektrotun altında, örnekleme portu aracılığıyla deney düzeneğinin geri kalanına bağlanan bir alüminyum örnekleme hunisi bulunmaktadır (Şekil 2b). Tüm örnekleme bileşenleri, parçacık örneklemesini bozabilecek yük birikimini önlemek için elektriksel olarak topraklanmıştır.
(a) Mühendislik ürünü Su Nanoyapısı Üretim Sistemi (EWNS). (b) En önemli parametreleri gösteren numune alma cihazı ve elektrosprey ünitesinin kesiti. (c) Bakteri inaktivasyonu için deneysel düzenek.
Yukarıda açıklanan EWNS üretim sistemi, EWNS özelliklerinin ince ayarını kolaylaştırmak için temel çalışma parametrelerini değiştirebilme özelliğine sahiptir. EWNS özelliklerini ince ayarlamak için uygulanan voltajı (V), iğne ile karşı elektrot arasındaki mesafeyi (L) ve kılcal borudan geçen su akışını (φ) ayarlayın. [V (kV), L (cm)] sembolleri farklı kombinasyonları belirtmek için kullanılır. Belirli bir [V, L] kümesinde kararlı bir Taylor konisi elde etmek için su akışını ayarlayın. Bu çalışma için, karşı elektrotun açıklığı (D) 0,5 inç (1,29 cm) olarak ayarlanmıştır.
Sınırlı geometri ve asimetri nedeniyle, elektrik alan şiddeti temel prensiplerden hesaplanamaz. Bunun yerine, elektrik alanı hesaplamak için QuickField™ yazılımı (Svendborg, Danimarka)19 kullanılmıştır. Elektrik alanı homojen olmadığından, kılcal borunun ucundaki elektrik alan değeri çeşitli konfigürasyonlar için referans değer olarak kullanılmıştır.
Çalışma sırasında, iğne ile karşı elektrot arasındaki voltaj ve mesafe kombinasyonlarının Taylor konisi oluşumu, Taylor konisi stabilitesi, EWNS üretim stabilitesi ve tekrarlanabilirliği açısından değerlendirilmesi yapılmıştır. Çeşitli kombinasyonlar Ek Tablo S1'de gösterilmiştir.
EWNS üretim sisteminin çıkışı, parçacık sayısı konsantrasyonunu ölçmek için doğrudan bir Tarama Hareketliliği Parçacık Boyutlandırıcısına (SMPS, model 3936, TSI, Shoreview, Minnesota) bağlandı ve aerosol akışlarını ölçmek için bir Faraday aerosol elektrometresi (TSI, model 3068B, Shoreview, ABD, MN) ile birlikte kullanıldı, önceki yayınımızda açıklandığı gibi9. Hem SMPS hem de aerosol elektrometresi 0,5 L/dak akış hızında örnekleme yaptı (toplam örnekleme akışı 1 L/dak). Parçacık konsantrasyonları ve aerosol akışları 120 saniye boyunca ölçüldü. Ölçüm 30 kez tekrarlandı. Toplam aerosol yükü mevcut ölçümlerden hesaplandı ve ortalama EWNS yükü, örneklenen toplam EWNS parçacık sayısından tahmin edildi. EWNS'nin ortalama maliyeti Denklem (1) kullanılarak hesaplanabilir:
Burada IEl ölçülen akımı, NSMPS SMPS ile ölçülen sayı konsantrasyonunu ve φEl elektrometreye akan akış hızını temsil etmektedir.
Bağıl nem (RH) yüzey yükünü etkilediğinden, deney süresince sıcaklık ve bağıl nem sırasıyla 21°C ve %45'te sabit tutuldu.
EWNS'nin boyutunu ve ömrünü ölçmek için atomik kuvvet mikroskobu (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, CA) ve AC260T probu (Olympus, Tokyo, Japonya) kullanıldı. AFM tarama hızı 1 Hz ve tarama alanı 5 µm × 5 µm olup 256 tarama çizgisine sahiptir. Tüm görüntüler, Asylum yazılımı kullanılarak birinci dereceden görüntü hizalamasına tabi tutuldu (100 nm aralıklı maske ve 100 pm eşik değeri).
Örnekleme hunisini çıkarın ve parçacıkların birleşmesini ve mika yüzeyinde düzensiz damlacıkların oluşmasını önlemek için mika yüzeyini karşı elektrottan 2,0 cm uzaklığa ortalama 120 saniye süreyle yerleştirin. EWNS, taze kesilmiş mika yüzeylerine doğrudan uygulandı (Ted Pella, Redding, CA). Püskürtme işleminden hemen sonra, mika yüzeyi AFM kullanılarak görüntülendi. Taze kesilmiş, modifiye edilmemiş mikanın yüzey temas açısı 0°'ye yakındır, bu nedenle EWNS, mika yüzeyinde kubbeli bir şekilde yayılır20. Difüzyon yapan damlacıkların çapı (a) ve yüksekliği (h), AFM topografisinden doğrudan ölçüldü ve daha önce doğrulanmış yöntemimiz8 kullanılarak kubbeli difüzyon hacmi EWNS'yi hesaplamak için kullanıldı. Yerleşik EVNS'nin aynı hacme sahip olduğu varsayılarak, eşdeğer çap denklem (2)'den hesaplanabilir:
Daha önce geliştirdiğimiz yönteme uygun olarak, EWNS'deki kısa ömürlü radikal ara ürünlerin varlığını tespit etmek için bir elektron spin rezonansı (ESR) spin kapanı kullanıldı. Aerosoller, 235 mM DEPMPO (5-(dietoksifosforil)-5-metil-1-pirolin-N-oksit) (Oxis International Inc., Portland, Oregon) içeren bir çözeltiden geçirildi. Tüm EPR ölçümleri, bir Bruker EMX spektrometresi (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, ABD) ve düz hücre dizileri kullanılarak gerçekleştirildi. Verilerin toplanması ve analizi için Acquisit yazılımı (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, ABD) kullanıldı. ROS karakterizasyonu yalnızca belirli çalışma koşulları [-6,5 kV, 4,0 cm] için gerçekleştirildi. EWNS konsantrasyonları, darbe cihazındaki EWNS kaybı dikkate alındıktan sonra SMPS kullanılarak ölçüldü.
Ozon seviyeleri, 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Co)8,9,10 kullanılarak izlendi.
Tüm EWNS özellikleri için ölçüm değeri, ölçümlerin ortalamasıdır ve ölçüm hatası standart sapmadır. Optimize edilmiş EWNS özelliğinin değerini, temel EWNS'nin karşılık gelen değeriyle karşılaştırmak için t-testi yapılmıştır.
Şekil 2c, EWNS11'i yüzeylere hedeflemek için kullanılabilen, daha önce geliştirilmiş ve karakterize edilmiş bir Elektrostatik Çökeltme Geçiş Sistemi (EPES) göstermektedir. EPES, EWNS yükünü güçlü bir elektrik alanı ile birleştirerek doğrudan hedefin yüzeyine "yönlendirir". EPES sisteminin detayları, Pyrgiotakis ve ark. tarafından yakın zamanda yayınlanan bir makalede sunulmuştur.11 Buna göre, EPES, ortasında 15,24 cm aralıkla yerleştirilmiş iki paralel paslanmaz çelik (304 paslanmaz çelik, ayna cilalı) metal plaka içeren, konik uçlu 3 boyutlu yazıcıda üretilmiş bir PVC hazneden oluşmaktadır. Plakalar harici bir yüksek voltaj kaynağına (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY) bağlanmıştır; alt plaka her zaman pozitif, üst plaka ise her zaman topraklanmıştır (yüzer). Hazne duvarları, parçacık kaybını önlemek için elektriksel olarak topraklanmış alüminyum folyo ile kaplanmıştır. Hazne, test yüzeylerinin plastik raflara yerleştirilmesine olanak tanıyan ve yüksek voltaj girişimini önlemek için alt metal plakadan kaldıran, sızdırmaz bir ön yükleme kapısına sahiptir.
EWNS'nin EPES içindeki birikim verimliliği, Ek Şekil S111'de ayrıntıları verilen daha önce geliştirilmiş bir protokole göre hesaplandı.
Kontrol odası olarak, silindirik odadan geçen ikinci akış, EWNS'yi uzaklaştırmak için ara bir HEPA filtresi kullanılarak EPES sistemiyle seri olarak bağlanmıştır. Şekil 2c'de gösterildiği gibi, EWNS aerosolü seri olarak bağlanmış iki odadan pompalanmıştır. Kontrol odası ile EPES arasındaki filtre, kalan EWNS'yi uzaklaştırarak aynı sıcaklık (T), bağıl nem (RH) ve ozon seviyelerini sağlar.
Escherichia coli (ATCC #27325) (fekal bir gösterge), Salmonella enterica (ATCC #53647) (gıda kaynaklı bir patojen), Listeria innocua (ATCC #33090) (patojenik Listeria monocytogenes'e alternatif), Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098) (bozulmaya neden olan mayaya alternatif) ve Mycobacterium parafortuitous (ATCC #19686) (daha dirençli canlı bakteri) gibi önemli gıda kaynaklı mikroorganizmaların taze ürünlerde kontamine olduğu tespit edilmiştir ve bu mikroorganizmalar ATCC'den (Manassas, Virginia) satın alınmıştır.
Yerel pazarınızdan rastgele organik üzüm domates kutuları satın alın ve kullanana kadar (en fazla 3 gün) 4°C'de buzdolabında saklayın. Deneme için yaklaşık 1/2 inç çapında tek bir boyutta domates seçin.
İnkübasyon, aşılama, maruz bırakma ve koloni sayımı protokolleri önceki yayınlarımızda ayrıntılı olarak açıklanmış ve Ek Veri 11'de detaylı olarak izah edilmiştir. EWNS performansı, aşılanmış domateslerin 40.000 #/cm3'e 45 dakika süreyle maruz bırakılmasıyla değerlendirilmiştir. Kısaca, t = 0 dakika anında, hayatta kalan mikroorganizmaların değerlendirilmesi için üç domates kullanılmıştır. Üç domates EPES'e yerleştirilmiş ve 40.000 #/cm3'te EWNS'ye maruz bırakılmıştır (EWNS'ye maruz bırakılan domatesler) ve diğer üçü kontrol odasına yerleştirilmiştir (kontrol domatesleri). Domates gruplarının hiçbirine ek işlem uygulanmamıştır. EWNS'ye maruz bırakılan domatesler ve kontroller, EWNS'nin etkisini değerlendirmek için 45 dakika sonra çıkarılmıştır.
Her deney üçer kez tekrarlandı. Veri analizi, Ek Verilerde açıklanan protokole göre gerçekleştirildi.
EWNS'ye (45 dakika, EWNS aerosol konsantrasyonu 40.000 #/cm3) maruz bırakılan ve bırakılmayan E. coli, Enterobacter ve L. innocua bakteri örnekleri, inaktivasyon mekanizmalarını değerlendirmek için çökeltildi. Çökelti, oda sıcaklığında 2 saat boyunca %2,5 glutaraldehit, %1,25 paraformaldehit ve %0,03 pikrik asit içeren bir sabitleyici ile 0,1 M sodyum kakodilat çözeltisinde (pH 7,4) sabitlendi. Yıkandıktan sonra, 2 saat boyunca %1 osmiyum tetroksit (OsO4)/%1,5 potasyum ferrosiyanür (KFeCN6) ile sabitlendi, 3 kez suyla yıkandı ve 1 saat boyunca %1 uranil asetatta inkübe edildi, ardından iki kez suyla yıkandı. Daha sonra %50, %70, %90 ve %100 alkolde her biri 10 dakika süreyle dehidrasyon uygulandı. Numuneler daha sonra 1 saat süreyle propilen oksit içine yerleştirildi ve propilen oksit ile TAAP Epon'un (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA) 1:1 karışımıyla emprenye edildi. Numuneler TAAB Epon'a gömüldü ve 60°C'de 48 saat süreyle polimerize edildi. Kürlenmiş granüler reçine kesildi ve AMT 2k CCD kamera (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, MA, ABD) ile donatılmış geleneksel bir transmisyon elektron mikroskobu olan JEOL 1200EX (JEOL, Tokyo, Japonya) kullanılarak TEM ile görüntülendi.
Tüm deneyler üçer kez tekrarlandı. Her zaman noktası için, bakteri yıkamaları üçer kez plaklara ekildi ve bu da her nokta için toplam dokuz veri noktasıyla sonuçlandı; bu verilerin ortalaması, ilgili organizmanın bakteri konsantrasyonu olarak kullanıldı. Standart sapma, ölçüm hatası olarak kullanıldı. Tüm noktalar dikkate alındı.
Bakteri konsantrasyonundaki azalmanın t = 0 dakikaya göre logaritması aşağıdaki formül kullanılarak hesaplandı:
Burada C0, 0 anındaki (yani yüzey kuruduktan sonra ancak odaya yerleştirilmeden önceki) kontrol örneğindeki bakteri konsantrasyonunu ve Cn ise n dakika maruz kalma süresinden sonra yüzeydeki bakteri konsantrasyonunu ifade eder.
45 dakikalık maruz kalma süresi boyunca bakterilerin doğal bozunmasını hesaba katmak için, 45. dakikadaki kontrol grubuna kıyasla Log-Azalma aşağıdaki gibi hesaplanmıştır:
Burada Cn, n anındaki kontrol örneğindeki bakteri konsantrasyonunu ve Cn-Control ise n anındaki kontrol bakterilerinin konsantrasyonunu ifade eder. Veriler, kontrole (EWNS maruziyeti yok) kıyasla logaritmik azalma olarak sunulmuştur.
Çalışma sırasında, iğne ile karşı elektrot arasındaki voltaj ve mesafe kombinasyonlarının Taylor konisi oluşumu, Taylor konisi stabilitesi, EWNS üretim stabilitesi ve tekrarlanabilirliği açısından değerlendirilmesi yapılmıştır. Çeşitli kombinasyonlar Ek Tablo S1'de gösterilmiştir. Kararlı ve tekrarlanabilir özellikler (Taylor konisi, EWNS üretimi ve zaman içindeki stabilite) gösteren iki durum, kapsamlı bir çalışma için seçilmiştir. Şekil 3'te, iki durum için ROS'un yükü, boyutu ve içeriği ile ilgili sonuçlar gösterilmektedir. Sonuçlar ayrıca Tablo 1'de özetlenmiştir. Referans olarak, Şekil 3 ve Tablo 1, daha önce sentezlenen optimize edilmemiş EWNS8, 9, 10, 11'in (temel EWNS) özelliklerini içermektedir. İki kuyruklu t-testi kullanılarak yapılan istatistiksel anlamlılık hesaplamaları Ek Tablo S2'de yeniden yayınlanmıştır. Ek olarak, karşı elektrot örnekleme deliği çapının (D) ve topraklama elektrodu ile iğne ucu arasındaki mesafenin (L) etkisine ilişkin çalışmalar da ek veriler arasında yer almaktadır (Ek Şekiller S2 ve S3).
(a–c) AFM boyut dağılımı. (d – f) Yüzey yükü karakteristiği. (g) ROS ve ESR karakterizasyonu.
Ayrıca, yukarıdaki tüm koşullar için ölçülen iyonizasyon akımlarının 2-6 µA aralığında ve voltajların -3,8 ila -6,5 kV aralığında olduğunu ve bunun sonucunda bu tek terminalli EWNS üretim modülü için güç tüketiminin 50 mW'tan az olduğunu belirtmek de önemlidir. EWNS yüksek basınç altında sentezlenmesine rağmen, ozon seviyeleri çok düşüktü ve asla 60 ppb'yi aşmadı.
Ek Şekil S4, sırasıyla [-6,5 kV, 4,0 cm] ve [-3,8 kV, 0,5 cm] senaryoları için simüle edilmiş elektrik alanlarını göstermektedir. [-6,5 kV, 4,0 cm] ve [-3,8 kV, 0,5 cm] senaryolarına göre alanlar sırasıyla 2 × 10⁵ V/m ve 4,7 × 10⁵ V/m olarak hesaplanmıştır. Bu, ikinci durumda gerilim/mesafe oranının çok daha yüksek olması nedeniyle beklenen bir sonuçtur.
Şekil 3a,b'de AFM8 ile ölçülen EWNS çapı gösterilmektedir. [-6,5 kV, 4,0 cm] ve [-3,8 kV, 0,5 cm] senaryoları için ortalama EWNS çapları sırasıyla 27 nm ve 19 nm olarak hesaplanmıştır. [-6,5 kV, 4,0 cm] ve [-3,8 kV, 0,5 cm] durumları için dağılımların geometrik standart sapmaları sırasıyla 1,41 ve 1,45 olup, dar bir boyut dağılımını göstermektedir. Hem ortalama boyut hem de geometrik standart sapma, sırasıyla 25 nm ve 1,41 olan temel EWNS'ye çok yakındır. Şekil 3c'de aynı yöntem ve aynı koşullar altında ölçülen temel EWNS'nin boyut dağılımı gösterilmektedir.
Şekil 3d,e'de yük karakterizasyonunun sonuçları gösterilmektedir. Veriler, konsantrasyon (#/cm3) ve akım (I) değerlerinin 30 eş zamanlı ölçümünün ortalama değerleridir. Analiz, EWNS üzerindeki ortalama yükün [-6,5 kV, 4,0 cm] ve [-3,8 kV, 0,5 cm] için sırasıyla 22 ± 6 e- ve 44 ± 6 e- olduğunu göstermektedir. Temel EWNS'ye (10 ± 2 e-) kıyasla, yüzey yükleri önemli ölçüde daha yüksektir; [-6,5 kV, 4,0 cm] senaryosunun iki katı ve [-3,8 kV, 0,5 cm] senaryosunun dört katıdır. 3f, temel EWNS ödeme verilerini göstermektedir.
EWNS sayı konsantrasyon haritalarından (Ek Şekiller S5 ve S6), [-6,5 kV, 4,0 cm] sahnesinin [-3,8 kV, 0,5 cm] sahnesine göre önemli ölçüde daha fazla parçacık içerdiği görülebilir. Ayrıca, EWNS sayı konsantrasyonlarının 4 saate kadar izlendiği (Ek Şekiller S5 ve S6) ve EWNS üretim kararlılığının her iki durumda da aynı parçacık sayı konsantrasyon seviyelerini gösterdiği de belirtilmelidir.
Şekil 3g, optimize edilmiş EWNS için [-6,5 kV, 4,0 cm]'de kontrol (arka plan) çıkarıldıktan sonraki EPR spektrumunu göstermektedir. ROS spektrumu ayrıca daha önce yayınlanmış bir makaledeki EWNS temel çizgisiyle de karşılaştırılmıştır. Spin tuzağıyla reaksiyona giren EWNS sayısı 7,5 × 104 EWNS/s olarak hesaplanmıştır ve bu, daha önce yayınlanmış Baseline-EWNS8 ile benzerdir. EPR spektrumları, O2-'nin baskın olduğu, OH•'nin ise daha az miktarda bulunduğu iki tip ROS'un varlığını açıkça göstermiştir. Ek olarak, tepe yoğunluklarının doğrudan karşılaştırılması, optimize edilmiş EWNS'nin temel çizgi EWNS'ye kıyasla önemli ölçüde daha yüksek bir ROS içeriğine sahip olduğunu göstermiştir.
Şekil 4'te, EPES'te EWNS'nin biriktirme verimliliği gösterilmektedir. Veriler ayrıca Tablo I'de özetlenmiş ve orijinal EWNS verileriyle karşılaştırılmıştır. Her iki EUNS durumu için de, 3,0 kV gibi düşük bir voltajda bile biriktirme %100'e yakındı. Tipik olarak, yüzey yükü değişiminden bağımsız olarak %100 biriktirme elde etmek için 3,0 kV yeterlidir. Aynı koşullar altında, Baseline-EWNS'nin biriktirme verimliliği, daha düşük yük nedeniyle (EWNS başına ortalama 10 elektron) yalnızca %56 idi.
Şekil 5 ve Tablo 2, optimum senaryoda [-6,5 kV, 4,0 cm] yaklaşık 40.000 #/cm3 EWNS'ye 45 dakika maruz kaldıktan sonra domates yüzeyine aşılanan mikroorganizmaların inaktivasyon derecesini özetlemektedir. Aşılanan E. coli ve L. innocua, 45 dakikalık maruz kalmanın ardından 3,8 log'luk önemli bir azalma göstermiştir. Aynı koşullar altında, S. enterica daha düşük bir log azalması (2,2 log) gösterirken, S. cerevisiae ve M. parafortuitum 1,0 log azalma göstermiştir.
EWNS'nin E. coli, Salmonella enterica ve L. innocua hücrelerinde inaktivasyona yol açan fiziksel değişikliklerini gösteren elektron mikrografları (Şekil 6). Kontrol bakterilerinin hücre zarları sağlamken, maruz kalan bakterilerin dış zarları hasar görmüştür.
Kontrol ve maruz bırakılan bakterilerin elektron mikroskobik görüntülemesi, zar hasarını ortaya çıkardı.
Optimize edilmiş EWNS'nin fizikoşimik özelliklerine ilişkin veriler, EWNS özelliklerinin (yüzey yükü ve ROS içeriği) daha önce yayınlanan EWNS temel verilerine kıyasla önemli ölçüde iyileştirildiğini göstermektedir8,9,10,11. Öte yandan, boyutları nanometre aralığında kalmıştır; bu da daha önce yayınlanan sonuçlara çok benzerdir ve havada uzun süre kalmalarını sağlar. Gözlemlenen polidispersite, Rayleigh etkisinin büyüklüğünü, rastgeleliği ve EWNS'nin potansiyel birleşmesini belirleyen yüzey yükündeki değişikliklerle açıklanabilir. Bununla birlikte, Nielsen ve ark.22 tarafından ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, yüksek yüzey yükü, su damlasının yüzey enerjisini/gerilimini etkili bir şekilde artırarak buharlaşmayı azaltır. Bu teori, mikro damlacıklar22 ve önceki yayınımızda8 EWNS için deneysel olarak doğrulanmıştır. Zamanla meydana gelen kayıplar da boyutu etkileyebilir ve gözlemlenen boyut dağılımına katkıda bulunabilir.
Ek olarak, koşullara bağlı olarak yapı başına yük yaklaşık 22-44 e-'dir; bu, yapı başına ortalama 10 ± 2 elektron yüküne sahip olan temel EWNS'ye kıyasla önemli ölçüde daha yüksektir. Bununla birlikte, bunun EWNS'nin ortalama yükü olduğunu belirtmek gerekir. Seto ve ark. tarafından yükün homojen olmadığı ve log-normal bir dağılım izlediği gösterilmiştir21. Önceki çalışmamıza kıyasla, yüzey yükünün iki katına çıkarılması, EPES sistemindeki biriktirme verimliliğini neredeyse %100'e çıkarır11.