Vă mulțumim că ați vizitat Nature.com. Folosiți o versiune de browser cu suport CSS limitat. Pentru o experiență optimă, vă recomandăm să utilizați un browser actualizat (sau să dezactivați Modul de compatibilitate în Internet Explorer). În plus, pentru a asigura suport continuu, afișăm site-ul fără stiluri și JavaScript.
Recent, a fost dezvoltată o platformă antimicrobiană fără substanțe chimice, bazată pe nanotehnologie care utilizează nanostructuri artificiale de apă (EWNS). EWNS au o sarcină superficială ridicată și sunt bogate în specii reactive de oxigen (ROS) care pot interacționa cu și inactiva o serie de microorganisme, inclusiv agenți patogeni transmiși prin alimente. Aici se demonstrează că proprietățile lor în timpul sintezei pot fi ajustate fin și optimizate pentru a le spori și mai mult potențialul antibacterian. Platforma de laborator EWNS a fost concepută pentru a ajusta fin proprietățile EWNS prin modificarea parametrilor de sinteză. Caracterizarea proprietăților EWNS (sarcină, dimensiune și conținut de ROS) a fost efectuată folosind metode analitice moderne. În plus, microorganisme alimentare precum Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocua, Mycobacterium para fortitum și Saccharomyces cerevisiae au fost inoculate pe suprafața roșiilor organice pentru a evalua potențialul lor de inactivare microbiană. Rezultatele prezentate aici demonstrează că proprietățile EWNS pot fi ajustate fin în timpul sintezei, rezultând o creștere exponențială a eficienței inactivării. În special, sarcina superficială a crescut cu un factor de patru, iar conținutul de ROS a crescut. Rata de îndepărtare microbiană a fost dependentă de microbi și a variat de la 1,0 la 3,8 log după 45 de minute de expunere la o doză de aerosol de 40.000 #/cm3 EWNS.
Contaminarea microbiană este principala cauză a bolilor transmise prin alimente, cauzate de ingerarea de agenți patogeni sau a toxinelor acestora. Bolile transmise prin alimente sunt responsabile pentru aproximativ 76 de milioane de boli, 325.000 de spitalizări și 5.000 de decese în fiecare an numai în Statele Unite1. În plus, Departamentul Agriculturii al Statelor Unite (USDA) estimează că creșterea consumului de produse proaspete este responsabilă pentru 48% din totalul bolilor transmise prin alimente raportate în Statele Unite2. Costul bolilor și al deceselor cauzate de agenți patogeni transmisi prin alimente în Statele Unite este foarte mare, estimat de Centrele pentru Controlul și Prevenirea Bolilor (CDC) la peste 15,6 miliarde USD pe an3.
În prezent, intervențiile antimicrobiene chimice4, radiative5 și termice6 pentru a asigura siguranța alimentară sunt implementate în principal la puncte critice de control (CCP) limitate în lanțul de producție (de obicei după recoltare și/sau în timpul ambalării), mai degrabă decât implementate continuu, astfel încât produsele proaspete să fie supuse contaminării încrucișate7. Intervențiile antimicrobiene sunt necesare pentru a controla mai bine bolile transmise prin alimente și alterarea alimentelor și au potențialul de a fi aplicate pe întregul continuum de la fermă la masă. Impact și costuri mai mici.
O platformă antimicrobiană fără substanțe chimice bazată pe nanotehnologie a fost recent dezvoltată pentru a inactiva bacteriile de pe suprafețe și din aer folosind nanostructuri artificiale de apă (EWNS). Pentru sinteza EVNS, au fost utilizate două procese paralele: electropulverizarea și ionizarea apei (Fig. 1a). Anterior, EWNS s-a dovedit a avea un set unic de proprietăți fizice și biologice8,9,10. EWNS are o medie de 10 electroni pe structură și o dimensiune medie nanometrică de 25 nm (Fig. 1b,c)8,9,10. În plus, rezonanța de spin electronic (ESR) a arătat că EWNS conțin o cantitate mare de specii reactive de oxigen (ROS), în principal radicali hidroxil (OH•) și superoxid (O2-) (Fig. 1c)8. EWNS au rămas în aer mult timp și s-au putut ciocni cu microbii suspendați în aer și prezenți pe suprafețe, livrând sarcina lor ROS și provocând inactivarea microbiană (Fig. 1d). Aceste studii anterioare au arătat, de asemenea, că EWNS pot interacționa cu și pot inactiva diverse bacterii gram-negative și gram-pozitive de importanță pentru sănătatea publică, inclusiv micobacterii, pe suprafețe și în aer8,9. Microscopia electronică de transmisie a arătat că inactivarea a fost cauzată de perturbarea membranei celulare. În plus, studiile de inhalare acută au arătat că doze mari de EWNS nu provoacă leziuni pulmonare sau inflamații8.
(a) Electropulverizarea are loc atunci când se aplică o tensiune înaltă între un capilar care conține lichid și un contraelectrod. (b) Aplicarea tensiunii înalte are ca rezultat două fenomene diferite: (i) electropulverizarea apei și (ii) generarea de specii reactive de oxigen (ioni) prinse în EWNS. (c) Structura unică a EWNS. (d) EWNS sunt foarte mobile datorită naturii lor nanoscale și pot interacționa cu agenți patogeni din aer.
Capacitatea platformei antimicrobiene EWNS de a inactiva microorganismele transmise prin alimente de pe suprafața alimentelor proaspete a fost, de asemenea, demonstrată recent. De asemenea, s-a demonstrat că încărcătura de suprafață EWNS poate fi utilizată în combinație cu un câmp electric pentru o administrare țintită. Mai important, s-a observat un rezultat inițial promițător de reducere de aproximativ 1,4 log a activității roșiilor organice împotriva diferitelor microorganisme alimentare, cum ar fi E. coli și Listeria, în decurs de 90 de minute de la expunerea la EWNS la o concentrație de aproximativ 50.000#/cm311. În plus, testele preliminare de evaluare organoleptică nu au arătat niciun efect organoleptic în comparație cu roșia de control. Deși aceste rezultate inițiale de inactivare promit siguranța alimentară chiar și la doze foarte mici de EWNS de 50.000#/cc. see, este clar că un potențial de inactivare mai mare ar fi mai benefic pentru a reduce în continuare riscul de infecție și alterare.
Aici, ne vom concentra cercetarea pe dezvoltarea unei platforme de generare de EWNS pentru a regla fin parametrii de sinteză și a optimiza proprietățile fizico-chimice ale EWNS pentru a le spori potențialul antibacterian. În special, optimizarea s-a concentrat pe creșterea sarcinii superficiale a acestora (pentru a îmbunătăți livrarea țintită) și a conținutului de ROS (pentru a îmbunătăți eficiența inactivării). Caracterizarea proprietăților fizico-chimice optimizate (dimensiune, sarcină și conținut de ROS) utilizând metode analitice moderne și microorganisme alimentare comune, cum ar fi E. coli, S. enterica, L. innocua, S. cerevisiae și M. parafortuitum.
EVNS a fost sintetizat prin electropulverizare și ionizare simultană a apei de înaltă puritate (18 MΩ cm–1). Atomizatorul electric 12 este de obicei utilizat pentru atomizarea lichidelor și a particulelor 13, precum și a fibrelor 14 de dimensiuni controlate, din polimeri sintetici și ceramice.
Așa cum este detaliat în publicațiile anterioare 8, 9, 10, 11, într-un experiment tipic, se aplică o tensiune înaltă între un capilar metalic și un contraelectrod împământat. În timpul acestui proces, au loc două fenomene diferite: 1) electropulverizare și 2) ionizarea apei. Un câmp electric puternic între cei doi electrozi determină acumularea de sarcini negative la suprafața apei condensate, rezultând formarea de conuri Taylor. Drept urmare, se formează picături de apă puternic încărcate, care continuă să se descompună în particule mai mici, conform teoriei Rayleigh16. În același timp, un câmp electric puternic determină divizarea și îndepărtarea electronilor de către unele dintre moleculele de apă (ionizare), generând astfel o cantitate mare de specii reactive de oxigen (ROS)17. Pachetele ROS18 generate simultan au fost încapsulate în EWNS (Fig. 1c).
În figura 2a este prezentat sistemul de generare EWNS dezvoltat și utilizat în sinteza EWNS din acest studiu. Apa purificată stocată într-o sticlă închisă a fost alimentată printr-un tub de teflon (diametru interior de 2 mm) către un ac din oțel inoxidabil de 30G (capilar metalic). După cum se arată în Figura 2b, debitul de apă este controlat de presiunea aerului din interiorul sticlei. Acul este atașat la o consolă de teflon care poate fi reglată manual la o anumită distanță față de contraelectrod. Contraelectrodul este un disc de aluminiu lustruit cu o gaură în mijloc pentru prelevare de probe. Sub contraelectrod se află o pâlnie de prelevare de probe din aluminiu, care este conectată la restul configurației experimentale printr-un port de prelevare de probe (Fig. 2b). Toate componentele eșantionatorului sunt împământate electric pentru a evita acumularea de sarcină care ar putea degrada eșantionarea particulelor.
(a) Sistem de generare a nanostructurilor de apă proiectate (EWNS). (b) Secțiune transversală a prelevătorului și a unității de electropulverizare care prezintă cei mai importanți parametri. (c) Configurație experimentală pentru inactivarea bacteriilor.
Sistemul de generare EWNS descris mai sus este capabil să modifice parametrii cheie de funcționare pentru a facilita reglarea fină a proprietăților EWNS. Ajustați tensiunea aplicată (V), distanța dintre ac și contraelectrod (L) și debitul de apă (φ) prin capilar pentru a regla fin caracteristicile EWNS. Simbolurile [V (kV), L (cm)] sunt utilizate pentru a desemna diferite combinații. Ajustați debitul de apă pentru a obține un con Taylor stabil cu un anumit set [V, L]. În scopul acestui studiu, deschiderea contraelectrodului (D) a fost setată la 0,5 inci (1,29 cm).
Din cauza geometriei limitate și a asimetriei, intensitatea câmpului electric nu poate fi calculată din principii fundamentale. În schimb, s-a utilizat software-ul QuickField™ (Svendborg, Danemarca)19 pentru calcularea câmpului electric. Câmpul electric nu este uniform, așadar valoarea câmpului electric la vârful capilarului a fost utilizată ca valoare de referință pentru diverse configurații.
În timpul studiului, au fost evaluate mai multe combinații de tensiune și distanță dintre ac și contraelectrod în ceea ce privește formarea conului Taylor, stabilitatea conului Taylor, stabilitatea producției EWNS și reproductibilitatea. Diverse combinații sunt prezentate în tabelul suplimentar S1.
Rezultatul sistemului de generare EWNS a fost conectat direct la un aparat de măsurare a dimensiunii particulelor cu mobilitate prin scanare (SMPS, model 3936, TSI, Shoreview, Minnesota) pentru a măsura concentrația numerică a particulelor și a fost utilizat cu un electrometru de aerosoli Faraday (TSI, model 3068B, Shoreview, SUA). MN) pentru a măsura fluxurile de aerosoli, așa cum este descris în publicația noastră anterioară9. Atât SMPS, cât și electrometrul de aerosoli au prelevat eșantion la un debit de 0,5 L/min (debit total al eșantionului 1 L/min). Concentrațiile de particule și fluxurile de aerosoli au fost măsurate timp de 120 s. Repetați măsurarea de 30 de ori. Încărcarea totală de aerosoli este calculată din măsurătorile curente, iar încărcătura medie EWNS este estimată din numărul total de particule EWNS prelevate. Costul mediu al EWNS poate fi calculat folosind ecuația (1):
unde IEl este curentul măsurat, NSMPS este concentrația numerică măsurată cu SMPS, iar φEl este debitul către electrometru.
Deoarece umiditatea relativă (UR) afectează sarcina superficială, temperatura și (UR) au fost menținute constante la 21°C și, respectiv, 45%, în timpul experimentului.
Microscopia cu forță atomică (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, CA) și sonda AC260T (Olympus, Tokyo, Japonia) au fost utilizate pentru a măsura dimensiunea și durata de viață a EWNS. Rata de scanare AFM este de 1 Hz, iar zona de scanare este de 5 µm × 5 µm cu 256 de linii de scanare. Toate imaginile au fost supuse alinierii de ordinul întâi a imaginilor folosind software-ul Asylum (mască cu un interval de 100 nm și un prag de 100 pm).
Îndepărtați pâlnia de prelevare a probelor și plasați suprafața de mică la o distanță de 2,0 cm de contraelectrod pentru o perioadă medie de 120 s pentru a evita coalescența particulelor și formarea de picături neregulate pe suprafața de mică. EWNS a fost aplicat direct pe suprafețele de mică proaspăt tăiate (Ted Pella, Redding, CA). Imediat după pulverizare, suprafața de mică a fost vizualizată folosind AFM. Unghiul de contact al suprafeței micii nemodificate proaspăt tăiate este aproape de 0°, astfel încât EWNS se propagă pe suprafața de mică într-o formă bombată20. Diametrul (a) și înălțimea (h) picăturilor difuzante au fost măsurate direct din topografia AFM și utilizate pentru a calcula volumul de difuzie bombat EWNS folosind metoda noastră validată anterior8. Presupunând că EVNS-ul de la bord are același volum, diametrul echivalent poate fi calculat din ecuația (2):
În conformitate cu metoda noastră dezvoltată anterior, a fost utilizată o capcană de spin cu rezonanță de spin electronic (ESR) pentru a detecta prezența intermediarilor radicalici cu viață scurtă în EWNS. Aerosolii au fost trecuți printr-o soluție care conține 235 mM DEPMPO (5-(dietoxifosforil)-5-metil-1-pirolină-N-oxid) (Oxis International Inc., Portland, Oregon). Toate măsurătorile EPR au fost efectuate utilizând un spectrometru Bruker EMX (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, SUA) și rețele de celule plate. Software-ul Acquisit (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, SUA) a fost utilizat pentru colectarea și analizarea datelor. Caracterizarea ROS a fost efectuată numai pentru un set de condiții de operare [-6,5 kV, 4,0 cm]. Concentrațiile de EWNS au fost măsurate utilizând SMPS după luarea în considerare a pierderii de EWNS în impact.
Nivelurile de ozon au fost monitorizate utilizând un monitor de ozon cu fascicul dual 205™ (2B Technologies, Boulder, Colorado)8,9,10.
Pentru toate proprietățile EWNS, valoarea măsurată este media măsurătorilor, iar eroarea de măsurare este deviația standard. A fost efectuat un test t pentru a compara valoarea atributului EWNS optimizat cu valoarea corespunzătoare a EWNS de bază.
Figura 2c prezintă un sistem de trecere prin precipitații electrostatice (EPES) dezvoltat și caracterizat anterior, care poate fi utilizat pentru a direcționa EWNS11 către suprafețe. EPES utilizează o sarcină EWNS în combinație cu un câmp electric puternic pentru a „indica” direct suprafața țintei. Detaliile sistemului EPES sunt prezentate într-o publicație recentă a lui Pyrgiotakis și colab.11. Astfel, EPES constă dintr-o cameră din PVC imprimată 3D cu capete conice care conțin două plăci metalice paralele din oțel inoxidabil (oțel inoxidabil 304, lustruit oglindă) la mijloc, la o distanță de 15,24 cm. Plăcile au fost conectate la o sursă externă de înaltă tensiune (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), placa de jos a fost întotdeauna pozitivă, iar placa de sus a fost întotdeauna legată la masă (plutitoare). Pereții camerei sunt acoperiți cu folie de aluminiu, care este legată la masă electric pentru a preveni pierderea de particule. Camera are o ușă frontală de încărcare etanșă, care permite plasarea suprafețelor de testare pe suporturi de plastic, ridicându-le de pe placa metalică de jos pentru a evita interferențele de înaltă tensiune.
Eficiența depunerii EWNS în EPES a fost calculată conform unui protocol dezvoltat anterior, detaliat în Figura suplimentară S111.
Ca o cameră de control, al doilea flux prin camera cilindrică este conectat în serie cu sistemul EPES folosind un filtru HEPA intermediar pentru a elimina EWNS. Așa cum se arată în fig. 2c, aerosolul EWNS a fost pompat prin două camere conectate în serie. Filtrul dintre camera de control și EPES elimină orice EWNS rămas, rezultând aceeași temperatură (T), umiditate relativă (RH) și niveluri de ozon.
S-a constatat că microorganisme importante transmise prin alimente contaminează produsele proaspete, cum ar fi Escherichia coli (ATCC #27325), un indicator fecal, Salmonella enterica (ATCC #53647), un agent patogen transmis prin alimente, Listeria innocua (ATCC #33090), o alternativă la Listeria monocytogenes, bacterie patogenă, Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098) ca alternativă la drojdia de alterare și Mycobacterium parafortuitous (ATCC #19686) ca bacterie vie mai rezistentă au fost achiziționate de la ATCC (Manassas, Virginia).
Cumpărați la întâmplare cutii de roșii organice de la piața locală și păstrați-le la frigider la 4°C până la utilizare (până la 3 zile). Selectați roșii pentru a experimenta, cu o singură dimensiune, de aproximativ 1,2 cm în diametru.
Protocoalele pentru incubare, inoculare, expunere și numărarea coloniilor au fost detaliate în publicațiile noastre anterioare și explicate în detaliu în Datele suplimentare 11. Performanța EWNS a fost evaluată prin expunerea roșiilor inoculate la 40.000 #/cm3 timp de 45 de minute. Pe scurt, la momentul t = 0 min, s-au folosit trei roșii pentru a evalua microorganismele supraviețuitoare. Trei roșii au fost plasate în EPES și expuse la EWNS la 40.000 #/cc (roșii expuse la EWNS), iar alte trei au fost plasate în camera de control (roșii de control). Niciunul dintre grupurile de roșii nu a fost supus unei procesări suplimentare. Roșiile expuse la EWNS și controalele au fost îndepărtate după 45 de minute pentru a evalua efectul EWNS.
Fiecare experiment a fost efectuat în triplicat. Analiza datelor a fost efectuată conform protocolului descris în Datele Suplimentare.
Probele bacteriene de E. coli, Enterobacter și L. innocua expuse la EWNS (45 min, concentrație de aerosol EWNS 40.000 #/cm3) și neexpuse au fost peletizate pentru a evalua mecanismele de inactivare. Precipitatul a fost fixat timp de 2 ore la temperatura camerei în soluție de cacodilat de sodiu 0,1 M (pH 7,4) cu un fixativ de glutaraldehidă 2,5%, paraformaldehidă 1,25% și acid picric 0,03%. După spălare, acestea au fost fixate cu tetroxid de osmiu (OsO4) 1%/ferocianură de potasiu (KFeCN6) 1,5% timp de 2 ore, spălate de 3 ori cu apă și incubate în acetat de uranil 1% timp de 1 oră, apoi spălate de două ori cu apă. Deshidratare ulterioară timp de 10 minute, fiecare cu alcool 50%, 70%, 90%, 100%. Probele au fost apoi plasate în oxid de propilenă timp de 1 oră și impregnate cu un amestec 1:1 de oxid de propilenă și TAAP Epon (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA). Probele au fost încorporate în TAAB Epon și polimerizate la 60°C timp de 48 de ore. Rășina granulară întărită a fost tăiată și vizualizată prin TEM utilizând un JEOL 1200EX (JEOL, Tokyo, Japonia), un microscop electronic de transmisie convențional echipat cu o cameră CCD AMT 2k (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, MA, SUA).
Toate experimentele au fost efectuate în triplicat. Pentru fiecare punct de timp, spălările bacteriene au fost plasate în triplicat, rezultând un total de nouă puncte de date per punct, a căror medie a fost utilizată ca și concentrație bacteriană pentru organismul respectiv. Abaterea standard a fost utilizată ca eroare de măsurare. Toate punctele contează.
Logaritmul scăderii concentrației de bacterii față de t = 0 min a fost calculat folosind următoarea formulă:
unde C0 este concentrația de bacterii din proba de control la momentul 0 (adică după ce suprafața s-a uscat, dar înainte de a fi plasată în cameră), iar Cn este concentrația de bacterii de pe suprafață după n minute de expunere.
Pentru a ține cont de degradarea naturală a bacteriilor în timpul perioadei de expunere de 45 de minute, s-a calculat și Log-Reduction în comparație cu lotul de control la 45 de minute, după cum urmează:
Unde Cn este concentrația bacteriilor din proba de control la momentul n, iar Cn-Control este concentrația bacteriilor de control la momentul n. Datele sunt prezentate ca o reducere logaritmică în comparație cu controlul (fără expunere la EWNS).
În timpul studiului, au fost evaluate mai multe combinații de tensiune și distanță dintre ac și contraelectrod în ceea ce privește formarea conului Taylor, stabilitatea conului Taylor, stabilitatea producției de EWNS și reproductibilitatea. Diverse combinații sunt prezentate în Tabelul suplimentar S1. Două cazuri au fost selectate pentru un studiu complet care prezintă proprietăți stabile și reproductibile (con Taylor, producție de EWNS și stabilitate în timp). În Fig. 3 sunt prezentate rezultatele privind sarcina, dimensiunea și conținutul de ROS pentru două cazuri. Rezultatele sunt, de asemenea, rezumate în Tabelul 1. Pentru referință, Figura 3 și Tabelul 1 includ proprietățile EWNS8, 9, 10, 11 (EWNS de bază) neoptimizate sintetizate anterior. Calculele de semnificație statistică utilizând un test t bilateral sunt republicate în Tabelul suplimentar S2. În plus, datele suplimentare includ studii privind efectul diametrului orificiului de eșantionare al contraelectrodului (D) și distanța dintre electrodul de masă și vârful acului (L) (Figurile suplimentare S2 și S3).
(a–c) Distribuția mărimii AFM. (d–f) Caracteristica sarcinii superficiale. (g) Caracterizarea ROS și ESR.
De asemenea, este important de menționat că, pentru toate condițiile de mai sus, curenții de ionizare măsurați s-au situat în intervalul 2-6 µA, iar tensiunile s-au situat în intervalul -3,8 până la -6,5 kV, rezultând un consum de energie pentru acest modul de generare EWNS cu un singur terminal mai mic de 50 mW. Deși EWNS a fost sintetizat la presiune ridicată, nivelurile de ozon au fost foarte scăzute, nedepășind niciodată 60 ppb.
Figura suplimentară S4 prezintă câmpurile electrice simulate pentru scenariile [-6,5 kV, 4,0 cm] și respectiv [-3,8 kV, 0,5 cm]. Câmpurile conform scenariilor [-6,5 kV, 4,0 cm] și respectiv [-3,8 kV, 0,5 cm] sunt calculate ca 2 × 105 V/m și, respectiv, 4,7 × 105 V/m. Acest lucru este de așteptat, deoarece raportul dintre tensiune și distanță este mult mai mare în al doilea caz.
În fig. 3a și b se prezintă diametrul EWNS măsurat cu AFM8. Diametrele medii ale EWNS pentru scenariile [-6,5 kV, 4,0 cm] și [-3,8 kV, 0,5 cm] au fost calculate ca fiind 27 nm și respectiv 19 nm. Abaterile standard geometrice ale distribuțiilor pentru cazurile [-6,5 kV, 4,0 cm] și [-3,8 kV, 0,5 cm] sunt 1,41 și respectiv 1,45, indicând o distribuție dimensională îngustă. Atât dimensiunea medie, cât și abaterea standard geometrică sunt foarte apropiate de EWNS-ul de bază, fiind de 25 nm și respectiv 1,41. În fig. 3c se prezintă distribuția dimensională a EWNS-ului de bază măsurat folosind aceeași metodă în aceleași condiții.
În fig. 3d și e sunt prezentate rezultatele caracterizării sarcinii. Datele reprezintă medii ale măsurătorilor a 30 de măsurători simultane ale concentrației (#/cm3) și curentului (I). Analiza arată că sarcina medie pe EWNS este de 22 ± 6 e- și 44 ± 6 e- pentru [-6,5 kV, 4,0 cm] și respectiv [-3,8 kV, 0,5 cm]. Comparativ cu EWNS de bază (10 ± 2 e-), sarcina lor superficială este semnificativ mai mare, de două ori mai mare decât în ​​scenariul [-6,5 kV, 4,0 cm] și de patru ori mai mare decât în ​​scenariul [-3,8 kV, 0,5 cm]. 3f prezintă datele de bază privind plata EWNS.
Din hărțile concentrațiilor numerice EWNS (Figurile suplimentare S5 și S6), se poate observa că scena [-6,5 kV, 4,0 cm] are un număr semnificativ mai mare de particule decât scena [-3,8 kV, 0,5 cm]. De asemenea, trebuie menționat că concentrațiile numerice EWNS au fost monitorizate timp de până la 4 ore (Figurile suplimentare S5 și S6), unde stabilitatea generării EWNS a arătat aceleași niveluri de concentrații numerice de particule în ambele cazuri.
Figura 3g prezintă spectrul EPR după scăderea controlului (de fundal) pentru EWNS optimizat la [-6,5 kV, 4,0 cm]. Spectrul ROS este, de asemenea, comparat cu linia de bază EWNS într-o lucrare publicată anterior. Numărul calculat de EWNS care reacționează cu capcana de spin este de 7,5 × 104 EWNS/s, similar cu Baseline-EWNS8 publicat anterior. Spectrele EPR au indicat clar prezența a două tipuri de ROS, unde O2- a predominat, în timp ce OH• a fost prezent într-o cantitate mai mică. În plus, o comparație directă a intensităților vârfurilor a arătat că EWNS optimizate au avut un conținut de ROS semnificativ mai mare în comparație cu EWNS-ul de bază.
În figura 4 este prezentată eficiența depunerii EWNS în EPES. Datele sunt, de asemenea, rezumate în Tabelul I și comparate cu datele EWNS originale. Pentru ambele cazuri EUNS, depunerea a fost aproape de 100% chiar și la o tensiune scăzută de 3,0 kV. De obicei, 3,0 kV este suficient pentru a obține o depunere de 100%, indiferent de modificarea sarcinii de suprafață. În aceleași condiții, eficiența de depunere a Baseline-EWNS a fost de doar 56% datorită sarcinii mai mici (în medie 10 electroni per EWNS).
Figura 5 și Tabelul 2 prezintă un rezumat al gradului de inactivare a microorganismelor inoculate pe suprafața roșiilor după expunerea la aproximativ 40.000 #/cm3 EWNS timp de 45 de minute în scenariul optim [-6,5 kV, 4,0 cm]. E. coli și L. innocua inoculate au prezentat o reducere semnificativă de 3,8 log după 45 de minute de expunere. În aceleași condiții, S. enterica a prezentat o reducere logaritmică mai mică de 2,2 log, în timp ce S. cerevisiae și M. parafortuitum au prezentat o reducere de 1,0 log.
Micrografii electronice (Figura 6) care prezintă modificările fizice induse de EWNS în celulele E. coli, Salmonella enterica și L. innocua, ducând la inactivare. Bacteriile de control au prezentat membrane celulare intacte, în timp ce bacteriile expuse aveau membrane exterioare deteriorate.
Imagistica microscopică electronică a bacteriilor de control și a celor expuse a relevat deteriorarea membranei.
Datele privind proprietățile fizico-chimice ale EWNS optimizate arată, în mod colectiv, că proprietățile EWNS (sarcina superficială și conținutul de ROS) au fost îmbunătățite semnificativ în comparație cu datele de referință EWNS publicate anterior8,9,10,11. Pe de altă parte, dimensiunea lor a rămas în intervalul nanometric, ceea ce este foarte similar cu rezultatele publicate anterior, permițându-le să rămână în aer pentru o perioadă lungă de timp. Polidispersia observată poate fi explicată prin modificările sarcinii superficiale, care determină magnitudinea efectului Rayleigh, aleatoriuitatea și potențiala fuziune a EWNS. Cu toate acestea, așa cum au detaliat Nielsen și colab.22, sarcina superficială ridicată reduce evaporarea prin creșterea eficientă a energiei/tensiunii superficiale a picăturii de apă. Această teorie a fost confirmată experimental pentru micropicături22 și EWNS în publicația noastră anterioară8. Pierderea în timp poate afecta, de asemenea, dimensiunea și poate contribui la distribuția dimensiunilor observată.
În plus, sarcina per structură este de aproximativ 22–44 e-, în funcție de circumstanțe, ceea ce este semnificativ mai mare în comparație cu EWNS-ul de bază, care are o sarcină medie de 10 ± 2 electroni per structură. Cu toate acestea, trebuie menționat că aceasta este sarcina medie a EWNS. Seto și colab. S-a demonstrat că sarcina nu este uniformă și urmează o distribuție log-normală21. Comparativ cu lucrările noastre anterioare, dublarea sarcinii de suprafață dublează eficiența depunerii în sistemul EPES la aproape 100%11.