Terima kasih telah mengunjungi Nature.com. Anda menggunakan versi peramban dengan dukungan CSS terbatas. Untuk pengalaman terbaik, kami sarankan Anda menggunakan peramban yang diperbarui (atau menonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer). Selain itu, untuk memastikan dukungan berkelanjutan, kami menampilkan situs tanpa gaya dan JavaScript.
Baru-baru ini, platform antimikroba bebas bahan kimia berbasis nanoteknologi menggunakan nanostruktur air buatan (EWNS) telah dikembangkan. EWNS memiliki muatan permukaan yang tinggi dan kaya akan spesies oksigen reaktif (ROS) yang dapat berinteraksi dengan dan menonaktifkan sejumlah mikroorganisme, termasuk patogen bawaan makanan. Di sini ditunjukkan bahwa sifat-sifatnya selama sintesis dapat disesuaikan dan dioptimalkan untuk lebih meningkatkan potensi antibakterinya. Platform laboratorium EWNS dirancang untuk menyesuaikan sifat-sifat EWNS dengan mengubah parameter sintesis. Karakterisasi sifat-sifat EWNS (muatan, ukuran, dan kandungan ROS) dilakukan menggunakan metode analitik modern. Selain itu, mikroorganisme makanan seperti Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocua, Mycobacterium para fortitum, dan Saccharomyces cerevisiae diinokulasi ke permukaan tomat anggur organik untuk mengevaluasi potensi inaktivasi mikrobanya. Hasil yang disajikan di sini menunjukkan bahwa sifat-sifat EWNS dapat disesuaikan selama sintesis, menghasilkan peningkatan efisiensi inaktivasi secara eksponensial. Secara khusus, muatan permukaan meningkat empat kali lipat, dan kandungan ROS meningkat. Tingkat penghilangan mikroba bergantung pada jenis mikroba dan berkisar antara 1,0 hingga 3,8 log setelah 45 menit terpapar dosis aerosol 40.000 #/cm3 EWNS.
Kontaminasi mikroba adalah penyebab utama penyakit bawaan makanan yang disebabkan oleh konsumsi patogen atau toksinnya. Penyakit bawaan makanan menyebabkan sekitar 76 juta kasus penyakit, 325.000 rawat inap, dan 5.000 kematian setiap tahunnya di Amerika Serikat saja¹. Selain itu, Departemen Pertanian Amerika Serikat (USDA) memperkirakan bahwa peningkatan konsumsi produk segar bertanggung jawab atas 48 persen dari semua penyakit bawaan makanan yang dilaporkan di Amerika Serikat². Biaya penyakit dan kematian akibat patogen bawaan makanan di Amerika Serikat sangat tinggi, diperkirakan oleh Pusat Pengendalian dan Pencegahan Penyakit (CDC) lebih dari US$15,6 miliar per tahun³.
Saat ini, intervensi antimikroba kimia4, radiasi5 dan termal6 untuk memastikan keamanan pangan sebagian besar diterapkan pada titik kontrol kritis (CCP) terbatas dalam rantai produksi (biasanya setelah panen dan/atau selama pengemasan) daripada diterapkan secara terus menerus sehingga produk segar rentan terhadap kontaminasi silang 7. Intervensi antimikroba diperlukan untuk mengendalikan penyakit bawaan makanan dan pembusukan makanan dengan lebih baik dan berpotensi diterapkan di seluruh rantai produksi dari pertanian hingga meja makan. Dampak dan biaya lebih rendah.
Sebuah platform antimikroba bebas bahan kimia berbasis nanoteknologi baru-baru ini telah dikembangkan untuk menonaktifkan bakteri pada permukaan dan di udara menggunakan nanostruktur air buatan (EWNS). Untuk sintesis EWNS, dua proses paralel digunakan: elektrospray dan ionisasi air (Gambar 1a). EWNS sebelumnya telah terbukti memiliki serangkaian sifat fisik dan biologis yang unik8,9,10. EWNS memiliki rata-rata 10 elektron per struktur dan ukuran nanometer rata-rata 25 nm (Gambar 1b,c)8,9,10. Selain itu, resonansi spin elektron (ESR) menunjukkan bahwa EWNS mengandung sejumlah besar spesies oksigen reaktif (ROS), terutama radikal hidroksil (OH•) dan superoksida (O2-) (Gambar 1c) 8. EWNS tetap berada di udara untuk waktu yang lama dan dapat bertabrakan dengan mikroba yang tersuspensi di udara dan yang ada di permukaan, mengirimkan muatan ROS mereka dan menyebabkan inaktivasi mikroba (Gambar 1d). Studi-studi sebelumnya juga menunjukkan bahwa EWNS dapat berinteraksi dengan dan menonaktifkan berbagai bakteri gram-negatif dan gram-positif yang penting bagi kesehatan masyarakat, termasuk mikobakteri, pada permukaan dan di udara8,9. Mikroskop elektron transmisi menunjukkan bahwa penonaktifan tersebut disebabkan oleh gangguan membran sel. Selain itu, studi inhalasi akut menunjukkan bahwa dosis tinggi EWNS tidak menyebabkan kerusakan atau peradangan paru-paru8.
(a) Elektrospray terjadi ketika tegangan tinggi diterapkan antara kapiler yang berisi cairan dan elektroda lawan. (b) Penerapan tegangan tinggi menghasilkan dua fenomena berbeda: (i) elektrospray air dan (ii) pembentukan spesies oksigen reaktif (ion) yang terperangkap dalam EWNS. (c) Struktur unik EWNS. (d) EWNS sangat mudah bergerak karena sifatnya yang berskala nano dan dapat berinteraksi dengan patogen di udara.
Kemampuan platform antimikroba EWNS untuk menonaktifkan mikroorganisme penyebab penyakit bawaan makanan pada permukaan makanan segar juga telah ditunjukkan baru-baru ini. Telah juga ditunjukkan bahwa muatan permukaan EWNS dapat digunakan dalam kombinasi dengan medan listrik untuk pengiriman yang ditargetkan. Lebih penting lagi, hasil awal yang menjanjikan berupa pengurangan aktivitas tomat organik sekitar 1,4 log terhadap berbagai mikroorganisme makanan seperti E. coli dan Listeria diamati dalam waktu 90 menit setelah terpapar EWNS pada konsentrasi sekitar 50.000#/cm³. Selain itu, uji evaluasi organoleptik pendahuluan menunjukkan tidak ada efek organoleptik dibandingkan dengan tomat kontrol. Meskipun hasil penonaktifan awal ini menjanjikan keamanan pangan bahkan pada dosis EWNS yang sangat rendah yaitu 50.000#/cm³, jelas bahwa potensi penonaktifan yang lebih tinggi akan lebih bermanfaat untuk lebih mengurangi risiko infeksi dan pembusukan.
Di sini, kami akan memfokuskan penelitian kami pada pengembangan platform generasi EWNS untuk menyempurnakan parameter sintesis dan mengoptimalkan sifat fisikokimia EWNS guna meningkatkan potensi antibakterinya. Secara khusus, optimasi difokuskan pada peningkatan muatan permukaan (untuk meningkatkan pengiriman yang ditargetkan) dan kandungan ROS (untuk meningkatkan efisiensi inaktivasi). Karakterisasi sifat fisikokimia yang dioptimalkan (ukuran, muatan, dan kandungan ROS) menggunakan metode analitik modern dan menggunakan mikroorganisme makanan umum seperti E. coli, S. enterica, L. innocua, S. cerevisiae, dan M. parafortuitum.
EVNS disintesis dengan penyemprotan elektro simultan dan ionisasi air dengan kemurnian tinggi (18 MΩ cm–1). Atomizer listrik 12 biasanya digunakan untuk mengatomisasi cairan dan partikel polimer sintetis dan keramik 13 serta serat 14 dengan ukuran terkontrol.
Sebagaimana dijelaskan secara rinci dalam publikasi sebelumnya 8, 9, 10, 11, dalam percobaan tipikal, tegangan tinggi diterapkan antara kapiler logam dan elektroda lawan yang diarde. Selama proses ini, dua fenomena berbeda terjadi: 1) elektrospray dan 2) ionisasi air. Medan listrik yang kuat antara kedua elektroda menyebabkan muatan negatif menumpuk di permukaan air yang terkondensasi, sehingga terbentuk kerucut Taylor. Akibatnya, tetesan air bermuatan tinggi terbentuk, yang terus pecah menjadi partikel yang lebih kecil, menurut teori Rayleigh16. Pada saat yang sama, medan listrik yang kuat menyebabkan beberapa molekul air terpecah dan melepaskan elektron (ionisasi), sehingga menghasilkan sejumlah besar spesies oksigen reaktif (ROS)17. Paket ROS18 yang dihasilkan secara bersamaan dienkapsulasi dalam EWNS (Gambar 1c).
Gambar 2a menunjukkan sistem pembangkitan EWNS yang dikembangkan dan digunakan dalam sintesis EWNS pada penelitian ini. Air murni yang disimpan dalam botol tertutup dialirkan melalui tabung Teflon (diameter dalam 2 mm) ke jarum baja tahan karat 30G (kapiler logam). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2b, aliran air dikendalikan oleh tekanan udara di dalam botol. Jarum tersebut terpasang pada konsol Teflon yang dapat disesuaikan secara manual ke jarak tertentu dari elektroda lawan. Elektroda lawan adalah cakram aluminium yang dipoles dengan lubang di tengahnya untuk pengambilan sampel. Di bawah elektroda lawan terdapat corong pengambilan sampel aluminium, yang terhubung ke bagian lain dari perangkat percobaan melalui port pengambilan sampel (Gambar 2b). Semua komponen pengambilan sampel dihubungkan ke ground listrik untuk menghindari penumpukan muatan yang dapat menurunkan kualitas pengambilan sampel partikel.
(a) Sistem Generasi Nanostruktur Air Rekayasa (EWNS). (b) Penampang melintang unit sampler dan elektrospray yang menunjukkan parameter terpenting. (c) Susunan eksperimental untuk inaktivasi bakteri.
Sistem pembangkitan EWNS yang dijelaskan di atas mampu mengubah parameter operasi utama untuk memfasilitasi penyetelan halus sifat-sifat EWNS. Sesuaikan tegangan yang diterapkan (V), jarak antara jarum dan elektroda lawan (L), dan aliran air (φ) melalui kapiler untuk menyetel halus karakteristik EWNS. Simbol [V (kV), L (cm)] digunakan untuk menunjukkan kombinasi yang berbeda. Sesuaikan aliran air untuk mendapatkan kerucut Taylor yang stabil dari set [V, L] tertentu. Untuk keperluan penelitian ini, bukaan elektroda lawan (D) diatur pada 0,5 inci (1,29 cm).
Karena geometri dan asimetri yang terbatas, kekuatan medan listrik tidak dapat dihitung dari prinsip pertama. Sebagai gantinya, perangkat lunak QuickField™ (Svendborg, Denmark)19 digunakan untuk menghitung medan listrik. Medan listrik tidak seragam, sehingga nilai medan listrik di ujung kapiler digunakan sebagai nilai referensi untuk berbagai konfigurasi.
Selama penelitian, beberapa kombinasi tegangan dan jarak antara jarum dan elektroda lawan dievaluasi dalam hal pembentukan kerucut Taylor, stabilitas kerucut Taylor, stabilitas produksi EWNS, dan reproduktivitas. Berbagai kombinasi tersebut ditunjukkan pada Tabel Tambahan S1.
Output dari sistem pembangkitan EWNS dihubungkan langsung ke Scanning Mobility Particle Sizer (SMPS, model 3936, TSI, Shoreview, Minnesota) untuk mengukur konsentrasi jumlah partikel dan digunakan dengan elektrometer aerosol Faraday (TSI, model 3068B, Shoreview, AS) untuk mengukur aliran aerosol, seperti yang dijelaskan dalam publikasi kami sebelumnya9. Baik SMPS maupun elektrometer aerosol mengambil sampel pada laju aliran 0,5 L/min (total aliran sampel 1 L/min). Konsentrasi partikel dan fluks aerosol diukur selama 120 detik. Pengukuran diulang 30 kali. Muatan aerosol total dihitung dari pengukuran saat ini, dan muatan EWNS rata-rata diperkirakan dari jumlah total partikel EWNS yang diambil sampelnya. Biaya rata-rata EWNS dapat dihitung menggunakan Persamaan (1):
di mana IEl adalah arus yang diukur, NSMPS adalah konsentrasi jumlah yang diukur dengan SMPS, dan φEl adalah laju aliran ke elektrometer.
Karena kelembapan relatif (RH) memengaruhi muatan permukaan, suhu dan (RH) dijaga konstan masing-masing pada 21°C dan 45% selama percobaan.
Mikroskop gaya atom (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, CA) dan probe AC260T (Olympus, Tokyo, Jepang) digunakan untuk mengukur ukuran dan masa hidup EWNS. Laju pemindaian AFM adalah 1 Hz dan area pemindaian adalah 5 µm × 5 µm dengan 256 garis pemindaian. Semua gambar dikenai penyelarasan gambar orde pertama menggunakan perangkat lunak Asylum (masking dengan rentang 100 nm dan ambang batas 100 pm).
Lepaskan corong pengambilan sampel dan letakkan permukaan mika pada jarak 2,0 cm dari elektroda lawan selama rata-rata 120 detik untuk menghindari penggabungan partikel dan pembentukan tetesan tidak beraturan pada permukaan mika. EWNS diaplikasikan langsung ke permukaan mika yang baru dipotong (Ted Pella, Redding, CA). Segera setelah penyemprotan, permukaan mika divisualisasikan menggunakan AFM. Sudut kontak permukaan mika yang baru dipotong dan tidak dimodifikasi mendekati 0°, sehingga EWNS merambat di atas permukaan mika dalam bentuk kubah20. Diameter (a) dan tinggi (h) tetesan yang berdifusi diukur langsung dari topografi AFM dan digunakan untuk menghitung volume difusi kubah EWNS menggunakan metode yang telah kami validasi sebelumnya8. Dengan asumsi bahwa EVNS yang terpasang memiliki volume yang sama, diameter ekivalen dapat dihitung dari persamaan (2):
Sesuai dengan metode yang telah kami kembangkan sebelumnya, perangkap spin resonansi spin elektron (ESR) digunakan untuk mendeteksi keberadaan intermediat radikal berumur pendek dalam EWNS. Aerosol dilewatkan melalui larutan yang mengandung 235 mM DEPMPO (5-(dietoksifosforil)-5-metil-1-pirolin-N-oksida) (Oxis International Inc., Portland, Oregon). Semua pengukuran EPR dilakukan menggunakan spektrometer Bruker EMX (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA) dan susunan sel datar. Perangkat lunak Acquisit (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA) digunakan untuk mengumpulkan dan menganalisis data. Karakterisasi ROS hanya dilakukan untuk serangkaian kondisi operasi [-6,5 kV, 4,0 cm]. Konsentrasi EWNS diukur menggunakan SMPS setelah memperhitungkan kehilangan EWNS di impaktor.
Tingkat ozon dipantau menggunakan 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Co)8,9,10.
Untuk semua properti EWNS, nilai pengukuran adalah rata-rata dari pengukuran, dan kesalahan pengukuran adalah deviasi standar. Uji t dilakukan untuk membandingkan nilai atribut EWNS yang dioptimalkan dengan nilai yang sesuai dari EWNS dasar.
Gambar 2c menunjukkan Sistem Pengaliran Presipitasi Elektrostatik (EPES) yang telah dikembangkan dan dikarakterisasi sebelumnya, yang dapat digunakan untuk mengarahkan EWNS11 ke permukaan. EPES menggunakan muatan EWNS yang dikombinasikan dengan medan listrik yang kuat untuk "menunjuk" langsung ke permukaan target. Detail sistem EPES disajikan dalam publikasi terbaru oleh Pyrgiotakis dkk.11. Dengan demikian, EPES terdiri dari ruang PVC cetak 3D dengan ujung meruncing yang berisi dua pelat logam baja tahan karat (baja tahan karat 304, dipoles cermin) paralel di tengah dengan jarak 15,24 cm. Pelat-pelat tersebut dihubungkan ke sumber tegangan tinggi eksternal (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), pelat bawah selalu positif dan pelat atas selalu diarde (mengambang). Dinding ruang ditutupi dengan foil aluminium, yang diarde secara elektrik untuk mencegah kehilangan partikel. Ruang tersebut memiliki pintu pemuatan depan yang tertutup rapat yang memungkinkan permukaan uji ditempatkan pada rak plastik, mengangkatnya dari pelat logam bawah untuk menghindari interferensi tegangan tinggi.
Efisiensi pengendapan EWNS dalam EPES dihitung berdasarkan protokol yang telah dikembangkan sebelumnya, yang dirinci dalam Gambar Tambahan S111.
Sebagai ruang kontrol, aliran kedua melalui ruang silinder dihubungkan secara seri dengan sistem EPES menggunakan filter HEPA perantara untuk menghilangkan EWNS. Seperti yang ditunjukkan pada gambar 2c, aerosol EWNS dipompa melalui dua ruang yang dihubungkan secara seri. Filter antara ruang kontrol dan EPES menghilangkan sisa EWNS sehingga menghasilkan suhu (T), kelembaban relatif (RH), dan kadar ozon yang sama.
Mikroorganisme penting penyebab penyakit bawaan makanan telah ditemukan mencemari produk segar seperti Escherichia coli (ATCC #27325), indikator feses, Salmonella enterica (ATCC #53647), patogen bawaan makanan, Listeria innocua (ATCC #33090), alternatif untuk Listeria monocytogenes patogenik, Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098) sebagai alternatif ragi pembusuk, dan Mycobacterium parafortuitous (ATCC #19686) sebagai bakteri hidup yang lebih tahan, dibeli dari ATCC (Manassas, Virginia).
Belilah secara acak beberapa kotak tomat ceri organik dari pasar lokal Anda dan simpan di lemari es pada suhu 4°C hingga digunakan (hingga 3 hari). Pilih tomat dengan satu ukuran untuk bereksperimen, sekitar 1/2 inci diameternya.
Protokol untuk inkubasi, inokulasi, paparan, dan penghitungan koloni telah dirinci dalam publikasi kami sebelumnya dan dijelaskan secara rinci dalam Data Tambahan 11. Kinerja EWNS dievaluasi dengan memaparkan tomat yang diinokulasi pada 40.000 #/cm3 selama 45 menit. Singkatnya, pada waktu t = 0 menit, tiga tomat digunakan untuk mengevaluasi mikroorganisme yang bertahan hidup. Tiga tomat ditempatkan dalam EPES dan dipaparkan pada EWNS pada 40.000 #/cc (tomat yang terpapar EWNS) dan tiga lainnya ditempatkan di ruang kontrol (tomat kontrol). Tidak satu pun dari kelompok tomat yang dikenai pemrosesan tambahan. Tomat yang terpapar EWNS dan kontrol dikeluarkan setelah 45 menit untuk mengevaluasi efek EWNS.
Setiap percobaan dilakukan sebanyak tiga kali. Analisis data dilakukan sesuai dengan protokol yang dijelaskan dalam Data Tambahan.
Sampel bakteri E. coli, Enterobacter, dan L. innocua yang terpapar EWNS (45 menit, konsentrasi aerosol EWNS 40.000 #/cm3) dan yang tidak terpapar diendapkan untuk menilai mekanisme inaktivasi. Endapan tersebut difiksasi selama 2 jam pada suhu kamar dalam larutan natrium kakodilat 0,1 M (pH 7,4) dengan fiksatif 2,5% glutaraldehida, 1,25% paraformaldehida, dan 0,03% asam pikrat. Setelah dicuci, sampel difiksasi dengan 1% osmium tetroksida (OsO4)/1,5% kalium ferrocyanida (KFeCN6) selama 2 jam, dicuci 3 kali dengan air, dan diinkubasi dalam 1% uranil asetat selama 1 jam, kemudian dicuci dua kali dengan air. Dehidrasi selanjutnya dilakukan selama 10 menit masing-masing dengan alkohol 50%, 70%, 90%, dan 100%. Sampel kemudian ditempatkan dalam propilen oksida selama 1 jam dan diimpregnasi dengan campuran 1:1 propilen oksida dan TAAP Epon (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA). Sampel kemudian ditanamkan dalam TAAB Epon dan dipolimerisasi pada suhu 60°C selama 48 jam. Resin granular yang telah mengeras dipotong dan divisualisasikan dengan TEM menggunakan JEOL 1200EX (JEOL, Tokyo, Jepang), mikroskop elektron transmisi konvensional yang dilengkapi dengan kamera CCD AMT 2k (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, MA, USA).
Semua percobaan dilakukan sebanyak tiga kali pengulangan. Untuk setiap titik waktu, hasil pencucian bakteri diinokulasi pada cawan petri sebanyak tiga kali pengulangan, sehingga menghasilkan total sembilan titik data per titik, yang rata-ratanya digunakan sebagai konsentrasi bakteri untuk organisme tertentu tersebut. Deviasi standar digunakan sebagai kesalahan pengukuran. Semua titik dihitung.
Logaritma penurunan konsentrasi bakteri dibandingkan dengan t = 0 menit dihitung menggunakan rumus berikut:
di mana C0 adalah konsentrasi bakteri dalam sampel kontrol pada waktu 0 (yaitu setelah permukaan mengering tetapi sebelum ditempatkan di dalam ruang) dan Cn adalah konsentrasi bakteri pada permukaan setelah n menit terpapar.
Untuk memperhitungkan degradasi alami bakteri selama periode paparan 45 menit, Log-Reduction juga dihitung dibandingkan dengan kontrol pada 45 menit sebagai berikut:
Di mana Cn adalah konsentrasi bakteri dalam sampel kontrol pada waktu n dan Cn-Kontrol adalah konsentrasi bakteri kontrol pada waktu n. Data disajikan sebagai pengurangan logaritma dibandingkan dengan kontrol (tanpa paparan EWNS).
Selama penelitian, beberapa kombinasi tegangan dan jarak antara jarum dan elektroda lawan dievaluasi dalam hal pembentukan kerucut Taylor, stabilitas kerucut Taylor, stabilitas produksi EWNS, dan reproduktivitas. Berbagai kombinasi ditunjukkan pada Tabel Tambahan S1. Dua kasus dipilih untuk studi lengkap yang menunjukkan sifat stabil dan dapat direproduksi (kerucut Taylor, produksi EWNS, dan stabilitas dari waktu ke waktu). Pada Gambar 3 menunjukkan hasil muatan, ukuran, dan kandungan ROS untuk dua kasus. Hasilnya juga dirangkum dalam Tabel 1. Sebagai referensi, Gambar 3 dan Tabel 1 mencakup sifat-sifat EWNS8, 9, 10, 11 yang sebelumnya disintesis dan belum dioptimalkan (EWNS dasar). Perhitungan signifikansi statistik menggunakan uji t dua arah dipublikasikan kembali dalam Tabel Tambahan S2. Selain itu, data tambahan mencakup studi tentang pengaruh diameter lubang pengambilan sampel elektroda lawan (D) dan jarak antara elektroda tanah dan ujung jarum (L) (Gambar Tambahan S2 dan S3).
(a–c) Distribusi ukuran AFM. (d – f) Karakteristik muatan permukaan. (g) Karakterisasi ROS dan ESR.
Penting juga untuk dicatat bahwa untuk semua kondisi di atas, arus ionisasi yang terukur berada dalam kisaran 2-6 µA, dan tegangan berada dalam kisaran -3,8 hingga -6,5 kV, sehingga konsumsi daya untuk modul pembangkit EWNS terminal tunggal ini kurang dari 50 mW. Meskipun EWNS disintesis di bawah tekanan tinggi, kadar ozon sangat rendah, tidak pernah melebihi 60 ppb.
Gambar Tambahan S4 menunjukkan medan listrik hasil simulasi untuk skenario [-6,5 kV, 4,0 cm] dan [-3,8 kV, 0,5 cm], masing-masing. Medan listrik menurut skenario [-6,5 kV, 4,0 cm] dan [-3,8 kV, 0,5 cm] dihitung masing-masing sebesar 2 × 10⁵ V/m dan 4,7 × 10⁵ V/m. Hal ini dapat diprediksi, karena rasio tegangan terhadap jarak jauh lebih tinggi pada kasus kedua.
Gambar 3a,b menunjukkan diameter EWNS yang diukur dengan AFM8. Diameter EWNS rata-rata untuk skenario [-6,5 kV, 4,0 cm] dan [-3,8 kV, 0,5 cm] dihitung masing-masing sebesar 27 nm dan 19 nm. Deviasi standar geometris dari distribusi untuk kasus [-6,5 kV, 4,0 cm] dan [-3,8 kV, 0,5 cm] masing-masing adalah 1,41 dan 1,45, menunjukkan distribusi ukuran yang sempit. Baik ukuran rata-rata maupun deviasi standar geometris sangat dekat dengan EWNS dasar, yaitu masing-masing 25 nm dan 1,41. Gambar 3c menunjukkan distribusi ukuran EWNS dasar yang diukur menggunakan metode yang sama dalam kondisi yang sama.
Pada Gambar 3d,e menunjukkan hasil karakterisasi muatan. Data merupakan pengukuran rata-rata dari 30 pengukuran simultan konsentrasi (#/cm3) dan arus (I). Analisis menunjukkan bahwa muatan rata-rata pada EWNS adalah 22 ± 6 e- dan 44 ± 6 e- untuk [-6,5 kV, 4,0 cm] dan [-3,8 kV, 0,5 cm], masing-masing. Dibandingkan dengan Baseline-EWNS (10 ± 2 e-), muatan permukaannya jauh lebih tinggi, dua kali lipat dari skenario [-6,5 kV, 4,0 cm] dan empat kali lipat dari [-3,8 kV, 0,5 cm]. Gambar 3f menunjukkan data pembayaran dasar EWNS.
Dari peta konsentrasi jumlah EWNS (Gambar Tambahan S5 dan S6), dapat dilihat bahwa skenario [-6,5 kV, 4,0 cm] memiliki jumlah partikel yang jauh lebih tinggi daripada skenario [-3,8 kV, 0,5 cm]. Perlu juga dicatat bahwa konsentrasi jumlah EWNS dipantau hingga 4 jam (Gambar Tambahan S5 dan S6), di mana stabilitas generasi EWNS menunjukkan tingkat konsentrasi jumlah partikel yang sama dalam kedua kasus tersebut.
Gambar 3g menunjukkan spektrum EPR setelah pengurangan kontrol (latar belakang) untuk EWNS yang dioptimalkan pada [-6,5 kV, 4,0 cm]. Spektrum ROS juga dibandingkan dengan garis dasar EWNS dalam makalah yang diterbitkan sebelumnya. Jumlah EWNS yang bereaksi dengan perangkap spin yang dihitung adalah 7,5 × 10⁴ EWNS/s, yang mirip dengan Garis Dasar-EWNS8 yang diterbitkan sebelumnya. Spektrum EPR dengan jelas menunjukkan keberadaan dua jenis ROS, di mana O²⁻ mendominasi, sedangkan OH• hadir dalam jumlah yang lebih kecil. Selain itu, perbandingan langsung intensitas puncak menunjukkan bahwa EWNS yang dioptimalkan memiliki kandungan ROS yang jauh lebih tinggi dibandingkan dengan garis dasar EWNS.
Gambar 4 menunjukkan efisiensi deposisi EWNS dalam EPES. Data tersebut juga dirangkum dalam Tabel I dan dibandingkan dengan data EWNS asli. Untuk kedua kasus EUNS, deposisi mendekati 100% bahkan pada tegangan rendah 3,0 kV. Biasanya, 3,0 kV sudah cukup untuk mencapai deposisi 100% terlepas dari perubahan muatan permukaan. Dalam kondisi yang sama, efisiensi deposisi Baseline-EWNS hanya 56% karena muatan yang lebih rendah (rata-rata 10 elektron per EWNS).
Gambar 5 dan Tabel 2 merangkum tingkat inaktivasi mikroorganisme yang diinokulasi pada permukaan tomat setelah terpapar sekitar 40.000 #/cm3 EWNS selama 45 menit dalam skenario optimal [-6,5 kV, 4,0 cm]. E. coli dan L. innocua yang diinokulasi menunjukkan pengurangan signifikan sebesar 3,8 log setelah 45 menit terpapar. Dalam kondisi yang sama, S. enterica menunjukkan pengurangan log yang lebih rendah yaitu 2,2 log, sedangkan S. cerevisiae dan M. parafortuitum menunjukkan pengurangan 1,0 log.
Mikrograf elektron (Gambar 6) yang menggambarkan perubahan fisik yang diinduksi oleh EWNS pada sel E. coli, Salmonella enterica, dan L. innocua yang menyebabkan inaktivasi. Bakteri kontrol menunjukkan membran sel yang utuh, sedangkan bakteri yang terpapar memiliki membran luar yang rusak.
Pencitraan mikroskop elektron pada bakteri kontrol dan bakteri yang terpapar menunjukkan adanya kerusakan membran.
Data mengenai sifat fisikokimia EWNS yang dioptimalkan secara kolektif menunjukkan bahwa sifat-sifat EWNS (muatan permukaan dan kandungan ROS) meningkat secara signifikan dibandingkan dengan data dasar EWNS yang telah dipublikasikan sebelumnya8,9,10,11. Di sisi lain, ukurannya tetap berada dalam kisaran nanometer, yang sangat mirip dengan hasil yang telah dipublikasikan sebelumnya, sehingga memungkinkan mereka untuk tetap berada di udara dalam jangka waktu yang lama. Polidispersitas yang diamati dapat dijelaskan oleh perubahan muatan permukaan, yang menentukan besarnya efek Rayleigh, keacakan, dan potensi penggabungan EWNS. Namun, seperti yang dijelaskan oleh Nielsen dkk.22, muatan permukaan yang tinggi mengurangi penguapan dengan secara efektif meningkatkan energi/tegangan permukaan tetesan air. Teori ini telah dikonfirmasi secara eksperimental untuk tetesan mikro22 dan EWNS dalam publikasi kami sebelumnya8. Kehilangan seiring waktu juga dapat memengaruhi ukuran dan berkontribusi pada distribusi ukuran yang diamati.
Selain itu, muatan per struktur sekitar 22–44 e-, tergantung pada keadaan, yang secara signifikan lebih tinggi dibandingkan dengan EWNS dasar, yang memiliki muatan rata-rata 10 ± 2 elektron per struktur. Namun, perlu dicatat bahwa ini adalah muatan rata-rata EWNS. Seto dkk. telah menunjukkan bahwa muatan tersebut tidak seragam dan mengikuti distribusi log-normal21. Dibandingkan dengan pekerjaan kami sebelumnya, penggandaan muatan permukaan menggandakan efisiensi deposisi dalam sistem EPES hingga hampir 100%11.