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최근, 인공 물 나노구조(EWNS)를 이용한 나노기술 기반의 무화학 항균 플랫폼이 개발되었습니다. EWNS는 높은 표면 전하를 가지고 있으며, 식품 매개 병원균을 포함한 여러 미생물과 상호작용하여 불활성화시킬 수 있는 활성 산소(ROS)가 풍부합니다. 본 연구에서는 합성 과정에서 EWNS의 특성을 미세 조정하고 최적화하여 항균 잠재력을 더욱 향상시킬 수 있음을 보여줍니다. EWNS 실험실 플랫폼은 합성 매개변수를 변경하여 EWNS의 특성을 미세 조정하도록 설계되었습니다. EWNS 특성(전하, 크기 및 ROS 함량)의 특성 분석은 최신 분석 방법을 사용하여 수행되었습니다. 또한, 대장균, 살모넬라 엔테리카, 리스테리아 이노콰, 마이코박테리움 파라포르티툼, 사카로마이세스 세레비시아와 같은 식품 미생물을 유기농 포도 토마토 표면에 접종하여 미생물 불활성화 잠재력을 평가했습니다. 본 연구에 제시된 결과는 EWNS의 특성이 합성 과정에서 미세 조정될 수 있으며, 이를 통해 불활성화 효율이 기하급수적으로 증가함을 보여줍니다. 특히, 표면 전하가 4배 증가했고, 활성산소(ROS) 함량도 증가했습니다. 미생물 제거율은 미생물에 따라 달랐으며, 40,000 #/cm³의 EWNS 에어로졸 농도에 45분 노출 후 1.0~3.8 log의 범위를 보였습니다.
미생물 오염은 병원균이나 그 독소의 섭취로 인한 식중독의 주요 원인입니다. 식중독은 미국에서만 매년 약 7,600만 건의 질병, 32만 5천 건의 입원, 그리고 5천 건의 사망을 초래합니다.1 또한, 미국 농무부(USDA)는 신선 농산물 소비 증가가 미국에서 보고된 모든 식중독의 48%를 차지한다고 추산합니다.2 미국에서 식중독균으로 인한 질병 및 사망 비용은 매우 높으며, 질병통제예방센터(CDC)는 이를 연간 156억 달러 이상으로 추산합니다.3
현재 식품 안전을 보장하기 위한 화학적4, 방사선5, 열6 항균 처리는 주로 생산 과정의 제한된 중요 관리점(CCP)(일반적으로 수확 후 및/또는 포장 과정)에서만 시행되고 있으며, 신선 농산물이 교차 오염될 수 있도록 지속적으로 시행되지는 않습니다. 항균 처리는 식품 매개 질병과 식품 부패를 더 효과적으로 관리하기 위해 필요하며, 농장에서 식탁까지 이어지는 전 과정에 걸쳐 적용될 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 항균 처리는 환경 영향과 비용을 절감할 수 있습니다.
나노기술 기반의 화학물질을 사용하지 않는 항균 플랫폼이 최근 인공 물 나노구조(EWNS)를 사용하여 표면과 공기 중의 박테리아를 불활성화하기 위해 개발되었습니다. EVNS의 합성을 위해 전기분무와 물 이온화라는 두 가지 병렬 공정이 사용되었습니다(그림 1a). EWNS는 이전에 고유한 물리적 및 생물학적 특성을 갖는 것으로 나타났습니다8,9,10. EWNS는 구조당 평균 10개의 전자와 25nm의 평균 나노미터 크기를 갖습니다(그림 1b,c)8,9,10. 또한 전자 스핀 공명(ESR)은 EWNS에 다량의 활성 산소종(ROS), 주로 하이드록실(OH•)과 슈퍼옥사이드(O2-) 라디칼이 포함되어 있음을 보여주었습니다(그림 1c)8. EWNS는 오랫동안 공기 중에 남아 있었고 공기 중에 떠다니고 표면에 있는 미생물과 충돌하여 ROS 페이로드를 전달하고 미생물 불활성화를 일으킬 수 있습니다(그림 1d). 이러한 초기 연구들은 EWNS가 표면 및 공기 중 결핵균을 포함한 공중보건에 중요한 다양한 그람 음성균 및 그람 양성균과 상호작용하여 불활성화시킬 수 있음을 보여주었습니다.8,9 투과전자현미경 검사 결과, 이러한 불활성화는 세포막 파괴로 인해 발생한 것으로 나타났습니다. 또한, 급성 흡입 연구에서는 고용량의 EWNS가 폐 손상이나 염증을 유발하지 않는 것으로 나타났습니다.8
(a) 전기분사는 액체가 담긴 모세관과 상대 전극 사이에 고전압을 인가하면 발생합니다. (b) 고전압을 인가하면 두 가지 다른 현상이 발생합니다. (i) 물의 전기분사 및 (ii) EWNS에 갇힌 활성 산소종(이온)의 생성. (c) EWNS의 고유한 구조. (d) EWNS는 나노스케일 특성으로 인해 매우 이동성이 뛰어나고 공기 중 병원균과 상호 작용할 수 있습니다.
EWNS 항균 플랫폼이 신선식품 표면의 식품 매개 미생물을 불활성화하는 능력 또한 최근 입증되었습니다. 또한 EWNS 표면 전하를 전기장과 함께 사용하여 표적 전달을 할 수 있음도 밝혀졌습니다. 더 중요한 것은, 약 50,000#/cm³11의 농도에서 유기농 토마토를 EWNS에 노출시킨 후 90분 이내에 대장균 및 리스테리아균과 같은 다양한 식품 미생물에 대한 활성이 약 1.4 log 감소하는 유망한 초기 결과가 관찰되었다는 것입니다. 또한, 예비 관능적 평가 시험에서 대조군 토마토와 비교하여 관능적 효과가 나타나지 않았습니다. 이러한 초기 불활성화 결과는 50,000#/cc의 매우 낮은 EWNS 용량에서도 식품 안전성을 보장하지만, 더 높은 불활성화 잠재력이 감염 및 부패 위험을 더욱 줄이는 데 더 유익할 것이라는 것은 분명합니다.
본 연구에서는 EWNS의 합성 매개변수를 미세 조정하고 물리화학적 특성을 최적화하여 항균 잠재력을 향상시키는 EWNS 생성 플랫폼 개발에 집중할 것입니다. 특히, 최적화는 표면 전하 증가(표적 전달 향상) 및 ROS 함량 증가(불활성화 효율 향상)에 중점을 두었습니다. 최신 분석 방법과 E. coli, S. enterica, L. innocua, S. cerevisiae, M. parafortuitum과 같은 일반적인 식품 미생물을 사용하여 최적화된 물리화학적 특성(크기, 전하 및 ROS 함량)을 분석합니다.
EVNS는 고순도 물(18 MΩ·cm–1)의 전기분무와 이온화를 동시에 수행하여 합성되었습니다. 전기 분무기 12는 일반적으로 액체, 합성 고분자 및 세라믹 입자 13, 그리고 크기가 조절된 섬유 14를 분무하는 데 사용됩니다.
이전 출판물 8, 9, 10, 11에서 자세히 설명했듯이, 일반적인 실험에서는 금속 모세관과 접지된 상대 전극 사이에 고전압을 인가합니다. 이 과정에서 1) 전기 분무 및 2) 물의 이온화라는 두 가지 현상이 발생합니다. 두 전극 사이의 강한 전기장은 응축된 물 표면에 음전하를 축적하여 테일러 콘을 형성합니다. 결과적으로 고하전된 물방울이 형성되고, 레일리 이론에 따라 이 물방울은 더 작은 입자로 계속 분해됩니다.16 동시에 강한 전기장은 일부 물 분자를 분열시켜 전자를 떼어내(이온화) 다량의 활성 산소종(ROS)17을 생성합니다. 동시에 생성된 ROS18 패킷은 EWNS에 캡슐화되었습니다(그림 1c).
그림 2a는 본 연구에서 EWNS 합성에 개발 및 사용된 EWNS 생성 시스템을 보여줍니다. 밀폐된 병에 저장된 정제수는 테플론 튜브(내경 2mm)를 통해 30G 스테인리스 스틸 바늘(금속 모세관)로 공급되었습니다. 그림 2b와 같이 물의 흐름은 병 내부의 공기압에 의해 제어됩니다. 바늘은 상대 전극으로부터 일정 거리까지 수동으로 조정할 수 있는 테플론 콘솔에 부착되어 있습니다. 상대 전극은 샘플링을 위해 중앙에 구멍이 있는 광택 처리된 알루미늄 디스크입니다. 상대 전극 아래에는 샘플링 포트(그림 2b)를 통해 나머지 실험 설정에 연결된 알루미늄 샘플링 깔때기가 있습니다. 모든 샘플러 구성 요소는 입자 샘플링을 저하시킬 수 있는 전하 축적을 방지하기 위해 전기적으로 접지됩니다.
(a) 엔지니어링된 물 나노구조 생성 시스템(EWNS). (b) 가장 중요한 매개변수를 보여주는 샘플러와 전기분무 장치의 단면도. (c) 박테리아 불활성화를 위한 실험 설정.
위에서 설명한 EWNS 생성 시스템은 주요 작동 매개변수를 변경하여 EWNS 특성의 미세 조정을 용이하게 할 수 있습니다. 인가 전압(V), 바늘과 상대 전극 사이의 거리(L), 그리고 모세관을 통과하는 물의 흐름(φ)을 조정하여 EWNS 특성을 미세 조정할 수 있습니다. 기호 [V(kV), L(cm)]는 다양한 조합을 나타내는 데 사용됩니다. 특정 [V, L] 세트의 안정적인 테일러 콘을 얻기 위해 물의 흐름을 조정하십시오. 본 연구의 목적을 위해 상대 전극의 구경(D)은 0.5인치(1.29cm)로 설정되었습니다.
제한된 기하 구조와 비대칭성으로 인해 전기장 세기를 기본 원리로 계산할 수 없습니다. 대신, QuickField™ 소프트웨어(스벤보르, 덴마크)19를 사용하여 전기장을 계산했습니다. 전기장은 균일하지 않으므로, 모세관 끝부분의 전기장 값을 다양한 구성의 기준값으로 사용했습니다.
연구 기간 동안 바늘과 상대전극 사이의 전압과 거리의 여러 조합을 테일러 콘 형성, 테일러 콘 안정성, EWNS 생성 안정성, 그리고 재현성 측면에서 평가했습니다. 다양한 조합은 보충 표 S1에 제시되어 있습니다.
EWNS 생성 시스템의 출력은 스캐닝 이동성 입자 크기 측정기(SMPS, 모델 3936, TSI, 미네소타주 쇼어뷰)에 직접 연결되어 입자 수 농도를 측정했으며, 패러데이 에어로졸 전위계(TSI, 모델 3068B, 미네소타주 쇼어뷰)와 함께 사용하여 이전 논문9에서 설명한 대로 에어로졸 유량을 측정했습니다. SMPS와 에어로졸 전위계 모두 0.5 L/min(총 시료 유량 1 L/min)의 유량으로 샘플링했습니다. 입자 농도와 에어로졸 플럭스는 120초 동안 측정했습니다. 측정을 30회 반복했습니다. 총 에어로졸 전하는 전류 측정값으로부터 계산하고, 평균 EWNS 전하는 샘플링된 EWNS 입자의 총 개수로부터 추정했습니다. EWNS의 평균 비용은 식 (1)을 사용하여 계산할 수 있습니다.
여기서 IEl은 측정된 전류이고, NSMPS는 SMPS로 측정한 농도수이며, φEl은 전기계로의 유량입니다.
상대 습도(RH)는 표면 전하에 영향을 미치므로 실험 동안 온도와 (RH)는 각각 21°C와 45%로 일정하게 유지되었습니다.
원자간력현미경(AFM), Asylum MFP-3D(Asylum Research, 캘리포니아주 산타바바라) 및 AC260T 프로브(Olympus, 일본 도쿄)를 사용하여 EWNS의 크기와 수명을 측정했습니다. AFM 스캔 속도는 1Hz이고, 스캔 영역은 5µm×5µm이며, 스캔 라인은 256개입니다. 모든 이미지는 Asylum 소프트웨어(100nm의 범위와 100pm의 임계값을 갖는 마스크)를 사용하여 1차 이미지 정렬을 수행했습니다.
샘플링 깔때기를 제거하고 운모 표면을 상대 전극으로부터 2.0cm 떨어진 곳에 평균 120초 동안 두어 입자의 합체와 운모 표면에 불규칙한 액적 형성을 방지합니다. EWNS는 새로 절단한 운모 표면(Ted Pella, Redding, CA)에 직접 도포했습니다. 스퍼터링 직후, 운모 표면을 AFM을 사용하여 시각화했습니다. 새로 절단한 비변형 운모의 표면 접촉각은 0°에 가깝기 때문에 EWNS는 운모 표면 위로 돔 형태로 전파됩니다. 확산 액적의 직경(a)과 높이(h)는 AFM 지형에서 직접 측정하여 이전에 검증된 방법8을 사용하여 돔형 확산 부피 EWNS를 계산했습니다. 온보드 EVNS의 부피가 동일하다고 가정할 때, 등가 직경은 다음 식 (2)를 통해 계산할 수 있습니다.
이전에 개발된 방법에 따라, 전자 스핀 공명(ESR) 스핀 트랩을 사용하여 EWNS에서 수명이 짧은 라디칼 중간체의 존재를 검출했습니다. 에어로졸을 235 mM DEPMPO(5-(diethoxyphosphoryl)-5-methyl-1-pyrroline-N-oxide)(Oxis International Inc., Portland, Oregon)가 포함된 용액에 통과시켰습니다. 모든 EPR 측정은 Bruker EMX 분광기(Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA)와 플랫 셀 어레이를 사용하여 수행했습니다. Acquisit 소프트웨어(Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA)를 사용하여 데이터를 수집하고 분석했습니다. ROS 특성 분석은 일련의 작동 조건[-6.5 kV, 4.0 cm]에 대해서만 수행했습니다. EWNS 농도는 임팩터에서 EWNS 손실을 고려한 후 SMPS를 사용하여 측정했습니다.
오존 수치는 205 Dual Beam Ozone Monitor™(2B Technologies, Boulder, Co)8,9,10을 사용하여 모니터링되었습니다.
모든 EWNS 속성에 대해 측정값은 측정값의 평균이고, 측정 오차는 표준 편차입니다. 최적화된 EWNS 속성값과 그에 상응하는 기본 EWNS 값을 비교하기 위해 t-검정을 수행했습니다.
그림 2c는 이전에 개발되고 특성화된 전기 집진 통과 시스템(EPES)을 보여주는데, 이를 사용하여 표면에 EWNS11을 타겟팅할 수 있습니다. EPES는 강한 전기장과 함께 EWNS 전하를 사용하여 타겟 표면을 직접 "가리킵니다". EPES 시스템의 세부 사항은 Pyrgiotakis 등이 발표한 최근 논문에 나와 있습니다.11 따라서 EPES는 중앙에 15.24cm 간격으로 두 개의 평행한 스테인리스 스틸(304 스테인리스 스틸, 거울 광택) 금속판이 들어 있는 테이퍼형 끝이 ​​있는 3D 프린팅 PVC 챔버로 구성됩니다. 보드는 외부 고전압 소스(Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY)에 연결되었으며, 하단 보드는 항상 양극이고 상단 보드는 항상 접지(플로팅)되었습니다. 챔버 벽은 입자 손실을 방지하기 위해 전기적으로 접지된 알루미늄 호일로 덮여 있습니다. 챔버에는 밀폐된 전면 로딩 도어가 있어 테스트 표면을 플라스틱 랙에 올려놓고 바닥 금속판에서 들어 올려 고전압 간섭을 피할 수 있습니다.
EPES에서 EWNS의 증착 효율은 보충 그림 S111에 자세히 설명된 기존에 개발된 프로토콜에 따라 계산되었습니다.
제어실로서, 원통형 챔버를 통과하는 두 번째 흐름은 중간 HEPA 필터를 통해 EPES 시스템과 직렬로 연결되어 EWNS를 제거합니다. 그림 2c에서 볼 수 있듯이, EWNS 에어로졸은 직렬로 연결된 두 개의 챔버를 통해 펌핑되었습니다. 제어실과 EPES 사이의 필터는 남아 있는 EWNS를 제거하여 동일한 온도(T), 상대 습도(RH), 오존 농도를 유지합니다.
대장균(ATCC #27325), 대변 지표, 살모넬라 엔테리카(ATCC #53647), 식품 병원균, 병원성 리스테리아 모노사이토제네스의 대체균인 리스테리아 이노콰(ATCC #33090), 부패 효모의 대체균인 사카로미세스 세레비시아(ATCC #4098), 내성이 더 강한 생균인 마이코박테리움 파라포르투이투스(ATCC #19686) 등 중요한 식품 매개 미생물이 신선 농산물을 오염시키는 것으로 밝혀졌습니다. 이러한 미생물은 ATCC(버지니아주 매너서스)에서 구입했습니다.
지역 마트에서 유기농 방울토마토 상자를 무작위로 구매하여 사용하기 전까지 4°C에서 냉장 보관하세요(최대 3일). 지름 약 1/2인치(약 1.2cm) 크기의 토마토를 선택하여 실험해 보세요.
배양, 접종, 노출 및 군집 계수 프로토콜은 이전 논문에 자세히 기술되어 있으며, 보충 자료 11에 자세히 설명되어 있습니다. EWNS 성능은 접종된 토마토를 40,000 #/cm³의 농도로 45분 동안 노출시켜 평가했습니다. 간단히 말해, t = 0분에 토마토 세 개를 사용하여 생존 미생물을 평가했습니다. 토마토 세 개를 EPES에 넣고 40,000 #/cc의 농도로 EWNS에 노출시켰고(EWNS 노출 토마토), 나머지 세 개는 대조군(대조군 토마토)에 두었습니다. 토마토 군에는 추가 처리를 하지 않았습니다. EWNS에 노출된 토마토와 대조군은 45분 후 꺼내 EWNS의 효과를 평가했습니다.
각 실험은 3회 반복하여 수행되었습니다. 데이터 분석은 보충 자료에 기술된 프로토콜에 따라 수행되었습니다.
EWNS(45분, EWNS 에어로졸 농도 40,000 #/cm3)에 노출된 대장균, 엔테로박터, 리스테리아 이노쿠아 박테리아 샘플과 노출되지 않은 샘플을 펠릿화하여 불활성화 기전을 평가했습니다. 침전물은 2.5% 글루타르알데히드, 1.25% 파라포름알데히드, 0.03% 피크르산 고정액이 포함된 0.1 M 카코딜산나트륨 용액(pH 7.4)에 실온에서 2시간 동안 고정했습니다. 세척 후, 1% 사산화오스뮴(OsO4)/1.5% 페로시안화칼륨(KFeCN6)으로 2시간 동안 고정하고, 물로 3회 세척한 후 1% 우라닐 아세테이트에서 1시간 동안 배양하고 물로 2회 세척했습니다. 이후 50%, 70%, 90%, 100% 알코올로 각각 10분씩 탈수했습니다. 샘플을 프로필렌 옥사이드에 1시간 동안 담근 후, 프로필렌 옥사이드와 TAAP Epon(Marivac Canada Inc., St. Laurent, CA)의 1:1 혼합물에 함침시켰다. 샘플을 TAAB Epon에 포매하고 60°C에서 48시간 동안 중합시켰다. 경화된 과립형 수지를 절단하여 AMT 2k CCD 카메라(Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, MA, USA)가 장착된 기존 투과 전자 현미경인 JEOL 1200EX(JEOL, Tokyo, Japan)를 사용하여 TEM으로 시각화하였다.
모든 실험은 3회 반복하여 수행되었습니다. 각 시점마다 세균 세척액을 3회 반복하여 도말하여, 각 시점당 총 9개의 데이터 포인트를 얻었으며, 이 평균값을 해당 미생물의 세균 농도로 사용했습니다. 표준 편차는 측정 오차로 사용되었습니다. 모든 포인트가 유효합니다.
t = 0분과 비교한 박테리아 농도 감소의 로그는 다음 공식을 사용하여 계산되었습니다.
여기서 C0는 시간 0(즉, 표면이 건조되었지만 챔버에 넣기 전)에서 대조 샘플의 박테리아 농도이고 Cn은 노출 후 n분 후 표면에 있는 박테리아 농도입니다.
45분 노출 기간 동안 박테리아의 자연적 분해를 설명하기 위해 45분 동안의 대조군과 비교하여 Log-Reduction도 다음과 같이 계산되었습니다.
여기서 Cn은 시점 n에서 대조군 샘플의 박테리아 농도이고, Cn-Control은 시점 n에서 대조군 박테리아 농도입니다. 데이터는 대조군(EWNS 노출 없음) 대비 로그 감소로 표시됩니다.
연구 동안, 테일러 콘 형성, 테일러 콘 안정성, EWNS 생성 안정성 및 재현성 측면에서 바늘과 상대 전극 사이의 전압과 거리의 여러 조합이 평가되었습니다. 다양한 조합이 보충 표 S1에 나와 있습니다. 안정적이고 재현 가능한 특성(테일러 콘, EWNS 생성 및 시간 경과에 따른 안정성)을 보여주는 완전한 연구를 위해 두 가지 사례가 선택되었습니다. 그림 3은 두 가지 사례에 대한 ROS의 전하, 크기 및 함량에 대한 결과를 보여줍니다. 결과는 표 1에도 요약되어 있습니다. 참고로, 그림 3과 표 1에는 이전에 합성된 최적화되지 않은 EWNS8, 9, 10, 11(기준선-EWNS)의 특성이 포함되어 있습니다. 양측 t-검정을 사용한 통계적 유의성 계산은 보충 표 S2에 다시 게시되었습니다. 또한, 추가 데이터에는 상대 전극 샘플링 구멍 직경(D)과 접지 전극과 바늘 끝 사이의 거리(L)의 영향에 대한 연구가 포함됩니다(보충 그림 S2 및 S3).
(a–c) AFM 크기 분포. (d–f) 표면 전하 특성. (g) ROS 및 ESR 특성.
위의 모든 조건에서 측정된 이온화 전류는 2~6µA 범위였고, 전압은 -3.8~-6.5kV 범위였으며, 이로 인해 이 단일 단자 EWNS의 전력 소비량은 50mW 미만이었습니다. 생성 모듈. EWNS는 고압 하에서 합성되었지만, 오존 농도는 매우 낮아 60ppb를 넘지 않았습니다.
보충 그림 S4는 각각 [-6.5 kV, 4.0 cm] 및 [-3.8 kV, 0.5 cm] 시나리오에 대한 시뮬레이션된 전기장을 보여줍니다. [-6.5 kV, 4.0 cm] 및 [-3.8 kV, 0.5 cm] 시나리오에 따른 전기장은 각각 2 × 105 V/m 및 4.7 × 105 V/m로 계산됩니다. 이는 두 번째 경우에서 전압 대 거리 비율이 훨씬 높기 때문에 예상된 결과입니다.
그림 3a, b는 AFM8로 측정한 EWNS 직경을 보여줍니다. [-6.5 kV, 4.0 cm]와 [-3.8 kV, 0.5 cm] 시나리오에 대한 평균 EWNS 직경은 각각 27 nm와 19 nm로 계산되었습니다. [-6.5 kV, 4.0 cm]와 [-3.8 kV, 0.5 cm] 경우에 대한 분포의 기하 표준 편차는 각각 1.41과 1.45로 좁은 크기 분포를 나타냅니다. 평균 크기와 기하 표준 편차는 모두 기준선 EWNS에 매우 가까워 각각 25 nm와 1.41입니다. 그림 3c는 동일한 조건에서 동일한 방법을 사용하여 측정한 기준선 EWNS의 크기 분포를 보여줍니다.
그림 3d, e는 전하 특성 분석 결과를 보여줍니다. 데이터는 농도(#/cm3)와 전류(I)를 동시에 30회 측정한 결과의 평균값입니다. 분석 결과, EWNS의 평균 전하는 [-6.5 kV, 4.0 cm] 및 [-3.8 kV, 0.5 cm]에서 각각 22 ± 6 e- 및 44 ± 6 e-인 것으로 나타났습니다. Baseline-EWNS(10 ± 2 e-)와 비교했을 때, 표면 전하는 [-6.5 kV, 4.0 cm] 시나리오의 두 배, [-3.8 kV, 0.5 cm] 시나리오의 네 배로 상당히 높습니다. 3f는 기본 EWNS 지불 데이터를 보여줍니다.
EWNS 수 농도 지도(보충 그림 S5 및 S6)에서 [-6.5 kV, 4.0 cm] 장면이 [-3.8 kV, 0.5 cm] 장면보다 입자 수가 훨씬 더 많음을 알 수 있습니다. 또한, EWNS 수 농도는 최대 4시간 동안 모니터링되었으며(보충 그림 S5 및 S6), 두 경우 모두 EWNS 생성 안정성이 동일한 수준의 입자 수 농도를 보였다는 점에도 주목해야 합니다.
그림 3g는 [-6.5 kV, 4.0 cm]에서 최적화된 EWNS에 대한 대조군(배경) 제거 후 EPR 스펙트럼을 보여줍니다. ROS 스펙트럼은 이전에 발표된 논문에서 EWNS 기준선과도 비교되었습니다. 스핀 트랩과 반응하는 EWNS의 계산된 수는 7.5 × 104 EWNS/s로, 이전에 발표된 Baseline-EWNS8과 유사합니다. EPR 스펙트럼은 두 가지 유형의 ROS가 존재함을 명확히 나타냈는데, O2-가 우세한 반면 OH•는 더 적은 양으로 존재했습니다. 또한, 피크 강도를 직접 비교한 ​​결과, 최적화된 EWNS는 기준선 EWNS에 비해 ROS 함량이 상당히 높았습니다.
그림 4는 EPES에서 EWNS의 증착 효율을 보여줍니다. 이 데이터는 표 I에 요약되어 있으며, 원래 EWNS 데이터와 비교되었습니다. 두 EUNS 모두 3.0 kV의 낮은 전압에서도 증착 효율이 100%에 가까웠습니다. 일반적으로 3.0 kV면 표면 전하 변화에 관계없이 100% 증착을 달성하기에 충분합니다. 동일한 조건에서 Baseline-EWNS의 증착 효율은 낮은 전하(EWNS당 평균 전자 10개)로 인해 56%에 불과했습니다.
그림 5와 표 2는 최적 조건 [-6.5 kV, 4.0 cm]에서 토마토 표면에 접종된 미생물을 약 40,000 #/cm3의 EWNS에 45분간 노출시킨 후 불활성화 정도를 요약한 것입니다. 접종된 대장균과 리스테리아 이노쿠아는 45분 노출 후 3.8 log의 유의미한 감소를 보였습니다. 동일한 조건에서 S. enterica는 2.2 log의 낮은 감소를 보인 반면, S. cerevisiae와 M. parafortuitum은 1.0 log의 감소를 보였습니다.
EWNS에 의해 유도된 물리적 변화로 인해 불활성화된 대장균, 살모넬라 엔테리카, 리스테리아 이노쿠아 세포를 보여주는 전자현미경 사진(그림 6). 대조군 세균은 세포막이 온전한 반면, 노출된 세균은 세포막이 손상되었다.
대조군과 노출된 박테리아의 전자현미경 이미징 결과 세포막 손상이 드러났습니다.
최적화된 EWNS의 물리화학적 특성에 대한 데이터는 EWNS 특성(표면 전하 및 ROS 함량)이 이전에 발표된 EWNS 기준 데이터8,9,10,11에 비해 상당히 개선되었음을 전체적으로 보여줍니다. 반면, 크기는 나노미터 범위로 유지되었는데, 이는 이전에 발표된 결과와 매우 유사하여 공기 중에 장시간 머무를 수 있었습니다. 관찰된 다분산성은 표면 전하의 변화로 설명될 수 있으며, 이는 레일리 효과의 크기, 무작위성 및 EWNS의 잠재적 병합을 결정합니다. 그러나 Nielsen et al.22에서 자세히 설명했듯이, 높은 표면 전하는 물방울의 표면 에너지/장력을 효과적으로 증가시켜 증발을 줄입니다. 이 이론은 이전 논문8에서 미세액적22과 EWNS에 대해 실험적으로 확인되었습니다. 시간 경과에 따른 손실 또한 크기에 영향을 미치고 관찰된 크기 분포에 영향을 미칠 수 있습니다.
또한, 구조당 전하는 상황에 따라 약 22~44 e-로, 구조당 평균 전하량이 10 ± 2인 기본 EWNS에 비해 상당히 높습니다. 그러나 이는 EWNS의 평균 전하량이라는 점에 유의해야 합니다. Seto 등은 전하가 균일하지 않고 대수 정규 분포를 따르는 것으로 나타났습니다.21. 이전 연구와 비교했을 때, 표면 전하를 두 배로 늘리면 EPES 시스템의 증착 효율이 거의 100%11로 두 배 증가합니다.