از بازدید شما از Nature.com متشکریم. شما از نسخه مرورگری با پشتیبانی محدود از CSS استفاده می‌کنید. برای بهترین تجربه، توصیه می‌کنیم از یک مرورگر به‌روز استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در Internet Explorer غیرفعال کنید). علاوه بر این، برای اطمینان از پشتیبانی مداوم، سایت را بدون استایل‌ها و جاوا اسکریپت نمایش می‌دهیم.
اخیراً، یک پلتفرم ضدمیکروبی عاری از مواد شیمیایی مبتنی بر فناوری نانو با استفاده از نانوساختارهای مصنوعی آب (EWNS) توسعه داده شده است. EWNS دارای بار سطحی بالایی است و سرشار از گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) است که می‌توانند با تعدادی از میکروارگانیسم‌ها، از جمله پاتوژن‌های غذایی، تعامل داشته و آنها را غیرفعال کنند. در اینجا نشان داده شده است که خواص آنها در طول سنتز می‌تواند به دقت تنظیم و بهینه شود تا پتانسیل ضدباکتریایی آنها بیشتر افزایش یابد. پلتفرم آزمایشگاهی EWNS برای تنظیم دقیق خواص EWNS با تغییر پارامترهای سنتز طراحی شده است. توصیف خواص EWNS (بار، اندازه و محتوای ROS) با استفاده از روش‌های تحلیلی مدرن انجام شد. علاوه بر این، میکروارگانیسم‌های غذایی مانند اشریشیا کلی، سالمونلا انتریکا، لیستریا اینوکوا، مایکوباکتریوم پارا فورتیتوم و ساکارومایسس سرویزیه بر روی سطح گوجه فرنگی‌های انگوری ارگانیک تلقیح شدند تا پتانسیل غیرفعال‌سازی میکروبی آنها ارزیابی شود. نتایج ارائه شده در اینجا نشان می‌دهد که خواص EWNS را می‌توان در طول سنتز به دقت تنظیم کرد و در نتیجه راندمان غیرفعال‌سازی را به طور نمایی افزایش داد. به طور خاص، بار سطحی چهار برابر افزایش یافت و محتوای ROS نیز افزایش یافت. نرخ حذف میکروبی به عوامل میکروبی وابسته بود و پس از ۴۵ دقیقه قرار گرفتن در معرض دوز آئروسل ۴۰۰۰۰ #/cm3 EWNS، از ۱.۰ تا ۳.۸ لگاریتم متغیر بود.
آلودگی میکروبی علت اصلی بیماری‌های ناشی از غذا است که در اثر مصرف عوامل بیماری‌زا یا سموم آنها ایجاد می‌شود. بیماری‌های ناشی از غذا سالانه حدود 76 میلیون مورد بیماری، 325000 مورد بستری در بیمارستان و 5000 مورد مرگ را فقط در ایالات متحده به خود اختصاص می‌دهد. علاوه بر این، وزارت کشاورزی ایالات متحده (USDA) تخمین می‌زند که افزایش مصرف محصولات تازه، عامل 48 درصد از کل بیماری‌های ناشی از غذا گزارش شده در ایالات متحده است. هزینه بیماری و مرگ ناشی از عوامل بیماری‌زای ناشی از غذا در ایالات متحده بسیار بالاست و توسط مراکز کنترل و پیشگیری از بیماری‌ها (CDC) بیش از 15.6 میلیارد دلار آمریکا در سال تخمین زده شده است.
در حال حاضر، مداخلات ضدمیکروبی شیمیایی4، پرتویی5 و حرارتی6 برای اطمینان از ایمنی مواد غذایی، عمدتاً در نقاط کنترل بحرانی (CCP) محدود در زنجیره تولید (معمولاً پس از برداشت و/یا در حین بسته‌بندی) اجرا می‌شوند، نه اینکه به طور مداوم به گونه‌ای اجرا شوند که محصولات تازه در معرض آلودگی متقاطع قرار گیرند. مداخلات ضدمیکروبی برای کنترل بهتر بیماری‌های ناشی از غذا و فساد مواد غذایی مورد نیاز هستند و می‌توانند در سراسر زنجیره از مزرعه تا سفره اعمال شوند. تأثیر و هزینه کمتر.
اخیراً یک پلتفرم ضدمیکروبی عاری از مواد شیمیایی مبتنی بر فناوری نانو برای غیرفعال کردن باکتری‌ها روی سطوح و در هوا با استفاده از نانوساختارهای مصنوعی آب (EWNS) توسعه داده شده است. برای سنتز EVNS، از دو فرآیند موازی استفاده شد: الکترواسپری و یونیزاسیون آب (شکل 1a). قبلاً نشان داده شده است که EWNS مجموعه‌ای منحصر به فرد از خواص فیزیکی و بیولوژیکی دارد8،9،10. EWNS به طور متوسط ​​10 الکترون در هر ساختار و اندازه نانومتری متوسط ​​25 نانومتر دارد (شکل 1b، c)8،9،10. علاوه بر این، رزونانس اسپین الکترون (ESR) نشان داد که EWNS حاوی مقدار زیادی گونه‌های فعال اکسیژن (ROS)، عمدتاً رادیکال‌های هیدروکسیل (OH•) و سوپراکسید (O2-) است (شکل 1c)8. EWNS برای مدت طولانی در هوا باقی می‌ماند و می‌تواند با میکروب‌های معلق در هوا و موجود روی سطوح برخورد کند، بار ROS خود را آزاد کند و باعث غیرفعال شدن میکروبی شود (شکل 1d). این مطالعات اولیه همچنین نشان دادند که EWNS می‌تواند با باکتری‌های گرم منفی و گرم مثبت مختلف دارای اهمیت برای سلامت عمومی، از جمله مایکوباکتری‌ها، روی سطوح و در هوا تعامل داشته و آنها را غیرفعال کند. میکروسکوپ الکترونی عبوری نشان داد که این غیرفعال شدن ناشی از اختلال در غشای سلولی است. علاوه بر این، مطالعات استنشاقی حاد نشان داده‌اند که دوزهای بالای EWNS باعث آسیب یا التهاب ریه نمی‌شوند.
(الف) الکترواسپری زمانی رخ می‌دهد که ولتاژ بالایی بین یک لوله مویین حاوی مایع و یک الکترود مقابل اعمال شود. (ب) اعمال ولتاژ بالا منجر به دو پدیده مختلف می‌شود: (۱) الکترواسپری آب و (۲) تولید گونه‌های فعال اکسیژن (یون‌ها) به دام افتاده در EWNS. (ج) ساختار منحصر به فرد EWNS. (د) EWNS به دلیل ماهیت نانومقیاس خود بسیار متحرک هستند و می‌توانند با عوامل بیماری‌زای موجود در هوا تعامل داشته باشند.
توانایی پلتفرم ضدمیکروبی EWNS در غیرفعال کردن میکروارگانیسم‌های منتقله از غذا روی سطح غذای تازه نیز اخیراً نشان داده شده است. همچنین نشان داده شده است که می‌توان از بار سطحی EWNS در ترکیب با میدان الکتریکی برای رسانش هدفمند استفاده کرد. مهم‌تر از آن، نتیجه اولیه امیدوارکننده‌ای از کاهش تقریباً ۱.۴ لگاریتمی در فعالیت گوجه‌فرنگی ارگانیک در برابر میکروارگانیسم‌های مختلف غذایی مانند E. coli و Listeria در عرض ۹۰ دقیقه پس از قرار گرفتن در معرض EWNS با غلظت تقریبی ۵۰۰۰۰ #/cm311 مشاهده شد. علاوه بر این، آزمایش‌های اولیه ارزیابی حسی هیچ اثر حسی در مقایسه با گوجه‌فرنگی کنترل نشان ندادند. اگرچه این نتایج غیرفعال‌سازی اولیه، ایمنی غذا را حتی در دوزهای بسیار پایین EWNS یعنی ۵۰۰۰۰ #/cc نوید می‌دهد. ببینید، واضح است که پتانسیل غیرفعال‌سازی بالاتر برای کاهش بیشتر خطر عفونت و فساد مفیدتر خواهد بود.
در اینجا، ما تحقیقات خود را بر توسعه یک پلتفرم تولید EWNS برای تنظیم دقیق پارامترهای سنتز و بهینه‌سازی خواص فیزیکوشیمیایی EWNS برای افزایش پتانسیل ضد باکتریایی آنها متمرکز خواهیم کرد. به طور خاص، بهینه‌سازی بر افزایش بار سطحی آنها (برای بهبود رسانش هدفمند) و محتوای ROS (برای بهبود راندمان غیرفعال‌سازی) متمرکز شده است. توصیف خواص فیزیکوشیمیایی بهینه شده (اندازه، بار و محتوای ROS) با استفاده از روش‌های تحلیلی مدرن و با استفاده از میکروارگانیسم‌های غذایی رایج مانند E. coli، S. enterica، L. innocua، S. cerevisiae و M. parafortuitum.
EVNS با الکترواسپری و یونیزاسیون همزمان آب با خلوص بالا (18 MΩ cm-1) سنتز شد. اتمایزر الکتریکی 12 معمولاً برای اتمایز کردن مایعات و ذرات پلیمری و سرامیکی مصنوعی 13 و الیاف 14 با اندازه کنترل شده استفاده می‌شود.
همانطور که در نشریات قبلی 8، 9، 10، 11 به تفصیل شرح داده شده است، در یک آزمایش معمول، ولتاژ بالایی بین یک لوله مویین فلزی و یک الکترود شمارنده متصل به زمین اعمال می‌شود. در طول این فرآیند، دو پدیده مختلف رخ می‌دهد: 1) الکترواسپری و 2) یونیزاسیون آب. یک میدان الکتریکی قوی بین دو الکترود باعث ایجاد بارهای منفی روی سطح آب تغلیظ شده می‌شود و در نتیجه مخروط‌های تیلور تشکیل می‌شوند. در نتیجه، قطرات آب با بار بالا تشکیل می‌شوند که طبق نظریه ریلی16 به تجزیه شدن به ذرات کوچکتر ادامه می‌دهند. در همان زمان، یک میدان الکتریکی قوی باعث می‌شود برخی از مولکول‌های آب شکافته شده و الکترون‌ها را از دست بدهند (یونیزاسیون)، در نتیجه مقدار زیادی گونه‌های فعال اکسیژن (ROS)17 تولید می‌شود. بسته‌های ROS18 که به طور همزمان تولید می‌شوند در EWNS کپسوله شدند (شکل 1c).
شکل 2a سیستم تولید EWNS توسعه‌یافته و مورد استفاده در سنتز EWNS در این مطالعه را نشان می‌دهد. آب تصفیه‌شده ذخیره‌شده در یک بطری دربسته از طریق یک لوله تفلونی (با قطر داخلی 2 میلی‌متر) به یک سوزن استیل ضد زنگ 30G (لوله مویین فلزی) تغذیه شد. همانطور که در شکل 2b نشان داده شده است، جریان آب توسط فشار هوای داخل بطری کنترل می‌شود. سوزن به یک کنسول تفلونی متصل است که می‌توان آن را به صورت دستی در فاصله مشخصی از الکترود شمارنده تنظیم کرد. الکترود شمارنده یک دیسک آلومینیومی صیقلی با سوراخی در وسط برای نمونه‌برداری است. در زیر الکترود شمارنده یک قیف نمونه‌برداری آلومینیومی وجود دارد که از طریق یک دریچه نمونه‌برداری به بقیه تجهیزات آزمایش متصل است (شکل 2b). تمام اجزای نمونه‌گیر به صورت الکتریکی به زمین متصل شده‌اند تا از تجمع بار که می‌تواند نمونه‌برداری ذرات را مختل کند، جلوگیری شود.
(الف) سامانه تولید نانوساختار آب مهندسی‌شده (EWNS). (ب) برش عرضی نمونه‌بردار و واحد الکترواسپری که مهم‌ترین پارامترها را نشان می‌دهد. (ج) چیدمان آزمایش برای غیرفعال‌سازی باکتری‌ها.
سیستم تولید EWNS که در بالا توضیح داده شد، قادر به تغییر پارامترهای کلیدی عملیاتی برای تسهیل تنظیم دقیق خواص EWNS است. ولتاژ اعمال شده (V)، فاصله بین سوزن و الکترود شمارنده (L) و جریان آب (φ) از طریق لوله مویین را برای تنظیم دقیق ویژگی‌های EWNS تنظیم کنید. نمادهای [V (kV)، L (cm)] برای نشان دادن ترکیبات مختلف استفاده می‌شوند. جریان آب را تنظیم کنید تا یک مخروط تیلور پایدار از یک مجموعه خاص [V، L] بدست آید. برای اهداف این مطالعه، دهانه الکترود شمارنده (D) روی 0.5 اینچ (1.29 سانتی‌متر) تنظیم شد.
با توجه به هندسه محدود و عدم تقارن، قدرت میدان الکتریکی را نمی‌توان از اصول اولیه محاسبه کرد. در عوض، از نرم‌افزار QuickField™ (Svendborg، دانمارک)19 برای محاسبه میدان الکتریکی استفاده شد. میدان الکتریکی یکنواخت نیست، بنابراین مقدار میدان الکتریکی در نوک مویرگ به عنوان مقدار مرجع برای پیکربندی‌های مختلف استفاده شد.
در طول مطالعه، چندین ترکیب ولتاژ و فاصله بین سوزن و الکترود مقابل از نظر تشکیل مخروط تیلور، پایداری مخروط تیلور، پایداری تولید EWNS و تکرارپذیری ارزیابی شدند. ترکیبات مختلف در جدول تکمیلی S1 نشان داده شده است.
خروجی سیستم تولید EWNS مستقیماً به یک دستگاه اندازه‌گیری ذرات با قابلیت تحرک اسکن (SMPS، مدل 3936، TSI، شورویو، مینه سوتا) متصل شد تا غلظت تعداد ذرات اندازه‌گیری شود و با یک الکترومتر آئروسل فارادی (TSI، مدل 3068B، شورویو، ایالات متحده آمریکا). MN) برای اندازه‌گیری جریان آئروسل، همانطور که در نشریه قبلی ما 9 توضیح داده شده است، استفاده شد. هم SMPS و هم الکترومتر آئروسل با سرعت جریان 0.5 لیتر در دقیقه (جریان کل نمونه 1 لیتر در دقیقه) نمونه‌برداری شدند. غلظت ذرات و شار آئروسل به مدت 120 ثانیه اندازه‌گیری شد. اندازه‌گیری را 30 بار تکرار کنید. بار کل آئروسل از اندازه‌گیری‌های جریان محاسبه می‌شود و میانگین بار EWNS از تعداد کل ذرات EWNS نمونه‌برداری شده تخمین زده می‌شود. میانگین هزینه EWNS را می‌توان با استفاده از معادله (1) محاسبه کرد:
که در آن IEl جریان اندازه‌گیری شده، NSMPS غلظت عددی اندازه‌گیری شده با SMPS و φEl سرعت جریان ورودی به الکترومتر است.
از آنجا که رطوبت نسبی (RH) بر بار سطحی تأثیر می‌گذارد، دما و (RH) در طول آزمایش به ترتیب در دمای ۲۱ درجه سانتیگراد و ۴۵ درصد ثابت نگه داشته شدند.
میکروسکوپ نیروی اتمی (AFM)، دستگاه Asylum MFP-3D (Asylum Research، سانتا باربارا، کالیفرنیا) و پروب AC260T (Olympus، توکیو، ژاپن) برای اندازه‌گیری اندازه و طول عمر EWNS استفاده شدند. نرخ اسکن AFM برابر با 1 هرتز و مساحت اسکن 5 میکرومتر × 5 میکرومتر با 256 خط اسکن است. همه تصاویر با استفاده از نرم‌افزار Asylum (ماسک با محدوده 100 نانومتر و آستانه 100 پیکومتر) تحت هم‌ترازی تصویر مرتبه اول قرار گرفتند.
قیف نمونه‌برداری را بردارید و سطح میکا را به مدت متوسط ​​۱۲۰ ثانیه در فاصله ۲ سانتی‌متر از الکترود شمارنده قرار دهید تا از به هم پیوستن ذرات و تشکیل قطرات نامنظم روی سطح میکا جلوگیری شود. EWNS مستقیماً روی سطوح میکای تازه برش خورده (تد پلا، ردینگ، کالیفرنیا) اعمال شد. بلافاصله پس از پاشش، سطح میکا با استفاده از AFM مشاهده شد. زاویه تماس سطح میکای اصلاح نشده تازه برش خورده نزدیک به ۰ درجه است، بنابراین EWNS به شکل گنبدی روی سطح میکا منتشر می‌شود20. قطر (a) و ارتفاع (h) قطرات پخش شونده مستقیماً از توپوگرافی AFM اندازه‌گیری و برای محاسبه حجم انتشار گنبدی EWNS با استفاده از روش قبلاً تأیید شده ما ۸ استفاده شد. با فرض اینکه EVNS روی برد حجم یکسانی دارد، قطر معادل را می‌توان از معادله (2) محاسبه کرد:
مطابق با روش توسعه‌یافته قبلی ما، از یک تله اسپین رزونانس الکترونی (ESR) برای تشخیص وجود واسطه‌های رادیکالی کوتاه‌عمر در EWNS استفاده شد. آئروسل‌ها از محلولی حاوی 235 میلی‌مولار DEPMPO (5-(دی‌اتوکسی‌فسفوریل)-5-متیل-1-پیرولین-N-اکسید) (Oxis International Inc.، پورتلند، اورگان) عبور داده شدند. تمام اندازه‌گیری‌های EPR با استفاده از طیف‌سنج Bruker EMX (Bruker Instruments Inc. Billerica، MA، ایالات متحده آمریکا) و آرایه‌های سلولی مسطح انجام شد. از نرم‌افزار Acquisit (Bruker Instruments Inc. Billerica، MA، ایالات متحده آمریکا) برای جمع‌آوری و تجزیه و تحلیل داده‌ها استفاده شد. توصیف ROS فقط برای مجموعه‌ای از شرایط عملیاتی [-6.5 کیلوولت، 4.0 سانتی‌متر مربع] انجام شد. غلظت EWNS پس از در نظر گرفتن از دست دادن EWNS در ضربه‌گیر، با استفاده از SMPS اندازه‌گیری شد.
سطوح ازن با استفاده از دستگاه 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Co)8،9،10 پایش شدند.
برای همه ویژگی‌های EWNS، مقدار اندازه‌گیری، میانگین اندازه‌گیری‌ها و خطای اندازه‌گیری، انحراف معیار است. آزمون t برای مقایسه مقدار ویژگی EWNS بهینه‌شده با مقدار متناظر EWNS پایه انجام شد.
شکل 2c یک سیستم رسوب الکترواستاتیک عبوری (EPES) که قبلاً توسعه یافته و مشخصه‌یابی شده است را نشان می‌دهد که می‌تواند برای هدف‌گیری EWNS11 به سطوح استفاده شود. EPES از یک بار EWNS در ترکیب با یک میدان الکتریکی قوی برای "نشانه‌گیری" مستقیم به سطح هدف استفاده می‌کند. جزئیات سیستم EPES در یک نشریه اخیر توسط Pyrgiotakis و همکارانش ارائه شده است. بنابراین، EPES شامل یک محفظه PVC چاپ سه‌بعدی با انتهای مخروطی حاوی دو صفحه فلزی موازی از جنس استیل ضد زنگ (فولاد ضد زنگ 304، صیقل آینه‌ای) در وسط با فاصله 15.24 سانتی‌متر است. تخته‌ها به یک منبع ولتاژ بالای خارجی (Bertran 205B-10R، Spellman، Hauppauge، NY) متصل بودند، تخته پایینی همیشه مثبت و تخته بالایی همیشه زمین شده (شناور) بود. دیواره‌های محفظه با فویل آلومینیومی پوشانده شده‌اند که برای جلوگیری از اتلاف ذرات، به صورت الکتریکی زمین شده است. محفظه دارای یک درب بارگذاری جلویی مهر و موم شده است که به سطوح آزمایش اجازه می‌دهد روی قفسه‌های پلاستیکی قرار گیرند و آنها را از صفحه فلزی پایینی بلند کنند تا از تداخل ولتاژ بالا جلوگیری شود.
راندمان رسوب‌گذاری EWNS در EPES طبق پروتکل توسعه‌یافته قبلی که جزئیات آن در شکل تکمیلی S111 آمده است، محاسبه شد.
به عنوان یک محفظه کنترل، جریان دوم از طریق محفظه استوانه‌ای به صورت سری با سیستم EPES با استفاده از یک فیلتر HEPA میانی برای حذف EWNS متصل می‌شود. همانطور که در شکل 2c نشان داده شده است، آئروسل EWNS از طریق دو محفظه متصل به صورت سری پمپ شد. فیلتر بین اتاق کنترل و EPES هرگونه EWNS باقی مانده را حذف می‌کند و در نتیجه دما (T)، رطوبت نسبی (RH) و سطح ازن یکسان می‌شود.
میکروارگانیسم‌های مهم منتقله از طریق غذا که محصولات تازه را آلوده می‌کنند، عبارتند از اشریشیا کلی (ATCC #27325)، یک شاخص مدفوعی، سالمونلا انتریکا (ATCC #53647)، یک پاتوژن منتقله از طریق غذا، لیستریا اینوکوا (ATCC #33090)، جایگزینی برای لیستریا مونوسیتوژنز بیماری‌زا. ساکارومایسس سرویزیه (ATCC #4098) به عنوان جایگزینی برای مخمر فاسد، و مایکوباکتریوم پارافورتوئیتوس (ATCC #19686) به عنوان یک باکتری زنده مقاوم‌تر از ATCC (ماناساس، ویرجینیا) خریداری شدند.
به طور تصادفی جعبه‌های گوجه‌فرنگی انگوری ارگانیک را از بازار محلی خود خریداری کنید و تا زمان استفاده (حداکثر ۳ روز) در دمای ۴ درجه سانتیگراد نگهداری کنید. گوجه‌فرنگی‌ها را برای آزمایش با یک اندازه، با قطر حدود ۱/۲ اینچ، انتخاب کنید.
پروتکل‌های انکوباسیون، تلقیح، مواجهه و شمارش کلنی در نشریات قبلی ما به تفصیل شرح داده شده و در داده‌های تکمیلی ۱۱ به تفصیل توضیح داده شده است. عملکرد EWNS با قرار دادن گوجه‌فرنگی‌های تلقیح شده در معرض ۴۰۰۰۰ #/cm3 به مدت ۴۵ دقیقه ارزیابی شد. به طور خلاصه، در زمان t = 0 دقیقه، از سه گوجه‌فرنگی برای ارزیابی میکروارگانیسم‌های زنده مانده استفاده شد. سه گوجه‌فرنگی در EPES قرار داده شدند و در معرض ۴۰۰۰۰ #/cc در معرض EWNS قرار گرفتند (گوجه‌فرنگی‌های مواجهه یافته با EWNS) و سه گوجه‌فرنگی دیگر در محفظه کنترل (گوجه‌فرنگی‌های کنترل) قرار گرفتند. هیچ یک از گروه‌های گوجه‌فرنگی تحت پردازش اضافی قرار نگرفتند. گوجه‌فرنگی‌های مواجهه یافته با EWNS و گروه کنترل پس از ۴۵ دقیقه برای ارزیابی اثر EWNS حذف شدند.
هر آزمایش در سه تکرار انجام شد. تجزیه و تحلیل داده‌ها طبق پروتکل شرح داده شده در داده‌های تکمیلی انجام شد.
نمونه‌های باکتریایی E. coli، Enterobacter و L. innocua که در معرض EWNS (45 دقیقه، غلظت آئروسل EWNS 40000 #/cm3) قرار گرفته بودند و در معرض آن قرار نگرفته بودند، برای ارزیابی مکانیسم‌های غیرفعال‌سازی، رسوب‌گذاری شدند. رسوب به مدت 2 ساعت در دمای اتاق در محلول 0.1 مولار سدیم کاکودیلات (pH 7.4) با تثبیت‌کننده 2.5٪ گلوتارآلدئید، 1.25٪ پارافرمالدهید و 0.03٪ اسید پیکریک تثبیت شد. پس از شستشو، آنها به مدت 2 ساعت با 1٪ تتراکسید اسمیوم (OsO4)/1.5٪ فروسیانید پتاسیم (KFeCN6) تثبیت شدند، 3 بار با آب شسته شدند و به مدت 1 ساعت در 1٪ استات اورانیل انکوبه شدند، سپس دو بار با آب شسته شدند. سپس به مدت 10 دقیقه با الکل 50٪، 70٪، 90٪ و 100٪ آبگیری شدند. سپس نمونه‌ها به مدت ۱ ساعت در اکسید پروپیلن قرار داده شدند و با مخلوط ۱:۱ اکسید پروپیلن و TAAP Epon (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA) آغشته شدند. نمونه‌ها در TAAB Epon قرار داده شده و به مدت ۴۸ ساعت در دمای ۶۰ درجه سانتیگراد پلیمریزه شدند. رزین دانه‌ای پخت شده برش داده شد و با استفاده از میکروسکوپ الکترونی عبوری معمولی JEOL 1200EX (JEOL، توکیو، ژاپن)، که یک میکروسکوپ الکترونی عبوری معمولی مجهز به دوربین AMT 2k CCD (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, MA, USA) است، توسط TEM مشاهده شد.
تمام آزمایش‌ها در سه تکرار انجام شد. برای هر نقطه زمانی، محلول‌های شستشوی باکتری در سه تکرار کشت داده شدند که در مجموع نه نقطه داده در هر نقطه وجود داشت که میانگین آنها به عنوان غلظت باکتری برای آن ارگانیسم خاص استفاده شد. انحراف معیار به عنوان خطای اندازه‌گیری در نظر گرفته شد. همه نقاط حساب می‌شوند.
لگاریتم کاهش غلظت باکتری‌ها در مقایسه با t = 0 دقیقه با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد:
که در آن C0 غلظت باکتری در نمونه کنترل در زمان 0 (یعنی پس از خشک شدن سطح اما قبل از قرار دادن در محفظه) و Cn غلظت باکتری روی سطح پس از n دقیقه قرار گرفتن در معرض آن است.
برای در نظر گرفتن تخریب طبیعی باکتری‌ها در طول دوره ۴۵ دقیقه‌ای قرار گرفتن در معرض نور، کاهش لگاریتمی نیز در مقایسه با نمونه کنترل در ۴۵ دقیقه به شرح زیر محاسبه شد:
که در آن Cn غلظت باکتری در نمونه کنترل در زمان n و Cn-Control غلظت باکتری‌های کنترل در زمان n است. داده‌ها به صورت لگاریتمی کاهش در مقایسه با کنترل (بدون مواجهه با EWNS) ارائه شده‌اند.
در طول مطالعه، چندین ترکیب ولتاژ و فاصله بین سوزن و الکترود شمارنده از نظر تشکیل مخروط تیلور، پایداری مخروط تیلور، پایداری تولید EWNS و تکرارپذیری ارزیابی شدند. ترکیبات مختلف در جدول تکمیلی S1 نشان داده شده‌اند. دو مورد برای یک مطالعه کامل انتخاب شدند که خواص پایدار و تکرارپذیر را نشان می‌دهند (مخروط تیلور، تولید EWNS و پایداری در طول زمان). شکل 3 نتایج مربوط به بار، اندازه و محتوای ROS را برای دو مورد نشان می‌دهد. نتایج همچنین در جدول 1 خلاصه شده‌اند. برای مرجع، شکل 3 و جدول 1 شامل خواص EWNS8، 9، 10، 11 سنتز شده قبلی (پایه-EWNS) هستند. محاسبات معناداری آماری با استفاده از آزمون t دو طرفه در جدول تکمیلی S2 بازنشر شده است. علاوه بر این، داده‌های اضافی شامل مطالعاتی در مورد تأثیر قطر سوراخ نمونه‌برداری الکترود شمارنده (D) و فاصله بین الکترود زمین و نوک سوزن (L) است (شکل‌های تکمیلی S2 و S3).
(الف-ج) توزیع اندازه AFM. (د-و) مشخصه بار سطحی. (ز) توصیف ROS و ESR.
همچنین لازم به ذکر است که برای همه شرایط فوق، جریان‌های یونیزاسیون اندازه‌گیری شده در محدوده ۲-۶ میکروآمپر و ولتاژها در محدوده -۳.۸ تا -۶.۵ کیلوولت بودند که منجر به مصرف برق کمتر از ۵۰ میلی‌وات برای این ماژول تولید EWNS تک ترمیناله می‌شود. اگرچه EWNS تحت فشار بالا سنتز شد، اما سطح ازن بسیار پایین بود و هرگز از ۶۰ ppb تجاوز نکرد.
شکل تکمیلی S4 میدان‌های الکتریکی شبیه‌سازی شده را به ترتیب برای سناریوهای [-6.5 کیلوولت، 4.0 سانتی‌متر] و [-3.8 کیلوولت، 0.5 سانتی‌متر] نشان می‌دهد. میدان‌ها طبق سناریوهای [-6.5 کیلوولت، 4.0 سانتی‌متر] و [-3.8 کیلوولت، 0.5 سانتی‌متر] به ترتیب 2 × 105 ولت بر متر و 4.7 × 105 ولت بر متر محاسبه شده‌اند. این قابل انتظار است، زیرا نسبت ولتاژ به فاصله در حالت دوم بسیار بیشتر است.
شکل‌های 3a و 3b قطر EWNS اندازه‌گیری شده با AFM8 را نشان می‌دهند. میانگین قطرهای EWNS برای سناریوهای [-6.5 کیلوولت، 4.0 سانتی‌متر] و [-3.8 کیلوولت، 0.5 سانتی‌متر] به ترتیب 27 نانومتر و 19 نانومتر محاسبه شدند. انحراف معیار هندسی توزیع‌ها برای موارد [-6.5 کیلوولت، 4.0 سانتی‌متر] و [-3.8 کیلوولت، 0.5 سانتی‌متر] به ترتیب 1.41 و 1.45 است که نشان‌دهنده توزیع اندازه باریک است. هم اندازه میانگین و هم انحراف معیار هندسی بسیار نزدیک به EWNS پایه هستند و به ترتیب 25 نانومتر و 1.41 هستند. شکل 3c توزیع اندازه EWNS پایه اندازه‌گیری شده با استفاده از همان روش تحت شرایط یکسان را نشان می‌دهد.
در شکل 3d، e نتایج مشخصه‌یابی بار را نشان می‌دهد. داده‌ها، اندازه‌گیری‌های میانگین 30 اندازه‌گیری همزمان غلظت (تعداد در هر سانتی‌متر مکعب) و جریان (I) هستند. تجزیه و تحلیل نشان می‌دهد که میانگین بار روی EWNS به ترتیب برای [-6.5 کیلوولت، 4.0 سانتی‌متر] و [-3.8 کیلوولت، 0.5 سانتی‌متر]، 22 ± 6 e- و 44 ± 6 e- است. در مقایسه با Baseline-EWNS (10 ± 2 e-)، بار سطحی آنها به طور قابل توجهی بالاتر است، دو برابر سناریوی [-6.5 کیلوولت، 4.0 سانتی‌متر] و چهار برابر سناریوی [-3.8 کیلوولت، 0.5 سانتی‌متر]. 3f داده‌های پرداخت پایه EWNS را نشان می‌دهد.
از نقشه‌های غلظت تعداد ذرات EWNS (شکل‌های تکمیلی S5 و S6)، می‌توان مشاهده کرد که صحنه [-6.5 کیلوولت، 4.0 سانتی‌متر مربع] تعداد ذرات بسیار بیشتری نسبت به صحنه [-3.8 کیلوولت، 0.5 سانتی‌متر مربع] دارد. همچنین باید توجه داشت که غلظت تعداد ذرات EWNS تا 4 ساعت (شکل‌های تکمیلی S5 و S6) مورد بررسی قرار گرفت، که در آن پایداری تولید EWNS در هر دو مورد، سطوح یکسانی از غلظت تعداد ذرات را نشان داد.
شکل 3g طیف EPR را پس از تفریق کنترل (زمینه) برای EWNS بهینه شده در [-6.5 کیلوولت، 4.0 سانتی‌متر] نشان می‌دهد. طیف ROS همچنین با خط پایه EWNS در یک مقاله منتشر شده قبلی مقایسه شده است. تعداد محاسبه شده EWNS که با تله اسپین واکنش می‌دهند 7.5 × 104 EWNS/s است که مشابه Baseline-EWNS8 منتشر شده قبلی است. طیف‌های EPR به وضوح وجود دو نوع ROS را نشان دادند، که در آن O2- غالب بود، در حالی که OH• در مقدار کمتری وجود داشت. علاوه بر این، مقایسه مستقیم شدت پیک‌ها نشان داد که EWNS بهینه شده در مقایسه با EWNS پایه، محتوای ROS به طور قابل توجهی بالاتری دارد.
شکل ۴ راندمان رسوب‌گذاری EWNS در EPES را نشان می‌دهد. داده‌ها همچنین در جدول ۱ خلاصه شده و با داده‌های اصلی EWNS مقایسه شده‌اند. برای هر دو مورد EUNS، رسوب‌گذاری حتی در ولتاژ پایین ۳.۰ کیلوولت نزدیک به ۱۰۰٪ بود. معمولاً ۳.۰ کیلوولت برای دستیابی به رسوب‌گذاری ۱۰۰٪ صرف نظر از تغییر بار سطحی کافی است. در شرایط یکسان، راندمان رسوب‌گذاری Baseline-EWNS به دلیل بار کمتر (به طور متوسط ​​۱۰ الکترون در هر EWNS) تنها ۵۶٪ بود.
شکل 5 و جدول 2 میزان غیرفعال‌سازی میکروارگانیسم‌های تلقیح‌شده روی سطح گوجه‌فرنگی‌ها را پس از قرار گرفتن در معرض تقریباً 40000 عدد بر سانتی‌متر مکعب EWNS به مدت 45 دقیقه تحت سناریوی بهینه [-6.5 کیلوولت، 4.0 سانتی‌متر] خلاصه می‌کنند. E. coli و L. innocua تلقیح‌شده پس از 45 دقیقه قرار گرفتن در معرض، کاهش قابل توجهی معادل 3.8 لگاریتم نشان دادند. در شرایط مشابه، S. enterica کاهش لگاریتمی کمتری معادل 2.2 لگاریتم نشان داد، در حالی که S. cerevisiae و M. parafortuitum کاهش 1.0 لگاریتمی نشان دادند.
تصاویر میکروسکوپ الکترونی (شکل 6) تغییرات فیزیکی ناشی از EWNS در سلول‌های E. coli، Salmonella enterica و L. innocua را که منجر به غیرفعال شدن آنها می‌شود، نشان می‌دهد. باکتری‌های گروه کنترل، غشای سلولی سالمی نشان دادند، در حالی که باکتری‌های در معرض قرار گرفته، غشای خارجی آسیب دیده‌ای داشتند.
تصویربرداری میکروسکوپ الکترونی از باکتری‌های گروه کنترل و باکتری‌های در معرض نور، آسیب غشایی را نشان داد.
داده‌های مربوط به خواص فیزیکوشیمیایی EWNS بهینه‌شده به‌طور کلی نشان می‌دهد که خواص EWNS (بار سطحی و محتوای ROS) در مقایسه با داده‌های پایه EWNS که قبلاً منتشر شده بودند، به‌طور قابل‌توجهی بهبود یافته‌اند8،9،10،11. از سوی دیگر، اندازه آنها در محدوده نانومتر باقی مانده است، که بسیار شبیه به نتایج منتشر شده قبلی است و به آنها اجازه می‌دهد برای مدت طولانی در هوا بمانند. پراکندگی مشاهده شده را می‌توان با تغییرات در بار سطحی توضیح داد، که بزرگی اثر ریلی، تصادفی بودن و ادغام بالقوه EWNS را تعیین می‌کند. با این حال، همانطور که توسط نیلسن و همکارانش شرح داده شده است22، بار سطحی بالا با افزایش مؤثر انرژی/کشش سطحی قطره آب، تبخیر را کاهش می‌دهد. این نظریه به‌طور تجربی برای ریزقطرات22 و EWNS در انتشار قبلی ما8 تأیید شد. از دست دادن زمان اضافی نیز می‌تواند بر اندازه تأثیر بگذارد و در توزیع اندازه مشاهده شده نقش داشته باشد.
علاوه بر این، بار در هر ساختار حدود 22 تا 44 الکترون- است که بسته به شرایط، به طور قابل توجهی بالاتر از EWNS پایه است که دارای بار متوسط ​​10 ± 2 الکترون در هر ساختار است. با این حال، باید توجه داشت که این بار متوسط ​​EWNS است. ستو و همکارانش نشان داده‌اند که بار یکنواخت نیست و از توزیع لگاریتمی نرمال پیروی می‌کند21. در مقایسه با کار قبلی ما، دو برابر کردن بار سطحی، راندمان رسوب در سیستم EPES را دو برابر می‌کند و تقریباً به 100٪ می‌رساند11.