Täname teid Nature.com-i külastamise eest. Teie brauseriversioon toetab piiratud CSS-i. Parima kogemuse saamiseks soovitame teil kasutada ajakohast brauserit (või keelata Internet Exploreris ühilduvusrežiimi). Lisaks kuvame saiti pideva toe tagamiseks ilma stiilide ja JavaScriptita.
Hiljuti töötati välja nanotehnoloogial põhinev kemikaalivaba antimikroobne platvorm, mis kasutab kunstlikke vee nanostruktuure (EWNS). EWNS-idel on kõrge pinnalaeng ja nad on rikkad reaktiivsete hapnikuühendite (ROS) poolest, mis suudavad suhelda paljude mikroorganismidega, sealhulgas toidust pärinevate patogeenidega, ja neid inaktiveerida. Siin näidatakse, et nende omadusi sünteesi ajal saab peenhäälestada ja optimeerida, et veelgi suurendada nende antibakteriaalset potentsiaali. EWNS-i laboriplatvorm loodi EWNS-i omaduste peenhäälestamiseks sünteesiparameetrite muutmise teel. EWNS-i omaduste (laeng, suurus ja ROS-i sisaldus) iseloomustamiseks kasutati kaasaegseid analüütilisi meetodeid. Lisaks inokuleeriti maheviinamarjatomatite pinnale toidumikroorganisme, nagu Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocua, Mycobacterium para fortitum ja Saccharomyces cerevisiae, et hinnata nende mikroobset inaktiveerimispotentsiaali. Siin esitatud tulemused näitavad, et EWNS-i omadusi saab sünteesi ajal peenhäälestada, mille tulemuseks on inaktiveerimise efektiivsuse eksponentsiaalne suurenemine. Eelkõige suurenes pinnalaeng neljakordselt ja ROS-i sisaldus suurenes. Mikroobide eemaldamise kiirus oli mikroobidest sõltuv ja jäi vahemikku 1,0–3,8 log10 pärast 45-minutilist kokkupuudet aerosooli annusega 40 000 #/cm3 EWNS.
Mikroobne saastumine on peamine toidust põhjustatud haiguste põhjus, mis on põhjustatud patogeenide või nende toksiinide allaneelamisest. Toidust põhjustatud haigused põhjustavad ainuüksi Ameerika Ühendriikides igal aastal umbes 76 miljonit haigestumist, 325 000 hospitaliseerimist ja 5000 surmajuhtumit1. Lisaks hindab Ameerika Ühendriikide Põllumajandusministeerium (USDA), et värskete toodete suurenenud tarbimine põhjustab 48 protsenti kõigist Ameerika Ühendriikides teatatud toidust põhjustatud haigustest2. Toidust põhjustatud patogeenide põhjustatud haiguste ja surmajuhtumite maksumus on Ameerika Ühendriikides väga kõrge, hinnates haiguste tõrje ja ennetamise keskuste (CDC) hinnangul üle 15,6 miljardi USA dollari aastas3.
Praegu rakendatakse toiduohutuse tagamiseks keemilisi,4 kiirgus-5 ja termilisi6 antimikroobseid sekkumisi peamiselt piiratud kriitilistes kontrollpunktides (KKP-des) tootmisahelas (tavaliselt pärast saagikoristust ja/või pakendamise ajal), mitte pidevalt nii, et värske toodang oleks ristsaastumise suhtes avatud.7 Antimikroobseid sekkumisi on vaja toidust põhjustatud haiguste ja toidu riknemise paremaks kontrollimiseks ning neid on võimalik rakendada kogu farmist lauale protsessis. Väiksem mõju ja kulud.
Hiljuti on välja töötatud nanotehnoloogial põhinev kemikaalivaba antimikroobne platvorm bakterite inaktiveerimiseks pindadel ja õhus, kasutades kunstlikke vee nanostruktuure (EWNS). EVNS-i sünteesiks kasutati kahte paralleelset protsessi: elektropihustust ja vee ionisatsiooni (joonis 1a). Varem on näidatud, et EWNS-il on ainulaadne füüsikaliste ja bioloogiliste omaduste kogum8,9,10. EWNS-il on keskmiselt 10 elektroni struktuuri kohta ja keskmine nanomeetri suurus on 25 nm (joonis 1b, c)8,9,10. Lisaks näitas elektronide spinnresonants (ESR), et EWNS-id sisaldavad suures koguses reaktiivseid hapnikuühendeid (ROS), peamiselt hüdroksüül- (OH•) ja superoksiidi (O2-) radikaale (joonis 1c)8. EWNS-id püsisid õhus pikka aega ja võisid põrkuda õhus hõljuvate ja pindadel esinevate mikroobidega, edastades oma ROS-i kasuliku koormuse ja põhjustades mikroobide inaktiveerimist (joonis 1d). Need varasemad uuringud näitasid ka, et EWNS suudab interakteeruda ja inaktiveerida mitmesuguseid rahvatervise seisukohast olulisi gramnegatiivseid ja grampositiivseid baktereid, sealhulgas mükobaktereid, pindadel ja õhus8,9. Transmissioon-elektronmikroskoopia näitas, et inaktiveerimise põhjustas rakumembraani kahjustumine. Lisaks on ägeda sissehingamise uuringud näidanud, et EWNS-i suured annused ei põhjusta kopsukahjustusi ega põletikku8.
(a) Elektropihustus tekib siis, kui vedeliku sisaldava kapillaari ja vastaselektroodi vahele rakendatakse kõrgepinge. (b) Kõrgepinge rakendamine põhjustab kahte erinevat nähtust: (i) vee elektropihustamine ja (ii) reaktiivsete hapnikuühendite (ioonide) teke, mis jäävad EWNS-i kinni. (c) EWNS-i ainulaadne struktuur. (d) EWNS-id on oma nanoskaala olemuse tõttu väga liikuvad ja võivad suhelda õhus levivate patogeenidega.
Hiljuti on samuti demonstreeritud EWNS-i antimikroobse platvormi võimet inaktiveerida värske toidu pinnal toidust pärinevaid mikroorganisme. Samuti on näidatud, et EWNS-i pinnalaengut saab kasutada koos elektriväljaga sihipäraseks kohaletoimetamiseks. Veelgi olulisem on see, et paljulubav esialgne tulemus, mis näitas orgaanilise tomati aktiivsuse vähenemist ligikaudu 1,4 logaritmi võrra erinevate toidumikroorganismide, näiteks E. coli ja Listeria vastu, 90 minuti jooksul pärast kokkupuudet EWNS-iga kontsentratsioonis ligikaudu 50 000#/cm311. Lisaks ei näidanud esialgsed organoleptilised hindamistestid organoleptilist toimet võrreldes kontrolltomatitega. Kuigi need esialgsed inaktiveerimise tulemused lubavad toiduohutust isegi väga madalate EWNS-i annuste (50 000#/cc) korral, on selge, et suurem inaktiveerimispotentsiaal oleks kasulikum nakkuse ja riknemise ohu edasiseks vähendamiseks.
Siin keskendume oma uurimistöös EWNS-i genereerimisplatvormi väljatöötamisele, et peenhäälestada sünteesiparameetreid ja optimeerida EWNS-i füüsikalis-keemilisi omadusi, et suurendada nende antibakteriaalset potentsiaali. Eelkõige on optimeerimine keskendunud nende pinnalaengu (sihipärase kohaletoimetamise parandamiseks) ja ROS-i sisalduse (inaktiveerimise efektiivsuse parandamiseks) suurendamisele. Optimeeritud füüsikalis-keemiliste omaduste (suurus, laeng ja ROS-i sisaldus) iseloomustamine kaasaegsete analüütiliste meetodite ja tavaliste toidumikroorganismide, nagu E. coli, S. enterica, L. innocua, S. cerevisiae ja M. parafortuitum, abil.
EVNS sünteesiti kõrge puhtusastmega vee (18 MΩ cm–1) samaaegse elektropihustamise ja ioniseerimise teel. Elektrilist pihustit 12 kasutatakse tavaliselt vedelike ja kontrollitud suurusega sünteetiliste polümeeride ja keraamiliste osakeste 13 ning kiudude 14 pihustamiseks.
Nagu varasemates publikatsioonides 8, 9, 10, 11 üksikasjalikult kirjeldatud, rakendatakse tüüpilises katses metallkapillaari ja maandatud vastaselektroodi vahele kõrgepinge. Selle protsessi käigus toimub kaks erinevat nähtust: 1) elektropihustus ja 2) vee ionisatsioon. Kahe elektroodi vaheline tugev elektriväli põhjustab kondenseerunud vee pinnale negatiivsete laengute kogunemise, mille tulemuseks on Taylori koonuste moodustumine. Selle tulemusena tekivad Rayleighi teooria16 kohaselt tugevalt laetud veepiisad, mis lagunevad jätkuvalt väiksemateks osakesteks. Samal ajal põhjustab tugev elektriväli mõnede veemolekulide lõhustumist ja elektronide eraldumist (ionisatsioon), tekitades seeläbi suure hulga reaktiivseid hapnikuühendeid (ROS)17. Samaaegselt genereeritud ROS18 paketid kapseldati EWNS-i (joonis 1c).
Joonisel 2a on näidatud käesolevas uuringus EWNS-i sünteesis välja töötatud ja kasutatud EWNS-i genereerimissüsteem. Suletud pudelis hoitud puhastatud vesi juhiti läbi teflontoru (siseläbimõõt 2 mm) 30G roostevabast terasest nõela (metallist kapillaar). Nagu joonisel 2b näidatud, reguleeritakse veevoolu pudeli sees oleva õhurõhu abil. Nõel on kinnitatud teflonkonsooli külge, mida saab käsitsi reguleerida teatud kaugusele vastaselektroodist. Vastaselektrood on poleeritud alumiiniumketas, mille keskel on auk proovi võtmiseks. Vastaselektroodi all on alumiiniumist proovivõtulehter, mis on proovivõtupordi kaudu ühendatud ülejäänud eksperimentaalse seadistusega (joonis 2b). Kõik proovivõtja komponendid on elektriliselt maandatud, et vältida laengu kogunemist, mis võiks osakeste proovivõttu halvendada.
(a) Inseneri abil loodud vee nanostruktuuride genereerimise süsteem (EWNS). (b) Proovivõtja ja elektropihustusseadme ristlõige, mis näitab kõige olulisemaid parameetreid. (c) Bakterite inaktiveerimise eksperimentaalne seadistus.
Ülalkirjeldatud EWNS-i genereerimissüsteem on võimeline muutma peamisi tööparameetreid, et hõlbustada EWNS-i omaduste peenhäälestamist. EWNS-i omaduste peenhäälestamiseks reguleerige rakendatavat pinget (V), nõela ja vastaselektroodi vahelist kaugust (L) ning veevoolu (φ) läbi kapillaari. Sümboleid [V (kV), L (cm)] kasutatakse erinevate kombinatsioonide tähistamiseks. Reguleerige veevoolu, et saada stabiilne Taylori koonus teatud komplektist [V, L]. Selle uuringu eesmärgil seati vastaselektroodi (D) ava suuruseks 0,5 tolli (1,29 cm).
Piiratud geomeetria ja asümmeetria tõttu ei saa elektrivälja tugevust arvutada esimeste põhimõtete põhjal. Selle asemel kasutati elektrivälja arvutamiseks QuickField™ tarkvara (Svendborg, Taani)19. Elektriväli ei ole ühtlane, seega kasutati kapillaari otsas olevat elektrivälja väärtust erinevate konfiguratsioonide võrdlusväärtusena.
Uuringu käigus hinnati nõela ja vastaselektroodi vahelise pinge ja kauguse mitmeid kombinatsioone Taylori koonuse moodustumise, Taylori koonuse stabiilsuse, EWNS-i tootmise stabiilsuse ja reprodutseeritavuse seisukohast. Erinevad kombinatsioonid on toodud lisatabelis S1.
EWNS-i genereerimissüsteemi väljund ühendati otse skaneeriva liikuvusega osakeste suuruse mõõtjaga (SMPS, mudel 3936, TSI, Shoreview, Minnesota) osakeste arvu kontsentratsiooni mõõtmiseks ja seda kasutati koos Faraday aerosooli elektromeetriga (TSI, mudel 3068B, Shoreview, USA). MN) aerosoolivoogude mõõtmiseks, nagu on kirjeldatud meie eelmises publikatsioonis9. Nii SMPS-i kui ka aerosooli elektromeetri proovid võeti voolukiirusel 0,5 l/min (proovi koguvool 1 l/min). Osakeste kontsentratsioone ja aerosoolivoogusid mõõdeti 120 sekundi jooksul. Mõõtmist korrati 30 korda. Aerosooli kogulaeng arvutati voolumõõtmiste põhjal ja keskmine EWNS-i laeng hinnati proovivõetud EWNS-i osakeste koguarvu põhjal. EWNS-i keskmist maksumust saab arvutada võrrandi (1) abil:
kus IEl on mõõdetud voolutugevus, NSMPS on SMPS-iga mõõdetud arvkontsentratsioon ja φEl on elektromeetrisse suunduv voolukiirus.
Kuna suhteline õhuniiskus (RH) mõjutab pinnalaengut, hoiti katse ajal temperatuuri ja (RH) konstantsena vastavalt 21 °C ja 45%.
EWNS-i suuruse ja eluea mõõtmiseks kasutati aatomjõumikroskoopiat (AFM), Asylum MFP-3D-d (Asylum Research, Santa Barbara, CA) ja AC260T-sondi (Olympus, Tokyo, Jaapan). AFM-i skaneerimissagedus on 1 Hz ja skaneerimisala on 5 µm × 5 µm 256 skaneerimisjoonega. Kõikidele piltidele tehti esimese järgu piltide joondamine Asylum tarkvara abil (mask lainepikkuste vahemikuga 100 nm ja läviväärtusega 100 pm).
Eemaldage proovivõtulehter ja asetage vilgupind vastaselektroodist 2,0 cm kaugusele keskmiselt 120 sekundiks, et vältida osakeste ühinemist ja ebakorrapäraste tilkade teket vilgupinnale. EWNS kanti otse värskelt lõigatud vilgupindadele (Ted Pella, Redding, CA). Vahetult pärast pihustamist visualiseeriti vilgupind AFM-i abil. Värskelt lõigatud modifitseerimata vilgupinna kontaktnurk on lähedane 0°-le, seega levib EWNS vilgupinnal kuplikujuliselt20. Difundeeruvate tilkade läbimõõt (a) ja kõrgus (h) mõõdeti otse AFM-i topograafiast ja neid kasutati kuplikujulise difusioonimahu EWNS arvutamiseks, kasutades meie eelnevalt valideeritud meetodit8. Eeldades, et sisseehitatud EVNS-il on sama maht, saab ekvivalentläbimõõdu arvutada võrrandi (2) abil:
Vastavalt meie eelnevalt väljatöötatud meetodile kasutati lühiealiste radikaalide vaheühendite tuvastamiseks EWNS-is elektronspinresonantsi (ESR) spinnlõksu. Aerosoolid juhiti läbi lahuse, mis sisaldas 235 mM DEPMPO-d (5-(dietoksüfosforüül)-5-metüül-1-pürroliin-N-oksiid) (Oxis International Inc., Portland, Oregon). Kõik EPR-mõõtmised viidi läbi Bruker EMX spektromeetri (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA) ja lamedate rakkude massiivide abil. Andmete kogumiseks ja analüüsimiseks kasutati Acquisiti tarkvara (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA). ROS-i iseloomustamine viidi läbi ainult teatud töötingimuste [-6,5 kV, 4,0 cm] korral. EWNS-i kontsentratsioonid mõõdeti SMPS-i abil, võttes arvesse EWNS-i kadu impaktoris.
Osoonitaset jälgiti seadmega 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Colorado)8,9,10.
Kõigi EWNS-i omaduste puhul on mõõtmisväärtus mõõtmiste keskmine ja mõõtmisviga on standardhälve. Optimeeritud EWNS-i atribuudi väärtuse võrdlemiseks baas-EWNS-i vastava väärtusega viidi läbi t-test.
Joonis 2c näitab eelnevalt väljatöötatud ja iseloomustatud elektrostaatilise sadestamise läbilaskesüsteemi (EPES), mida saab kasutada EWNS11 suunamiseks pindadele. EPES kasutab EWNS-laengut koos tugeva elektriväljaga, et suunata otse sihtmärgi pinnale. EPES-süsteemi üksikasjad on esitatud Pyrgiotakis jt hiljutises publikatsioonis. Seega koosneb EPES 3D-prinditud PVC-kambrist, mille koonilised otsad sisaldavad kahte paralleelset roostevabast terasest (304 roostevaba teras, peegelpoleeritud) metallplaati keskel 15,24 cm kaugusel teineteisest. Plaadid ühendati välise kõrgepingeallikaga (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), alumine plaat oli alati positiivne ja ülemine plaat oli alati maandatud (ujuv). Kambri seinad on kaetud alumiiniumfooliumiga, mis on elektriliselt maandatud, et vältida osakeste kadu. Kambril on suletud esilaadimisuks, mis võimaldab testpindu asetada plastraamidele, tõstes need alumiselt metallplaadilt ära, et vältida kõrgepinge interferentsi.
EWNS-i sadestamise efektiivsus EPES-is arvutati eelnevalt väljatöötatud protokolli kohaselt, mida on üksikasjalikult kirjeldatud lisajoonisel S111.
Juhtkambrina on silindrilise kambri teine ​​vool ühendatud järjestikku EPES-süsteemiga, kasutades vahepealset HEPA-filtrit EWNS-i eemaldamiseks. Nagu joonisel 2c näidatud, pumbati EWNS-i aerosool läbi kahe järjestikku ühendatud kambri. Juhtruumi ja EPES-i vaheline filter eemaldab kõik järelejäänud EWNS-id, mille tulemuseks on sama temperatuur (T), suhteline õhuniiskus (RH) ja osoonitase.
On leitud, et olulised toidust pärinevad mikroorganismid saastavad värskeid tooteid, näiteks Escherichia coli (ATCC #27325), mis on fekaalne indikaator, Salmonella enterica (ATCC #53647), mis on toidust pärinev patogeen, Listeria innocua (ATCC #33090), mis on alternatiiv patogeensele Listeria monocytogenes'ile. ATCC-st (Manassas, Virginia) osteti ka Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098) alternatiivina riknemispärmile ja Mycobacterium parafortuitous (ATCC #19686) kui resistentsem elusbakter.
Osta kohalikult turult suvaliselt kaste orgaanilisi viinamarjatomateid ja hoia neid kuni kasutamiseni (kuni 3 päeva) külmkapis temperatuuril 4 °C. Katsetamiseks vali ühe suurusega tomatid, läbimõõduga umbes 1,25 cm.
Inkubatsiooni, inokuleerimise, eksponeerimise ja kolooniate loendamise protokollid on üksikasjalikult kirjeldatud meie varasemates publikatsioonides ja üksikasjalikult selgitatud lisaandmetes 11. EWNS-i toimivust hinnati, eksponeerides inokuleeritud tomateid 45 minuti jooksul 40 000 #/cm3 kontsentratsioonile. Lühidalt, ajahetkel t = 0 min kasutati ellujäänud mikroorganismide hindamiseks kolme tomatit. Kolm tomatit pandi EPES-i ja eksponeeriti EWNS-ile kontsentratsioonil 40 000 #/cc (EWNS-iga eksponeeritud tomatid) ning kolm teist pandi kontrollkambrisse (kontrolltomatid). Ühtegi tomatirühma ei töödeldud täiendavalt. EWNS-iga eksponeeritud tomatid ja kontrollrühmad eemaldati 45 minuti pärast, et hinnata EWNS-i mõju.
Iga katse viidi läbi kolmes korduses. Andmete analüüs viidi läbi vastavalt lisaandmetes kirjeldatud protokollile.
EWNS-iga (45 min, EWNS aerosooli kontsentratsioon 40 000 #/cm3) töödeldud ja eksponeerimata E. coli, Enterobacteri ja L. innocua bakteriproovid sadestati inaktiveerimismehhanismide hindamiseks. Sade fikseeriti 2 tundi toatemperatuuril 0,1 M naatriumkakodülaadi lahuses (pH 7,4), kasutades fiksaatorit, mis koosnes 2,5% glutaraldehüüdist, 1,25% paraformaldehüüdist ja 0,03% pikriinhappest. Pärast pesemist fikseeriti need 2 tundi 1% osmiumtetroksiidi (OsO4)/1,5% kaaliumferrotsüaniidiga (KFeCN6), pesti 3 korda veega ja inkubeeriti 1 tund 1% uranüülatsetaadis, seejärel pesti kaks korda veega. Järgnev dehüdratsioon 10 minutit iga kord 50%, 70%, 90% ja 100% alkoholiga. Seejärel asetati proovid üheks tunniks propüleenoksiidi ja immutati propüleenoksiidi ja TAAP Eponi 1:1 seguga (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA). Proovid sukeldati TAAB Eponi ja polümeriseeriti temperatuuril 60 °C 48 tundi. Kõvenenud granuleeritud vaiku lõigati ja visualiseeriti TEM-meetodil, kasutades JEOL 1200EX (JEOL, Tokyo, Jaapan), tavapärast transmissioon-elektronmikroskoopi, mis on varustatud AMT 2k CCD-kaameraga (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, MA, USA).
Kõik katsed viidi läbi kolmes korduses. Iga ajapunkti kohta plaaditi bakteriaalsed pesud kolmes korduses, saades kokku üheksa andmepunkti punkti kohta, mille keskmist kasutati selle konkreetse organismi bakterite kontsentratsioonina. Mõõtmisveana kasutati standardhälvet. Kõik punktid loevad.
Bakterite kontsentratsiooni vähenemise logaritm võrreldes t = 0 min-ga arvutati järgmise valemi abil:
kus C0 on bakterite kontsentratsioon kontrollproovis ajahetkel 0 (st pärast pinna kuivamist, kuid enne kambrisse asetamist) ja Cn on bakterite kontsentratsioon pinnal pärast n minutit kestnud kokkupuudet.
Bakterite loomuliku lagunemise arvessevõtmiseks 45-minutilise kokkupuuteperioodi jooksul arvutati log-vähenemine võrreldes kontrollrühmaga 45 minuti pärast järgmiselt:
Kus Cn on bakterite kontsentratsioon kontrollproovis ajahetkel n ja Cn-Control on kontrollbakterite kontsentratsioon ajahetkel n. Andmed on esitatud logaritmilise vähenemisena võrreldes kontrollprooviga (ilma EWNS-iga kokkupuuteta).
Uuringu käigus hinnati Taylori koonuse moodustumise, Taylori koonuse stabiilsuse, EWNS-i tootmise stabiilsuse ja reprodutseeritavuse osas mitmeid pinge ja nõela ning vastaselektroodi vahelise kauguse kombinatsioone. Erinevad kombinatsioonid on toodud lisatabelis S1. Täieliku uuringu jaoks valiti kaks juhtumit, mis näitavad stabiilseid ja reprodutseeritavaid omadusi (Taylori koonus, EWNS-i tootmine ja stabiilsus aja jooksul). Joonisel 3 on näidatud kahe juhtumi ROS-i laengu, suuruse ja sisalduse tulemused. Tulemused on kokku võetud ka tabelis 1. Võrdluseks on joonis 3 ja tabel 1 esitanud eelnevalt sünteesitud optimeerimata EWNS-ide 8, 9, 10, 11 (lähtetaseme EWNS) omadused. Kahepoolse t-testi abil tehtud statistilise olulisuse arvutused on uuesti avaldatud lisatabelis S2. Lisaks hõlmavad lisaandmed uuringuid vastaselektroodi proovivõtuava läbimõõdu (D) ja maanduselektroodi ning nõela otsa vahelise kauguse (L) mõju kohta (lisajoonised S2 ja S3).
(a–c) AFM-i suurusjaotus. (d–f) Pindlaengu karakteristik. (g) ROS-i ja ESR-i iseloomustus.
Samuti on oluline märkida, et kõigil ülaltoodud tingimustel olid mõõdetud ionisatsioonivoolud vahemikus 2–6 µA ja pinged vahemikus -3,8 kuni -6,5 kV, mille tulemuseks oli selle üheterminalilise EWNS-i energiatarve alla 50 mW. Kuigi EWNS-i sünteesiti kõrge rõhu all, oli osoonitase väga madal, ei ületanud kunagi 60 ppb.
Lisajoonis S4 näitab simuleeritud elektrivälju vastavalt stsenaariumide [-6,5 kV, 4,0 cm] ja [-3,8 kV, 0,5 cm] korral. Stsenaariumide [-6,5 kV, 4,0 cm] ja [-3,8 kV, 0,5 cm] kohased väljad on arvutatud vastavalt kui 2 × 105 V/m ja 4,7 × 105 V/m. See on ootuspärane, kuna pinge ja kauguse suhe on teisel juhul palju suurem.
Joonisel 3a, b on näidatud AFM8 abil mõõdetud EWNS-i läbimõõt. Stsenaariumide [-6,5 kV, 4,0 cm] ja [-3,8 kV, 0,5 cm] keskmised EWNS-i läbimõõdud olid vastavalt 27 nm ja 19 nm. Juhtude [-6,5 kV, 4,0 cm] ja [-3,8 kV, 0,5 cm] jaotuste geomeetrilised standardhälbed on vastavalt 1,41 ja 1,45, mis näitab kitsast suurusjaotust. Nii keskmine suurus kui ka geomeetriline standardhälve on väga lähedased baasjoone EWNS-ile, olles vastavalt 25 nm ja 1,41. Joonisel 3c on näidatud baasjoone EWNS-i suurusjaotus, mis on mõõdetud sama meetodi abil samades tingimustes.
Joonisel 3d, e on näidatud laengu iseloomustamise tulemused. Andmed on 30 samaaegse kontsentratsiooni (#/cm3) ja voolutugevuse (I) mõõtmise keskmised väärtused. Analüüs näitab, et EWNS-i keskmine laeng on vastavalt 22 ± 6 e- ja 44 ± 6 e- [-6,5 kV, 4,0 cm] ja [-3,8 kV, 0,5 cm] korral. Võrreldes baas-EWNS-iga (10 ± 2 e-) on nende pinnalaeng oluliselt suurem, kaks korda suurem kui [-6,5 kV, 4,0 cm] stsenaariumi korral ja neli korda suurem kui [-3,8 kV, 0,5 cm] stsenaariumi korral. Joonis 3f näitab EWNS-i põhilisi makseandmeid.
EWNS-i osakeste kontsentratsioonikaartidelt (lisajoonised S5 ja S6) on näha, et stseenil [-6,5 kV, 4,0 cm] on oluliselt suurem osakeste arv kui stseenil [-3,8 kV, 0,5 cm]. Samuti tuleb märkida, et EWNS-i osakeste kontsentratsioone jälgiti kuni 4 tundi (lisajoonised S5 ja S6), kus EWNS-i genereerimise stabiilsus näitas mõlemal juhul samu osakeste arvu kontsentratsioone.
Joonis 3g näitab optimeeritud EWNS-i EPR-spektrit pärast kontroll- (tausta) lahutamist lainepikkusel [-6,5 kV, 4,0 cm]. ROS-spektrit on võrreldud ka EWNS-i baasjoonega varem avaldatud artiklis. Spinnilõksuga reageerivate EWNS-ide arvutatud arv on 7,5 × 104 EWNS/s, mis on sarnane varem avaldatud baasjoone-EWNS8-ga. EPR-spektrid näitasid selgelt kahte tüüpi ROS-i olemasolu, kus domineeris O2-, samas kui OH• oli esindatud väiksemas koguses. Lisaks näitas tippintensiivsuste otsene võrdlus, et optimeeritud EWNS-il oli oluliselt kõrgem ROS-i sisaldus võrreldes baasjoone EWNS-iga.
Joonisel 4 on näidatud EWNS-i sadestamise efektiivsus EPES-is. Andmed on kokku võetud ka tabelis I ja võrreldud EWNS-i algsete andmetega. Mõlema EUNS-i juhul oli sadestamine peaaegu 100% isegi madala pinge 3,0 kV juures. Tavaliselt piisab 3,0 kV-st 100% sadestamise saavutamiseks olenemata pinnalaengu muutusest. Samades tingimustes oli baasjoone-EWNS-i sadestamise efektiivsus madalama laengu (keskmiselt 10 elektroni EWNS-i kohta) tõttu vaid 56%.
Joonis 5 ja tabel 2 võtavad kokku tomatite pinnale inokuleeritud mikroorganismide inaktiveerimise astme pärast kokkupuudet ligikaudu 40 000 #/cm3 EWNS-iga 45 minuti jooksul optimaalse stsenaariumi korral [-6,5 kV, 4,0 cm]. Inokuleeritud E. coli ja L. innocua näitasid pärast 45-minutilist kokkupuudet olulist vähenemist 3,8 log. Samades tingimustes näitas S. enterica madalamat logaritmilist vähenemist 2,2 logaritmi, samas kui S. cerevisiae ja M. parafortuitum näitasid 1,0 logaritmilist vähenemist.
Elektronmikroskoobi fotod (joonis 6), mis kujutavad EWNS-i poolt E. coli, Salmonella enterica ja L. innocua rakkudes indutseeritud füüsikalisi muutusi, mis viivad inaktiveerimiseni. Kontrollbakteritel olid terved rakumembraanid, samas kui avatud bakteritel olid kahjustatud välismembraanid.
Kontroll- ja eksponeeritud bakterite elektronmikroskoopiline pildistamine näitas membraanikahjustusi.
Optimeeritud EWNS-i füüsikalis-keemiliste omaduste andmed näitavad kokkuvõttes, et EWNS-i omadused (pinnalaeng ja ROS-i sisaldus) olid võrreldes varem avaldatud EWNS-i baasandmetega oluliselt paranenud8,9,10,11. Teisest küljest jäi nende suurus nanomeetri vahemikku, mis on väga sarnane varem avaldatud tulemustega, võimaldades neil õhus pikka aega püsida. Täheldatud polüdisperssust saab seletada pinnalaengu muutustega, mis määravad Rayleigh' efekti suuruse, juhuslikkuse ja EWNS-i võimaliku ühinemise. Nagu Nielsen jt.22 on aga üksikasjalikult kirjeldanud, vähendab suur pinnalaeng aurustumist, suurendades tõhusalt veepiisa pinnaenergiat/pinget. Seda teooriat kinnitati eksperimentaalselt mikropiisakeste22 ja EWNS-i puhul meie eelmises publikatsioonis8. Ajapiiskade kadu võib samuti suurust mõjutada ja panustada täheldatud suurusjaotusse.
Lisaks on laeng struktuuri kohta umbes 22–44 e-, olenevalt asjaoludest, mis on oluliselt kõrgem võrreldes põhilise EWNS-iga, mille keskmine laeng on 10 ± 2 elektroni struktuuri kohta. Siiski tuleb märkida, et see on EWNS-i keskmine laeng. Seto jt. On näidatud, et laeng ei ole ühtlane ja järgib log-normaaljaotust21. Võrreldes meie varasema tööga kahekordistab pinnalaengu kahekordistamine EPES-süsteemis sadestamise efektiivsust peaaegu 100%-ni11.