Благодарим вас за посещение сайта Nature.com. Вы используете версию браузера с ограниченной поддержкой CSS. Для наилучшего взаимодействия с сайтом мы рекомендуем использовать обновленную версию браузера (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). Кроме того, для обеспечения постоянной поддержки мы отображаем сайт без стилей и JavaScript.
Недавно была разработана безхимическая антимикробная платформа на основе нанотехнологий с использованием искусственных водных наноструктур (EWNS). EWNS обладают высоким поверхностным зарядом и богаты активными формами кислорода (ROS), которые могут взаимодействовать с рядом микроорганизмов и инактивировать их, включая патогены, передающиеся через пищу. В данной работе показано, что их свойства в процессе синтеза могут быть точно настроены и оптимизированы для дальнейшего повышения их антибактериального потенциала. Лабораторная платформа EWNS была разработана для точной настройки свойств EWNS путем изменения параметров синтеза. Характеризация свойств EWNS (заряд, размер и содержание ROS) проводилась с использованием современных аналитических методов. Кроме того, для оценки потенциала инактивации микроорганизмов на поверхность органических томатов были нанесены пищевые микроорганизмы, такие как Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocua, Mycobacterium para fortitum и Saccharomyces cerevisiae. Представленные здесь результаты демонстрируют, что свойства EWNS можно точно регулировать в процессе синтеза, что приводит к экспоненциальному увеличению эффективности инактивации. В частности, поверхностный заряд увеличился в четыре раза, а содержание АФК возросло. Скорость удаления микроорганизмов зависела от их количества и варьировалась от 1,0 до 3,8 log после 45 минут воздействия аэрозольной дозы 40 000 #/см3 EWNS.
Микробное загрязнение является основной причиной пищевых отравлений, вызванных попаданием в организм патогенов или их токсинов. В одних только Соединенных Штатах ежегодно регистрируется около 76 миллионов случаев заболеваний, 325 000 госпитализаций и 5 000 смертей от пищевых отравлений¹. Кроме того, по оценкам Министерства сельского хозяйства США (USDA), увеличение потребления свежих продуктов является причиной 48 процентов всех зарегистрированных случаев пищевых отравлений в Соединенных Штатах². Стоимость заболеваний и смертей от пищевых патогенов в Соединенных Штатах очень высока и, по оценкам Центров по контролю и профилактике заболеваний (CDC), составляет более 15,6 миллиардов долларов США в год³.
В настоящее время химические4, радиационные5 и термические6 антимикробные меры для обеспечения безопасности пищевых продуктов в основном применяются в ограниченном количестве критических контрольных точек (ККТ) в производственной цепочке (обычно после сбора урожая и/или во время упаковки), а не непрерывно, что приводит к перекрестному загрязнению свежей продукции7. Антимикробные меры необходимы для более эффективного контроля заболеваний, передающихся через пищу, и порчи продуктов питания и имеют потенциал для применения на всем протяжении цепочки от фермы до стола. Меньшее воздействие и меньшие затраты.
Недавно была разработана нанотехнологическая платформа для антимикробной обработки без использования химических веществ, предназначенная для инактивации бактерий на поверхностях и в воздухе с помощью искусственных водных наноструктур (EWNS). Для синтеза EVNS использовались два параллельных процесса: электрораспыление и ионизация воды (рис. 1a). Ранее было показано, что EWNS обладают уникальным набором физических и биологических свойств8,9,10. EWNS содержат в среднем 10 электронов на структуру и имеют средний нанометровый размер 25 нм (рис. 1b,c)8,9,10. Кроме того, электронный спиновый резонанс (ЭСР) показал, что EWNS содержат большое количество активных форм кислорода (АФК), главным образом гидроксильных (OH•) и супероксидных (O2-) радикалов (рис. 1c)8. EWNS долгое время оставались в воздухе и могли сталкиваться с микробами, взвешенными в воздухе и присутствующими на поверхностях, доставляя свой груз АФК и вызывая инактивацию микроорганизмов (рис. 1d). Эти более ранние исследования также показали, что EWNS может взаимодействовать с различными грамотрицательными и грамположительными бактериями, представляющими угрозу для общественного здравоохранения, включая микобактерии, и инактивировать их на поверхностях и в воздухе8,9. Трансмиссионная электронная микроскопия показала, что инактивация вызвана нарушением клеточной мембраны. Кроме того, исследования острого ингаляционного воздействия показали, что высокие дозы EWNS не вызывают повреждения легких или воспаления8.
(a) Электрораспыление происходит при подаче высокого напряжения между капилляром, содержащим жидкость, и противоэлектродом. (b) Приложение высокого напряжения приводит к двум различным явлениям: (i) электрораспылению воды и (ii) генерации активных форм кислорода (ионов), захваченных в наночастицах электрораспыления. (c) Уникальная структура наночастиц электрораспыления. (d) Наночастицы электрораспыления обладают высокой подвижностью благодаря своей наноразмерной природе и могут взаимодействовать с патогенами, переносимыми по воздуху.
Недавно также была продемонстрирована способность антимикробной платформы EWNS инактивировать пищевые микроорганизмы на поверхности свежих продуктов. Было также показано, что поверхностный заряд EWNS можно использовать в сочетании с электрическим полем для целенаправленной доставки. Что еще более важно, был получен многообещающий первоначальный результат: снижение активности органических томатов против различных пищевых микроорганизмов, таких как E. coli и Listeria, примерно на 1,4 порядка в течение 90 минут после воздействия EWNS в концентрации около 50 000 мг/см³. Кроме того, предварительные органолептические тесты показали отсутствие органолептического эффекта по сравнению с контрольными томатами. Хотя эти первоначальные результаты инактивации обещают безопасность пищевых продуктов даже при очень низких дозах EWNS (50 000 мг/см³), очевидно, что более высокий потенциал инактивации был бы более полезен для дальнейшего снижения риска заражения и порчи.
В данном исследовании мы сосредоточимся на разработке платформы для генерации наночастиц EWNS с целью точной настройки параметров синтеза и оптимизации физико-химических свойств EWNS для повышения их антибактериального потенциала. В частности, оптимизация была направлена ​​на увеличение поверхностного заряда (для улучшения адресной доставки) и содержания активных форм кислорода (для повышения эффективности инактивации). Характеризация оптимизированных физико-химических свойств (размер, заряд и содержание активных форм кислорода) будет проводиться с использованием современных аналитических методов и распространенных пищевых микроорганизмов, таких как E. coli, S. enterica, L. innocua, S. cerevisiae и M. parafortuitum.
EVNS был синтезирован путем одновременного электрораспыления и ионизации воды высокой чистоты (18 МΩ·см⁻¹). Электрический распылитель 12 обычно используется для распыления жидкостей, а также синтетических полимерных и керамических частиц 13 и волокон 14 контролируемого размера.
Как подробно описано в предыдущих публикациях 8, 9, 10, 11, в типичном эксперименте между металлическим капилляром и заземленным противоэлектродом подается высокое напряжение. В ходе этого процесса происходят два различных явления: 1) электрораспыление и 2) ионизация воды. Сильное электрическое поле между двумя электродами вызывает накопление отрицательных зарядов на поверхности сконденсированной воды, что приводит к образованию конусов Тейлора. В результате образуются сильно заряженные капли воды, которые продолжают распадаться на более мелкие частицы в соответствии с теорией Рэлея16. В то же время сильное электрическое поле вызывает расщепление некоторых молекул воды и отрыв от них электронов (ионизация), тем самым генерируя большое количество активных форм кислорода (АФК)17. Одновременно с этим, пакеты АФК18 были инкапсулированы в EWNS (рис. 1c).
На рис. 2а показана система генерации ЭВНС, разработанная и использованная в данном исследовании для синтеза ЭВНС. Очищенная вода, хранящаяся в закрытой бутылке, подавалась через тефлоновую трубку (внутренний диаметр 2 мм) к игле из нержавеющей стали 30G (металлический капилляр). Как показано на рис. 2b, поток воды регулируется давлением воздуха внутри бутылки. Игла прикреплена к тефлоновой консоли, которую можно вручную отрегулировать на определенное расстояние от противоэлектрода. Противоэлектрод представляет собой полированный алюминиевый диск с отверстием посередине для отбора проб. Под противоэлектродом находится алюминиевая воронка для отбора проб, которая соединена с остальной частью экспериментальной установки через порт для отбора проб (рис. 2b). Все компоненты пробоотборника электрически заземлены, чтобы избежать накопления заряда, которое может ухудшить отбор проб частиц.
(a) Система генерации наноструктур воды с помощью инженерных методов (EWNS). (b) Поперечное сечение пробоотборника и электрораспылительного блока, показывающее наиболее важные параметры. (c) Экспериментальная установка для инактивации бактерий.
Описанная выше система генерации ЭВНС позволяет изменять ключевые рабочие параметры для точной настройки свойств ЭВНС. Для точной настройки характеристик ЭВНС регулируют приложенное напряжение (В), расстояние между иглой и противоэлектродом (L) и поток воды (φ) через капилляр. Символы [В (кВ), L (см)] используются для обозначения различных комбинаций. Поток воды регулируется для получения стабильного конуса Тейлора определенного набора [В, L]. Для целей данного исследования апертура противоэлектрода (D) была установлена ​​на уровне 0,5 дюйма (1,29 см).
Из-за ограниченной геометрии и асимметрии напряженность электрического поля не может быть рассчитана из первых принципов. Вместо этого для расчета электрического поля использовалось программное обеспечение QuickField™ (Свендборг, Дания)19. Электрическое поле неоднородно, поэтому значение электрического поля на кончике капилляра использовалось в качестве эталонного значения для различных конфигураций.
В ходе исследования были оценены несколько комбинаций напряжения и расстояния между иглой и противоэлектродом с точки зрения формирования конуса Тейлора, стабильности конуса Тейлора, стабильности получения EWNS и воспроизводимости. Различные комбинации показаны в дополнительной таблице S1.
Выход системы генерации EWNS был напрямую подключен к сканирующему анализатору подвижности частиц (SMPS, модель 3936, TSI, Шорвью, Миннесота) для измерения концентрации числа частиц и использовался с аэрозольным электрометром Фарадея (TSI, модель 3068B, Шорвью, США). MN) для измерения потоков аэрозоля, как описано в нашей предыдущей публикации9. И SMPS, и аэрозольный электрометр отбирали пробы со скоростью потока 0,5 л/мин (общий поток пробы 1 л/мин). Концентрации частиц и потоки аэрозоля измерялись в течение 120 с. Измерение повторялось 30 раз. Общий заряд аэрозоля рассчитывается на основе текущих измерений, а средний заряд EWNS оценивается на основе общего числа отобранных частиц EWNS. Средняя стоимость EWNS может быть рассчитана с использованием уравнения (1):
где IEl — измеренный ток, NSMPS — концентрация частиц, измеренная с помощью SMPS, а φEl — расход жидкости, подаваемой в электрометр.
Поскольку относительная влажность (ОВ) влияет на поверхностный заряд, температура и ОВ поддерживались постоянными на уровне 21 °C и 45 % соответственно в течение эксперимента.
Для измерения размера и времени жизни ЭВНС использовались атомно-силовая микроскопия (АСМ), прибор Asylum MFP-3D (Asylum Research, Санта-Барбара, Калифорния) и зонд AC260T (Olympus, Токио, Япония). Скорость сканирования АСМ составляла 1 Гц, а область сканирования — 5 мкм × 5 мкм с 256 линиями сканирования. Все изображения были подвергнуты выравниванию первого порядка с помощью программного обеспечения Asylum (маска с диапазоном 100 нм и порогом 100 пм).
Снимите пробоотборную воронку и поместите поверхность слюды на расстоянии 2,0 см от противоэлектрода на среднее время 120 с, чтобы избежать коалесценции частиц и образования нерегулярных капель на поверхности слюды. EWNS наносили непосредственно на свежесрезанные поверхности слюды (Ted Pella, Реддинг, Калифорния). Сразу после распыления поверхность слюды визуализировали с помощью АСМ. Угол смачивания свежесрезанной немодифицированной слюды близок к 0°, поэтому EWNS распространяется по поверхности слюды в виде купола20. Диаметр (a) и высота (h) диффундирующих капель измерялись непосредственно по топографии АСМ и использовались для расчета объема диффузии EWNS в виде купола с использованием нашего ранее проверенного метода8. Предполагая, что бортовой EVNS имеет тот же объем, эквивалентный диаметр можно рассчитать по уравнению (2):
В соответствии с разработанным нами ранее методом, для обнаружения присутствия короткоживущих радикальных промежуточных продуктов в EWNS использовалась спиновая ловушка электронного спинового резонанса (ЭСР). Аэрозоли пропускали через раствор, содержащий 235 мМ DEPMPO (5-(диэтоксифосфорил)-5-метил-1-пирролин-N-оксид) (Oxis International Inc., Портленд, Орегон). Все измерения ЭПР проводились с использованием спектрометра Bruker EMX (Bruker Instruments Inc., Биллерика, Массачусетс, США) и плоских ячеек. Для сбора и анализа данных использовалось программное обеспечение Acquisit (Bruker Instruments Inc., Биллерика, Массачусетс, США). Характеристика АФК проводилась только для набора рабочих условий [-6,5 кВ, 4,0 см]. Концентрации EWNS измерялись с помощью SMPS с учетом потерь EWNS в импакторе.
Уровень озона контролировался с помощью двухлучевого озонатора 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Боулдер, Колорадо)8,9,10.
Для всех свойств EWNS измеренное значение представляет собой среднее значение измерений, а погрешность измерения — стандартное отклонение. Для сравнения значения оптимизированного атрибута EWNS с соответствующим значением базового EWNS был проведен t-тест.
На рисунке 2c показана ранее разработанная и охарактеризованная система электростатического осаждения (EPES), которая может использоваться для направленного воздействия EWNS11 на поверхности. EPES использует заряд EWNS в сочетании с сильным электрическим полем для «направления» непосредственно на поверхность цели. Подробности о системе EPES представлены в недавней публикации Пиргиотакиса и др.11. Таким образом, EPES состоит из напечатанной на 3D-принтере камеры из ПВХ с коническими концами, содержащей две параллельные металлические пластины из нержавеющей стали (304, зеркально отполированные) посередине на расстоянии 15,24 см друг от друга. Пластины были подключены к внешнему источнику высокого напряжения (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), нижняя пластина всегда была положительно заряжена, а верхняя — заземлена (плавающая). Стенки камеры покрыты алюминиевой фольгой, которая электрически заземлена для предотвращения потери частиц. Камера оснащена герметичной передней загрузочной дверцей, которая позволяет размещать тестируемые поверхности на пластиковых штативах, приподнимая их над нижней металлической пластиной, чтобы избежать помех от высокого напряжения.
Эффективность осаждения EWNS в EPES рассчитывалась в соответствии с ранее разработанным протоколом, подробно описанным на дополнительном рисунке S111.
В качестве контрольной камеры второй поток через цилиндрическую камеру соединен последовательно с системой EPES с использованием промежуточного HEPA-фильтра для удаления EWNS. Как показано на рис. 2c, аэрозоль EWNS прокачивался через две камеры, соединенные последовательно. Фильтр между контрольной комнатой и системой EPES удаляет любые оставшиеся частицы EWNS, что приводит к сохранению одинаковой температуры (T), относительной влажности (RH) и уровня озона.
Было обнаружено, что важные пищевые микроорганизмы загрязняют свежие продукты, такие как Escherichia coli (ATCC #27325), фекальный индикатор, Salmonella enterica (ATCC #53647), пищевой патоген, Listeria innocua (ATCC #33090), альтернатива патогенной Listeria monocytogenes, Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098) в качестве альтернативы дрожжам, вызывающим порчу, и Mycobacterium parafortuitous (ATCC #19686) в качестве более устойчивых живых бактерий, приобретенных в ATCC (Манассас, Вирджиния).
Наугад купите на местном рынке несколько коробок органических помидоров черри и храните их в холодильнике при температуре 4°C до использования (до 3 дней). Для эксперимента выберите помидоры одного размера, примерно 1,2 см в диаметре.
Протоколы инкубации, инокуляции, воздействия и подсчета колоний подробно описаны в наших предыдущих публикациях и подробно изложены в Дополнительных данных 11. Эффективность EWNS оценивали путем воздействия на инокулированные томаты дозой 40 000 #/см3 в течение 45 минут. Вкратце, в момент времени t = 0 мин для оценки выживаемости микроорганизмов использовали три томата. Три томата помещали в EPES и подвергали воздействию EWNS при дозе 40 000 #/см3 (томаты, подвергнутые воздействию EWNS), а три других помещали в контрольную камеру (контрольные томаты). Ни одна из групп томатов не подвергалась дополнительной обработке. Томаты, подвергнутые воздействию EWNS, и контрольные томаты удаляли через 45 минут для оценки эффекта EWNS.
Каждый эксперимент проводился в трех повторениях. Анализ данных выполнялся в соответствии с протоколом, описанным в дополнительных материалах.
Образцы бактерий E. coli, Enterobacter и L. innocua, подвергнутые воздействию EWNS (45 мин, концентрация аэрозоля EWNS 40 000 #/см3) и не подвергнутые воздействию, были осаждены центрифугированием для оценки механизмов инактивации. Осадок фиксировали в течение 2 часов при комнатной температуре в 0,1 М растворе какодилата натрия (pH 7,4) с использованием фиксатора, состоящего из 2,5% глутарового альдегида, 1,25% параформальдегида и 0,03% пикриновой кислоты. После промывки их фиксировали 1% тетраоксидом осмия (OsO4)/1,5% ферроцианидом калия (KFeCN6) в течение 2 часов, трижды промывали водой и инкубировали в 1% ацетате уранила в течение 1 часа, затем дважды промывали водой. Последующую дегидратацию проводили по 10 минут в 50%, 70%, 90%, 100% спирте. Затем образцы помещали в оксид пропилена на 1 час и пропитывали смесью оксида пропилена и эпоксидной смолы TAAP в соотношении 1:1 (Marivac Canada Inc., Сент-Лоран, Калифорния). Образцы заливали эпоксидной смолой TAAB и полимеризовали при 60°C в течение 48 часов. Затвердевшую гранулированную смолу разрезали и визуализировали с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) на микроскопе JEOL 1200EX (JEOL, Токио, Япония), обычном просвечивающем электронном микроскопе, оснащенном ПЗС-камерой AMT 2k (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Вобурн, Массачусетс, США).
Все эксперименты проводились в трех повторениях. Для каждой временной точки бактериальные смывы высевали в трех повторениях, в результате чего получалось девять точек данных для каждой точки, среднее значение которых использовалось в качестве концентрации бактерий для данного организма. В качестве погрешности измерения использовалось стандартное отклонение. Учитываются все точки.
Логарифм уменьшения концентрации бактерий по сравнению с моментом времени t = 0 мин был рассчитан по следующей формуле:
где C0 — концентрация бактерий в контрольном образце в момент времени 0 (т.е. после высыхания поверхности, но до помещения образца в камеру), а Cn — концентрация бактерий на поверхности после n минут воздействия.
Для учета естественного разложения бактерий в течение 45-минутного периода воздействия, логарифмическое снижение также рассчитывалось по сравнению с контролем через 45 минут следующим образом:
Где Cn — концентрация бактерий в контрольном образце в момент времени n, а Cn-Control — концентрация контрольных бактерий в момент времени n. Данные представлены в виде логарифмического снижения по сравнению с контролем (без воздействия EWNS).
В ходе исследования были оценены несколько комбинаций напряжения и расстояния между иглой и противоэлектродом с точки зрения формирования конуса Тейлора, стабильности конуса Тейлора, стабильности образования EWNS и воспроизводимости. Различные комбинации показаны в дополнительной таблице S1. Для полного исследования были выбраны два случая, демонстрирующие стабильные и воспроизводимые свойства (конус Тейлора, образование EWNS и стабильность во времени). На рис. 3 показаны результаты по заряду, размеру и содержанию ROS для двух случаев. Результаты также суммированы в таблице 1. Для сравнения, на рисунке 3 и в таблице 1 приведены свойства ранее синтезированных неоптимизированных EWNS8, 9, 10, 11 (базовый EWNS). Расчеты статистической значимости с использованием двухстороннего t-критерия приведены в дополнительной таблице S2. Кроме того, дополнительные данные включают исследования влияния диаметра отверстия для отбора проб противоэлектрода (D) и расстояния между заземляющим электродом и кончиком иглы (L) (дополнительные рисунки S2 и S3).
(a–c) Распределение размеров по данным АСМ. (d–f) Характеристики поверхностного заряда. (g) Характеристика АФК и ЭПР.
Важно также отметить, что при всех вышеперечисленных условиях измеренные токи ионизации находились в диапазоне 2–6 мкА, а напряжения — в диапазоне от -3,8 до -6,5 кВ, что привело к энергопотреблению этого одноконтактного модуля генерации EWNS менее 50 мВт. Несмотря на то, что синтез EWNS проводился под высоким давлением, уровень озона был очень низким, никогда не превышая 60 ppb.
На дополнительном рисунке S4 показаны смоделированные электрические поля для сценариев [-6,5 кВ, 4,0 см] и [-3,8 кВ, 0,5 см] соответственно. Поля в соответствии со сценариями [-6,5 кВ, 4,0 см] и [-3,8 кВ, 0,5 см] рассчитаны как 2 × 10⁵ В/м и 4,7 × 10⁵ В/м соответственно. Это ожидаемо, поскольку отношение напряжения к расстоянию во втором случае значительно выше.
На рис. 3a,b показан диаметр EWNS, измеренный с помощью AFM8. Средние диаметры EWNS для сценариев [-6,5 кВ, 4,0 см] и [-3,8 кВ, 0,5 см] составили 27 нм и 19 нм соответственно. Геометрические стандартные отклонения распределений для случаев [-6,5 кВ, 4,0 см] и [-3,8 кВ, 0,5 см] составляют 1,41 и 1,45 соответственно, что указывает на узкое распределение по размерам. Как средний размер, так и геометрическое стандартное отклонение очень близки к базовому значению EWNS, составляя 25 нм и 1,41 соответственно. На рис. 3c показано распределение размеров базового значения EWNS, измеренное тем же методом в тех же условиях.
На рис. 3d,e показаны результаты характеризации заряда. Данные представляют собой средние значения 30 одновременных измерений концентрации (#/см³) и тока (I). Анализ показывает, что средний заряд на EWNS составляет 22 ± 6 e- и 44 ± 6 e- для [-6,5 кВ, 4,0 см] и [-3,8 кВ, 0,5 см] соответственно. По сравнению с базовым EWNS (10 ± 2 e-), их поверхностный заряд значительно выше, в два раза выше, чем в сценарии [-6,5 кВ, 4,0 см], и в четыре раза выше, чем в сценарии [-3,8 кВ, 0,5 см]. На рис. 3f показаны основные данные об оплате EWNS.
Из карт концентрации числа частиц EWNS (дополнительные рисунки S5 и S6) видно, что в области [-6,5 кВ, 4,0 см] наблюдается значительно большее количество частиц, чем в области [-3,8 кВ, 0,5 см]. Следует также отметить, что концентрация числа частиц EWNS отслеживалась в течение 4 часов (дополнительные рисунки S5 и S6), при этом стабильность генерации EWNS показала одинаковый уровень концентрации числа частиц в обоих случаях.
На рисунке 3g показан спектр ЭПР после вычитания контрольного (фонового) сигнала для оптимизированных EWNS при [-6,5 кВ, 4,0 см]. Спектр АФК также сравнивается с базовым спектром EWNS, представленным в ранее опубликованной статье. Расчетное количество EWNS, реагирующих со спиновой ловушкой, составляет 7,5 × 10⁴ EWNS/с, что аналогично ранее опубликованному базовому спектру Baseline-EWNS8. Спектры ЭПР четко указывают на присутствие двух типов АФК, где преобладал O₂⁻, а OH• присутствовал в меньшем количестве. Кроме того, прямое сравнение интенсивностей пиков показало, что оптимизированные EWNS имели значительно более высокое содержание АФК по сравнению с базовым спектром EWNS.
На рис. 4 показана эффективность осаждения EWNS в EPES. Данные также суммированы в таблице I и сопоставлены с исходными данными по EWNS. В обоих случаях осаждение было близко к 100% даже при низком напряжении 3,0 кВ. Как правило, 3,0 кВ достаточно для достижения 100% осаждения независимо от изменения поверхностного заряда. В тех же условиях эффективность осаждения базового EWNS составляла всего 56% из-за меньшего заряда (в среднем 10 электронов на EEWNS).
На рисунке 5 и в таблице 2 представлена ​​сводная информация о степени инактивации микроорганизмов, инокулированных на поверхность томатов после воздействия приблизительно 40 000 #/см3 EWNS в течение 45 минут при оптимальных условиях [-6,5 кВ, 4,0 см]. Инокулированные E. coli и L. innocua показали значительное снижение на 3,8 log после 45 минут воздействия. В тех же условиях S. enterica показала меньшее снижение на 2,2 log, в то время как S. cerevisiae и M. parafortuitum показали снижение на 1,0 log.
Электронные микроснимки (рисунок 6), иллюстрирующие физические изменения, вызванные EWNS в клетках E. coli, Salmonella enterica и L. innocua, приводящие к инактивации. У контрольных бактерий наблюдались неповрежденные клеточные мембраны, тогда как у бактерий, подвергнутых воздействию, внешние мембраны были повреждены.
Электронно-микроскопическое исследование контрольных и экспериментальных бактерий выявило повреждение мембраны.
Данные о физико-химических свойствах оптимизированных EWNS в совокупности показывают, что свойства EWNS (поверхностный заряд и содержание ROS) значительно улучшились по сравнению с ранее опубликованными базовыми данными EWNS8,9,10,11. С другой стороны, их размер оставался в нанометровом диапазоне, что очень похоже на ранее опубликованные результаты, позволяя им оставаться на воздухе в течение длительного времени. Наблюдаемая полидисперсность может быть объяснена изменениями поверхностного заряда, которые определяют величину эффекта Рэлея, случайность и потенциальное слияние EWNS. Однако, как подробно описано Нильсеном и др.22, высокий поверхностный заряд снижает испарение за счет эффективного увеличения поверхностной энергии/натяжения капли воды. Эта теория была экспериментально подтверждена для микрокапель22 и EWNS в нашей предыдущей публикации8. Потеря со временем также может влиять на размер и способствовать наблюдаемому распределению размеров.
Кроме того, заряд на структуру составляет примерно 22–44 электрона в зависимости от обстоятельств, что значительно выше по сравнению с базовыми EWNS, средний заряд которых составляет 10 ± 2 электрона на структуру. Однако следует отметить, что это средний заряд EWNS. Сето и др. показали, что заряд неравномерен и подчиняется логарифмически нормальному распределению21. По сравнению с нашей предыдущей работой, удвоение поверхностного заряда удваивает эффективность осаждения в системе EPES почти до 100%11.