نشكرك على زيارة موقع Nature.com. أنت تستخدم متصفحًا يدعم CSS بشكل محدود. للحصول على أفضل تجربة، نوصي باستخدام متصفح مُحدّث (أو تعطيل وضع التوافق في Internet Explorer). بالإضافة إلى ذلك، ولضمان استمرار الدعم، نعرض الموقع بدون أنماط CSS وجافا سكريبت.
طُوِّرت مؤخرًا منصة مضادة للميكروبات خالية من المواد الكيميائية، تعتمد على تقنية النانو باستخدام هياكل نانوية مائية اصطناعية (EWNS). تتميز هذه الهياكل بشحنة سطحية عالية وغناها بأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) التي تتفاعل مع عدد من الكائنات الدقيقة، بما في ذلك مسببات الأمراض المنقولة بالغذاء، وتُعطِّلها. تُظهر هذه الدراسة إمكانية ضبط خصائص هذه الهياكل وتحسينها أثناء عملية التصنيع لتعزيز فعاليتها المضادة للبكتيريا. صُمِّمت منصة مختبرية خاصة بهياكل EWNS لضبط خصائصها بدقة من خلال تغيير معايير التصنيع. أُجري توصيف لخصائص هياكل EWNS (الشحنة، والحجم، ومحتوى أنواع الأكسجين التفاعلية) باستخدام أساليب تحليلية حديثة. إضافةً إلى ذلك، زُرعت كائنات دقيقة غذائية، مثل الإشريكية القولونية، والسالمونيلا المعوية، والليستيريا البريئة، والمتفطرة شبه القوية، والخميرة الجعوية، على سطح طماطم عنب عضوية لتقييم قدرتها على تعطيل الميكروبات. تُظهر النتائج المعروضة هنا إمكانية ضبط خصائص جسيمات EWNS بدقة أثناء عملية التصنيع، مما يؤدي إلى زيادة هائلة في كفاءة التثبيط. وعلى وجه الخصوص، زادت الشحنة السطحية بمقدار أربعة أضعاف، وزاد محتوى أنواع الأكسجين التفاعلية. وكان معدل إزالة الميكروبات مرتبطًا بنوع الميكروب، وتراوح بين 1.0 و3.8 لوغاريتم بعد 45 دقيقة من التعرض لجرعة رذاذ من جسيمات EWNS مقدارها 40,000 جسيم/سم³.
يُعد التلوث الميكروبي السبب الرئيسي للأمراض المنقولة بالغذاء، والناجمة عن تناول مسببات الأمراض أو سمومها. وتُسجّل الأمراض المنقولة بالغذاء حوالي 76 مليون حالة مرضية، و325 ألف حالة دخول إلى المستشفيات، و5 آلاف حالة وفاة سنويًا في الولايات المتحدة وحدها¹. إضافةً إلى ذلك، تُشير تقديرات وزارة الزراعة الأمريكية إلى أن زيادة استهلاك المنتجات الطازجة مسؤولة عن 48% من جميع الأمراض المنقولة بالغذاء المُبلّغ عنها في الولايات المتحدة². وتُعدّ تكلفة الأمراض والوفيات الناجمة عن مسببات الأمراض المنقولة بالغذاء في الولايات المتحدة باهظة للغاية، حيث تُقدّرها مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها بأكثر من 15.6 مليار دولار أمريكي سنويًا³.
تُطبَّق حاليًا التدخلات الكيميائية والإشعاعية والحرارية المضادة للميكروبات لضمان سلامة الغذاء بشكل رئيسي عند نقاط تحكم حرجة محدودة في سلسلة الإنتاج (عادةً بعد الحصاد و/أو أثناء التعبئة والتغليف)، بدلاً من تطبيقها بشكل مستمر بحيث تتعرض المنتجات الطازجة للتلوث المتبادل. وتُعدّ التدخلات المضادة للميكروبات ضرورية لتحسين السيطرة على الأمراض المنقولة بالغذاء وتلف الأغذية، ولها القدرة على التطبيق في جميع مراحل سلسلة الإنتاج، من المزرعة إلى المائدة. وتتميز هذه التدخلات بانخفاض تأثيرها وتكلفتها.
طُوِّرت مؤخرًا منصة مضادة للميكروبات خالية من المواد الكيميائية تعتمد على تقنية النانو، وذلك لتعطيل البكتيريا على الأسطح وفي الهواء باستخدام هياكل نانوية اصطناعية من الماء (EWNS). ولتصنيع هذه الهياكل، استُخدمت عمليتان متوازيتان: الرش الكهروستاتيكي وتأيين الماء (الشكل 1أ). وقد أظهرت الدراسات السابقة أن هياكل EWNS تمتلك مجموعة فريدة من الخصائص الفيزيائية والبيولوجية^8،9،10. تحتوي كل بنية من هياكل EWNS على 10 إلكترونات في المتوسط، ويبلغ متوسط ​​حجمها النانوي 25 نانومترًا (الشكل 1ب، ج)^8،9،10. بالإضافة إلى ذلك، أظهر رنين الدوران الإلكتروني (ESR) أن هياكل EWNS تحتوي على كمية كبيرة من أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS)، وخاصة جذور الهيدروكسيل (OH•) وجذور الأكسيد الفائق (O2-) (الشكل 1ج)⁸. تبقى هياكل EWNS في الهواء لفترة طويلة، ويمكنها أن تصطدم بالميكروبات العالقة في الهواء والموجودة على الأسطح، حاملةً معها حمولتها من أنواع الأكسجين التفاعلية، مما يؤدي إلى تعطيلها (الشكل 1د). أظهرت هذه الدراسات السابقة أيضًا أن مادة EWNS قادرة على التفاعل مع أنواع مختلفة من البكتيريا سالبة وموجبة الغرام ذات الأهمية للصحة العامة، بما في ذلك المتفطرات، على الأسطح وفي الهواء، وتعطيلها^8،9. وأظهر الفحص المجهري الإلكتروني النافذ أن التعطيل ناتج عن تمزق غشاء الخلية. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت دراسات الاستنشاق الحاد أن الجرعات العالية من مادة EWNS لا تُسبب تلفًا أو التهابًا في الرئة⁸.
(أ) يحدث الرش الكهروستاتيكي عند تطبيق جهد كهربائي عالٍ بين أنبوب شعري يحتوي على سائل وقطب كهربائي مضاد. (ب) يؤدي تطبيق الجهد العالي إلى ظاهرتين مختلفتين: (1) الرش الكهروستاتيكي للماء، و(2) توليد أنواع الأكسجين التفاعلية (أيونات) المحصورة في جسيمات النانو المائية الكهروكيميائية. (ج) البنية الفريدة لجسيمات النانو المائية الكهروكيميائية. (د) تتميز جسيمات النانو المائية الكهروكيميائية بحركية عالية نظرًا لطبيعتها النانوية، ويمكنها التفاعل مع مسببات الأمراض المحمولة جوًا.
لقد تم مؤخرًا إثبات قدرة منصة EWNS المضادة للميكروبات على تعطيل الكائنات الدقيقة المنقولة بالغذاء على سطح الأطعمة الطازجة. كما تبين إمكانية استخدام الشحنة السطحية لـ EWNS مع مجال كهربائي للتوصيل الموجه. والأهم من ذلك، لوحظت نتيجة أولية واعدة تمثلت في انخفاض بنسبة 1.4 لوغاريتم تقريبًا في فعالية الطماطم العضوية ضد مختلف الكائنات الدقيقة الغذائية، مثل الإشريكية القولونية والليستيريا، خلال 90 دقيقة من التعرض لـ EWNS بتركيز يقارب 50,000 وحدة/سم³. بالإضافة إلى ذلك، لم تُظهر اختبارات التقييم الحسي الأولية أي تأثير حسي مقارنةً بالطماطم غير المعالجة. على الرغم من أن نتائج التعطيل الأولية هذه تبشر بسلامة الغذاء حتى مع جرعات منخفضة جدًا من EWNS تبلغ 50,000 وحدة/سم³، فمن الواضح أن زيادة قدرة التعطيل ستكون أكثر فائدة لتقليل خطر العدوى والتلف.
سنركز في هذا البحث على تطوير منصة لإنتاج جسيمات نانوية بلورية مغلفة بالبوليمر (EWNS) بهدف ضبط معايير التخليق وتحسين الخصائص الفيزيائية والكيميائية لهذه الجسيمات لتعزيز فعاليتها المضادة للبكتيريا. وقد انصبّ التركيز بشكل خاص على زيادة الشحنة السطحية (لتحسين التوصيل الموجه) ومحتوى أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) (لتحسين كفاءة التثبيط). وسيتم توصيف الخصائص الفيزيائية والكيميائية المُحسّنة (الحجم، والشحنة، ومحتوى أنواع الأكسجين التفاعلية) باستخدام أساليب تحليلية حديثة، وباستخدام كائنات دقيقة شائعة الاستخدام في الأغذية، مثل الإشريكية القولونية، والسالمونيلا المعوية، واللاكتوباسيلوس البريء، والخميرة الجعوية، والمتفطرة العرضية.
تم تصنيع EVNS عن طريق الرش الكهربائي والتأيين المتزامنين للماء عالي النقاوة (18 ميجا أوم سم–1). يُستخدم المرذاذ الكهربائي 12 عادةً لرش السوائل وجزيئات البوليمر الاصطناعي والسيراميك 13 والألياف 14 ذات الحجم المُتحكم به.
كما هو موضح بالتفصيل في المنشورات السابقة 8، 9، 10، 11، في تجربة نموذجية، يُطبَّق جهد كهربائي عالٍ بين أنبوب شعري معدني وقطب كهربائي مضاد مؤرض. خلال هذه العملية، تحدث ظاهرتان مختلفتان: 1) الرش الكهروستاتيكي و2) تأين الماء. يتسبب المجال الكهربائي القوي بين القطبين في تراكم الشحنات السالبة على سطح الماء المتكثف، مما يؤدي إلى تكوين مخاريط تايلور. ونتيجة لذلك، تتشكل قطرات ماء عالية الشحنة، والتي تستمر في التفتت إلى جزيئات أصغر، وفقًا لنظرية رايلي 16. في الوقت نفسه، يتسبب المجال الكهربائي القوي في انقسام بعض جزيئات الماء وفقدانها للإلكترونات (التأين)، مما يُولِّد كمية كبيرة من أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) 17. وقد تم تغليف حزم أنواع الأكسجين التفاعلية المتولدة في الوقت نفسه 18 في جسيمات نانوية بلورية كهروستاتيكية (الشكل 1ج).
يوضح الشكل 2أ نظام توليد جسيمات النانو الكهربائية (EWNS) الذي طُوِّر واستُخدم في عملية التخليق في هذه الدراسة. يُغذَّى الماء النقي المخزن في زجاجة مغلقة عبر أنبوب من التفلون (قطره الداخلي 2 مم) إلى إبرة من الفولاذ المقاوم للصدأ عيار 30 (أنبوب شعري معدني). وكما هو موضح في الشكل 2ب، يُتحكَّم في تدفق الماء بواسطة ضغط الهواء داخل الزجاجة. تُثبَّت الإبرة على وحدة تحكم من التفلون يمكن ضبطها يدويًا على مسافة محددة من القطب المضاد. القطب المضاد عبارة عن قرص من الألومنيوم المصقول به ثقب في المنتصف لأخذ العينات. يوجد أسفل القطب المضاد قمع لأخذ العينات مصنوع من الألومنيوم، ومتصل ببقية مكونات الجهاز التجريبي عبر منفذ أخذ العينات (الشكل 2ب). جميع مكونات جهاز أخذ العينات مؤرضة كهربائيًا لتجنب تراكم الشحنات الذي قد يؤثر سلبًا على عملية أخذ عينات الجسيمات.
(أ) نظام توليد البنية النانوية المائية المُهندسة (EWNS). (ب) مقطع عرضي لوحدة أخذ العينات ووحدة الرش الكهروستاتيكي يوضح أهم المعايير. (ج) الإعداد التجريبي لتعطيل البكتيريا.
يُمكن لنظام توليد الموجات الكهروإجهادية الموصوف أعلاه تغيير معايير التشغيل الرئيسية لتسهيل ضبط خصائص الموجات الكهروإجهادية بدقة. يُمكن ضبط الجهد المُطبق (V)، والمسافة بين الإبرة والقطب المضاد (L)، وتدفق الماء (φ) عبر الأنبوب الشعري لضبط خصائص الموجات الكهروإجهادية بدقة. تُستخدم الرموز [V (kV)، L (cm)] للدلالة على تركيبات مختلفة. يُمكن ضبط تدفق الماء للحصول على مخروط تايلور مستقر بقيمة مُحددة [V، L]. لأغراض هذه الدراسة، تم ضبط فتحة القطب المضاد (D) على 0.5 بوصة (1.29 سم).
نظراً لمحدودية الهندسة وعدم التناظر، لا يمكن حساب شدة المجال الكهربائي من المبادئ الأساسية. لذا، استُخدم برنامج QuickField™ (سفيندبورغ، الدنمارك)¹⁹ لحساب المجال الكهربائي. ولأن المجال الكهربائي غير منتظم، فقد استُخدمت قيمته عند طرف الأنبوب الشعري كقيمة مرجعية لمختلف التكوينات.
خلال الدراسة، تم تقييم عدة توليفات من الجهد والمسافة بين الإبرة والقطب المضاد من حيث تكوين مخروط تايلور، واستقرار مخروط تايلور، واستقرار إنتاج EWNS، وقابلية التكرار. تُعرض التوليفات المختلفة في الجدول التكميلي S1.
تم توصيل مخرج نظام توليد EWNS مباشرةً بجهاز قياس حجم الجسيمات المتحركة (SMPS، طراز 3936، TSI، شورفيو، مينيسوتا) لقياس تركيز عدد الجسيمات، واستُخدم مع مقياس فاراداي الكهربائي للهباء الجوي (TSI، طراز 3068B، شورفيو، الولايات المتحدة الأمريكية) لقياس تدفقات الهباء الجوي، كما هو موضح في منشورنا السابق⁹. أخذ كل من جهاز SMPS ومقياس الهباء الجوي الكهربائي عينات بمعدل تدفق 0.5 لتر/دقيقة (إجمالي تدفق العينة 1 لتر/دقيقة). تم قياس تركيزات الجسيمات وتدفقات الهباء الجوي لمدة 120 ثانية. كرر القياس 30 مرة. حُسب إجمالي شحنة الهباء الجوي من القياسات الحالية، وقُدّر متوسط ​​شحنة EWNS من إجمالي عدد جسيمات EWNS التي تم أخذ عينات منها. يمكن حساب متوسط ​​تكلفة EWNS باستخدام المعادلة (1):
حيث IEl هو التيار المقاس، وNSMPS هو تركيز العدد المقاس بواسطة SMPS، وφEl هو معدل التدفق إلى مقياس الكهرباء.
نظراً لأن الرطوبة النسبية تؤثر على الشحنة السطحية، فقد تم الحفاظ على درجة الحرارة والرطوبة النسبية ثابتة عند 21 درجة مئوية و 45٪ على التوالي أثناء التجربة.
استُخدم المجهر الذري الماسح (AFM)، وجهاز Asylum MFP-3D (شركة Asylum Research، سانتا باربرا، كاليفورنيا)، ومسبار AC260T (شركة Olympus، طوكيو، اليابان) لقياس حجم وعمر جسيمات EWNS. تبلغ سرعة مسح المجهر الذري الماسح 1 هرتز، ومساحة المسح 5 ميكرومتر × 5 ميكرومتر، مع 256 خط مسح. خضعت جميع الصور لمحاذاة صور من الدرجة الأولى باستخدام برنامج Asylum (قناع بنطاق 100 نانومتر وعتبة 100 بيكومتر).
أزل قمع أخذ العينات وضع سطح الميكا على بُعد 2.0 سم من القطب المضاد لمدة 120 ثانية في المتوسط ​​لتجنب اندماج الجسيمات وتكوّن قطرات غير منتظمة على سطح الميكا. طُبِّقَت تقنية الترسيب الكهروكيميائي للأغشية النانوية (EWNS) مباشرةً على أسطح الميكا المقطوعة حديثًا (Ted Pella، ريدينغ، كاليفورنيا). مباشرةً بعد الترسيب، تم تصوير سطح الميكا باستخدام المجهر الذري الماسح (AFM). زاوية التلامس السطحي للميكا غير المُعدَّلة والمقطوعة حديثًا قريبة من 0°، لذا تنتشر تقنية EWNS على سطح الميكا بشكل مقبب. تم قياس قطر (a) وارتفاع (h) القطرات المنتشرة مباشرةً من صورة المجهر الذري الماسح، واستُخدمت لحساب حجم الانتشار المقبب لتقنية EWNS باستخدام طريقتنا التي تم التحقق من صحتها سابقًا. بافتراض أن حجم تقنية EVNS الموجودة على متن الجهاز له نفس الحجم، يمكن حساب القطر المكافئ من المعادلة (2).
وفقًا لطريقتنا المطورة سابقًا، استُخدم مصيدة دوران رنين الدوران الإلكتروني (ESR) للكشف عن وجود وسائط جذرية قصيرة العمر في جسيمات EWNS. مُرِّرت الهباءات الهوائية عبر محلول يحتوي على 235 ملي مول من DEPMPO (5-(ثنائي إيثوكسي فوسفوريل)-5-ميثيل-1-بيرولين-N-أكسيد) (شركة أوكسيس إنترناشونال، بورتلاند، أوريغون). أُجريت جميع قياسات الرنين المغناطيسي الإلكتروني (EPR) باستخدام مطياف Bruker EMX (شركة Bruker Instruments، بيليريكا، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية) ومصفوفات الخلايا المسطحة. استُخدم برنامج Acquisit (شركة Bruker Instruments، بيليريكا، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية) لجمع البيانات وتحليلها. أُجري توصيف أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) فقط لمجموعة من ظروف التشغيل [-6.5 كيلو فولت، 4.0 سم]. قُيست تركيزات جسيمات EWNS باستخدام مطياف الكتلة ذي المقياس المغناطيسي (SMPS) بعد مراعاة فقدان جسيمات EWNS في المصادم.
تمت مراقبة مستويات الأوزون باستخدام جهاز مراقبة الأوزون ثنائي الحزمة 205 (2B Technologies، بولدر، كولورادو) 8،9،10.
بالنسبة لجميع خصائص EWNS، تمثل قيمة القياس متوسط ​​القياسات، بينما يمثل خطأ القياس الانحراف المعياري. وقد أُجري اختبار t لمقارنة قيمة سمة EWNS المُحسَّنة مع القيمة المقابلة لها في EWNS الأساسي.
يوضح الشكل 2ج نظامًا مُطوَّرًا وموصوفًا سابقًا للترسيب الكهروستاتيكي (EPES)، والذي يُمكن استخدامه لتوجيه جسيمات EWNS11 نحو الأسطح. يستخدم نظام EPES شحنة EWNS مع مجال كهربائي قوي لتوجيه الجسيمات مباشرةً نحو سطح الهدف. تُعرض تفاصيل نظام EPES في منشور حديث لـ Pyrgiotakis وآخرون. يتكون نظام EPES من حجرة مطبوعة ثلاثية الأبعاد من مادة PVC ذات نهايات مدببة، تحتوي في منتصفها على لوحين معدنيين متوازيين من الفولاذ المقاوم للصدأ (304، مصقول كالمرآة) يفصل بينهما مسافة 15.24 سم. تم توصيل اللوحين بمصدر جهد عالٍ خارجي (Bertran 205B-10R، Spellman، Hauppauge، نيويورك)، وكان اللوح السفلي موجبًا دائمًا، بينما كان اللوح العلوي مؤرضًا دائمًا (غير موصل). جدران الحجرة مغطاة برقائق ألومنيوم مؤرضة كهربائيًا لمنع فقدان الجسيمات. تحتوي الحجرة على باب تحميل أمامي محكم الإغلاق يسمح بوضع أسطح الاختبار على رفوف بلاستيكية، ورفعها عن الصفيحة المعدنية السفلية لتجنب التداخل عالي الجهد.
تم حساب كفاءة ترسيب EWNS في EPES وفقًا لبروتوكول تم تطويره مسبقًا ومفصل بالتفصيل في الشكل التكميلي S111.
كغرفة تحكم، يتم توصيل التدفق الثاني عبر الغرفة الأسطوانية على التوالي بنظام EPES باستخدام مرشح HEPA وسيط لإزالة جزيئات EWNS. وكما هو موضح في الشكل 2ج، تم ضخ رذاذ EWNS عبر غرفتين متصلتين على التوالي. يقوم المرشح الموجود بين غرفة التحكم ونظام EPES بإزالة أي جزيئات EWNS متبقية، مما ينتج عنه نفس درجة الحرارة (T) والرطوبة النسبية (RH) ومستويات الأوزون.
تم العثور على كائنات دقيقة مهمة تنتقل عن طريق الغذاء وتلوث المنتجات الطازجة، مثل الإشريكية القولونية (ATCC #27325)، وهي مؤشر على التلوث البرازي، والسالمونيلا المعوية (ATCC #53647)، وهي ممرض ينتقل عن طريق الغذاء، والليستيريا البريئة (ATCC #33090)، وهي بديل لليستيريا المستوحدة الممرضة، والخميرة الجعوية (ATCC #4098) كبديل لخميرة التلف، والمتفطرة شبه العرضية (ATCC #19686) كبكتيريا حية أكثر مقاومة، وقد تم شراؤها من ATCC (ماناساس، فيرجينيا).
اشترِ عشوائياً صناديق من طماطم العنب العضوية من السوق المحلي، وضعها في الثلاجة على درجة حرارة 4 مئوية حتى استخدامها (لمدة تصل إلى 3 أيام). اختر طماطماً واحدة للتجربة، بحجم حوالي 1.25 سم في القطر.
تم تفصيل بروتوكولات الحضانة والتلقيح والتعريض وعدّ المستعمرات في منشوراتنا السابقة، وشُرحت بالتفصيل في البيانات التكميلية رقم 11. قُيِّم أداء نظام EWNS بتعريض الطماطم الملقحة لـ 40,000 وحدة/سم³ لمدة 45 دقيقة. باختصار، عند الزمن t = 0 دقيقة، استُخدمت ثلاث طماطم لتقييم الكائنات الحية الدقيقة المتبقية. وُضعت ثلاث طماطم في محلول EPES وعُرضت لنظام EWNS بكثافة 40,000 وحدة/سم³ (طماطم مُعرَّضة لنظام EWNS)، بينما وُضعت ثلاث طماطم أخرى في حجرة التحكم (طماطم التحكم). لم تخضع أي من مجموعات الطماطم لأي معالجة إضافية. أُزيلت الطماطم المُعرَّضة لنظام EWNS وطماطم التحكم بعد 45 دقيقة لتقييم تأثير نظام EWNS.
أُجريت كل تجربة ثلاث مرات. وتم تحليل البيانات وفقًا للبروتوكول الموضح في البيانات التكميلية.
تم ترسيب عينات من بكتيريا الإشريكية القولونية، والإنتيروباكتر، والليستيريا البريئة، المعرضة لرذاذ EWNS (لمدة 45 دقيقة، بتركيز رذاذ EWNS 40,000 جزيء/سم³)، وأخرى غير معرضة له، لتقييم آليات التثبيط. ثُبِّت الراسب لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة في محلول كاكوديليت الصوديوم 0.1 مولار (الأس الهيدروجيني 7.4) باستخدام مُثبِّت مكون من 2.5% غلوتارالدهيد، و1.25% بارافورمالدهيد، و0.03% حمض البيكريك. بعد الغسل، ثُبِّتت العينات بمحلول رباعي أكسيد الأوزميوم 1% (OsO₄) / فيروسيانيد البوتاسيوم 1.5% (KFeCN₆) لمدة ساعتين، ثم غُسلت ثلاث مرات بالماء، وحُضنت في محلول أسيتات اليورانيل 1% لمدة ساعة، ثم غُسلت مرتين بالماء. بعد ذلك، تم تجفيف العينات لمدة 10 دقائق باستخدام محاليل كحول بتراكيز 50%، 70%، 90%، و100%. ثم وُضعت العينات في أكسيد البروبيلين لمدة ساعة واحدة، وشُربت بمزيج بنسبة 1:1 من أكسيد البروبيلين وTAAB Epon (شركة Marivac Canada Inc.، سانت لوران، كاليفورنيا). بعد ذلك، غُمرت العينات في TAAB Epon، ثم بُلمرت عند درجة حرارة 60 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. قُطع الراتنج الحبيبي المتصلب، وفُحص باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) من نوع JEOL 1200EX (شركة JEOL، طوكيو، اليابان)، وهو مجهر إلكتروني نافذ تقليدي مزود بكاميرا CCD من نوع AMT 2k (شركة Advanced Microscopy Techniques، ووبرن، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية).
أُجريت جميع التجارب ثلاث مرات. عند كل نقطة زمنية، زُرعت غسولات البكتيريا ثلاث مرات، ما أسفر عن تسع نقاط بيانات لكل نقطة، واستُخدم متوسطها كتركيز بكتيري لذلك الكائن الحي. استُخدم الانحراف المعياري كخطأ قياس. جميع النقاط مهمة.
تم حساب لوغاريتم الانخفاض في تركيز البكتيريا مقارنةً بالوقت t = 0 دقيقة باستخدام الصيغة التالية:
حيث C0 هو تركيز البكتيريا في عينة التحكم في الوقت 0 (أي بعد أن يجف السطح ولكن قبل وضعه في الحجرة) و Cn هو تركيز البكتيريا على السطح بعد n دقيقة من التعرض.
ولمراعاة التحلل الطبيعي للبكتيريا خلال فترة التعرض التي تبلغ 45 دقيقة، تم أيضًا حساب معدل الانخفاض اللوغاريتمي مقارنةً بالعينة الضابطة عند 45 دقيقة على النحو التالي:
حيث Cn هو تركيز البكتيريا في عينة التحكم عند الزمن n و Cn-Control هو تركيز بكتيريا التحكم عند الزمن n. يتم عرض البيانات كانخفاض لوغاريتمي مقارنة بالتحكم (بدون التعرض لـ EWNS).
خلال الدراسة، تم تقييم عدة توليفات من الجهد والمسافة بين الإبرة والقطب المضاد من حيث تكوين مخروط تايلور، واستقراره، واستقرار إنتاج جسيمات EWNS النانوية، وقابلية التكرار. تُعرض التوليفات المختلفة في الجدول التكميلي S1. تم اختيار حالتين لإجراء دراسة شاملة تُظهر خصائص مستقرة وقابلة للتكرار (مخروط تايلور، وإنتاج جسيمات EWNS النانوية، والاستقرار مع مرور الوقت). يوضح الشكل 3 نتائج الشحنة والحجم ومحتوى أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) للحالتين. كما تم تلخيص النتائج في الجدول 1. وللمقارنة، يتضمن الشكل 3 والجدول 1 خصائص جسيمات EWNS النانوية غير المُحسَّنة المُصنَّعة سابقًا (EWNS 8، 9، 10، 11) (جسيمات EWNS الأساسية). أُعيد نشر حسابات الدلالة الإحصائية باستخدام اختبار t ثنائي الطرف في الجدول التكميلي S2. بالإضافة إلى ذلك، تتضمن البيانات الإضافية دراسات حول تأثير قطر فتحة أخذ العينات للقطب المضاد (D) والمسافة بين القطب الأرضي وطرف الإبرة (L) (الشكلان التكميليان S2 و S3).
(أ-ج) توزيع حجم الجسيمات باستخدام مجهر القوة الذرية. (د-و) خصائص الشحنة السطحية. (ز) توصيف أنواع الأكسجين التفاعلية والرنين المغناطيسي الإلكتروني.
من المهم أيضًا ملاحظة أنه في جميع الظروف المذكورة أعلاه، تراوحت تيارات التأين المقاسة بين 2 و6 ميكروأمبير، وتراوحت الفولتية بين -3.8 و-6.5 كيلوفولت، مما أدى إلى استهلاك طاقة أقل من 50 ميلي واط لوحدة توليد الطاقة EWNS أحادية الطرف هذه. وعلى الرغم من تصنيع EWNS تحت ضغط عالٍ، كانت مستويات الأوزون منخفضة جدًا، ولم تتجاوز 60 جزءًا في المليار.
يوضح الشكل التكميلي S4 الحقول الكهربائية المحاكاة لسيناريوهي [-6.5 كيلو فولت، 4.0 سم] و[-3.8 كيلو فولت، 0.5 سم] على التوالي. وقد حُسبت الحقول وفقًا لهذين السيناريوهين لتكون 2 × 10⁵ فولت/متر و4.7 × 10⁵ فولت/متر على التوالي. وهذا متوقع، نظرًا لأن نسبة الجهد إلى المسافة أعلى بكثير في الحالة الثانية.
يوضح الشكلان 3أ و3ب قطر جسيمات EWNS المقاسة باستخدام مجهر القوة الذرية AFM8. وقد حُسب متوسط ​​أقطار جسيمات EWNS في حالتي [-6.5 كيلو فولت، 4.0 سم] و[-3.8 كيلو فولت، 0.5 سم] فكان 27 نانومتر و19 نانومتر على التوالي. أما الانحرافات المعيارية الهندسية لتوزيعات هذه الجسيمات فكانت 1.41 و1.45 على التوالي، مما يشير إلى توزيع ضيق للأحجام. ويقترب كل من متوسط ​​الحجم والانحراف المعياري الهندسي من قيمة جسيمات EWNS الأساسية، حيث يبلغ 25 نانومتر و1.41 على التوالي. ويوضح الشكل 3ج توزيع أحجام جسيمات EWNS الأساسية المقاسة باستخدام الطريقة نفسها وتحت الظروف ذاتها.
يوضح الشكلان 3د و3هـ نتائج توصيف الشحنة. البيانات عبارة عن متوسط ​​قياسات 30 قياسًا متزامنًا للتركيز (عدد الإلكترونات/سم³) والتيار (I). يُظهر التحليل أن متوسط ​​الشحنة على شبكة EWNS هو 22 ± 6 إلكترونًا و44 ± 6 إلكترونًا عند [-6.5 كيلو فولت، 4.0 سم] و[-3.8 كيلو فولت، 0.5 سم] على التوالي. بالمقارنة مع شبكة EWNS الأساسية (10 ± 2 إلكترونًا)، فإن شحنتها السطحية أعلى بكثير، أي ضعف شحنة الحالة [-6.5 كيلو فولت، 4.0 سم] وأربعة أضعاف شحنة الحالة [-3.8 كيلو فولت، 0.5 سم]. يوضح الشكل 3و بيانات الدفع الأساسية لشبكة EWNS.
من خرائط تركيز عدد الجسيمات النانوية ذات الموجة الكهربائية (الشكلان التكميليان S5 وS6)، يتضح أن المشهد [-6.5 كيلو فولت، 4.0 سم] يحتوي على عدد جسيمات أعلى بكثير من المشهد [-3.8 كيلو فولت، 0.5 سم]. تجدر الإشارة أيضًا إلى أنه تم رصد تركيز عدد الجسيمات النانوية ذات الموجة الكهربائية لمدة تصل إلى 4 ساعات (الشكلان التكميليان S5 وS6)، حيث أظهر استقرار توليد هذه الجسيمات مستويات متماثلة من تركيز عدد الجسيمات في كلتا الحالتين.
يوضح الشكل 3g طيف الرنين المغناطيسي الإلكتروني (EPR) بعد طرح إشارة التحكم (الخلفية) لـ EWNS المُحسَّن عند [-6.5 كيلو فولت، 4.0 سم]. كما تمت مقارنة طيف أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) مع خط الأساس لـ EWNS في ورقة بحثية منشورة سابقًا. بلغ عدد جزيئات EWNS المتفاعلة مع مصيدة الدوران 7.5 × 10⁴ جزيء/ثانية، وهو ما يُقارب قيمة خط الأساس لـ EWNS⁸ المنشورة سابقًا. أشارت أطياف الرنين المغناطيسي الإلكتروني بوضوح إلى وجود نوعين من أنواع الأكسجين التفاعلية، حيث ساد O₂⁻، بينما وُجد OH• بكمية أقل. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت مقارنة مباشرة لشدة الذروة أن EWNS المُحسَّن يحتوي على نسبة أعلى بكثير من أنواع الأكسجين التفاعلية مقارنةً بـ EWNS الأساسي.
يوضح الشكل 4 كفاءة ترسيب جسيمات EWNS في EPES. كما تم تلخيص البيانات في الجدول 1 ومقارنتها ببيانات EWNS الأصلية. في كلتا حالتي EUNS، اقترب الترسيب من 100% حتى عند جهد منخفض قدره 3.0 كيلو فولت. عادةً، يكفي 3.0 كيلو فولت لتحقيق ترسيب بنسبة 100% بغض النظر عن تغير الشحنة السطحية. في ظل الظروف نفسها، بلغت كفاءة ترسيب Baseline-EWNS 56% فقط بسبب انخفاض الشحنة (بمعدل 10 إلكترونات لكل جسيم EWNS).
يلخص الشكل 5 والجدول 2 درجة تعطيل الكائنات الدقيقة الملقحة على سطح الطماطم بعد تعريضها لحوالي 40,000 ميكرومتر/سم³ من الموجات الكهرومغناطيسية لمدة 45 دقيقة في ظل الظروف المثلى [-6.5 كيلو فولت، 4.0 سم]. أظهرت بكتيريا الإشريكية القولونية (E. coli) وبكتيريا الليستيريا البريئة (L. innocua) الملقحة انخفاضًا ملحوظًا بمقدار 3.8 لوغاريتم بعد 45 دقيقة من التعرض. في ظل الظروف نفسها، أظهرت بكتيريا السالمونيلا المعوية (S. enterica) انخفاضًا أقل بمقدار 2.2 لوغاريتم، بينما أظهرت بكتيريا الخميرة (S. cerevisiae) وبكتيريا المتفطرة العرضية (M. parafortuitum) انخفاضًا بمقدار 1.0 لوغاريتم.
تُظهر الصور المجهرية الإلكترونية (الشكل 6) التغيرات الفيزيائية التي يُحدثها عامل EWNS في خلايا الإشريكية القولونية، والسالمونيلا المعوية، والليستيريا البريئة، مما يؤدي إلى تعطيلها. أظهرت البكتيريا الضابطة أغشية خلوية سليمة، بينما أظهرت البكتيريا المعرضة للعامل أغشية خارجية متضررة.
كشف التصوير المجهري الإلكتروني للبكتيريا الضابطة والمعرضة عن تلف في الغشاء.
تُظهر البيانات المتعلقة بالخصائص الفيزيائية والكيميائية لجسيمات EWNS المُحسَّنة تحسُّنًا ملحوظًا في خصائصها (الشحنة السطحية ومحتوى أنواع الأكسجين التفاعلية) مقارنةً بالبيانات الأساسية المنشورة سابقًا^8،9،10،11. من جهة أخرى، بقي حجمها في نطاق النانومتر، وهو ما يُشابه النتائج المنشورة سابقًا، مما يسمح لها بالبقاء في الهواء لفترة طويلة. يُمكن تفسير التشتت الملحوظ في الحجم بتغيرات الشحنة السطحية، التي تُحدد مقدار تأثير رايلي، والعشوائية، واحتمالية اندماج جسيمات EWNS. مع ذلك، وكما أوضح نيلسن وآخرون²²، فإن ارتفاع الشحنة السطحية يُقلل من التبخر عن طريق زيادة طاقة/توتر سطح قطرة الماء. وقد تم تأكيد هذه النظرية تجريبيًا بالنسبة للقطرات الميكروية²² وجسيمات EWNS في منشورنا السابق⁸. كما يُمكن أن يؤثر الفقدان بمرور الوقت على الحجم ويُساهم في توزيع الحجم الملحوظ.
بالإضافة إلى ذلك، تتراوح الشحنة لكل بنية بين 22 و44 إلكترونًا تقريبًا، تبعًا للظروف، وهي أعلى بكثير مقارنةً ببنية EWNS الأساسية، التي يبلغ متوسط ​​شحنتها 10 ± 2 إلكترون لكل بنية. مع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن هذا هو متوسط ​​شحنة EWNS. وقد أظهرت دراسة سيتو وآخرون أن الشحنة غير منتظمة وتتبع توزيعًا لوغاريتميًا طبيعيًا.²¹ وبالمقارنة مع عملنا السابق، فإن مضاعفة الشحنة السطحية تُضاعف كفاءة الترسيب في نظام EPES لتصل إلى ما يقارب 100%.¹¹