Děkujeme za návštěvu webu Nature.com. Používáte verzi prohlížeče s omezenou podporou CSS. Pro dosažení nejlepšího zážitku doporučujeme používat aktualizovaný prohlížeč (nebo v prohlížeči Internet Explorer vypnout režim kompatibility). Abychom zajistili neustálou podporu, zobrazujeme web bez stylů a JavaScriptu.
Nedávno byla vyvinuta bezchemická antimikrobiální platforma založená na nanotechnologiích s využitím umělých vodních nanostruktur (EWNS). EWNS mají vysoký povrchový náboj a jsou bohaté na reaktivní formy kyslíku (ROS), které mohou interagovat s řadou mikroorganismů a inaktivovat je, včetně patogenů přenášených potravinami. Zde je ukázáno, že jejich vlastnosti během syntézy lze jemně doladit a optimalizovat, aby se dále zvýšil jejich antibakteriální potenciál. Laboratorní platforma EWNS byla navržena tak, aby doladila vlastnosti EWNS změnou parametrů syntézy. Charakterizace vlastností EWNS (náboj, velikost a obsah ROS) byla provedena pomocí moderních analytických metod. Kromě toho byly na povrch organických hroznových rajčat naočkovány potravinářské mikroorganismy, jako je Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocua, Mycobacterium para fortitum a Saccharomyces cerevisiae, aby se vyhodnotil jejich potenciál mikrobiální inaktivace. Zde prezentované výsledky ukazují, že vlastnosti EWNS lze během syntézy jemně doladit, což vede k exponenciálnímu zvýšení účinnosti inaktivace. Zejména se povrchový náboj zvýšil čtyřnásobně a zvýšil se i obsah ROS. Rychlost odstraňování mikrobů byla mikrobiálně závislá a pohybovala se v rozmezí od 1,0 do 3,8 log po 45 minutách expozice dávce aerosolu 40 000 #/cm3 EWNS.
Mikrobiální kontaminace je hlavní příčinou onemocnění z potravin způsobených požitím patogenů nebo jejich toxinů. Nemoci z potravin jsou jen ve Spojených státech příčinou přibližně 76 milionů onemocnění, 325 000 hospitalizací a 5 000 úmrtí ročně1. Ministerstvo zemědělství Spojených států (USDA) navíc odhaduje, že zvýšená konzumace čerstvých produktů je zodpovědná za 48 procent všech onemocnění z potravin hlášených ve Spojených státech2. Náklady na nemoci a úmrtí v důsledku patogenů z potravin ve Spojených státech jsou velmi vysoké a Centra pro kontrolu a prevenci nemocí (CDC) je odhadují na více než 15,6 miliardy USD ročně3.
V současné době se chemické4, radiační5 a tepelné6 antimikrobiální intervence k zajištění bezpečnosti potravin provádějí hlavně v omezených kritických kontrolních bodech (CCP) ve výrobním řetězci (obvykle po sklizni a/nebo během balení), spíše než aby se prováděly průběžně tak, že by čerstvé produkty byly vystaveny křížové kontaminaci7. Antimikrobiální intervence jsou nezbytné pro lepší kontrolu nemocí přenášených potravinami a znehodnocení potravin a mají potenciál být aplikovány v celém kontinuu „od farmy až na stůl“. Menší dopad a náklady.
Nedávno byla vyvinuta nanotechnologická antimikrobiální platforma bez chemikálií pro inaktivaci bakterií na površích a ve vzduchu pomocí umělých vodních nanostruktur (EWNS). Pro syntézu EVNS byly použity dva paralelní procesy: elektrosprej a ionizace vody (obr. 1a). Dříve bylo prokázáno, že EWNS mají jedinečnou sadu fyzikálních a biologických vlastností8,9,10. EWNS má průměrně 10 elektronů na strukturu a průměrnou velikost v nanometrech 25 nm (obr. 1b,c)8,9,10. Kromě toho elektronová spinová rezonance (ESR) ukázala, že EWNS obsahují velké množství reaktivních forem kyslíku (ROS), zejména hydroxylových (OH•) a superoxidových (O2-) radikálů (obr. 1c)8. EWNS zůstávaly ve vzduchu po dlouhou dobu a mohly se srážet s mikroby suspendovanými ve vzduchu a přítomnými na površích, čímž dodávaly své ROS a způsobovaly mikrobiální inaktivaci (obr. 1d). Tyto dřívější studie také ukázaly, že EWNS mohou interagovat s různými gramnegativními a grampozitivními bakteriemi veřejného zdraví, včetně mykobakterií, a inaktivovat je na površích a ve vzduchu8,9. Transmisní elektronová mikroskopie ukázala, že inaktivace byla způsobena narušením buněčné membrány. Studie akutní inhalace navíc ukázaly, že vysoké dávky EWNS nezpůsobují poškození plic ani zánět8.
(a) K elektrospreji dochází, když je mezi kapiláru obsahující kapalinu a protielektrodu aplikováno vysoké napětí. (b) Aplikace vysokého napětí má za následek dva různé jevy: (i) elektrosprej vody a (ii) tvorbu reaktivních forem kyslíku (iontů) zachycených v EWNS. (c) Unikátní struktura EWNS. (d) EWNS jsou vysoce mobilní díky své nanoskopické povaze a mohou interagovat s patogeny přenášenými vzduchem.
Nedávno byla prokázána i schopnost antimikrobiální platformy EWNS inaktivovat mikroorganismy přenášené potravinami na povrchu čerstvých potravin. Ukázalo se také, že povrchový náboj EWNS lze použít v kombinaci s elektrickým polem pro cílené dodávání. Ještě důležitější je, že slibný počáteční výsledek přibližně 1,4 logaritmického snížení aktivity organických rajčat proti různým potravinářským mikroorganismům, jako je E. coli a Listeria, byl pozorován během 90 minut po vystavení EWNS v koncentraci přibližně 50 000#/cm311. Předběžné organoleptické testy navíc neprokázaly žádný organoleptický účinek ve srovnání s kontrolním rajčetem. Ačkoli tyto počáteční výsledky inaktivace slibují bezpečnost potravin i při velmi nízkých dávkách EWNS 50 000#/cm3, je zřejmé, že vyšší inaktivační potenciál by byl prospěšnější pro další snížení rizika infekce a znehodnocení.
Zde se zaměříme na výzkum vývoje platformy pro generování EWNS s cílem doladit parametry syntézy a optimalizovat fyzikálně-chemické vlastnosti EWNS za účelem zvýšení jejich antibakteriálního potenciálu. Optimalizace se zaměřila zejména na zvýšení jejich povrchového náboje (pro zlepšení cíleného dodávání) a obsahu ROS (pro zlepšení účinnosti inaktivace). Charakterizace optimalizovaných fyzikálně-chemických vlastností (velikost, náboj a obsah ROS) s využitím moderních analytických metod a běžných potravinářských mikroorganismů, jako jsou E. coli, S. enterica, L. innocua, S. cerevisiae a M. parafortuitum.
EVNS byl syntetizován současným elektrosprejováním a ionizací vysoce čisté vody (18 MΩ cm–1). Elektrický atomizér 12 se obvykle používá k atomizaci kapalin a syntetických polymerních a keramických částic 13 a vláken 14 o kontrolované velikosti.
Jak je podrobně popsáno v předchozích publikacích 8, 9, 10, 11, v typickém experimentu je mezi kovovou kapiláru a uzemněnou protielektrodu aplikováno vysoké napětí. Během tohoto procesu dochází ke dvěma různým jevům: 1) elektrosprej a 2) ionizace vody. Silné elektrické pole mezi oběma elektrodami způsobuje hromadění záporných nábojů na povrchu kondenzované vody, což vede k tvorbě Taylorových kuželů. V důsledku toho se tvoří vysoce nabité kapičky vody, které se podle Rayleighovy teorie16 dále rozpadají na menší částice. Zároveň silné elektrické pole způsobuje, že některé molekuly vody štěpí a odtrhávají elektrony (ionizace), čímž vzniká velké množství reaktivních forem kyslíku (ROS)17. Současně generované pakety ROS18 byly zapouzdřeny v EWNS (obr. 1c).
Na obr. 2a je znázorněn systém generování EWNS vyvinutý a použitý při syntéze EWNS v této studii. Čištěná voda uložená v uzavřené láhvi byla přiváděna teflonovou trubicí (vnitřní průměr 2 mm) do jehly z nerezové oceli 30G (kovová kapilára). Jak je znázorněno na obrázku 2b, průtok vody je řízen tlakem vzduchu uvnitř láhve. Jehla je připevněna k teflonové konzoli, kterou lze ručně nastavit do určité vzdálenosti od protielektrody. Protielektroda je leštěný hliníkový disk s otvorem uprostřed pro odběr vzorků. Pod protielektrodou se nachází hliníkový vzorkovací trychtýř, který je připojen ke zbytku experimentálního zařízení přes vzorkovací port (obr. 2b). Všechny komponenty vzorkovače jsou elektricky uzemněny, aby se zabránilo hromadění náboje, které by mohlo degradovat odběr vzorků částic.
(a) Systém pro generování nanostruktur vody (EWNS). (b) Průřez vzorkovačem a elektrosprejovou jednotkou zobrazující nejdůležitější parametry. (c) Experimentální uspořádání pro inaktivaci bakterií.
Výše popsaný systém generování EWNS je schopen měnit klíčové provozní parametry pro usnadnění jemného doladění vlastností EWNS. Pro jemné doladění charakteristik EWNS upravte aplikované napětí (V), vzdálenost mezi jehlou a protielektrodou (L) a průtok vody (φ) kapilárou. Symboly [V (kV), L (cm)] označují různé kombinace. Upravte průtok vody tak, abyste dosáhli stabilního Taylorova kužele určité sady [V, L]. Pro účely této studie byla apertura protielektrody (D) nastavena na 0,5 palce (1,29 cm).
Vzhledem k omezené geometrii a asymetrii nelze intenzitu elektrického pole vypočítat z prvních principů. Místo toho byl k výpočtu elektrického pole použit software QuickField™ (Svendborg, Dánsko)19. Elektrické pole není rovnoměrné, takže hodnota elektrického pole na špičce kapiláry byla použita jako referenční hodnota pro různé konfigurace.
Během studie bylo hodnoceno několik kombinací napětí a vzdálenosti mezi jehlou a protielektrodou z hlediska tvorby Taylorova kužele, stability Taylorova kužele, stability produkce EWNS a reprodukovatelnosti. Různé kombinace jsou uvedeny v doplňkové tabulce S1.
Výstup ze systému generování EWNS byl přímo připojen k skenovacímu zařízení pro měření velikosti částic Scanning Mobility Particle Sizer (SMPS, model 3936, TSI, Shoreview, Minnesota) pro měření koncentrace počtu částic a byl použit s Faradayovým aerosolovým elektrometrem (TSI, model 3068B, Shoreview, USA). (MN) pro měření průtoků aerosolů, jak je popsáno v naší předchozí publikaci9. SMPS i aerosolový elektrometr odebíraly vzorky průtokem 0,5 l/min (celkový průtok vzorku 1 l/min). Koncentrace částic a toky aerosolů byly měřeny po dobu 120 s. Měření opakujte 30krát. Celkový náboj aerosolu se vypočítá z měření proudu a průměrný náboj EWNS se odhadne z celkového počtu odebraných částic EWNS. Průměrné náklady na EWNS lze vypočítat pomocí rovnice (1):
kde IEl je měřený proud, NSMPS je číselná koncentrace měřená pomocí SMPS a φEl je průtok elektrometrem.
Protože relativní vlhkost (RH) ovlivňuje povrchový náboj, teplota a (RH) byly během experimentu udržovány konstantní na 21 °C, respektive 45 %.
K měření velikosti a životnosti EWNS byla použita mikroskopie atomárních sil (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, CA) a sonda AC260T (Olympus, Tokio, Japonsko). Frekvence skenování AFM je 1 Hz a plocha skenování je 5 µm × 5 µm s 256 řádky skenování. Všechny snímky byly podrobeny zarovnání obrazu prvního řádu pomocí softwaru Asylum (maska ​​s rozsahem 100 nm a prahovou hodnotou 100 pm).
Odstraňte vzorkovací trychtýř a umístěte povrch slídy do vzdálenosti 2,0 cm od protielektrody na průměrnou dobu 120 s, aby se zabránilo koalescenci částic a tvorbě nepravidelných kapiček na povrchu slídy. EWNS bylo aplikováno přímo na čerstvě nařezané povrchy slídy (Ted Pella, Redding, CA). Ihned po naprašování byl povrch slídy vizualizován pomocí AFM. Úhel kontaktu s povrchem čerstvě nařezané nemodifikované slídy je blízký 0°, takže EWNS se šíří po povrchu slídy v kopulovitém tvaru20. Průměr (a) a výška (h) difuzních kapiček byly měřeny přímo z topografie AFM a použity k výpočtu kopulovitého difuzního objemu EWNS pomocí naší dříve validované metody8. Za předpokladu, že integrovaný EVNS má stejný objem, lze ekvivalentní průměr vypočítat z rovnice (2):
V souladu s naší dříve vyvinutou metodou byla k detekci přítomnosti krátkodobých radikálových meziproduktů v EWNS použita spinová past s elektronovou spinovou rezonancí (ESR). Aerosoly byly propouštěny roztokem obsahujícím 235 mM DEPMPO (5-(diethoxyfosforyl)-5-methyl-1-pyrrolin-N-oxid) (Oxis International Inc., Portland, Oregon). Všechna EPR měření byla provedena pomocí spektrometru Bruker EMX (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA) a plochých cel. Pro sběr a analýzu dat byl použit software Acquisit (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA). Charakterizace ROS byla provedena pouze pro soubor provozních podmínek [-6,5 kV, 4,0 cm]. Koncentrace EWNS byly měřeny pomocí SMPS po zohlednění ztráty EWNS v impaktoru.
Hladiny ozonu byly monitorovány pomocí dvoupaprskového ozonového monitoru 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Colorado)8,9,10.
Pro všechny vlastnosti EWNS je naměřená hodnota průměrem měření a chyba měření je směrodatná odchylka. Pro porovnání hodnoty optimalizovaného atributu EWNS s odpovídající hodnotou základního EWNS byl proveden t-test.
Obrázek 2c ukazuje dříve vyvinutý a charakterizovaný systém pro průchod elektrostatickou precipitací (EPES), který lze použít k zacílení EWNS11 na povrchy. EPES využívá náboj EWNS v kombinaci se silným elektrickým polem k přímému „namíření“ na povrch cíle. Podrobnosti o systému EPES jsou prezentovány v nedávné publikaci Pyrgiotakise a kol.11. EPES se skládá z 3D tištěné PVC komory se zúženými konci, která obsahuje dvě rovnoběžné kovové desky z nerezové oceli (nerezová ocel 304, zrcadlově leštěná) uprostřed vzdálené od sebe 15,24 cm. Desky byly připojeny k externímu zdroji vysokého napětí (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), spodní deska byla vždy kladná a horní deska byla vždy uzemněna (plovoucí). Stěny komory jsou pokryty hliníkovou fólií, která je elektricky uzemněna, aby se zabránilo ztrátě částic. Komora má utěsněná přední plnicí dvířka, která umožňují umístění testovacích povrchů na plastové stojany a jejich zvedání ze spodní kovové desky, aby se zabránilo rušení vysokým napětím.
Účinnost depozice EWNS v EPES byla vypočtena podle dříve vyvinutého protokolu podrobně popsaného v doplňkovém obrázku S111.
Jako řídicí komora je druhý tok válcovou komorou zapojen do série se systémem EPES pomocí mezilehlého HEPA filtru pro odstranění EWNS. Jak je znázorněno na obr. 2c, aerosol EWNS byl čerpán dvěma komorami zapojenými do série. Filtr mezi řídicí místností a EPES odstraňuje veškeré zbývající EWNS, což vede ke stejné teplotě (T), relativní vlhkosti (RH) a hladině ozonu.
Bylo zjištěno, že důležité mikroorganismy přenášené potravinami kontaminují čerstvé produkty, jako je Escherichia coli (ATCC #27325), indikátor stolice, Salmonella enterica (ATCC #53647), patogen přenášený potravinami, Listeria innocua (ATCC #33090), alternativa k patogenní Listeria monocytogenes, Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098) jako alternativa ke kvasinkám způsobujícím kazení plodin a Mycobacterium parafortuitous (ATCC #19686) jako rezistentnější živé bakterie byly zakoupeny od společnosti ATCC (Manassas, Virginie).
Náhodně si kupte krabice bio rajčat hroznového vína z místního trhu a uložte je do chladničky při teplotě 4 °C do spotřeby (až 3 dny). Vyberte rajčata k experimentování o jedné velikosti, asi 1,2 cm v průměru.
Protokoly pro inkubaci, inokulaci, expozici a počítání kolonií byly podrobně popsány v našich předchozích publikacích a podrobně vysvětleny v doplňkových datech 11. Výkonnost EWNS byla hodnocena vystavením inokulovaných rajčat působení 40 000 #/cm3 po dobu 45 minut. Stručně řečeno, v čase t = 0 min byla k vyhodnocení přeživších mikroorganismů použita tři rajčata. Tři rajčata byla umístěna do EPES a vystavena EWNS v koncentraci 40 000 #/cm3 (rajčata vystavená EWNS) a tři další byla umístěna do kontrolní komory (kontrolní rajčata). Žádná ze skupin rajčat nebyla podrobena dalšímu zpracování. Rajčata vystavená EWNS a kontrolní skupina byly po 45 minutách odstraněny, aby se vyhodnotil účinek EWNS.
Každý experiment byl proveden trojmo. Analýza dat byla provedena podle protokolu popsaného v doplňkových datech.
Vzorky bakterií E. coli, Enterobacter a L. innocua vystavené EWNS (45 min, koncentrace aerosolu EWNS 40 000 #/cm3) a neexponované byly peletovány za účelem posouzení mechanismů inaktivace. Sraženina byla fixována po dobu 2 hodin při pokojové teplotě v 0,1 M roztoku kakodylátu sodného (pH 7,4) s fixativem 2,5% glutaraldehydu, 1,25% paraformaldehydu a 0,03% kyseliny pikrové. Po promytí byly fixovány 1% oxidem osmia (OsO4)/1,5% ferokyanidem draselným (KFeCN6) po dobu 2 hodin, 3krát promyty vodou a inkubovány v 1% uranylacetátu po dobu 1 hodiny, poté dvakrát promyty vodou. Následná dehydratace po dobu 10 minut 50%, 70%, 90% a 100% alkoholem. Vzorky byly poté na 1 hodinu umístěny do propylenoxidu a impregnovány směsí propylenoxidu a TAAP Eponu v poměru 1:1 (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA). Vzorky byly zality do TAAB Eponu a polymerovány při 60 °C po dobu 48 hodin. Vytvrzená granulovaná pryskyřice byla nařezána a vizualizována pomocí TEM za použití JEOL 1200EX (JEOL, Tokio, Japonsko), konvenčního transmisního elektronového mikroskopu vybaveného CCD kamerou AMT 2k (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, MA, USA).
Všechny experimenty byly provedeny trojmo. Pro každý časový bod byly bakteriální výplachy naneseny trojmo, což vedlo k celkem devíti datovým bodům na bod, jejichž průměr byl použit jako bakteriální koncentrace pro daný organismus. Směrodatná odchylka byla použita jako chyba měření. Počítají se všechny body.
Logaritmus poklesu koncentrace bakterií v porovnání s časem t = 0 min byl vypočítán pomocí následujícího vzorce:
kde C0 je koncentrace bakterií v kontrolním vzorku v čase 0 (tj. po vysušení povrchu, ale před umístěním do komory) a Cn je koncentrace bakterií na povrchu po n minutách expozice.
Aby se zohlednila přirozená degradace bakterií během 45minutové expoziční doby, byla logaritmická redukce vypočítána ve srovnání s kontrolní skupinou po 45 minutách takto:
Kde Cn je koncentrace bakterií v kontrolním vzorku v čase n a Cn-Control je koncentrace kontrolních bakterií v čase n. Data jsou prezentována jako logaritmické snížení ve srovnání s kontrolou (bez expozice EWNS).
Během studie bylo vyhodnoceno několik kombinací napětí a vzdálenosti mezi jehlou a protielektrodou z hlediska tvorby Taylorova kužele, stability Taylorova kužele, stability produkce EWNS a reprodukovatelnosti. Různé kombinace jsou uvedeny v doplňkové tabulce S1. Pro kompletní studii byly vybrány dva případy, které ukazují stabilní a reprodukovatelné vlastnosti (Taylorův kužel, produkce EWNS a stabilita v čase). Na obr. 3 jsou znázorněny výsledky týkající se náboje, velikosti a obsahu ROS pro dva případy. Výsledky jsou také shrnuty v tabulce 1. Pro referenci, obrázek 3 a tabulka 1 zahrnují vlastnosti dříve syntetizovaných neoptimalizovaných EWNS8, 9, 10, 11 (výchozí hodnota-EWNS). Výpočty statistické významnosti s použitím oboustranného t-testu jsou znovu publikovány v doplňkové tabulce S2. Kromě toho další data zahrnují studie o vlivu průměru vzorkovacího otvoru protielektrody (D) a vzdálenosti mezi zemnící elektrodou a špičkou jehly (L) (doplňkové obrázky S2 a S3).
(a–c) Distribuce velikosti AFM. (d–f) Charakteristika povrchového náboje. (g) Charakterizace ROS a ESR.
Je také důležité poznamenat, že pro všechny výše uvedené podmínky byly naměřené ionizační proudy v rozsahu 2-6 µA a napětí v rozsahu -3,8 až -6,5 kV, což vedlo ke spotřebě energie tohoto jednopólového generátorového modulu EWNS menší než 50 mW. Přestože byl EWNS syntetizován za vysokého tlaku, hladiny ozonu byly velmi nízké a nikdy nepřekročily 60 ppb.
Doplňkový obrázek S4 ukazuje simulovaná elektrická pole pro scénáře [-6,5 kV, 4,0 cm] a [-3,8 kV, 0,5 cm]. Pole podle scénářů [-6,5 kV, 4,0 cm] a [-3,8 kV, 0,5 cm] jsou vypočítána jako 2 × 10⁶ V/m a 4,7 × 10⁶ V/m. To se dá očekávat, protože poměr napětí k vzdálenosti je ve druhém případě mnohem vyšší.
Na obr. 3a,b je znázorněn průměr EWNS měřený pomocí AFM8. Průměrné průměry EWNS pro scénáře [-6,5 kV, 4,0 cm] a [-3,8 kV, 0,5 cm] byly vypočítány jako 27 nm a 19 nm. Geometrické směrodatné odchylky rozdělení pro případy [-6,5 kV, 4,0 cm] a [-3,8 kV, 0,5 cm] jsou 1,41 a 1,45, což naznačuje úzké rozdělení velikosti. Průměrná velikost i geometrická směrodatná odchylka jsou velmi blízké základnímu EWNS a činí 25 nm a 1,41. Na obr. 3c je znázorněno rozdělení velikosti základního EWNS měřené stejnou metodou za stejných podmínek.
Na obr. 3d,e jsou znázorněny výsledky charakterizace náboje. Data představují průměrná měření 30 simultánních měření koncentrace (#/cm3) a proudu (I). Analýza ukazuje, že průměrný náboj na EWNS je 22 ± 6 e- a 44 ± 6 e- pro [-6,5 kV, 4,0 cm] a [-3,8 kV, 0,5 cm] v uvedeném pořadí. Ve srovnání se základním EWNS (10 ± 2 e-) je jejich povrchový náboj výrazně vyšší, dvojnásobek oproti scénáři [-6,5 kV, 4,0 cm] a čtyřnásobek oproti scénáři [-3,8 kV, 0,5 cm]. Obr. 3f ukazuje základní platební data EWNS.
Z map koncentrace částic EWNS (doplňkové obrázky S5 a S6) je patrné, že scéna [-6,5 kV, 4,0 cm] má výrazně vyšší počet částic než scéna [-3,8 kV, 0,5 cm]. Je třeba také poznamenat, že koncentrace částic EWNS byly monitorovány až 4 hodiny (doplňkové obrázky S5 a S6), přičemž stabilita generace EWNS vykazovala v obou případech stejné úrovně koncentrace částic.
Obrázek 3g ukazuje EPR spektrum po odečtení kontroly (pozadí) pro optimalizované EWNS při [-6,5 kV, 4,0 cm]. ROS spektrum je také porovnáno s výchozí hodnotou EWNS v dříve publikovaném článku. Vypočítaný počet EWNS reagujících se spinovou pastí je 7,5 × 10⁴ EWNS/s, což je podobné dříve publikovanému Baseline-EWNS8. EPR spektra jasně ukázala přítomnost dvou typů ROS, kde převládal O2-, zatímco OH• byl přítomen v menším množství. Kromě toho přímé srovnání intenzit píků ukázalo, že optimalizované EWNS měly výrazně vyšší obsah ROS ve srovnání se základní hodnotou EWNS.
Na obr. 4 je znázorněna účinnost depozice EWNS v EPES. Data jsou také shrnuta v tabulce I a porovnána s původními daty EWNS. V obou případech EUNS byla depozice blízká 100 % i při nízkém napětí 3,0 kV. Typicky je 3,0 kV dostatečné k dosažení 100% depozice bez ohledu na změnu povrchového náboje. Za stejných podmínek byla účinnost depozice Baseline-EWNS pouze 56 % kvůli nižšímu náboji (průměrně 10 elektronů na EWNS).
Obrázek 5 a tabulka 2 shrnují stupeň inaktivace mikroorganismů naočkovaných na povrchu rajčat po expozici přibližně 40 000 #/cm3 EWNS po dobu 45 minut za optimálního scénáře [-6,5 kV, 4,0 cm]. Inokulované E. coli a L. innocua vykazovaly po 45 minutách expozice významné snížení o 3,8 log. Za stejných podmínek vykazovala S. enterica nižší logaritmické snížení o 2,2 log, zatímco S. cerevisiae a M. parafortuitum vykazovaly snížení o 1,0 log.
Elektronové mikrofotografie (obrázek 6) znázorňující fyzikální změny vyvolané EWNS v buňkách E. coli, Salmonella enterica a L. innocua, které vedly k inaktivaci. Kontrolní bakterie vykazovaly neporušené buněčné membrány, zatímco exponované bakterie měly poškozené vnější membrány.
Elektromikroskopické zobrazování kontrolních a exponovaných bakterií odhalilo poškození membrány.
Data o fyzikálně-chemických vlastnostech optimalizovaných EWNS souhrnně ukazují, že vlastnosti EWNS (povrchový náboj a obsah ROS) se výrazně zlepšily ve srovnání s dříve publikovanými základními daty EWNS8,9,10,11. Na druhou stranu jejich velikost zůstala v nanometrovém rozsahu, což je velmi podobné dříve publikovaným výsledkům, což jim umožňuje zůstat ve vzduchu po dlouhou dobu. Pozorovanou polydisperzitu lze vysvětlit změnami povrchového náboje, které určují velikost Rayleighova jevu, náhodnosti a potenciálního slučování EWNS. Jak však podrobně popsali Nielsen a kol.22, vysoký povrchový náboj snižuje odpařování efektivním zvýšením povrchové energie/napětí vodní kapky. Tato teorie byla experimentálně potvrzena pro mikrokapičky22 a EWNS v naší předchozí publikaci8. Ztráta času může také ovlivnit velikost a přispět k pozorovanému rozdělení velikosti.
Kromě toho je náboj na strukturu přibližně 22–44 e-, v závislosti na okolnostech, což je výrazně více ve srovnání se základním EWNS, který má průměrný náboj 10 ± 2 elektronů na strukturu. Je však třeba poznamenat, že se jedná o průměrný náboj EWNS. Seto a kol. Bylo prokázáno, že náboj není rovnoměrný a sleduje logaritmicky normální rozdělení21. Ve srovnání s naší předchozí prací zdvojnásobení povrchového náboje zdvojnásobuje účinnost depozice v systému EPES na téměř 100 %11.