Vielen Dank für Ihren Besuch auf Nature.com. Sie verwenden eine Browserversion mit eingeschränkter CSS-Unterstützung. Für eine optimale Darstellung empfehlen wir Ihnen, einen aktuellen Browser zu verwenden (oder den Kompatibilitätsmodus im Internet Explorer zu deaktivieren). Um die zukünftige Unterstützung zu gewährleisten, wird die Website außerdem ohne CSS-Stile und JavaScript angezeigt.
Kürzlich wurde eine chemikalienfreie antimikrobielle Plattform auf Basis von Nanotechnologie unter Verwendung künstlicher Wassernanostrukturen (EWNS) entwickelt. EWNS weisen eine hohe Oberflächenladung auf und sind reich an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), die mit einer Reihe von Mikroorganismen, darunter auch Lebensmittelpathogene, interagieren und diese inaktivieren können. Hier wird gezeigt, dass ihre Eigenschaften während der Synthese feinabgestimmt und optimiert werden können, um ihr antibakterielles Potenzial weiter zu steigern. Die EWNS-Laborplattform wurde entwickelt, um die Eigenschaften von EWNS durch Variation der Syntheseparameter gezielt einzustellen. Die Charakterisierung der EWNS-Eigenschaften (Ladung, Größe und ROS-Gehalt) erfolgte mittels moderner Analysemethoden. Darüber hinaus wurden Lebensmittelmikroorganismen wie Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocua, Mycobacterium parafortitum und Saccharomyces cerevisiae auf die Oberfläche von Bio-Cherrytomaten aufgebracht, um deren mikrobielles Inaktivierungspotenzial zu bewerten. Die hier präsentierten Ergebnisse zeigen, dass die Eigenschaften von EWNS während der Synthese feinjustiert werden können, was zu einer exponentiellen Steigerung der Inaktivierungseffizienz führt. Insbesondere erhöhte sich die Oberflächenladung um den Faktor vier und der ROS-Gehalt stieg. Die mikrobielle Abbaurate war mikrobiell abhängig und lag nach 45-minütiger Exposition gegenüber einer Aerosoldosis von 40.000 #/cm³ EWNS zwischen 1,0 und 3,8 log.
Mikrobielle Kontamination ist die Hauptursache für lebensmittelbedingte Erkrankungen durch die Aufnahme von Krankheitserregern oder deren Toxinen. Allein in den Vereinigten Staaten verursachen lebensmittelbedingte Erkrankungen jährlich etwa 76 Millionen Krankheitsfälle, 325.000 Krankenhausaufenthalte und 5.000 Todesfälle¹. Darüber hinaus schätzt das US-Landwirtschaftsministerium (USDA), dass der gestiegene Konsum von Frischprodukten für 48 Prozent aller in den USA gemeldeten lebensmittelbedingten Erkrankungen verantwortlich ist². Die Kosten für Erkrankungen und Todesfälle durch lebensmittelbedingte Krankheitserreger in den Vereinigten Staaten sind sehr hoch und werden von den Centers for Disease Control and Prevention (CDC) auf über 15,6 Milliarden US-Dollar pro Jahr geschätzt³.
Derzeit werden chemische⁴, radiologische⁵ und thermische⁶ antimikrobielle Maßnahmen zur Gewährleistung der Lebensmittelsicherheit hauptsächlich an wenigen kritischen Kontrollpunkten (CCPs) in der Produktionskette (in der Regel nach der Ernte und/oder während der Verpackung) eingesetzt, anstatt kontinuierlich, sodass Frischprodukte einer Kreuzkontamination ausgesetzt sind⁷. Antimikrobielle Maßnahmen sind notwendig, um lebensmittelbedingte Erkrankungen und Lebensmittelverderb besser zu kontrollieren und haben das Potenzial, entlang der gesamten Wertschöpfungskette vom Erzeuger bis zum Verbraucher angewendet zu werden. Dies würde die Umweltbelastung und die Kosten reduzieren.
Eine nanotechnologiebasierte, chemikalienfreie antimikrobielle Plattform wurde kürzlich entwickelt, um Bakterien auf Oberflächen und in der Luft mithilfe künstlicher Wassernanostrukturen (EWNS) zu inaktivieren. Für die Synthese der EWNS wurden zwei parallele Prozesse eingesetzt: Elektrospray und Wasserionisation (Abb. 1a). EWNS weisen bekanntermaßen einzigartige physikalische und biologische Eigenschaften auf^8,9,10. Jede EWNS-Struktur besitzt durchschnittlich 10 Elektronen und eine durchschnittliche Größe von 25 nm (Abb. 1b,c)^8,9,10. Darüber hinaus zeigte die Elektronenspinresonanz (ESR), dass EWNS eine große Menge reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), hauptsächlich Hydroxyl- (OH•) und Superoxid-Radikale (O_2-), enthalten (Abb. 1c)⁸. EWNS verbleiben lange in der Luft und können mit in der Luft suspendierten und auf Oberflächen vorhandenen Mikroorganismen kollidieren, ihre ROS-Ladung freisetzen und so die Mikroorganismen inaktivieren (Abb. 1d). Frühere Studien zeigten auch, dass EWNS mit verschiedenen gramnegativen und grampositiven Bakterien von Bedeutung für die öffentliche Gesundheit, einschließlich Mykobakterien, auf Oberflächen und in der Luft interagieren und diese inaktivieren kann^8,9. Transmissionselektronenmikroskopische Untersuchungen ergaben, dass die Inaktivierung durch eine Zerstörung der Zellmembran verursacht wird. Akute Inhalationsstudien zeigten zudem, dass hohe Dosen von EWNS keine Lungenschäden oder Entzündungen hervorrufen⁸.
(a) Elektrospray entsteht durch Anlegen einer Hochspannung zwischen einer flüssigkeitsgefüllten Kapillare und einer Gegenelektrode. (b) Die Anlegung der Hochspannung führt zu zwei Phänomenen: (i) dem Elektrosprayen von Wasser und (ii) der Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies (Ionen), die in den elektrosprayten Nanopartikeln (EWNS) eingeschlossen werden. (c) Die einzigartige Struktur der EWNS. (d) Aufgrund ihrer Nanogröße sind EWNS hochmobil und können mit luftgetragenen Krankheitserregern interagieren.
Die Fähigkeit der antimikrobiellen EWNS-Plattform, lebensmittelbedingte Mikroorganismen auf der Oberfläche frischer Lebensmittel zu inaktivieren, wurde kürzlich nachgewiesen. Es konnte zudem gezeigt werden, dass die Oberflächenladung von EWNS in Kombination mit einem elektrischen Feld für eine gezielte Applikation genutzt werden kann. Besonders vielversprechend ist ein erstes Ergebnis: Innerhalb von 90 Minuten nach der Exposition gegenüber EWNS in einer Konzentration von ca. 50.000#/cm³ wurde eine Reduktion der Aktivität von Bio-Tomaten gegenüber verschiedenen Lebensmittelmikroorganismen wie E. coli und Listerien um ca. 1,4 log beobachtet. Vorläufige organoleptische Tests zeigten darüber hinaus im Vergleich zu Kontrolltomaten keine organoleptischen Effekte. Obwohl diese ersten Inaktivierungsergebnisse die Lebensmittelsicherheit selbst bei sehr niedrigen EWNS-Dosen von 50.000#/cm³ erwarten lassen, ist klar, dass ein höheres Inaktivierungspotenzial vorteilhafter wäre, um das Risiko von Infektionen und Verderb weiter zu reduzieren.
Hier konzentrieren wir uns in unserer Forschung auf die Entwicklung einer Plattform zur Herstellung von EWNS (Electron-Waveed Nanoscales), um die Syntheseparameter feinabzustimmen und die physikochemischen Eigenschaften der EWNS zu optimieren und so deren antibakterielles Potenzial zu steigern. Die Optimierung konzentrierte sich insbesondere auf die Erhöhung der Oberflächenladung (zur Verbesserung der gezielten Wirkstofffreisetzung) und des ROS-Gehalts (zur Verbesserung der Inaktivierungseffizienz). Die Charakterisierung der optimierten physikochemischen Eigenschaften (Größe, Ladung und ROS-Gehalt) erfolgte mittels moderner Analysemethoden und unter Verwendung gängiger Lebensmittelmikroorganismen wie E. coli, S. enterica, L. innocua, S. cerevisiae und M. parafortuitum.
EVNS wurde durch gleichzeitiges Elektrosprayen und Ionisieren von hochreinem Wasser (18 MΩ cm–1) synthetisiert. Der elektrische Zerstäuber 12 wird typischerweise zum Zerstäuben von Flüssigkeiten sowie synthetischen Polymer- und Keramikpartikeln 13 und Fasern 14 mit kontrollierter Größe verwendet.
Wie in früheren Veröffentlichungen 8, 9, 10, 11 detailliert beschrieben, wird in einem typischen Experiment eine Hochspannung zwischen einer Metallkapillare und einer geerdeten Gegenelektrode angelegt. Dabei treten zwei Phänomene auf: 1) Elektrospray und 2) Ionisierung des Wassers. Ein starkes elektrisches Feld zwischen den beiden Elektroden führt zur Bildung negativer Ladungen auf der Oberfläche des kondensierten Wassers, wodurch sich Taylor-Kegel ausbilden. Infolgedessen entstehen hochgeladene Wassertröpfchen, die gemäß der Rayleigh-Theorie 16 weiter in kleinere Partikel zerfallen. Gleichzeitig bewirkt das starke elektrische Feld die Spaltung einiger Wassermoleküle und die Abgabe von Elektronen (Ionisierung), wodurch eine große Menge reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) 17 erzeugt wird. Die gleichzeitig erzeugten ROS-Pakete 18 wurden in EWNS (Abb. 1c) verkapselt.
Abbildung 2a zeigt das in dieser Studie entwickelte und verwendete EWNS-Generierungssystem. Gereinigtes Wasser aus einer geschlossenen Flasche wurde durch einen Teflonschlauch (2 mm Innendurchmesser) zu einer 30G-Edelstahlnadel (Metallkapillare) geleitet. Wie in Abbildung 2b dargestellt, wird der Wasserfluss durch den Luftdruck in der Flasche gesteuert. Die Nadel ist an einer Teflonkonsole befestigt, die manuell in einem bestimmten Abstand zur Gegenelektrode positioniert werden kann. Die Gegenelektrode ist eine polierte Aluminiumscheibe mit einer mittigen Öffnung zur Probenahme. Unterhalb der Gegenelektrode befindet sich ein Aluminium-Probenahmetrichter, der über einen Probenahmeanschluss (Abb. 2b) mit dem restlichen Versuchsaufbau verbunden ist. Alle Komponenten des Probenahmesystems sind geerdet, um eine Ladungsansammlung zu vermeiden, die die Partikelprobenahme beeinträchtigen könnte.
(a) System zur Erzeugung von Nanostrukturen in technischem Wasser (EWNS). (b) Querschnitt des Probennehmers und der Elektrospray-Einheit mit den wichtigsten Parametern. (c) Versuchsaufbau zur Bakterieninaktivierung.
Das oben beschriebene EWNS-Erzeugungssystem ermöglicht die Anpassung wichtiger Betriebsparameter zur Feinabstimmung der EWNS-Eigenschaften. Durch Einstellen der angelegten Spannung (V), des Abstands zwischen Nadel und Gegenelektrode (L) sowie des Wasserdurchflusses (φ) durch die Kapillare lassen sich die EWNS-Charakteristiken feinabstimmen. Die Symbole [V (kV), L (cm)] bezeichnen verschiedene Kombinationen. Der Wasserdurchfluss wird so angepasst, dass ein stabiler Taylor-Kegel mit den entsprechenden Werten [V, L] entsteht. Für diese Studie wurde die Öffnung der Gegenelektrode (D) auf 0,5 Zoll (1,29 cm) eingestellt.
Aufgrund der eingeschränkten Geometrie und Asymmetrie lässt sich die elektrische Feldstärke nicht aus grundlegenden Prinzipien berechnen. Stattdessen wurde die Software QuickField™ (Svendborg, Dänemark)¹⁹ zur Berechnung des elektrischen Feldes verwendet. Da das elektrische Feld nicht homogen ist, diente der Wert des elektrischen Feldes an der Kapillarspitze als Referenzwert für verschiedene Konfigurationen.
Im Rahmen der Studie wurden verschiedene Kombinationen von Spannung und Abstand zwischen Nadel und Gegenelektrode hinsichtlich der Taylor-Kegel-Bildung, der Taylor-Kegel-Stabilität, der Stabilität der EWNS-Produktion und der Reproduzierbarkeit untersucht. Verschiedene Kombinationen sind in der ergänzenden Tabelle S1 dargestellt.
Der Ausgang des EWNS-Generierungssystems wurde direkt mit einem Scanning Mobility Particle Sizer (SMPS, Modell 3936, TSI, Shoreview, Minnesota, USA) zur Messung der Partikelanzahlkonzentration verbunden und zusammen mit einem Faraday-Aerosolelektrometer (TSI, Modell 3068B, Shoreview, USA) zur Messung der Aerosolflüsse verwendet, wie in unserer vorherigen Publikation⁹ beschrieben. Sowohl das SMPS als auch das Aerosolelektrometer beprobten mit einer Durchflussrate von 0,5 l/min (Gesamtprobendurchfluss 1 l/min). Partikelkonzentrationen und Aerosolflüsse wurden über 120 s gemessen. Die Messung wurde 30-mal wiederholt. Die Gesamtladung des Aerosols wurde aus den Strommessungen berechnet, und die durchschnittliche EWNS-Ladung wurde aus der Gesamtzahl der erfassten EWNS-Partikel geschätzt. Die durchschnittlichen Kosten von EWNS können mit Gleichung (1) berechnet werden.
wobei IEl der gemessene Strom, NSMPS die mit dem SMPS gemessene Teilchenkonzentration und φEl die Durchflussrate zum Elektrometer ist.
Da die relative Luftfeuchtigkeit (RH) die Oberflächenladung beeinflusst, wurden die Temperatur und die relative Luftfeuchtigkeit während des Experiments konstant bei 21°C bzw. 45% gehalten.
Zur Messung der Größe und Lebensdauer der EWNS wurde ein Rasterkraftmikroskop (AFM) mit dem Modell Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, CA) und der Sonde AC260T (Olympus, Tokio, Japan) verwendet. Die AFM-Abtastrate betrug 1 Hz, die Abtastfläche 5 µm × 5 µm mit 256 Abtastlinien. Alle Bilder wurden mithilfe der Asylum-Software einer Bildausrichtung erster Ordnung unterzogen (Maske mit einem Bereich von 100 nm und einem Schwellenwert von 100 pm).
Entfernen Sie den Probenahmetrichter und platzieren Sie die Glimmeroberfläche für eine durchschnittliche Zeit von 120 s in einem Abstand von 2,0 cm zur Gegenelektrode, um das Zusammenfließen von Partikeln und die Bildung unregelmäßiger Tröpfchen auf der Glimmeroberfläche zu vermeiden. EWNS wurde direkt auf frisch geschnittene Glimmeroberflächen (Ted Pella, Redding, CA) aufgetragen. Unmittelbar nach dem Sputtern wurde die Glimmeroberfläche mittels AFM visualisiert. Der Oberflächenkontaktwinkel von frisch geschnittenem, unmodifiziertem Glimmer liegt nahe bei 0°, sodass sich EWNS kuppelförmig über die Glimmeroberfläche ausbreitet.²⁰ Durchmesser (a) und Höhe (h) der diffundierenden Tröpfchen wurden direkt aus der AFM-Topographie gemessen und zur Berechnung des kuppelförmigen Diffusionsvolumens von EWNS mithilfe unserer zuvor validierten Methode verwendet.⁸ Unter der Annahme, dass das integrierte EVNS das gleiche Volumen aufweist, kann der äquivalente Durchmesser aus Gleichung (2) berechnet werden.
Gemäß unserer zuvor entwickelten Methode wurde eine Elektronenspinresonanz (ESR)-Spinfalle verwendet, um kurzlebige Radikalzwischenprodukte in EWNS nachzuweisen. Aerosole wurden durch eine Lösung mit 235 mM DEPMPO (5-(Diethoxyphosphoryl)-5-methyl-1-pyrrolin-N-oxid) (Oxis International Inc., Portland, Oregon) geleitet. Alle EPR-Messungen wurden mit einem Bruker EMX-Spektrometer (Bruker Instruments Inc., Billerica, MA, USA) und flachen Messzellen durchgeführt. Die Datenerfassung und -analyse erfolgte mit der Software Acquisit (Bruker Instruments Inc., Billerica, MA, USA). Die ROS-Charakterisierung wurde nur für die Betriebsbedingungen [-6,5 kV, 4,0 cm] durchgeführt. Die EWNS-Konzentrationen wurden unter Berücksichtigung der EWNS-Verluste im Impaktor mittels SMPS gemessen.
Die Ozonwerte wurden mit einem 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Co)8,9,10 überwacht.
Für alle EWNS-Eigenschaften entspricht der Messwert dem Mittelwert der Einzelmessungen, der Messfehler der Standardabweichung. Ein t-Test wurde durchgeführt, um den Wert des optimierten EWNS-Attributs mit dem entsprechenden Wert des Basis-EWNS zu vergleichen.
Abbildung 2c zeigt ein zuvor entwickeltes und charakterisiertes elektrostatisches Abscheidungssystem (EPES), mit dem EWNS11 gezielt auf Oberflächen aufgebracht werden kann. EPES nutzt eine EWNS-Ladung in Kombination mit einem starken elektrischen Feld, um die Oberfläche des Zielobjekts direkt zu treffen. Details zum EPES-System sind in einer kürzlich erschienenen Publikation von Pyrgiotakis et al.11 beschrieben. EPES besteht aus einer 3D-gedruckten PVC-Kammer mit konischen Enden, in deren Mitte sich zwei parallele Edelstahlplatten (304, hochglanzpoliert) im Abstand von 15,24 cm befinden. Die Platten sind an eine externe Hochspannungsquelle (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY) angeschlossen. Die untere Platte ist stets positiv, die obere stets geerdet (potentialfrei). Die Kammerwände sind mit geerdeter Aluminiumfolie bespannt, um Partikelverluste zu vermeiden. Die Kammer verfügt über eine abgedichtete Frontladeklappe, durch die Testoberflächen auf Kunststoffgestellen platziert werden können. Diese werden von der unteren Metallplatte abgehoben, um Störungen durch die Hochspannung zu vermeiden.
Die Abscheidungseffizienz von EWNS in EPES wurde gemäß einem zuvor entwickelten Protokoll berechnet, das in der ergänzenden Abbildung S111 detailliert beschrieben ist.
Als Kontrollkammer ist der zweite Durchfluss durch die zylindrische Kammer in Reihe mit dem EPES-System geschaltet. Ein zwischengeschalteter HEPA-Filter dient der Entfernung von EWNS. Wie in Abb. 2c dargestellt, wurde das EWNS-Aerosol durch zwei in Reihe geschaltete Kammern gepumpt. Der Filter zwischen Kontrollraum und EPES entfernt verbleibendes EWNS, sodass Temperatur (T), relative Luftfeuchtigkeit (RH) und Ozonwerte konstant bleiben.
Wichtige lebensmittelbedingte Mikroorganismen wie Escherichia coli (ATCC #27325), ein Fäkalindikator, Salmonella enterica (ATCC #53647), ein lebensmittelbedingter Krankheitserreger, Listeria innocua (ATCC #33090), eine Alternative zu dem pathogenen Listeria monocytogenes, Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098) als Alternative zu Verderbnishefen und Mycobacterium parafortuitous (ATCC #19686) als resistentere lebende Bakterien wurden von ATCC (Manassas, Virginia) bezogen.
Kaufen Sie nach Belieben Kisten mit Bio-Cherrytomaten auf Ihrem lokalen Markt und lagern Sie diese bis zur Verwendung (maximal 3 Tage) bei 4 °C im Kühlschrank. Wählen Sie für Ihre Experimente Tomaten einer Größe mit etwa 1,25 cm Durchmesser aus.
Die Protokolle für Inkubation, Inokulation, Exposition und Koloniezählung wurden in unseren vorherigen Publikationen detailliert beschrieben und in den ergänzenden Daten 11 ausführlich erläutert. Die Leistung von EWNS wurde durch Exposition inokulierter Tomaten gegenüber 40.000 Keimen/cm³ für 45 Minuten evaluiert. Kurz gesagt, wurden zum Zeitpunkt t = 0 min drei Tomaten verwendet, um die überlebenden Mikroorganismen zu bestimmen. Drei Tomaten wurden in EPES platziert und EWNS mit 40.000 Keimen/cm³ ausgesetzt (EWNS-exponierte Tomaten), während drei weitere in der Kontrollkammer platziert wurden (Kontrolltomaten). Keine der Tomatengruppen wurde einer weiteren Verarbeitung unterzogen. Die EWNS-exponierten Tomaten und die Kontrolltomaten wurden nach 45 Minuten entnommen, um die Wirkung von EWNS zu bewerten.
Jedes Experiment wurde dreifach durchgeführt. Die Datenanalyse erfolgte gemäß dem in den ergänzenden Daten beschriebenen Protokoll.
Bakterienproben von E. coli, Enterobacter und L. innocua, die EWNS (45 min, EWNS-Aerosolkonzentration 40.000 Partikel/cm³) ausgesetzt waren bzw. nicht exponiert wurden, wurden pelletiert, um Inaktivierungsmechanismen zu untersuchen. Das Pellet wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur in 0,1 M Natriumcacodylatlösung (pH 7,4) mit einem Fixiermittel aus 2,5 % Glutaraldehyd, 1,25 % Paraformaldehyd und 0,03 % Pikrinsäure fixiert. Nach dem Waschen wurden die Proben 2 Stunden mit 1 % Osmiumtetroxid (OsO₄)/1,5 % Kaliumhexacyanoferrat(II) (KFeCN₆) fixiert, dreimal mit Wasser gewaschen und 1 Stunde in 1 % Uranylacetat inkubiert. Anschließend wurden sie zweimal mit Wasser gewaschen. Die Dehydratisierung erfolgte jeweils 10 Minuten in aufsteigenden Alkoholkonzentrationen von 50 %, 70 %, 90 % und 100 %. Die Proben wurden anschließend 1 Stunde lang in Propylenoxid gelagert und mit einem 1:1-Gemisch aus Propylenoxid und TAAP Epon (Marivac Canada Inc., St. Laurent, CA, USA) imprägniert. Die Proben wurden in TAAB Epon eingebettet und 48 Stunden lang bei 60 °C polymerisiert. Das ausgehärtete Granulat wurde geschnitten und mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) mit einem JEOL 1200EX (JEOL, Tokio, Japan), einem konventionellen Transmissionselektronenmikroskop mit einer AMT 2k CCD-Kamera (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, MA, USA), visualisiert.
Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt. Für jeden Messzeitpunkt wurden Bakterienwaschproben dreifach ausplattiert, sodass insgesamt neun Datenpunkte pro Messpunkt vorlagen. Der Mittelwert dieser Datenpunkte wurde als Bakterienkonzentration für den jeweiligen Organismus verwendet. Die Standardabweichung diente als Messfehler. Alle Messwerte wurden berücksichtigt.
Der Logarithmus der Abnahme der Bakterienkonzentration im Vergleich zu t = 0 min wurde mit folgender Formel berechnet:
wobei C0 die Bakterienkonzentration in der Kontrollprobe zum Zeitpunkt 0 (d. h. nachdem die Oberfläche getrocknet ist, aber bevor sie in die Kammer gestellt wird) und Cn die Bakterienkonzentration auf der Oberfläche nach n Minuten Exposition ist.
Um dem natürlichen Abbau der Bakterien während der 45-minütigen Expositionszeit Rechnung zu tragen, wurde die Log-Reduktion im Vergleich zur Kontrolle nach 45 Minuten wie folgt berechnet:
Dabei ist Cn die Bakterienkonzentration in der Kontrollprobe zum Zeitpunkt n und Cn-Kontrolle die Bakterienkonzentration in der Kontrollprobe zum Zeitpunkt n. Die Daten werden als logarithmische Reduktion im Vergleich zur Kontrolle (keine EWNS-Exposition) dargestellt.
Im Rahmen der Studie wurden verschiedene Kombinationen von Spannung und Abstand zwischen Nadel und Gegenelektrode hinsichtlich der Taylor-Kegel-Bildung, der Taylor-Kegel-Stabilität, der Stabilität der EWNS-Produktion und der Reproduzierbarkeit untersucht. Verschiedene Kombinationen sind in Tabelle S1 (Anhang) dargestellt. Zwei Fälle mit stabilen und reproduzierbaren Eigenschaften (Taylor-Kegel, EWNS-Produktion und zeitliche Stabilität) wurden für eine umfassende Studie ausgewählt. Abbildung 3 zeigt die Ergebnisse zu Ladung, Größe und ROS-Gehalt für diese beiden Fälle. Die Ergebnisse sind auch in Tabelle 1 zusammengefasst. Zum Vergleich sind in Abbildung 3 und Tabelle 1 die Eigenschaften der zuvor synthetisierten, nicht optimierten EWNS^8,9,10,11 (Baseline-EWNS) aufgeführt. Die Berechnungen zur statistischen Signifikanz mittels zweiseitigem t-Test sind in Tabelle S2 (Anhang) erneut veröffentlicht. Zusätzlich wurden weitere Daten zum Einfluss des Durchmessers (D) der Probenahmeöffnung der Gegenelektrode und des Abstands (L) zwischen Erdungselektrode und Nadelspitze erhoben (Abbildungen S2 und S3 im Anhang).
(a–c) AFM-Größenverteilung. (d–f) Oberflächenladungscharakteristik. (g) Charakterisierung von ROS und ESR.
Es ist außerdem wichtig zu erwähnen, dass unter allen oben genannten Bedingungen die gemessenen Ionisationsströme im Bereich von 2–6 µA und die Spannungen im Bereich von -3,8 bis -6,5 kV lagen, was zu einer Leistungsaufnahme von weniger als 50 mW für dieses einpolige EWNS-Generierungsmodul führte. Obwohl EWNS unter hohem Druck synthetisiert wurde, waren die Ozonwerte sehr niedrig und überschritten nie 60 ppb.
Abbildung S4 im Anhang zeigt die simulierten elektrischen Felder für die Szenarien [-6,5 kV, 4,0 cm] bzw. [-3,8 kV, 0,5 cm]. Die Feldstärken betragen in diesen Szenarien 2 × 10⁵ V/m bzw. 4,7 × 10⁵ V/m. Dies ist zu erwarten, da das Verhältnis von Spannung zu Abstand im zweiten Fall deutlich höher ist.
Abbildung 3a,b zeigt den mit dem AFM8 gemessenen EWNS-Durchmesser. Die mittleren EWNS-Durchmesser für die Szenarien [-6,5 kV, 4,0 cm] und [-3,8 kV, 0,5 cm] wurden mit 27 nm bzw. 19 nm berechnet. Die geometrischen Standardabweichungen der Verteilungen für die Fälle [-6,5 kV, 4,0 cm] und [-3,8 kV, 0,5 cm] betragen 1,41 bzw. 1,45, was auf eine enge Größenverteilung hindeutet. Sowohl die mittlere Größe als auch die geometrische Standardabweichung liegen sehr nahe an den Werten der Referenz-EWNS (25 nm bzw. 1,41). Abbildung 3c zeigt die Größenverteilung der Referenz-EWNS, gemessen mit derselben Methode unter denselben Bedingungen.
Abbildung 3d,e zeigt die Ergebnisse der Ladungscharakterisierung. Die Daten stellen Mittelwerte aus 30 simultanen Messungen der Konzentration (#/cm³) und des Stroms (I) dar. Die Analyse zeigt, dass die durchschnittliche Ladung auf den EWNS 22 ± 6 e⁻ bzw. 44 ± 6 e⁻ für [-6,5 kV, 4,0 cm] bzw. [-3,8 kV, 0,5 cm] beträgt. Verglichen mit den Baseline-EWNS (10 ± 2 e⁻) ist ihre Oberflächenladung deutlich höher: doppelt so hoch wie im Szenario [-6,5 kV, 4,0 cm] und viermal so hoch wie im Szenario [-3,8 kV, 0,5 cm]. Abbildung 3f zeigt grundlegende Zahlungsdaten der EWNS.
Aus den EWNS-Anzahlkonzentrationskarten (Ergänzende Abbildungen S5 und S6) geht hervor, dass die Szene [-6,5 kV, 4,0 cm] eine deutlich höhere Partikelanzahl aufweist als die Szene [-3,8 kV, 0,5 cm]. Es ist außerdem anzumerken, dass die EWNS-Anzahlkonzentrationen über einen Zeitraum von bis zu vier Stunden überwacht wurden (Ergänzende Abbildungen S5 und S6). Die Stabilität der EWNS-Erzeugung zeigte dabei in beiden Fällen vergleichbare Partikelanzahlkonzentrationen.
Abbildung 3g zeigt das EPR-Spektrum nach Subtraktion des Kontrollsignals (Hintergrundsignal) für optimiertes EWNS bei [-6,5 kV, 4,0 cm]. Das ROS-Spektrum wird zudem mit dem EWNS-Baseline-Spektrum aus einer früheren Publikation verglichen. Die berechnete Anzahl der mit dem Spin-Trap reagierenden EWNS beträgt 7,5 × 10⁴ EWNS/s und ist damit vergleichbar mit dem zuvor publizierten Baseline-EWNS8. Die EPR-Spektren wiesen deutlich auf das Vorhandensein zweier ROS-Arten hin, wobei O₂⁻ überwog, während OH• in geringerer Menge vorlag. Ein direkter Vergleich der Peakintensitäten zeigte darüber hinaus, dass das optimierte EWNS einen signifikant höheren ROS-Gehalt aufwies als das Baseline-EWNS.
Abbildung 4 zeigt die Abscheidungseffizienz von EWNS in EPES. Die Daten sind auch in Tabelle I zusammengefasst und mit den ursprünglichen EWNS-Daten verglichen. In beiden EUNS-Fällen lag die Abscheidung selbst bei einer niedrigen Spannung von 3,0 kV nahe 100 %. Typischerweise reichen 3,0 kV aus, um unabhängig von der Oberflächenladungsänderung eine 100%ige Abscheidung zu erreichen. Unter denselben Bedingungen betrug die Abscheidungseffizienz des Baseline-EWNS aufgrund der geringeren Ladung (durchschnittlich 10 Elektronen pro EWNS) nur 56 %.
Abbildung 5 und Tabelle 2 fassen den Grad der Inaktivierung von Mikroorganismen zusammen, die auf die Oberfläche von Tomaten aufgebracht wurden, nach einer 45-minütigen Exposition gegenüber ca. 40.000 #/cm³ EWNS unter optimalen Bedingungen [-6,5 kV, 4,0 cm]. Die aufgebrachten E. coli und L. innocua zeigten nach 45 Minuten Exposition eine signifikante Reduktion um 3,8 log-Stufen. Unter denselben Bedingungen wies S. enterica eine geringere Reduktion um 2,2 log-Stufen auf, während S. cerevisiae und M. parafortuitum eine Reduktion um 1,0 log-Stufe zeigten.
Elektronenmikroskopische Aufnahmen (Abbildung 6) zeigen die durch EWNS induzierten physikalischen Veränderungen in E. coli-, Salmonella enterica- und L. innocua-Zellen, die zur Inaktivierung führen. Kontrollbakterien wiesen intakte Zellmembranen auf, während exponierte Bakterien beschädigte äußere Membranen zeigten.
Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Kontroll- und exponierten Bakterien zeigten Membranschäden.
Die Daten zu den physikochemischen Eigenschaften der optimierten EWNS zeigen insgesamt, dass die EWNS-Eigenschaften (Oberflächenladung und ROS-Gehalt) im Vergleich zu den zuvor veröffentlichten EWNS-Basisdaten^8,9,10,11 signifikant verbessert wurden. Andererseits blieb ihre Größe im Nanometerbereich, was sehr ähnlich zu früheren Veröffentlichungen ist und ihnen eine lange Verweildauer in der Luft ermöglicht. Die beobachtete Polydispersität lässt sich durch Änderungen der Oberflächenladung erklären, welche die Stärke des Rayleigh-Effekts, die Zufälligkeit und die potenzielle Verschmelzung der EWNS bestimmen. Wie Nielsen et al.²² detailliert beschrieben haben, reduziert eine hohe Oberflächenladung die Verdunstung, indem sie die Oberflächenenergie/-spannung des Wassertropfens effektiv erhöht. Diese Theorie wurde experimentell für Mikrotröpfchen²² und EWNS in unserer vorherigen Publikation⁸ bestätigt. Der mit der Zeit abnehmende Partikelanteil kann ebenfalls die Größe beeinflussen und zur beobachteten Größenverteilung beitragen.
Darüber hinaus beträgt die Ladung pro Struktur je nach den Gegebenheiten etwa 22–44 e⁻, was deutlich höher ist als bei den Basis-EWNS mit einer durchschnittlichen Ladung von 10 ± 2 Elektronen pro Struktur. Es ist jedoch zu beachten, dass es sich hierbei um die durchschnittliche Ladung von EWNS handelt. Seto et al. haben gezeigt, dass die Ladung nicht gleichmäßig verteilt ist und einer logarithmischen Normalverteilung folgt.²¹ Im Vergleich zu unserer vorherigen Arbeit führt eine Verdopplung der Oberflächenladung zu einer Verdopplung der Abscheidungseffizienz im EPES-System auf nahezu 100 %.¹¹