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近年、人工水ナノ構造体（EWNS）を用いたナノテクノロジーに基づく化学物質不使用の抗菌プラットフォームが開発されている。EWNSは表面電荷が高く、活性酸素種（ROS）を豊富に含み、食中毒菌を含む多くの微生物と相互作用して不活性化することができる。本研究では、合成過程におけるEWNSの特性を微調整・最適化することで、抗菌能をさらに高めることができることを示した。EWNSラボプラットフォームは、合成パラメータを変更することでEWNSの特性を微調整できるように設計された。EWNSの特性（電荷、サイズ、ROS含有量）は、最新の分析手法を用いて評価した。さらに、大腸菌、サルモネラ菌、リステリア菌、マイコバクテリウム・パラフォルティタム、サッカロミセス・セレビシエなどの食中毒菌を有機栽培のブドウトマトの表面に接種し、EWNSの微生物不活性化能を評価した。本研究で得られた結果は、EWNSの特性を合成中に微調整することで、不活性化効率が飛躍的に向上することを示している。特に、表面電荷は4倍に増加し、ROS含有量も増加した。微生物除去率は微生物の種類によって異なり、40,000 #/cm3のEWNSエアロゾルに45分間曝露した後、1.0～3.8 logの範囲であった。
微生物汚染は、病原体またはその毒素の摂取によって引き起こされる食中毒の主な原因です。米国だけでも、食中毒は毎年約7,600万人の罹患、32万5,000人の入院、5,000人の死亡を引き起こしています1。さらに、米国農務省（USDA）は、生鮮食品の消費量の増加が、米国で報告されているすべての食中毒の48％の原因となっていると推定しています2。米国における食中毒病原体による疾病と死亡のコストは非常に高く、疾病管理予防センター（CDC）は年間156億ドル以上と推定しています3。
現在、食品の安全性を確保するための化学的4、放射線5、熱6による抗菌介入は、主に生産チェーンの限られた重要管理点（CCP）（通常は収穫後および/または包装中）で実施されており、生鮮食品が交差汚染7にさらされるような方法で継続的に実施されているわけではない。抗菌介入は、食中毒や食品の腐敗をより適切に制御するために必要であり、農場から食卓までの連続体全体に適用される可能性がある。影響とコストが少ない。
ナノテクノロジーに基づく化学物質不使用の抗菌プラットフォームが最近開発され、人工水ナノ構造（EWNS）を使用して表面や空気中の細菌を不活性化します。EVNSの合成には、エレクトロスプレーと水のイオン化という2つの並行プロセスが使用されました（図1a）。EWNSは、独自の物理的および生物学的特性セットを持つことが以前に示されています8,9,10。EWNSは、構造あたり平均10個の電子を持ち、平均ナノメートルサイズは25 nmです（図1b、c）8,9,10。さらに、電子スピン共鳴（ESR）により、EWNSには、主にヒドロキシル（OH•）ラジカルとスーパーオキシド（O2-）ラジカルなどの活性酸素種（ROS）が大量に含まれていることが示されました（図1c）8。EWNSは長時間空気中に留まり、空気中に浮遊している微生物や表面に存在する微生物と衝突し、ROSペイロードを届け、微生物を不活性化する可能性があります（図1d）。これらの先行研究では、EWNSが表面や空気中のマイコバクテリアを含む、公衆衛生上重要なグラム陰性菌およびグラム陽性菌と相互作用して不活化することも示されました8,9。透過型電子顕微鏡観察により、不活化は細胞膜の破壊によって引き起こされることが示されました。さらに、急性吸入試験では、高用量のEWNSが肺の損傷や炎症を引き起こさないことが示されています8。
(a) 液体を含む毛細管と対向電極の間に高電圧を印加すると、エレクトロスプレーが発生します。(b) 高電圧を印加すると、(i) 水のエレクトロスプレーと (ii) EWNS 内に捕捉された活性酸素種 (イオン) の生成という 2 つの異なる現象が発生します。(c) EWNS の独特な構造。(d) EWNS はナノスケールであるため移動性が高く、空気中の病原体と相互作用することができます。
EWNS抗菌プラットフォームが生鮮食品表面の食中毒微生物を不活化する能力も最近実証されました。また、EWNS表面電荷は電場と組み合わせて標的送達に使用できることも示されています。さらに重要なことに、EWNS濃度約50,000#/cm311に90分曝露すると、大腸菌やリステリア菌などの様々な食品微生物に対する有機トマトの活性が約1.4 log減少するという有望な初期結果が観察されました。加えて、予備的な官能評価試験では、対照トマトと比較して官能的な影響は見られませんでした。これらの初期不活化結果は、50,000#/cc311という非常に低いEWNS投与量でも食品の安全性を約束するものの、感染や腐敗のリスクをさらに低減するには、より高い不活化能力がより有益であることは明らかです。
本研究では、EWNSの合成パラメータを微調整し、EWNSの物理化学的特性を最適化して抗菌性を高めるためのEWNS生成プラットフォームの開発に焦点を当てます。特に、最適化は、表面電荷（標的送達の改善）とROS含有量（不活化効率の向上）の増加に重点を置いています。最適化された物理化学的特性（サイズ、電荷、ROS含有量）は、最新の分析方法と、大腸菌、サルモネラ菌、ラクトバチルス・イノキュア、サッカロミセス・セレビシエ、ミクロフィラリア・パラフォルトゥイタムなどの一般的な食品微生物を用いて特性評価を行います。
EVNSは、高純度水（18 MΩ cm–1）の同時電気噴霧およびイオン化によって合成された。電気噴霧器12は、一般的に液体、合成ポリマーおよびセラミック粒子13、ならびに制御されたサイズの繊維14を噴霧するために使用される。
以前の出版物8、9、10、11で詳述されているように、典型的な実験では、金属毛細管と接地された対向電極の間に高電圧が印加されます。このプロセス中に、1) エレクトロスプレーと 2) 水のイオン化という 2 つの異なる現象が発生します。2 つの電極間の強い電場により、凝縮水の表面に負電荷が蓄積され、テイラー コーンが形成されます。その結果、高電荷の水滴が形成され、レイリー理論16 に従って、より小さな粒子に分裂し続けます。同時に、強い電場により、一部の水分子が分裂して電子を剥ぎ取り（イオン化）、大量の活性酸素種（ROS）17 が生成されます。同時に生成された ROS18 パケットは EWNS にカプセル化されました（図 1c）。
図2aは、本研究でEWNS合成に使用されたEWNS生成システムを示しています。密閉ボトルに貯蔵された精製水は、テフロンチューブ（内径2mm）を通して30Gステンレス鋼針（金属毛細管）に供給されます。図2bに示すように、水の流れはボトル内の空気圧によって制御されます。針はテフロンコンソールに取り付けられており、対向電極から一定の距離に手動で調整できます。対向電極は、中央にサンプリング用の穴が開いた研磨アルミニウムディスクです。対向電極の下にはアルミニウム製のサンプリング漏斗があり、サンプリングポートを介して実験装置の残りの部分に接続されています（図2b）。すべてのサンプラーコンポーネントは、粒子サンプリングを劣化させる可能性のある電荷の蓄積を避けるために電気的に接地されています。
（a）人工水ナノ構造生成システム（EWNS）。（b）サンプラーとエレクトロスプレーユニットの断面図。最も重要なパラメータを示す。（c）細菌不活化のための実験装置。
上述のEWNS生成システムは、主要な動作パラメータを変更することで、EWNSの特性を微調整することができます。印加電圧（V）、針と対向電極間の距離（L）、および毛細管を通る水流量（φ）を調整することで、EWNSの特性を微調整します。記号[V（kV）、L（cm）]は、異なる組み合わせを表すために使用されます。特定のセット[V、L]の安定したテイラーコーンが得られるように水流量を調整します。本研究では、対向電極の開口部（D）を0.5インチ（1.29cm）に設定しました。
形状の制約と非対称性のため、電界強度を第一原理から計算することはできません。そこで、QuickField™ソフトウェア（デンマーク、スヴェンボー）19を用いて電界を計算しました。電界は均一ではないため、様々な構成における基準値として、毛細管先端の電界値を用いました。
本研究では、テイラーコーンの形成、テイラーコーンの安定性、EWNS生成の安定性、および再現性の観点から、針と対向電極間の電圧と距離のいくつかの組み合わせを評価した。さまざまな組み合わせを補足表S1に示す。
EWNS生成システムの出力は、粒子数濃度を測定するために走査移動度粒子径測定器（SMPS、モデル3936、TSI、ミネソタ州ショアビュー）に直接接続され、ファラデーエアロゾル電位計（TSI、モデル3068B、米国ショアビュー）とともに使用され、エアロゾル流量の測定に使用されました。これは、以前の出版物9で説明したとおりです。SMPSとエアロゾル電位計の両方で、流量0.5 L/min（総サンプル流量1 L/min）でサンプリングを行いました。粒子濃度とエアロゾルフラックスは120秒間測定しました。測定を30回繰り返しました。総エアロゾル電荷は電流測定値から計算され、平均EWNS電荷はサンプリングされたEWNS粒子の総数から推定されます。EWNSの平均コストは、式（1）を使用して計算できます。
ここで、IElは測定された電流、NSMPSはSMPSで測定された数濃度、φElは電位計への流量である。
相対湿度（RH）は表面電荷に影響を与えるため、実験中は温度と相対湿度をそれぞれ21℃と45%に一定に保った。
EWNSのサイズと寿命の測定には、原子間力顕微鏡（AFM）、Asylum MFP-3D（Asylum Research、カリフォルニア州サンタバーバラ）、およびAC260Tプローブ（オリンパス、東京、日本）を使用した。AFMのスキャン速度は1 Hz、スキャン領域は5 µm×5 µmで、スキャンライン数は256本である。すべての画像は、Asylumソフトウェア（範囲100 nm、閾値100 pmのマスク）を使用して、一次画像アライメントを行った。
サンプリング漏斗を取り外し、マイカ表面を対向電極から 2.0 cm の距離に平均 120 秒間置いて、粒子の合体やマイカ表面上の不規則な液滴の形成を防いだ。EWNS は、切りたてのマイカ表面 (Ted Pella、カリフォルニア州レディング) に直接塗布した。スパッタリング直後、AFM を使用してマイカ表面を可視化した。切りたての未修飾マイカの表面接触角は 0° に近いので、EWNS はドーム状にマイカ表面上を伝播する 20。拡散液滴の直径 (a) と高さ (h) は、AFM トポグラフィーから直接測定し、以前に検証した方法 8 を使用してドーム状拡散体積 EWNS を計算するために使用した。オンボード EVNS が同じ体積であると仮定すると、等価直径は式 (2) から計算できる。
以前に開発した方法に従って、電子スピン共鳴（ESR）スピントラップを使用して、EWNS 中の短寿命ラジカル中間体の存在を検出しました。エアロゾルは、235 mM DEPMPO（5-（ジエトキシホスホリル）-5-メチル-1-ピロリン-N-オキシド）（Oxis International Inc.、ポートランド、オレゴン）を含む溶液に通しました。すべての EPR 測定は、Bruker EMX 分光計（Bruker Instruments Inc.、ビレリカ、マサチューセッツ州、米国）とフラットセルアレイを使用して実行しました。データの収集と分析には、Acquisit ソフトウェア（Bruker Instruments Inc.、ビレリカ、マサチューセッツ州、米国）を使用しました。ROS 特性評価は、一連の動作条件 [-6.5 kV、4.0 cm] でのみ実行しました。EWNS 濃度は、インパクターでの EWNS の損失を考慮した後、SMPS を使用して測定しました。
オゾン濃度は、205デュアルビームオゾンモニター™（2Bテクノロジーズ、コロラド州ボルダー）8,9,10を使用して監視されました。
すべてのEWNSプロパティについて、測定値は測定値の平均値であり、測定誤差は標準偏差である。最適化されたEWNS属性の値と、対応する基本EWNSの値を比較するためにt検定を実施した。
図2cは、EWNS11を表面に照射するために使用できる、以前に開発され特性評価された静電沈殿パススルーシステム（EPES）を示しています。EPESは、EWNSの電荷と強力な電界を組み合わせて、ターゲットの表面に直接「照射」します。EPESシステムの詳細は、Pyrgiotakisらによる最近の論文11に記載されています。EPESは、テーパー状の端部を持つ3DプリントされたPVCチャンバーで構成され、中央に15.24cm離れた2枚の平行なステンレス鋼（304ステンレス鋼、鏡面研磨）金属板が配置されています。これらの板は外部の高電圧電源（Bertran 205B-10R、Spellman、Hauppauge、NY）に接続され、下側の板は常に正極、上側の板は常に接地（フローティング）されています。チャンバーの壁はアルミホイルで覆われており、粒子の損失を防ぐために電気的に接地されています。このチャンバーには密閉式の前面投入口があり、試験面をプラスチック製のラックに載せて底部の金属板から持ち上げることで、高電圧による干渉を回避できるようになっている。
EPESにおけるEWNSの堆積効率は、補足図S111に詳述されている以前に開発されたプロトコルに従って計算された。
制御室として、円筒形チャンバーを通る2番目の流れは、中間HEPAフィルターを介してEPESシステムと直列に接続され、EWNSを除去します。図2cに示すように、EWNSエアロゾルは直列に接続された2つのチャンバーを通してポンプで送られます。制御室とEPESの間のフィルターは、残留するEWNSを除去し、温度（T）、相対湿度（RH）、オゾン濃度を同じにします。
重要な食中毒微生物が、糞便指標菌である大腸菌（ATCC #27325）、食中毒病原菌であるサルモネラ菌（ATCC #53647）、病原性リステリア菌の代替菌であるリステリア菌イノキュア（ATCC #33090）、腐敗酵母の代替菌であるサッカロミセス・セレビシエ（ATCC #4098）、およびより耐性の高い生菌であるマイコバクテリウム・パラフォルトゥイトゥス（ATCC #19686）など、生鮮食品を汚染することがわかっています。これらの菌は、ATCC（バージニア州マナサス）から購入しました。
地元の市場で有機栽培のミニトマトを箱買いし、使うまで（最長3日間）4℃で冷蔵保存してください。実験用に、直径約1.2cmのトマトを選んでください。
インキュベーション、接種、曝露、コロニー計数のプロトコルは、以前の出版物で詳しく説明されており、補足データ 11 で詳しく説明されています。 EWNS の性能は、接種したトマトを 40,000 #/cm3 に 45 分間曝露することで評価しました。簡単に説明すると、t = 0 分時点で、3 つのトマトを使用して生存している微生物を評価しました。3 つのトマトを EPES に入れ、40,000 #/cc の EWNS に曝露し (EWNS 曝露トマト)、他の 3 つのトマトをコントロール チャンバーに入れました (コントロール トマト)。トマトのグループには、追加の処理は行いませんでした。EWNS 曝露トマトとコントロールは、45 分後に取り出して EWNS の効果を評価しました。
各実験は3回ずつ繰り返して実施した。データ解析は補足資料に記載されている手順に従って行った。
EWNSに曝露した（45分、EWNSエアロゾル濃度40,000 #/cm3）大腸菌、エンテロバクター、およびL.イノキュアの細菌サンプルと曝露していないサンプルをペレット化して不活化メカニズムを評価した。沈殿物を室温で2時間、2.5%グルタルアルデヒド、1.25%パラホルムアルデヒド、および0.03%ピクリン酸の固定剤を含む0.1 Mカコジル酸ナトリウム溶液（pH 7.4）で固定した。洗浄後、1%四酸化オスミウム（OsO4）/1.5%フェロシアン化カリウム（KFeCN6）で2時間固定し、水で3回洗浄し、1%酢酸ウラニルで1時間インキュベートし、その後水で2回洗浄した。続いて、50%、70%、90%、100%アルコールでそれぞれ10分間脱水した。次に、サンプルを1時間プロピレンオキシドに浸漬し、プロピレンオキシドとTAAPエポン（Marivac Canada Inc.、カリフォルニア州セントローレント）の1:1混合物を含浸させた。サンプルをTAABエポンに埋め込み、60℃で48時間重合させた。硬化した顆粒状樹脂を切断し、AMT 2k CCDカメラ（Advanced Microscopy Techniques, Corp.、マサチューセッツ州ウォーバーン、米国）を搭載した従来の透過型電子顕微鏡JEOL 1200EX（日本電子、東京、日本）を用いてTEMで観察した。
すべての実験は3回繰り返して実施した。各時点において、細菌洗浄液を3回ずつ平板培養し、1時点あたり合計9つのデータポイントを得た。これらの平均値を、その特定の微生物の細菌濃度とした。標準偏差を測定誤差として用いた。すべてのデータポイントを有効とした。
t = 0分と比較した細菌濃度の減少の対数は、以下の式を用いて計算した。
ここで、C0は時間0（つまり、表面が乾燥した後、チャンバーに入れる前）における対照サンプル中の細菌濃度であり、Cnはn分間の暴露後の表面上の細菌濃度である。
45分間の曝露期間中に細菌が自然に分解されることを考慮するため、45分後の対照群と比較して、対数減少率も以下のように計算した。
ここで、Cnは時間nにおける対照サンプル中の細菌濃度、Cn-Controlは時間nにおける対照細菌濃度である。データは対照（EWNS曝露なし）と比較した対数減少として示されている。
本研究では、テイラーコーン形成、テイラーコーンの安定性、EWNS生成の安定性、再現性の観点から、針と対向電極間の電圧と距離のいくつかの組み合わせを評価した。さまざまな組み合わせを補足表S1に示す。安定性と再現性のある特性（テイラーコーン、EWNS生成、および時間経過に伴う安定性）を示す完全な研究のために2つのケースを選択した。図3には、2つのケースにおけるROSの電荷、サイズ、および含有量の結果を示す。結果は表1にもまとめられている。参考として、図3と表1には、以前に合成された最適化されていないEWNS8、9、10、11（ベースラインEWNS）の特性も含まれている。両側t検定を使用した統計的有意性の計算は、補足表S2に再掲載されている。さらに、追加データには、対向電極のサンプリング穴の直径（D）と接地電極と針の先端間の距離（L）の影響に関する研究が含まれています（補足図S2およびS3）。
(a～c) AFMサイズ分布。(d～f) 表面電荷特性。(g) ROSおよびESRの特性評価。
また、上記のすべての条件において、測定されたイオン化電流は 2〜6 µA の範囲であり、電圧は -3.8〜-6.5 kV の範囲であったため、この単端子 EWNS 生成モジュールの消費電力は 50 mW 未満であったことも重要です。EWNS は高圧下で合成されましたが、オゾン濃度は非常に低く、60 ppb を超えることはありませんでした。
補足図S4は、それぞれ[-6.5 kV、4.0 cm]と[-3.8 kV、0.5 cm]のシナリオにおけるシミュレーションされた電界を示しています。[-6.5 kV、4.0 cm]と[-3.8 kV、0.5 cm]のシナリオにおける電界は、それぞれ2 × 10⁵ V/mと4.7 × 10⁵ V/mと計算されています。これは、2番目のケースでは電圧と距離の比率がはるかに高いため、当然の結果です。
図3a、bには、AFM8で測定したEWNSの直径を示します。[-6.5 kV、4.0 cm]と[-3.8 kV、0.5 cm]のシナリオにおけるEWNSの平均直径は、それぞれ27 nmと19 nmと計算されました。[-6.5 kV、4.0 cm]と[-3.8 kV、0.5 cm]の場合の分布の幾何標準偏差は、それぞれ1.41と1.45であり、狭いサイズ分布を示しています。平均サイズと幾何標準偏差は、ベースラインEWNSに非常に近く、それぞれ25 nmと1.41です。図3cには、同じ方法で同じ条件下で測定したベースラインEWNSのサイズ分布を示します。
図3d、eは電荷特性評価の結果を示しています。データは濃度（#/cm3）と電流（I）の同時測定30回の平均値です。分析によると、EWNSの平均電荷は[-6.5 kV、4.0 cm]で22 ± 6 e-、[-3.8 kV、0.5 cm]で44 ± 6 e-です。ベースラインEWNS（10 ± 2 e-）と比較すると、その表面電荷は著しく高く、[-6.5 kV、4.0 cm]シナリオの2倍、[-3.8 kV、0.5 cm]の4倍です。3fはEWNSの基本支払いデータを示しています。
EWNSの数濃度マップ（補足図S5およびS6）から、[-6.5 kV、4.0 cm]シーンは[-3.8 kV、0.5 cm]シーンよりも粒子数が著しく多いことがわかります。また、EWNSの数濃度は最大4時間モニタリングされました（補足図S5およびS6）。この間、EWNSの発生安定性は、どちらの場合も同じレベルの粒子数濃度を示しました。
図3gは、[-6.5 kV、4.0 cm]における最適化されたEWNSのコントロール（バックグラウンド）減算後のEPRスペクトルを示しています。ROSスペクトルは、以前に発表された論文のEWNSベースラインとも比較されています。スピントラップと反応するEWNSの計算数は7.5 × 104 EWNS/sであり、これは以前に発表されたベースラインEWNS8と類似しています。EPRスペクトルは、2種類のROSの存在を明確に示しており、O2-が優勢で、OH•は少量存在していました。さらに、ピーク強度の直接比較により、最適化されたEWNSはベースラインEWNSと比較してROS含有量が著しく高いことが示されました。
図4は、EPESにおけるEWNSの堆積効率を示しています。データは表Iにもまとめられており、元のEWNSデータと比較されています。どちらのEUNSの場合も、3.0 kVという低電圧でも堆積率は100%に近かった。通常、3.0 kVは表面電荷の変化に関係なく100%の堆積を達成するのに十分です。同じ条件下では、ベースラインEWNSの堆積効率は、電荷が低い（EWNSあたり平均10電子）ため、わずか56%でした。
図5と表2は、最適な条件[-6.5 kV、4.0 cm]で45分間、約40,000 #/cm3のEWNSに曝露した後のトマト表面に接種された微生物の不活化度をまとめたものである。接種されたE. coliとL. innocuaは、45分間の曝露後に3.8 logの有意な減少を示した。同じ条件下で、S. entericaは2.2 logのより低いlog減少を示し、S. cerevisiaeとM. parafortuitumは1.0 logの減少を示した。
電子顕微鏡写真（図6）は、EWNSによって大腸菌、サルモネラ菌、およびリステリア菌の細胞に引き起こされる物理的変化を示しており、最終的に不活化に至る。対照群の細菌は細胞膜が損傷を受けていないのに対し、EWNSに曝露された細菌は外膜が損傷していた。
対照群および曝露群の細菌を電子顕微鏡で観察したところ、細胞膜の損傷が明らかになった。
最適化された EWNS の物理化学的特性に関するデータは、EWNS の特性 (表面電荷と ROS 含有量) が、以前に発表された EWNS のベースライン データ 8,9,10,11 と比較して大幅に改善されたことを総合的に示しています。一方、そのサイズはナノメートル範囲に留まり、これは以前に発表された結果と非常によく似ているため、長時間空気中に留まることができます。観察された多分散性は、レイリー効果の大きさ、ランダム性、および EWNS の潜在的な合体を決定する表面電荷の変化によって説明できます。しかし、Nielsen ら 22 によって詳述されているように、高い表面電荷は、水滴の表面エネルギー/張力を効果的に増加させることにより蒸発を減少させます。この理論は、マイクロドロップレット 22 および EWNS について、以前の論文 8 で実験的に確認されています。時間の経過による損失もサイズに影響を与え、観察されたサイズ分布に寄与する可能性があります。
さらに、構造あたりの電荷は状況によって約 22〜44 e- であり、構造あたり平均電荷が 10 ± 2 電子である基本的な EWNS と比較してかなり高い。ただし、これは EWNS の平均電荷であることに注意する必要がある。Seto らは、電荷は均一ではなく、対数正規分布に従うことを示した 21。我々の以前の研究と比較すると、表面電荷を 2 倍にすると、EPES システムの堆積効率がほぼ 100% に 2 倍になる 11。