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最近、人工水ナノ構造（EWNS）を用いたナノテクノロジーに基づく、化学薬品を使用しない抗菌プラットフォームが開発されました。EWNSは表面電荷が高く、食品媒介性病原体を含む多くの微生物と相互作用して不活性化できる活性酸素種（ROS）が豊富です。ここでは、合成中にその特性を微調整して最適化することで、抗菌力をさらに高めることができることが示されています。EWNS実験プラットフォームは、合成パラメータを変更することでEWNSの特性を微調整するように設計されました。EWNS特性（電荷、サイズ、およびROS含有量）の特性評価は、最新の分析方法を使用して実施されました。さらに、大腸菌、サルモネラ・エンテリカ、リステリア・イノキュア、マイコバクテリウム・パラ・フォルティタム、サッカロミセス・セレビシエなどの食品微生物を有機栽培のグレープトマトの表面に接種し、微生物不活性化能を評価しました。本研究で示した結果は、EWNSの特性を合成中に微調整することで、不活化効率が飛躍的に向上することを示しています。特に、表面電荷は4倍に増加し、ROS含有量も増加しました。微生物除去率は微生物の種類に依存し、40,000 #/cm3のEWNSエアロゾルに45分間曝露した後、1.0～3.8 logの範囲でした。
微生物汚染は、病原体またはその毒素の摂取によって引き起こされる食中毒の主な原因です。食中毒は、米国だけでも毎年約7,600万人の罹患、32万5,000人の入院、そして5,000人の死亡を引き起こしています1。さらに、米国農務省（USDA）は、米国で報告されている食中毒の48%は生鮮食品の消費量の増加に起因すると推定しています2。米国における食中毒による病原体による疾病と死亡のコストは非常に高く、米国疾病予防管理センター（CDC）の推定によると、年間156億ドル以上となっています3。
現在、食品の安全性を確保するための化学的4、放射線5、および熱的6な抗菌介入は、主に生産チェーンにおける限定重要管理点（CCP）（通常は収穫後および／または包装中）で実施されており、生鮮農産物が交差汚染7にさらされるような方法で継続的に実施されているわけではありません。抗菌介入は、食中毒や食品の腐敗をより効果的に抑制するために必要であり、農場から食卓までの一連のプロセス全体に適用できる可能性があります。影響とコストの軽減。
ナノテクノロジーに基づく化学薬品を使用しない抗菌プラットフォームが最近開発され、人工水ナノ構造（EWNS）を使用して表面および空気中の細菌を不活性化しました。EVNSの合成には、エレクトロスプレーと水のイオン化という2つの並行プロセスが使用されました（図1a）。EWNSは以前に、独自の物理的および生物学的特性を持つことが示されています8,9,10。EWNSは構造あたり平均10個の電子を持ち、平均ナノメートルサイズは25 nmです（図1b、c）8,9,10。さらに、電子スピン共鳴（ESR）により、EWNSには大量の活性酸素種（ROS）、主にヒドロキシル（OH•）およびスーパーオキシド（O2-）ラジカルが含まれていることが示されました（図1c）8。EWNSは長時間空気中に残留し、空気中に浮遊している微生物や表面に存在する微生物と衝突して、ROSペイロードを送達し、微生物の不活性化を引き起こします（図1d）。これらの先行研究では、EWNSが、表面上および空気中の結核菌を含む、公衆衛生上重要な様々なグラム陰性細菌およびグラム陽性細菌と相互作用し、不活化できることも示されています8,9。透過型電子顕微鏡による観察では、この不活化は細胞膜の破壊によって引き起こされることが示されました。さらに、急性吸入試験では、高用量のEWNSが肺の損傷や炎症を引き起こさないことが示されています8。
(a) 電気噴霧は、液体が入った毛細管と対電極の間に高電圧を印加すると発生します。(b) 高電圧を印加すると、(i) 水の電気噴霧と (ii) EWNS に捕捉された活性酸素種（イオン）の生成という 2 つの異なる現象が発生します。(c) EWNS の独自の構造。(d) EWNS はナノスケールであるため移動性が高く、空気中の病原体と相互作用する可能性があります。
EWNS抗菌プラットフォームには、生鮮食品表面の食中毒菌を不活化する能力があることも最近実証されました。また、EWNSの表面電荷を電界と組み合わせて標的に送達できることも示されています。さらに重要なのは、約50,000#/cm3の濃度のEWNSに曝露してから90分以内に、大腸菌やリステリア菌などのさまざまな食品微生物に対する有機トマトの活性が約1.4 log減少するという有望な初期結果が観察されたことです11。さらに、予備的な官能評価テストでは、コントロールトマトと比較して官能的な影響は見られませんでした。これらの初期不活化結果は、50,000#/ccという非常に低いEWNS用量でも食品の安全性を約束しますが、感染と腐敗のリスクをさらに低減するには、不活化ポテンシャルが高いほど有益であることは明らかです。
本研究では、EWNS生成プラットフォームの開発に焦点を当て、合成パラメータを微調整し、EWNSの物理化学的特性を最適化して抗菌活性を高めます。特に、最適化では表面電荷の増加（標的への送達向上）とROS含有量の増加（不活化効率向上）に重点を置きました。最新の分析手法を用い、E. coli、S. enterica、L. innocua、S. cerevisiae、M. parafortuitumといった一般的な食品微生物を用いて、最適化された物理化学的特性（サイズ、電荷、ROS含有量）を解析しました。
EVNSは、高純度水（18 MΩ cm–1）の同時エレクトロスプレーとイオン化によって合成されました。電気噴霧器12は、通常、液体、合成ポリマー、セラミック粒子13、および繊維14を制御されたサイズに噴霧するために使用されます。
以前の文献 8, 9, 10, 11 で詳述されているように、典型的な実験では、金属毛細管と接地された対電極の間に高電圧が印加されます。このプロセス中に、1) 電気噴霧と 2) 水のイオン化という 2 つの異なる現象が発生します。2 つの電極間の強力な電界により、凝縮水の表面に負電荷が蓄積され、テイラーコーンが形成されます。その結果、高電荷の水滴が形成され、レイリー理論 16 によれば、これらの水滴はより小さな粒子に分解され続けます。同時に、強力な電界により一部の水分子が分裂して電子を剥ぎ取り (イオン化)、大量の活性酸素種 (ROS) が生成されます 17。同時に生成された ROS 18 パケットが EWNS に封入されました (図 1c)。
図2aは、本研究でEWNS合成に開発され、使用されたEWNS生成システムを示しています。密閉ボトルに保存された精製水は、テフロンチューブ（内径2mm）を介して30Gステンレス鋼ニードル（金属毛細管）に供給されました。図2bに示すように、水の流れはボトル内の空気圧によって制御されます。ニードルはテフロンコンソールに取り付けられており、手動で対電極から特定の距離に調整できます。対電極は、サンプリング用に中央に穴が開いた研磨されたアルミニウムディスクです。対電極の下にはアルミニウムサンプリング漏斗があり、サンプリングポートを介して実験装置の残りの部分に接続されています（図2b）。すべてのサンプラーコンポーネントは、粒子サンプリングを劣化させる可能性のある電荷の蓄積を避けるために電気的に接地されています。
(a) エンジニアリングウォーターナノ構造生成システム（EWNS）。(b) 最も重要なパラメータを示すサンプラーとエレクトロスプレーユニットの断面図。(c) 細菌不活化のための実験装置。
上述のEWNS生成システムは、主要な動作パラメータを変更することで、EWNS特性の微調整を容易にします。印加電圧（V）、針と対電極間の距離（L）、および毛細管を通過する水流（φ）を調整することで、EWNS特性を微調整できます。記号[V（kV）、L（cm）]は、異なる組み合わせを表すために使用されます。水流を調整することで、特定の組み合わせ[V、L]で安定したテイラーコーンが得られます。本研究では、対電極の開口部（D）は0.5インチ（1.29 cm）に設定しました。
形状の制約と非対称性のため、電界強度を第一原理から計算することはできません。代わりに、QuickField™ソフトウェア（スベンボー、デンマーク）19を用いて電界を計算しました。電界は均一ではないため、キャピラリー先端の電界値を様々な構成における基準値として使用しました。
本研究では、電圧と針と対電極間の距離の複数の組み合わせについて、テイラーコーンの形成、テイラーコーンの安定性、EWNS生成の安定性、および再現性の観点から評価しました。様々な組み合わせは補足表S1に示されています。
EWNS 生成システムの出力は、粒子数濃度を測定するために走査型移動度粒子サイズ測定装置 (SMPS、モデル 3936、TSI、ミネソタ州ショアビュー) に直接接続され、ファラデー エアロゾル電位計 (TSI、モデル 3068B、米国ショアビュー) とともに使用されました。 MN) は、以前の出版物9 で説明したように、エアロゾルの流れを測定するために使用されました。 SMPS とエアロゾル電位計の両方で、0.5 L/分 (合計サンプル流量 1 L/分) の流量でサンプリングを行いました。粒子濃度とエアロゾルフラックスは 120 秒間測定されました。測定を 30 回繰り返します。総エアロゾル電荷は電流測定値から計算され、平均 EWNS 電荷はサンプリングされた EWNS 粒子の総数から推定されます。
ここで、IEl は測定電流、NSMPS は SMPS で測定された数濃度、φEl は電位計への流量です。
相対湿度 (RH) は表面電荷に影響を与えるため、実験中は温度と (RH) はそれぞれ 21°C と 45% で一定に保たれました。
原子間力顕微鏡（AFM）、Asylum MFP-3D（Asylum Research、カリフォルニア州サンタバーバラ）およびAC260Tプローブ（Olympus、東京、日本）を用いて、EWNSのサイズと寿命を測定した。AFMの走査速度は1Hz、走査領域は5µm×5µm、走査線数は256本である。全ての画像は、Asylumソフトウェア（マスク範囲100nm、閾値100pm）を用いて一次画像アライメントを行った。
サンプリング漏斗を取り外し、粒子の凝集と雲母表面での不規則な液滴の形成を防ぐため、平均時間 120 秒間、雲母表面を対電極から 2.0 cm の距離に置きます。EWNS は、切りたての雲母表面 (Ted Pella、カリフォルニア州レディング) に直接塗布されました。スパッタリング直後、雲母表面は AFM を使用して可視化されました。切りたての改質されていない雲母の表面接触角は 0° に近いため、EWNS はドーム状に雲母表面上を伝播します20。拡散する液滴の直径 (a) と高さ (h) は AFM トポグラフィーから直接測定され、以前に検証した方法8 を使用してドーム状拡散体積 EWNS を計算するために使用されました。搭載されている EVNS が同じ体積であると仮定すると、等価直径は式 (2) から計算できます。
以前に開発した方法に従い、電子スピン共鳴（ESR）スピントラップを使用して、EWNS中の短寿命ラジカル中間体の存在を検出しました。エアロゾルを、235 mM DEPMPO（5-（ジエトキシホスホリル）-5-メチル-1-ピロリン-N-オキシド）（Oxis International Inc.、オレゴン州ポートランド）を含む溶液に通過させました。すべてのEPR測定は、Bruker EMX分光計（Bruker Instruments Inc.、米国マサチューセッツ州ビレリカ）およびフラットセルアレイを使用して実施しました。データの収集と分析には、Acquisitソフトウェア（Bruker Instruments Inc.、米国マサチューセッツ州ビレリカ）を使用しました。ROS特性評価は、一連の動作条件（-6.5 kV、4.0 cm）でのみ実施しました。EWNS濃度は、インパクターでのEWNSの損失を考慮した後、SMPSを使用して測定しました。
オゾン濃度は、205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies、コロラド州ボルダー)8,9,10 を使用して監視されました。
すべてのEWNSプロパティにおいて、測定値は測定値の平均、測定誤差は標準偏差です。最適化されたEWNS属性の値とベースEWNSの対応する値を比較するためにt検定を実施しました。
図 2c は、以前に開発され特性評価された静電集塵パススルー システム (EPES) を示しています。これを使用すると、EWNS11 を表面に向けることができます。EPES は、EWNS 電荷と強力な電界を組み合わせて、ターゲットの表面を直接「指し示します」。EPES システムの詳細は、Pyrgiotakis らによる最近の出版物に記載されています。11。つまり、EPES は、両端が先細りの 3D プリントされた PVC チャンバーで構成され、チャンバーの中央には 15.24 cm 間隔で 2 枚の平行なステンレス鋼 (304 ステンレス鋼、鏡面研磨) 金属プレートが含まれています。ボードは外部の高電圧源 (Bertran 205B-10R、Spellman、ニューヨーク州ホーポージ) に接続され、下部のボードは常にプラス、上部のボードは常に接地 (フローティング) されていました。チャンバーの壁はアルミホイルで覆われており、粒子の損失を防ぐために電気的に接地されています。このチャンバーには密閉された前面ローディングドアがあり、テスト表面をプラスチックラックに置き、高電圧干渉を避けるために下部の金属プレートから持ち上げることができます。
EPES における EWNS の沈着効率は、補足図 S111 に詳述されている以前に開発されたプロトコルに従って計算されました。
制御室として、円筒形チャンバーを通る2番目の流れは、中間HEPAフィルターを介してEPESシステムに直列に接続され、EWNSを除去します。図2cに示すように、EWNSエアロゾルは直列に接続された2つのチャンバーを通過します。制御室とEPESの間にあるフィルターは、残留するEWNSを除去し、温度（T）、相対湿度（RH）、およびオゾン濃度を一定に保ちます。
生鮮農産物には、大腸菌（ATCC #27325）、糞便指標菌、サルモネラ・エンテリカ（ATCC #53647）、病原菌リステリア・モノサイトゲネスの代替菌であるリステリア・イノキュア（ATCC #33090）などの重要な食中毒微生物が汚染されていることが判明しています。また、腐敗酵母の代替菌としてサッカロミセス・セレビシエ（ATCC #4098）、より耐性のある生菌であるマイコバクテリウム・パラフォーチュイタス（ATCC #19686）は、ATCC（バージニア州マナサス）から購入しました。
地元のスーパーでオーガニックのグレープトマトを箱買いし、使用するまで（最大3日間）4℃で冷蔵保存します。直径約1.3cmほどのトマトを1つ選び、実験に使ってみましょう。
インキュベーション、接種、曝露、およびコロニー計数のプロトコルは、以前の出版物で詳述されており、補足データ 11 で詳細に説明されています。EWNS の性能は、接種したトマトを 40,000 #/cm3 に 45 分間曝露することで評価しました。簡単に説明すると、t = 0 分の時点で、3 個のトマトを使用して生存微生物を評価しました。3 個のトマトを EPES に入れ、40,000 #/cc の EWNS に曝露し (EWNS 曝露トマト)、他の 3 個をコントロール チャンバーに入れました (コントロール トマト)。いずれのトマト グループにも追加処理は施しませんでした。EWNS に曝露したトマトとコントロールは、EWNS の効果を評価するために 45 分後に取り除かれました。
各実験は3回実施し、データ解析は補足データに記載されているプロトコルに従って実施しました。
EWNS（45分、EWNSエアロゾル濃度40,000 #/cm3）に曝露した大腸菌、エンテロバクター、およびL. innocuaの細菌サンプルと、曝露していないサンプルをペレット化し、不活化メカニズムを評価した。沈殿物は、2.5%グルタルアルデヒド、1.25%パラホルムアルデヒド、および0.03%ピクリン酸を固定液とした0.1Mカコジル酸ナトリウム溶液（pH 7.4）中で室温で2時間固定した。洗浄後、1%四酸化オスミウム（OsO4）/1.5%フェロシアン化カリウム（KFeCN6）で2時間固定し、水で3回洗浄した後、1%酢酸ウラニルで1時間インキュベートし、水で2回洗浄した。その後、50%、70%、90%、100%アルコールでそれぞれ10分間脱水した。その後、サンプルをプロピレンオキシドに1時間浸漬し、プロピレンオキシドとTAAP Epon（Marivac Canada Inc.、カリフォルニア州セントローレン）の1:1混合液で含浸させた。サンプルをTAAB Eponに包埋し、60℃で48時間重合させた。硬化した顆粒状樹脂を切断し、AMT 2k CCDカメラ（Advanced Microscopy Techniques, Corp.、マサチューセッツ州ウォーバーン、米国）を搭載した従来型透過型電子顕微鏡JEOL 1200EX（JEOL、東京、日本）を用いてTEM観察を行った。
すべての実験は3回繰り返して実施しました。各時点において、細菌洗浄液を3回ずつ塗布し、1時点あたり合計9つのデータポイントが得られました。その平均値を、その特定の微生物の細菌濃度として使用しました。標準偏差を測定誤差として使用しました。すべてのポイントがカウントされます。
t = 0 分と比較した細菌濃度の減少の対数は、次の式を使用して計算されました。
ここで、C0 は時間 0 (つまり、表面が乾燥した後でチャンバー内に置かれる前) のコントロール サンプル内の細菌濃度であり、Cn は n 分間の暴露後の表面上の細菌濃度です。
45 分間の暴露期間中の細菌の自然な分解を考慮するために、次のように 45 分間のコントロールと比較した Log-Reduction も計算されました。
ここで、Cnはn時点における対照サンプル中の細菌濃度、Cn-Controlはn時点における対照細菌濃度です。データは、対照（EWNS曝露なし）と比較した対数減少として示されます。
研究では、電圧と針と対電極間の距離のいくつかの組み合わせが、テイラーコーンの形成、テイラーコーンの安定性、EWNS生成の安定性、および再現性の観点から評価されました。さまざまな組み合わせが補足表S1に示されています。安定した再現可能な特性（テイラーコーン、EWNS生成、および経時的な安定性）を示す完全な研究のために2つのケースが選択されました。図3に、2つのケースのROSの電荷、サイズ、および含有量の結果を示します。結果は表1にもまとめられています。参考までに、図3と表1には、以前に合成された最適化されていないEWNS8、9、10、11（ベースラインEWNS）の特性が含まれています。両側t検定を使用した統計的有意性の計算は、補足表S2に再公開されています。さらに、追加データには、対電極のサンプリング穴の直径（D）と接地電極と針の先端間の距離（L）の影響に関する研究が含まれます（補足図S2およびS3）。
(a–c) AFM サイズ分布。(d–f) 表面電荷特性。(g) ROS および ESR の特性評価。
また、上記のすべての条件において、測定されたイオン化電流は2～6µA、電圧は-3.8～-6.5kVの範囲にあり、この単端子EWNSの消費電力は50mW未満であったことも重要です。EWNSは高圧下で合成されましたが、オゾン濃度は非常に低く、60ppbを超えることはありませんでした。
補足図S4は、それぞれ[-6.5 kV、4.0 cm]および[-3.8 kV、0.5 cm]のシナリオにおける電界シミュレーション結果を示しています。[-6.5 kV、4.0 cm]および[-3.8 kV、0.5 cm]のシナリオにおける電界は、それぞれ2 × 105 V/mおよび4.7 × 105 V/mと計算されています。これは、後者のケースでは電圧と距離の比がはるかに高いため、予想通りの結果です。
図3a、bはAFM8で測定したEWNS径を示しています。[-6.5 kV、4.0 cm]および[-3.8 kV、0.5 cm]のシナリオにおける平均EWNS径は、それぞれ27 nmおよび19 nmと算出されました。[-6.5 kV、4.0 cm]および[-3.8 kV、0.5 cm]の場合の分布の幾何標準偏差はそれぞれ1.41および1.45であり、狭いサイズ分布を示しています。平均サイズと幾何標準偏差はどちらもベースラインEWNSに非常に近く、それぞれ25 nmと1.41です。図3cは、同じ方法および同じ条件下で測定したベースラインEWNSのサイズ分布を示しています。
図3d、eは電荷特性評価の結果を示しています。データは、濃度（#/cm3）と電流（I）の同時測定30回の平均値です。解析の結果、EWNSの平均電荷は、[-6.5 kV、4.0 cm]と[-3.8 kV、0.5 cm]でそれぞれ22 ± 6 e-と44 ± 6 e-でした。ベースラインEWNS（10 ± 2 e-）と比較すると、表面電荷は大幅に高く、[-6.5 kV、4.0 cm]のシナリオの2倍、[-3.8 kV、0.5 cm]のシナリオの4倍となっています。図3fは、EWNSの基本電荷データを示しています。
EWNS数濃度マップ（補足図S5およびS6）から、[-6.5 kV、4.0 cm]のシーンでは、[-3.8 kV、0.5 cm]のシーンよりも粒子数が著しく多いことがわかります。また、EWNS数濃度は最大4時間までモニタリングされており（補足図S5およびS6）、EWNS生成安定性はどちらの場合も粒子数濃度が同レベルであることにも注目すべきです。
図3gは、最適化されたEWNS（[-6.5 kV、4.0 cm]）のコントロール（バックグラウンド）減算後のEPRスペクトルを示しています。ROSスペクトルは、以前発表された論文のEWNSベースラインとも比較されています。スピントラップと反応するEWNSの計算値は7.5 × 104 EWNS/sで、これは以前発表されたBaseline-EWNS8とほぼ同等です。EPRスペクトルは、2種類のROSの存在を明確に示しており、O2-が優勢で、OH•は少量存在していました。さらに、ピーク強度を直接比較したところ、最適化されたEWNSはベースラインEWNSと比較してROS含有量が有意に高いことがわかりました。
図4は、EPESにおけるEWNSの堆積効率を示しています。データは表Iにもまとめられており、元のEWNSデータと比較されています。どちらのEUNSケースでも、3.0 kVという低電圧でも堆積率はほぼ100%でした。通常、表面電荷の変化に関わらず、3.0 kVであれば100%の堆積率を達成できます。同じ条件下で、Baseline-EWNSの堆積効率は、電荷が低い（EWNSあたり平均10電子）ため、わずか56%でした。
図5と表2は、最適シナリオ（-6.5 kV、4.0 cm）において、約40,000 #/cm3のEWNSに45分間曝露した後のトマト表面に接種した微生物の不活化度をまとめたものです。接種したE. coliとL. innocuaは、45分間の曝露後に3.8 logの有意な減少を示しました。同じ条件下で、S. entericaは2.2 logの減少を示しましたが、S. cerevisiaeとM. parafortuitumは1.0 logの減少を示しました。
EWNSが大腸菌、サルモネラ・エンテリカ、およびL.イノキュアの細胞に誘導し、不活化に至る物理的変化を示す電子顕微鏡写真（図6）。対照細菌では細胞膜に損傷は見られなかったが、曝露を受けた細菌では外膜が損傷していた。
対照細菌と曝露細菌の電子顕微鏡画像では、膜損傷が明らかになりました。
最適化された EWNS の物理化学的特性に関するデータは総合的に、EWNS 特性 (表面電荷および ROS 含有量) が、以前に公開された EWNS ベースライン データ8,9,10,11 と比較して大幅に改善されたことを示しています。一方、それらのサイズはナノメートル範囲にとどまり、これは以前に公開された結果と非常に類似しているため、長期間空気中に留まることができます。観測された多分散性は、レイリー効果、ランダム性、および EWNS の潜在的な併合の大きさを決定する表面電荷の変化によって説明できます。しかし、Nielsen ら22 が詳述しているように、高い表面電荷は水滴の表面エネルギー/張力を効果的に増加させることによって蒸発を減らします。この理論は、以前の出版物8 でマイクロ液滴22 と EWNS について実験的に確認されました。時間経過による損失もサイズに影響を及ぼし、観測されるサイズ分布に寄与する可能性があります。
さらに、構造あたりの電荷量は状況に応じて約22～44 e-であり、これは構造あたり平均10 ± 2電子の基本的なEWNSと比較して大幅に高くなります。ただし、これはEWNSの平均電荷であることに注意する必要があります。Setoらは、電荷が均一ではなく、対数正規分布に従うことを示し21ました。私たちの以前の研究と比較すると、表面電荷を2倍にすると、EPESシステムにおける堆積効率はほぼ100%に倍増します11。