Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com. U gebruikt een browserversie met beperkte CSS-ondersteuning. Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen). Om de ondersteuning te blijven garanderen, tonen we de site bovendien zonder stijlen en JavaScript.
Onlangs is een chemievrij antimicrobieel platform ontwikkeld op basis van nanotechnologie met behulp van kunstmatige waternanostructuren (EWNS). EWNS hebben een hoge oppervlakte lading en zijn rijk aan reactieve zuurstofsoorten (ROS) die kunnen interageren met en een aantal micro-organismen, waaronder voedseloverdragende pathogenen, kunnen inactiveren. Hier wordt aangetoond dat hun eigenschappen tijdens de synthese nauwkeurig kunnen worden afgestemd en geoptimaliseerd om hun antibacteriële potentieel verder te versterken. Het EWNS-laboratoriumplatform is ontworpen om de eigenschappen van EWNS nauwkeurig af te stemmen door de syntheseparameters te wijzigen. De karakterisering van de eigenschappen van EWNS (lading, grootte en ROS-gehalte) werd uitgevoerd met behulp van moderne analytische methoden. Daarnaast werden voedselmicro-organismen zoals Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocua, Mycobacterium para fortitum en Saccharomyces cerevisiae geënt op het oppervlak van biologische cherrytomaten om hun potentieel voor microbiële inactivatie te evalueren. De hier gepresenteerde resultaten tonen aan dat de eigenschappen van EWNS tijdens de synthese nauwkeurig kunnen worden afgestemd, wat resulteert in een exponentiële toename van de inactivatie-efficiëntie. In het bijzonder nam de oppervlakte lading met een factor vier toe en steeg het ROS-gehalte. De microbiële verwijderingssnelheid was afhankelijk van de microbiële samenstelling en varieerde van 1,0 tot 3,8 log na 45 minuten blootstelling aan een aerosoldosis van 40.000 #/cm3 EWNS.
Microbiële besmetting is de belangrijkste oorzaak van door voedsel overgedragen ziekten, veroorzaakt door de inname van pathogenen of hun toxines. Alleen al in de Verenigde Staten leiden voedselvergiftigingen jaarlijks tot ongeveer 76 miljoen ziektegevallen, 325.000 ziekenhuisopnames en 5.000 sterfgevallen¹. Daarnaast schat het Amerikaanse ministerie van Landbouw (USDA) dat de toegenomen consumptie van verse producten verantwoordelijk is voor 48 procent van alle gemelde voedselvergiftigingen in de Verenigde Staten². De kosten van ziekte en overlijden door voedselvergiftiging zijn in de Verenigde Staten zeer hoog; de Centers for Disease Control and Prevention (CDC) schatten deze op meer dan 15,6 miljard dollar per jaar³.
Momenteel worden antimicrobiële interventies met chemische4, straling5 en thermische6 middelen om de voedselveiligheid te waarborgen, voornamelijk toegepast op beperkte kritische controlepunten (CCP's) in de productieketen (meestal na de oogst en/of tijdens het verpakken), in plaats van continu, waardoor verse producten vatbaar zijn voor kruisbesmetting7. Antimicrobiële interventies zijn nodig om voedselvergiftiging en bederf beter te beheersen en kunnen potentieel worden toegepast in de gehele keten van boer tot tafel. Minder impact en lagere kosten.
Recent is een op nanotechnologie gebaseerd, chemicaliënvrij antimicrobieel platform ontwikkeld om bacteriën op oppervlakken en in de lucht te inactiveren met behulp van kunstmatige waternanostructuren (EWNS). Voor de synthese van EWNS werden twee parallelle processen gebruikt: elektrospray en waterionisatie (Fig. 1a). Van EWNS is eerder aangetoond dat ze een unieke set fysische en biologische eigenschappen bezitten8,9,10. EWNS heeft gemiddeld 10 elektronen per structuur en een gemiddelde nanometergrootte van 25 nm (Fig. 1b,c)8,9,10. Bovendien toonde elektronenspinresonantie (ESR) aan dat EWNS een grote hoeveelheid reactieve zuurstofsoorten (ROS) bevatten, voornamelijk hydroxylradicalen (OH•) en superoxideradicalen (O2-) (Fig. 1c)8. EWNS bleven lange tijd in de lucht en konden botsen met microben die in de lucht zweven en op oppervlakken aanwezig zijn, waarbij ze hun ROS-lading afgaven en microbiële inactivatie veroorzaakten (Fig. 1d). Uit deze eerdere onderzoeken bleek ook dat EWNS kan interageren met en diverse gramnegatieve en grampositieve bacteriën die van belang zijn voor de volksgezondheid, waaronder mycobacteriën, op oppervlakken en in de lucht kan inactiveren8,9. Transmissie-elektronenmicroscopie toonde aan dat de inactivatie werd veroorzaakt door verstoring van het celmembraan. Bovendien hebben acute inhalatiestudies aangetoond dat hoge doses EWNS geen longschade of ontsteking veroorzaken8.
(a) Elektrospray vindt plaats wanneer een hoge spanning wordt aangelegd tussen een capillair met vloeistof en een tegenelektrode. (b) Het aanleggen van een hoge spanning resulteert in twee verschillende verschijnselen: (i) elektrosprayen van water en (ii) de generatie van reactieve zuurstofsoorten (ionen) die in de EWNS worden opgesloten. (c) De unieke structuur van EWNS. (d) EWNS zijn zeer mobiel vanwege hun nanogrootte en kunnen interageren met ziekteverwekkers in de lucht.
Recent is ook aangetoond dat het EWNS-antimicrobiële platform in staat is om micro-organismen in voedsel op het oppervlak van vers voedsel te inactiveren. Het is tevens gebleken dat de oppervlakte lading van EWNS in combinatie met een elektrisch veld kan worden gebruikt voor gerichte toediening. Belangrijker nog, een veelbelovend eerste resultaat van ongeveer 1,4 log reductie in de activiteit van biologische tomaten tegen diverse micro-organismen in voedsel, zoals E. coli en Listeria, werd waargenomen binnen 90 minuten na blootstelling aan EWNS bij een concentratie van ongeveer 50.000 µg/cm³. Bovendien lieten voorlopige organoleptische evaluatietests geen organoleptisch effect zien in vergelijking met de controletomaten. Hoewel deze eerste inactivatieresultaten voedselveiligheid beloven, zelfs bij zeer lage EWNS-doseringen van 50.000 µg/cm³, is het duidelijk dat een hoger inactivatiepotentieel gunstiger zou zijn om het risico op infectie en bederf verder te verminderen.
In dit onderzoek richten we ons op de ontwikkeling van een platform voor de generatie van EWNS om de syntheseparameters te verfijnen en de fysisch-chemische eigenschappen van EWNS te optimaliseren, teneinde hun antibacteriële potentieel te versterken. De optimalisatie is met name gericht op het verhogen van hun oppervlakte lading (voor een betere gerichte afgifte) en ROS-gehalte (voor een betere inactivatie-efficiëntie). De geoptimaliseerde fysisch-chemische eigenschappen (grootte, lading en ROS-gehalte) worden gekarakteriseerd met behulp van moderne analytische methoden en met veelvoorkomende micro-organismen in voedsel, zoals E. coli, S. enterica, L. innocua, S. cerevisiae en M. parafortuitum.
EVNS werd gesynthetiseerd door gelijktijdige elektrospray en ionisatie van zeer zuiver water (18 MΩ cm–1). De elektrische verstuiver 12 wordt doorgaans gebruikt voor het verstuiven van vloeistoffen en synthetische polymeer- en keramische deeltjes 13 en vezels 14 van gecontroleerde grootte.
Zoals gedetailleerd beschreven in eerdere publicaties 8, 9, 10, 11, wordt in een typisch experiment een hoge spanning aangelegd tussen een metalen capillair en een geaarde tegenelektrode. Tijdens dit proces treden twee verschillende verschijnselen op: 1) elektrospray en 2) ionisatie van water. Een sterk elektrisch veld tussen de twee elektroden zorgt ervoor dat negatieve ladingen zich ophopen op het oppervlak van het gecondenseerde water, wat resulteert in de vorming van Taylor-kegels. Hierdoor ontstaan ​​sterk geladen waterdruppels, die zich volgens de Rayleigh-theorie verder opsplitsen in kleinere deeltjes16. Tegelijkertijd zorgt een sterk elektrisch veld ervoor dat sommige watermoleculen zich splitsen en elektronen afstoten (ionisatie), waardoor een grote hoeveelheid reactieve zuurstofsoorten (ROS) wordt gegenereerd17. Tegelijkertijd werden de gegenereerde ROS18-pakketjes ingekapseld in EWNS (Fig. 1c).
Figuur 2a toont het EWNS-generatiesysteem dat is ontwikkeld en gebruikt voor de EWNS-synthese in dit onderzoek. Gezuiverd water, opgeslagen in een gesloten fles, werd via een Teflon-buis (2 mm binnendiameter) naar een roestvrijstalen naald (30G) (metalen capillair) geleid. Zoals weergegeven in figuur 2b, wordt de waterstroom geregeld door de luchtdruk in de fles. De naald is bevestigd aan een Teflon-console die handmatig op een bepaalde afstand van de tegenelektrode kan worden ingesteld. De tegenelektrode is een gepolijste aluminium schijf met een gat in het midden voor bemonstering. Onder de tegenelektrode bevindt zich een aluminium bemonsteringsrechter, die via een bemonsteringspoort is verbonden met de rest van de experimentele opstelling (figuur 2b). Alle componenten van de bemonsteringsinrichting zijn elektrisch geaard om ladingopbouw te voorkomen die de deeltjesbemonstering zou kunnen beïnvloeden.
(a) Systeem voor het genereren van gemanipuleerde waternanostructuren (EWNS). (b) Doorsnede van de sampler en de elektrospray-eenheid met de belangrijkste parameters. (c) Experimentele opstelling voor het inactiveren van bacteriën.
Het hierboven beschreven EWNS-generatiesysteem is in staat om belangrijke operationele parameters te wijzigen, waardoor de eigenschappen van de EWNS nauwkeurig kunnen worden afgesteld. Door de toegepaste spanning (V), de afstand tussen de naald en de tegenelektrode (L) en de waterstroom (φ) door de capillaire buis aan te passen, kunnen de EWNS-karakteristieken worden verfijnd. De symbolen [V (kV), L (cm)] worden gebruikt om verschillende combinaties aan te duiden. Stel de waterstroom zo in dat een stabiele Taylor-kegel met een bepaalde [V, L]-waarde wordt verkregen. Voor dit onderzoek is de opening van de tegenelektrode (D) ingesteld op 0,5 inch (1,29 cm).
Vanwege de beperkte geometrie en asymmetrie kan de elektrische veldsterkte niet vanuit de basisprincipes worden berekend. In plaats daarvan werd de QuickField™-software (Svendborg, Denemarken)19 gebruikt om het elektrische veld te berekenen. Het elektrische veld is niet uniform, dus werd de waarde van het elektrische veld aan het uiteinde van de capillair gebruikt als referentiewaarde voor verschillende configuraties.
Tijdens het onderzoek werden verschillende combinaties van spanning en afstand tussen de naald en de tegenelektrode geëvalueerd met betrekking tot de vorming van de Taylor-kegel, de stabiliteit van de Taylor-kegel, de stabiliteit van de EWNS-productie en de reproduceerbaarheid. Diverse combinaties worden weergegeven in aanvullende tabel S1.
De output van het EWNS-generatiesysteem werd rechtstreeks aangesloten op een Scanning Mobility Particle Sizer (SMPS, model 3936, TSI, Shoreview, Minnesota) om de deeltjesaantalconcentratie te meten en werd gebruikt met een Faraday-aerosolelektrometer (TSI, model 3068B, Shoreview, VS) om de aerosolstromen te meten, zoals beschreven in onze eerdere publicatie⁹. Zowel de SMPS als de aerosolelektrometer namen monsters met een debiet van 0,5 L/min (totale monsterstroom 1 L/min). Deeltjesconcentraties en aerosolstromen werden gedurende 120 seconden gemeten. Herhaal de meting 30 keer. De totale aerosollading wordt berekend op basis van de stroommetingen en de gemiddelde EWNS-lading wordt geschat op basis van het totale aantal bemonsterde EWNS-deeltjes. De gemiddelde kosten van EWNS kunnen worden berekend met behulp van vergelijking (1):
waarbij IEl de gemeten stroomsterkte is, NSMPS de deeltjesconcentratie gemeten met de SMPS, en φEl de stroomsnelheid naar de elektrometer.
Omdat de relatieve luchtvochtigheid (RV) de oppervlakte lading beïnvloedt, werden de temperatuur en de RV tijdens het experiment constant gehouden op respectievelijk 21 °C en 45%.
Atoomkrachtmicroscopie (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, CA) en AC260T-sonde (Olympus, Tokio, Japan) werden gebruikt om de grootte en levensduur van de EWNS te meten. De AFM-scansnelheid is 1 Hz en het scanbereik is 5 µm × 5 µm met 256 scanlijnen. Alle beelden werden onderworpen aan een eerste-orde beelduitlijning met behulp van Asylum-software (masker met een bereik van 100 nm en een drempelwaarde van 100 pm).
Verwijder de monstertrechter en plaats het mica-oppervlak op een afstand van 2,0 cm van de tegenelektrode gedurende een gemiddelde tijd van 120 s om coalescentie van deeltjes en de vorming van onregelmatige druppels op het mica-oppervlak te voorkomen. EWNS werd rechtstreeks aangebracht op vers gesneden mica-oppervlakken (Ted Pella, Redding, CA). Direct na het sputteren werd het mica-oppervlak gevisualiseerd met behulp van AFM. De contacthoek van vers gesneden, ongemodificeerd mica is bijna 0°, waardoor EWNS zich in een koepelvorm over het mica-oppervlak verspreidt20. De diameter (a) en hoogte (h) van de diffunderende druppels werden rechtstreeks gemeten aan de hand van de AFM-topografie en gebruikt om het koepelvormige diffusievolume van EWNS te berekenen met behulp van onze eerder gevalideerde methode8. Ervan uitgaande dat de ingebouwde EVNS hetzelfde volume heeft, kan de equivalente diameter worden berekend met behulp van vergelijking (2):
Volgens onze eerder ontwikkelde methode werd een elektronenspinresonantie (ESR) spinval gebruikt om de aanwezigheid van kortstondige radicaalintermediairen in EWNS te detecteren. Aerosolen werden door een oplossing geleid die 235 mM DEPMPO (5-(diethoxyfosforyl)-5-methyl-1-pyrroline-N-oxide) bevatte (Oxis International Inc., Portland, Oregon). Alle EPR-metingen werden uitgevoerd met een Bruker EMX-spectrometer (Bruker Instruments Inc., Billerica, MA, VS) en vlakke celarrays. De Acquisit-software (Bruker Instruments Inc., Billerica, MA, VS) werd gebruikt om de gegevens te verzamelen en te analyseren. De ROS-karakterisering werd alleen uitgevoerd voor een set bedrijfsomstandigheden [-6,5 kV, 4,0 cm]. EWNS-concentraties werden gemeten met SMPS na rekening te hebben gehouden met het verlies van EWNS in de impactor.
De ozonniveaus werden gemeten met behulp van een 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Co)8,9,10.
Voor alle EWNS-eigenschappen is de meetwaarde het gemiddelde van de metingen en de meetfout de standaardafwijking. Er werd een t-test uitgevoerd om de waarde van het geoptimaliseerde EWNS-kenmerk te vergelijken met de overeenkomstige waarde van de basis-EWNS.
Figuur 2c toont een eerder ontwikkeld en gekarakteriseerd elektrostatisch precipitatie-doorvoersysteem (EPES) dat kan worden gebruikt om EWNS11 op oppervlakken te richten. EPES gebruikt een EWNS-lading in combinatie met een sterk elektrisch veld om direct op het oppervlak van het doelwit te "richten". Details van het EPES-systeem worden gepresenteerd in een recente publicatie van Pyrgiotakis et al.11. EPES bestaat uit een 3D-geprinte PVC-kamer met taps toelopende uiteinden, waarin zich in het midden twee parallelle roestvrijstalen (304 roestvrij staal, spiegelgepolijst) metalen platen bevinden met een tussenafstand van 15,24 cm. De platen waren verbonden met een externe hoogspanningsbron (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY). De onderste plaat was altijd positief en de bovenste plaat was altijd geaard (zwevend). De wanden van de kamer zijn bedekt met aluminiumfolie, die elektrisch geaard is om verlies van deeltjes te voorkomen. De kamer heeft een afgesloten voordeur waardoor testoppervlakken op plastic rekken kunnen worden geplaatst, waardoor ze van de onderste metalen plaat worden getild om interferentie door hoogspanning te voorkomen.
De afzettingsefficiëntie van EWNS in EPES werd berekend volgens een eerder ontwikkeld protocol, zoals gedetailleerd beschreven in Aanvullende Figuur S111.
Als controlekamer is de tweede luchtstroom door de cilindrische kamer in serie geschakeld met het EPES-systeem, waarbij een tussenliggend HEPA-filter wordt gebruikt om EWNS te verwijderen. Zoals weergegeven in figuur 2c, werd het EWNS-aerosol door twee in serie geschakelde kamers gepompt. Het filter tussen de controlekamer en EPES verwijdert alle resterende EWNS, waardoor dezelfde temperatuur (T), relatieve luchtvochtigheid (RH) en ozonconcentratie worden bereikt.
Er zijn belangrijke micro-organismen in voedsel aangetroffen die verse producten kunnen besmetten, zoals Escherichia coli (ATCC #27325), een fecale indicator, Salmonella enterica (ATCC #53647), een voedseloverdragende ziekteverwekker, Listeria innocua (ATCC #33090), een alternatief voor de pathogene Listeria monocytogenes, Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098) als alternatief voor bederfveroorzakende gist, en Mycobacterium parafortuitous (ATCC #19686) als een resistentere levende bacterie. Deze bacteriën werden aangeschaft bij ATCC (Manassas, Virginia).
Koop willekeurig dozen biologische cherrytomaten op de lokale markt en bewaar ze in de koelkast bij 4 °C tot gebruik (maximaal 3 dagen). Kies tomaten van één formaat om mee te experimenteren, met een diameter van ongeveer 1,25 cm.
De protocollen voor incubatie, inoculatie, blootstelling en koloniebepaling zijn gedetailleerd beschreven in onze eerdere publicaties en worden uitgebreid toegelicht in Aanvullende Gegevens 11. De prestaties van EWNS werden geëvalueerd door geïnoculeerde tomaten gedurende 45 minuten bloot te stellen aan 40.000 #/cm³. Kort gezegd werden op tijdstip t = 0 min drie tomaten gebruikt om de overlevende micro-organismen te evalueren. Drie tomaten werden in EPES geplaatst en blootgesteld aan EWNS met een concentratie van 40.000 #/cm³ (aan EWNS blootgestelde tomaten) en drie andere werden in de controlekamer geplaatst (controletomaten). Geen van de tomatengroepen werd verder verwerkt. De aan EWNS blootgestelde tomaten en de controletomaten werden na 45 minuten verwijderd om het effect van EWNS te evalueren.
Elk experiment werd in drievoud uitgevoerd. De data-analyse werd uitgevoerd volgens het protocol beschreven in de aanvullende gegevens.
Bacteriële monsters van E. coli, Enterobacter en L. innocua, blootgesteld aan EWNS (45 min, EWNS-aerosolconcentratie 40.000 #/cm3) en onblootgestelde monsters, werden gecentrifugeerd om de inactivatiemechanismen te beoordelen. Het precipitaat werd gedurende 2 uur bij kamertemperatuur gefixeerd in een 0,1 M natriumcacodylaatoplossing (pH 7,4) met een fixatief van 2,5% glutaraldehyde, 1,25% paraformaldehyde en 0,03% picrinezuur. Na het wassen werden ze gedurende 2 uur gefixeerd met 1% osmiumtetroxide (OsO4)/1,5% kaliumferrocyanide (KFeCN6), driemaal gewassen met water en gedurende 1 uur geïncubeerd in 1% uranylacetaat, waarna ze tweemaal met water werden gewassen. Vervolgens werden ze gedurende 10 minuten gedehydrateerd in achtereenvolgens 50%, 70%, 90% en 100% alcohol. De monsters werden vervolgens gedurende 1 uur in propyleenoxide geplaatst en geïmpregneerd met een 1:1 mengsel van propyleenoxide en TAAP Epon (Marivac Canada Inc., St. Laurent, CA). De monsters werden ingebed in TAAP Epon en gedurende 48 uur bij 60 °C gepolymeriseerd. De uitgeharde korrelige hars werd gesneden en gevisualiseerd met behulp van een TEM met een JEOL 1200EX (JEOL, Tokio, Japan), een conventionele transmissie-elektronenmicroscoop uitgerust met een AMT 2k CCD-camera (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, MA, VS).
Alle experimenten werden in drievoud uitgevoerd. Voor elk tijdstip werden bacteriële spoelingen in drievoud uitgeplaat, wat resulteerde in een totaal van negen datapunten per tijdstip. Het gemiddelde van deze datapunten werd gebruikt als de bacteriële concentratie voor dat specifieke organisme. De standaardafwijking werd gebruikt als meetfout. Alle datapunten tellen mee.
De logaritme van de afname van de bacterieconcentratie ten opzichte van t = 0 min werd berekend met behulp van de volgende formule:
waarbij C0 de concentratie bacteriën in het controlemonster is op tijdstip 0 (d.w.z. nadat het oppervlak is opgedroogd maar voordat het in de kamer wordt geplaatst) en Cn de concentratie bacteriën op het oppervlak is na n minuten blootstelling.
Om rekening te houden met de natuurlijke afbraak van bacteriën gedurende de blootstellingsperiode van 45 minuten, werd de logaritmische reductie ook berekend ten opzichte van de controle na 45 minuten, als volgt:
Waarbij Cn de concentratie bacteriën in het controlemonster is op tijdstip n en Cn-Control de concentratie bacteriën in de controle op tijdstip n. De gegevens worden weergegeven als een logaritmische reductie ten opzichte van de controle (geen blootstelling aan EWNS).
Tijdens het onderzoek werden verschillende combinaties van spanning en afstand tussen de naald en de tegenelektrode geëvalueerd met betrekking tot de vorming van de Taylor-kegel, de stabiliteit van de Taylor-kegel, de stabiliteit van de EWNS-productie en de reproduceerbaarheid. Diverse combinaties worden weergegeven in Aanvullende Tabel S1. Twee gevallen werden geselecteerd voor een volledig onderzoek dat stabiele en reproduceerbare eigenschappen aantoont (Taylor-kegel, EWNS-productie en stabiliteit in de tijd). Figuur 3 toont de resultaten betreffende de lading, grootte en inhoud van ROS voor deze twee gevallen. De resultaten zijn ook samengevat in Tabel 1. Ter referentie bevatten Figuur 3 en Tabel 1 de eigenschappen van de eerder gesynthetiseerde, niet-geoptimaliseerde EWNS8, 9, 10, 11 (baseline-EWNS). Statistische significantieberekeningen met behulp van een tweezijdige t-test zijn opnieuw gepubliceerd in Aanvullende Tabel S2. Daarnaast omvatten de aanvullende gegevens studies naar het effect van de diameter van het bemonsteringsgat van de tegenelektrode (D) en de afstand tussen de aardelektrode en de punt van de naald (L) (Aanvullende Figuren S2 en S3).
(a–c) AFM-grootteverdeling. (d–f) Karakteristiek van de oppervlaktelading. (g) Karakterisering van ROS en ESR.
Het is ook belangrijk op te merken dat onder alle bovengenoemde omstandigheden de gemeten ionisatiestromen in het bereik van 2-6 µA lagen en de spanningen in het bereik van -3,8 tot -6,5 kV, wat resulteerde in een stroomverbruik voor deze EWNS-generatiemodule met één aansluiting van minder dan 50 mW. Hoewel EWNS onder hoge druk werd gesynthetiseerd, waren de ozonniveaus zeer laag en overschreden ze nooit 60 ppb.
Aanvullende figuur S4 toont de gesimuleerde elektrische velden voor respectievelijk de scenario's [-6,5 kV, 4,0 cm] en [-3,8 kV, 0,5 cm]. De velden volgens de scenario's [-6,5 kV, 4,0 cm] en [-3,8 kV, 0,5 cm] zijn berekend op respectievelijk 2 × 10⁵ V/m en 4,7 × 10⁵ V/m. Dit is te verwachten, aangezien de verhouding tussen spanning en afstand in het tweede geval veel hoger is.
Figuur 3a en 3b tonen de EWNS-diameter gemeten met de AFM8. De gemiddelde EWNS-diameters voor de scenario's [-6,5 kV, 4,0 cm] en [-3,8 kV, 0,5 cm] werden berekend op respectievelijk 27 nm en 19 nm. De geometrische standaarddeviaties van de verdelingen voor de gevallen [-6,5 kV, 4,0 cm] en [-3,8 kV, 0,5 cm] zijn respectievelijk 1,41 en 1,45, wat wijst op een smalle grootteverdeling. Zowel de gemiddelde grootte als de geometrische standaarddeviatie liggen zeer dicht bij die van de baseline-EWNS, namelijk respectievelijk 25 nm en 1,41. Figuur 3c toont de grootteverdeling van de baseline-EWNS gemeten met dezelfde methode onder dezelfde omstandigheden.
Figuur 3d en 3e tonen de resultaten van de ladingskarakterisering. De gegevens zijn gemiddelde metingen van 30 gelijktijdige metingen van concentratie (#/cm³) en stroom (I). De analyse laat zien dat de gemiddelde lading op de EWNS 22 ± 6 e- en 44 ± 6 e- bedraagt ​​voor respectievelijk [-6,5 kV, 4,0 cm] en [-3,8 kV, 0,5 cm]. Vergeleken met de basis-EWNS (10 ± 2 e-) is de oppervlaktelading aanzienlijk hoger, tweemaal zo hoog als in het scenario [-6,5 kV, 4,0 cm] en viermaal zo hoog als in het scenario [-3,8 kV, 0,5 cm]. Figuur 3f toont basisgegevens over de betaling van de EWNS.
Uit de EWNS-deeltjesconcentratiekaarten (aanvullende figuren S5 en S6) blijkt dat de scène met [-6,5 kV, 4,0 cm] een significant hoger aantal deeltjes bevat dan de scène met [-3,8 kV, 0,5 cm]. Het is ook belangrijk op te merken dat de EWNS-deeltjesconcentraties tot wel 4 uur lang zijn gemeten (aanvullende figuren S5 en S6), waarbij de stabiliteit van de EWNS-generatie in beide gevallen dezelfde deeltjesconcentraties vertoonde.
Figuur 3g toont het EPR-spectrum na subtractie van de controle (achtergrond) voor geoptimaliseerde EWNS bij [-6,5 kV, 4,0 cm]. Het ROS-spectrum wordt ook vergeleken met de EWNS-baseline in een eerder gepubliceerd artikel. Het berekende aantal EWNS dat reageert met de spinval is 7,5 × 10⁴ EWNS/s, wat vergelijkbaar is met de eerder gepubliceerde Baseline-EWNS⁸. De EPR-spectra gaven duidelijk de aanwezigheid aan van twee soorten ROS, waarbij O₂⁻ overheerste, terwijl OH• in kleinere hoeveelheden aanwezig was. Bovendien toonde een directe vergelijking van de piekintensiteiten aan dat de geoptimaliseerde EWNS een significant hoger ROS-gehalte had in vergelijking met de baseline EWNS.
Figuur 4 toont de afzettingsefficiëntie van EWNS in EPES. De gegevens zijn ook samengevat in Tabel I en vergeleken met de oorspronkelijke EWNS-gegevens. Voor beide EWNS-gevallen was de afzetting bijna 100%, zelfs bij een lage spanning van 3,0 kV. Doorgaans is 3,0 kV voldoende om 100% afzetting te bereiken, ongeacht de verandering in oppervlaktelading. Onder dezelfde omstandigheden was de afzettingsefficiëntie van de Baseline-EWNS slechts 56% vanwege de lagere lading (gemiddeld 10 elektronen per EWNS).
Figuur 5 en tabel 2 geven een overzicht van de mate van inactivatie van micro-organismen die op het oppervlak van tomaten zijn geënt na blootstelling aan ongeveer 40.000 #/cm3 EWNS gedurende 45 minuten onder het optimale scenario [-6,5 kV, 4,0 cm]. Geïnoculeerde E. coli en L. innocua vertoonden een significante reductie van 3,8 log na 45 minuten blootstelling. Onder dezelfde omstandigheden vertoonde S. enterica een lagere logreductie van 2,2 log, terwijl S. cerevisiae en M. parafortuitum een ​​reductie van 1,0 log lieten zien.
Elektronenmicroscopische beelden (Figuur 6) tonen de fysieke veranderingen die EWNS teweegbrengt in E. coli-, Salmonella enterica- en L. innocua-cellen, wat leidt tot inactivatie. Controlebacteriën vertoonden intacte celmembranen, terwijl blootgestelde bacteriën beschadigde buitenmembranen hadden.
Elektronenmicroscopisch onderzoek van controlebacteriën en blootgestelde bacteriën bracht membraanschade aan het licht.
De gegevens over de fysisch-chemische eigenschappen van de geoptimaliseerde EWNS laten gezamenlijk zien dat de eigenschappen van de EWNS (oppervlaktelading en ROS-gehalte) aanzienlijk verbeterd zijn ten opzichte van de eerder gepubliceerde basisgegevens van EWNS8,9,10,11. Aan de andere kant bleef hun grootte in het nanometerbereik, wat zeer vergelijkbaar is met eerder gepubliceerde resultaten, waardoor ze gedurende lange tijd in de lucht kunnen blijven. De waargenomen polydispersiteit kan worden verklaard door veranderingen in de oppervlaktelading, die de omvang van het Rayleigh-effect, de willekeurigheid en de potentiële samensmelting van EWNS bepalen. Zoals gedetailleerd beschreven door Nielsen et al.22, vermindert een hoge oppervlaktelading echter de verdamping door de oppervlakte-energie/spanning van de waterdruppel effectief te verhogen. Deze theorie werd experimenteel bevestigd voor microdruppels22 en EWNS in onze eerdere publicatie8. Het verlies in de loop van de tijd kan ook de grootte beïnvloeden en bijdragen aan de waargenomen grootteverdeling.
Bovendien bedraagt ​​de lading per structuur ongeveer 22–44 e-, afhankelijk van de omstandigheden, wat aanzienlijk hoger is dan bij de basis-EWNS, die een gemiddelde lading van 10 ± 2 elektronen per structuur heeft. Het is echter belangrijk op te merken dat dit de gemiddelde lading van EWNS is. Seto et al. hebben aangetoond dat de lading niet uniform is en een lognormale verdeling volgt21. In vergelijking met ons eerdere werk verdubbelt het verdubbelen van de oppervlaktelading de depositie-efficiëntie in het EPES-systeem tot bijna 100%11.