Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com. U gebruikt een browserversie met beperkte CSS-ondersteuning. Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen). Om continue ondersteuning te garanderen, tonen we de site bovendien zonder stijlen en JavaScript.
Onlangs is een chemievrij antimicrobieel platform ontwikkeld op basis van nanotechnologie met kunstmatige waternanostructuren (EWNS). EWNS hebben een hoge oppervlaktelading en zijn rijk aan reactieve zuurstofsoorten (ROS) die kunnen interageren met een aantal micro-organismen, waaronder voedselpathogenen, en deze kunnen inactiveren. Hier wordt aangetoond dat hun eigenschappen tijdens de synthese kunnen worden verfijnd en geoptimaliseerd om hun antibacteriële potentieel verder te verbeteren. Het EWNS-laboratoriumplatform is ontworpen om de eigenschappen van EWNS te verfijnen door de syntheseparameters te wijzigen. De karakterisering van EWNS-eigenschappen (lading, grootte en ROS-gehalte) werd uitgevoerd met behulp van moderne analytische methoden. Daarnaast werden voedselmicro-organismen zoals Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocua, Mycobacterium para fortitum en Saccharomyces cerevisiae geïnoculeerd op het oppervlak van biologische druiventomaten om hun microbiële inactivatiepotentieel te evalueren. De hier gepresenteerde resultaten tonen aan dat de eigenschappen van EWNS tijdens de synthese nauwkeurig kunnen worden afgesteld, wat resulteert in een exponentiële toename van de inactiveringsefficiëntie. Met name de oppervlaktelading nam met een factor vier toe en het ROS-gehalte nam toe. De microbiële verwijderingssnelheid was microbieel afhankelijk en varieerde van 1,0 tot 3,8 log na 45 minuten blootstelling aan een aerosoldosis van 40.000 #/cm3 EWNS.
Microbiële besmetting is de belangrijkste oorzaak van door voedsel overgedragen ziekten, veroorzaakt door de inname van ziekteverwekkers of hun toxines. Voedselgerelateerde ziekten zijn de oorzaak van ongeveer 76 miljoen ziektegevallen, 325.000 ziekenhuisopnames en 5.000 sterfgevallen per jaar, alleen al in de Verenigde Staten1. Bovendien schat het Amerikaanse ministerie van Landbouw (USDA) dat de toegenomen consumptie van verse producten verantwoordelijk is voor 48 procent van alle in de Verenigde Staten gemelde door voedsel overgedragen ziekten2. De kosten van ziekte en overlijden door door voedsel overgedragen pathogenen in de Verenigde Staten zijn zeer hoog en worden door de Centers for Disease Control and Prevention (CDC) geschat op meer dan 15,6 miljard dollar per jaar3.
Momenteel worden chemische4, straling5 en thermische6 antimicrobiële interventies om voedselveiligheid te garanderen voornamelijk toegepast op een beperkt aantal kritische controlepunten (CCP's) in de productieketen (meestal na de oogst en/of tijdens het verpakken), in plaats van continu te worden toegepast op een manier die kruisbesmetting van verse producten mogelijk maakt. Antimicrobiële interventies zijn nodig om voedselgerelateerde ziekten en voedselbederf beter te beheersen en hebben de potentie om in het hele proces van boer tot bord te worden toegepast. Minder impact en kosten.
Nederlands Onlangs is een op nanotechnologie gebaseerd chemievrij antimicrobieel platform ontwikkeld om bacteriën op oppervlakken en in de lucht te inactiveren met behulp van kunstmatige waternanostructuren (EWNS). Voor de synthese van EVNS werden twee parallelle processen gebruikt: elektrospray en waterionisatie (Fig. 1a). Eerder is aangetoond dat EWNS een unieke set fysische en biologische eigenschappen hebben8,9,10. EWNS heeft gemiddeld 10 elektronen per structuur en een gemiddelde nanometergrootte van 25 nm (Fig. 1b,c)8,9,10. Bovendien toonde elektronenspinresonantie (ESR) aan dat EWNS een grote hoeveelheid reactieve zuurstofsoorten (ROS) bevatten, voornamelijk hydroxyl (OH•) en superoxide (O2-) radicalen (Fig. 1c) 8 . EWNS bleven lang in de lucht en konden botsen met in de lucht zwevende en op oppervlakken aanwezige microben, waarbij ze hun ROS-lading afgaven en microbiële inactivering veroorzaakten (Fig. 1d). Deze eerdere studies toonden ook aan dat EWNS kan interageren met en inactiveren van diverse gramnegatieve en grampositieve bacteriën die van belang zijn voor de volksgezondheid, waaronder mycobacteriën, op oppervlakken en in de lucht8,9. Transmissie-elektronenmicroscopie toonde aan dat de inactivering werd veroorzaakt door verstoring van het celmembraan. Bovendien hebben acute inhalatiestudies aangetoond dat hoge doses EWNS geen longschade of -ontsteking veroorzaken8.
(a) Elektrospray treedt op wanneer een hoge spanning wordt aangelegd tussen een capillair met vloeistof en een tegenelektrode. (b) Het aanleggen van de hoge spanning resulteert in twee verschillende verschijnselen: (i) elektrospraying van water en (ii) generatie van reactieve zuurstofsoorten (ionen) die in het EWNS worden gevangen. (c) De unieke structuur van EWNS. (d) EWNS zijn zeer mobiel vanwege hun nanoschaal-aard en kunnen interacteren met in de lucht aanwezige pathogenen.
Het vermogen van het EWNS-antimicrobiële platform om door voedsel overgedragen micro-organismen op het oppervlak van vers voedsel te inactiveren, is recentelijk ook aangetoond. Ook is aangetoond dat de EWNS-oppervlaktelading in combinatie met een elektrisch veld kan worden gebruikt voor gerichte toediening. Belangrijker nog, een veelbelovend eerste resultaat van ongeveer 1,4 log reductie in de activiteit van biologische tomaten tegen verschillende voedselmicro-organismen zoals E. coli en Listeria werd waargenomen binnen 90 minuten na blootstelling aan EWNS in een concentratie van ongeveer 50.000#/cm311. Bovendien toonden voorlopige organoleptische evaluatietests geen organoleptisch effect in vergelijking met de controletomaat. Hoewel deze eerste inactiveringsresultaten voedselveiligheid beloven, zelfs bij zeer lage EWNS-doses van 50.000#/cc, is het duidelijk dat een hoger inactivatiepotentieel gunstiger zou zijn om het risico op infectie en bederf verder te verminderen.
We richten ons onderzoek hier op de ontwikkeling van een EWNS-generatieplatform om de syntheseparameters te verfijnen en de fysisch-chemische eigenschappen van EWNS te optimaliseren en zo hun antibacteriële potentieel te vergroten. Optimalisatie richt zich met name op het verhogen van hun oppervlaktelading (om de gerichte afgifte te verbeteren) en ROS-gehalte (om de inactiveringsefficiëntie te verbeteren). Karakterisering van geoptimaliseerde fysisch-chemische eigenschappen (grootte, lading en ROS-gehalte) met behulp van moderne analytische methoden en veelvoorkomende voedselmicro-organismen zoals E. coli, S. enterica, L. innocua, S. cerevisiae en M. parafortuitum.
EVNS werd gesynthetiseerd door gelijktijdige elektrospraying en ionisatie van zeer zuiver water (18 MΩ cm–1). De elektrische verstuiver 12 wordt doorgaans gebruikt voor het verstuiven van vloeistoffen en synthetische polymeren en keramische deeltjes 13 en vezels 14 van gecontroleerde grootte.
Zoals beschreven in eerdere publicaties 8, 9, 10, 11, wordt in een typisch experiment een hoge spanning aangelegd tussen een metalen capillair en een geaarde tegenelektrode. Tijdens dit proces treden twee verschillende verschijnselen op: 1) elektrospray en 2) ionisatie van water. Een sterk elektrisch veld tussen de twee elektroden zorgt ervoor dat negatieve ladingen zich ophopen op het oppervlak van het gecondenseerde water, wat resulteert in de vorming van Taylor-kegels. Hierdoor ontstaan ​​sterk geladen waterdruppels, die volgens de Rayleigh-theorie16 verder uiteenvallen in kleinere deeltjes. Tegelijkertijd zorgt een sterk elektrisch veld ervoor dat een deel van de watermoleculen zich splitst en elektronen afstoot (ionisatie), waardoor een grote hoeveelheid reactieve zuurstofsoorten (ROS)17 ontstaat. Gelijktijdig gegenereerde ROS18-pakketten werden ingekapseld in EWNS (Fig. 1c).
Figuur 2a toont het EWNS-generatiesysteem dat is ontwikkeld en gebruikt in de EWNS-synthese in deze studie. Gezuiverd water, opgeslagen in een gesloten fles, werd via een teflonbuis (binnendiameter 2 mm) naar een 30G roestvrijstalen naald (metalen capillair) geleid. Zoals weergegeven in figuur 2b, wordt de waterstroom geregeld door de luchtdruk in de fles. De naald is bevestigd aan een teflonconsole die handmatig kan worden ingesteld op een bepaalde afstand van de tegenelektrode. De tegenelektrode is een gepolijste aluminium schijf met een gat in het midden voor de bemonstering. Onder de tegenelektrode bevindt zich een aluminium bemonsteringstrechter, die via een bemonsteringspoort is verbonden met de rest van de experimentele opstelling (figuur 2b). Alle componenten van de sampler zijn elektrisch geaard om ladingsopbouw te voorkomen die de deeltjesbemonstering zou kunnen aantasten.
(a) Engineered Water Nanostructure Generation System (EWNS). (b) Dwarsdoorsnede van de sampler en de elektrospray-eenheid met de belangrijkste parameters. (c) Experimentele opstelling voor bacterie-inactivering.
Het hierboven beschreven EWNS-generatiesysteem kan belangrijke bedrijfsparameters wijzigen om de EWNS-eigenschappen nauwkeurig af te stemmen. Pas de aangelegde spanning (V), de afstand tussen de naald en de tegenelektrode (L) en de waterstroom (φ) door het capillair aan om de EWNS-karakteristieken nauwkeurig af te stemmen. De symbolen [V (kV), L (cm)] worden gebruikt om verschillende combinaties aan te duiden. Pas de waterstroom aan om een ​​stabiele Taylor-kegel van een bepaalde set [V, L] te verkrijgen. Voor deze studie werd de opening van de tegenelektrode (D) ingesteld op 0,5 inch (1,29 cm).
Vanwege de beperkte geometrie en asymmetrie kan de elektrische veldsterkte niet worden berekend op basis van basisprincipes. In plaats daarvan werd de QuickField™-software (Svendborg, Denemarken)19 gebruikt om het elektrische veld te berekenen. Het elektrische veld is niet uniform, dus de waarde van het elektrische veld aan de punt van de capillair werd gebruikt als referentiewaarde voor verschillende configuraties.
Tijdens het onderzoek werden verschillende combinaties van spanning en afstand tussen de naald en de tegenelektrode geëvalueerd op basis van Taylor-conusvorming, Taylor-conusstabiliteit, EWNS-productiestabiliteit en reproduceerbaarheid. Verschillende combinaties worden weergegeven in aanvullende tabel S1.
De uitgang van het EWNS-generatiesysteem werd rechtstreeks aangesloten op een Scanning Mobility Particle Sizer (SMPS, model 3936, TSI, Shoreview, Minnesota) om de concentratie van het deeltjesaantal te meten en werd gebruikt met een Faraday-aerosolelektrometer (TSI, model 3068B, Shoreview, VS). [De zin "Minnesota" is onvolledig en kan worden vertaald als ...
waarbij IEl de gemeten stroom is, NSMPS de met de SMPS gemeten concentratie en φEl de stroomsnelheid naar de elektrometer.
Omdat de relatieve vochtigheid (RV) de oppervlaktelading beïnvloedt, werden de temperatuur en de RV tijdens het experiment constant gehouden op respectievelijk 21°C en 45%.
Atoomkrachtmicroscopie (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, Californië) en de AC260T-sonde (Olympus, Tokio, Japan) werden gebruikt om de grootte en levensduur van het EWNS te meten. De scanfrequentie van de AFM is 1 Hz en het scangebied is 5 µm × 5 µm met 256 scanlijnen. Alle beelden werden onderworpen aan een eerste-orde-beelduitlijning met behulp van Asylum-software (masker met een bereik van 100 nm en een drempelwaarde van 100 pm).
Verwijder de monstertrechter en plaats het mica-oppervlak op een afstand van 2,0 cm van de tegenelektrode gedurende een gemiddelde tijd van 120 seconden om samensmelting van deeltjes en de vorming van onregelmatige druppels op het mica-oppervlak te voorkomen. EWNS werd direct op vers gesneden mica-oppervlakken aangebracht (Ted Pella, Redding, CA). Direct na het sputteren werd het mica-oppervlak gevisualiseerd met behulp van AFM. De contacthoek van het oppervlak van vers gesneden, ongemodificeerd mica ligt dicht bij 0°, waardoor EWNS zich in een koepelvorm over het mica-oppervlak voortplant20. De diameter (a) en hoogte (h) van de diffunderende druppels werden direct gemeten vanuit de AFM-topografie en gebruikt om het koepelvormige diffusievolume van EWNS te berekenen met behulp van onze eerder gevalideerde methode8. Ervan uitgaande dat de ingebouwde EVNS hetzelfde volume heeft, kan de equivalente diameter worden berekend met vergelijking (2):
In overeenstemming met onze eerder ontwikkelde methode werd een elektronenspinresonantie (ESR)-spinval gebruikt om de aanwezigheid van kortlevende radicale tussenproducten in EWNS te detecteren. Aerosolen werden door een oplossing geleid die 235 mM DEPMPO (5-(diethoxyfosforyl)-5-methyl-1-pyrroline-N-oxide) (Oxis International Inc., Portland, Oregon) bevatte. Alle EPR-metingen werden uitgevoerd met een Bruker EMX-spectrometer (Bruker Instruments Inc., Billerica, MA, VS) en flat cell arrays. De Acquisit-software (Bruker Instruments Inc., Billerica, MA, VS) werd gebruikt om de gegevens te verzamelen en te analyseren. De ROS-karakterisering werd alleen uitgevoerd voor een reeks bedrijfsomstandigheden [-6,5 kV, 4,0 cm]. De EWNS-concentraties werden gemeten met behulp van SMPS, rekening houdend met het verlies van EWNS in de impactor.
De ozonniveaus werden gecontroleerd met een 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Co)8,9,10.
Voor alle EWNS-eigenschappen is de meetwaarde het gemiddelde van de metingen en is de meetfout de standaarddeviatie. Er is een t-toets uitgevoerd om de waarde van het geoptimaliseerde EWNS-kenmerk te vergelijken met de overeenkomstige waarde van de basis-EWNS.
Figuur 2c toont een eerder ontwikkeld en gekarakteriseerd Electrostatic Precipitation Pass Through System (EPES) dat kan worden gebruikt om EWNS11 op oppervlakken te richten. EPES gebruikt een EWNS-lading in combinatie met een sterk elektrisch veld om direct naar het oppervlak van het doelwit te "richten". Details van het EPES-systeem worden gepresenteerd in een recente publicatie van Pyrgiotakis et al.11. EPES bestaat dus uit een 3D-geprinte PVC-kamer met taps toelopende uiteinden, met twee parallelle roestvrijstalen (304 roestvrij staal, spiegelgepolijst) metalen platen in het midden, op een afstand van 15,24 cm. De platen werden aangesloten op een externe hoogspanningsbron (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), de onderste plaat was altijd positief en de bovenste plaat was altijd geaard (zwevend). De kamerwanden zijn bedekt met aluminiumfolie, dat elektrisch geaard is om deeltjesverlies te voorkomen. De kamer heeft een afgesloten laaddeur aan de voorkant, waardoor testoppervlakken op plastic rekken kunnen worden geplaatst, waarbij ze van de onderste metalen plaat worden getild om hoogspanningsinterferentie te voorkomen.
De depositie-efficiëntie van EWNS in EPES werd berekend volgens een eerder ontwikkeld protocol dat gedetailleerd is beschreven in aanvullende figuur S111.
Als controlekamer is de tweede stroming door de cilindrische kamer in serie geschakeld met het EPES-systeem met behulp van een tussenliggend HEPA-filter om EWNS te verwijderen. Zoals weergegeven in figuur 2c, werd de EWNS-aerosol door twee in serie geschakelde kamers gepompt. Het filter tussen de controlekamer en het EPES verwijdert alle resterende EWNS, wat resulteert in dezelfde temperatuur (T), relatieve vochtigheid (RV) en ozonconcentraties.
Er zijn belangrijke door voedsel overgedragen micro-organismen aangetroffen die verse producten besmetten, zoals Escherichia coli (ATCC #27325), een fecale indicator, Salmonella enterica (ATCC #53647), een door voedsel overgedragen pathogeen, Listeria innocua (ATCC #33090), een alternatief voor de pathogene Listeria monocytogenes., Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098) als alternatief voor bederfgist, en Mycobacterium parafortuitous (ATCC #19686) als een resistentere levende bacterie die werd gekocht van ATCC (Manassas, Virginia).
Koop willekeurige dozen biologische cherrytomaten op de lokale markt en bewaar ze in de koelkast bij 4 °C tot gebruik (maximaal 3 dagen). Kies tomaten uit om te experimenteren met één maat, ongeveer 1,25 cm in diameter.
De protocollen voor incubatie, inoculatie, blootstelling en kolonietelling zijn gedetailleerd beschreven in onze eerdere publicaties en worden uitgebreid toegelicht in Aanvullende Gegevens 11. De EWNS-prestaties werden geëvalueerd door geënte tomaten gedurende 45 minuten bloot te stellen aan 40.000 #/cm³. Kort gezegd werden op tijdstip t = 0 min drie tomaten gebruikt om de overlevende micro-organismen te evalueren. Drie tomaten werden in EPES geplaatst en blootgesteld aan EWNS met 40.000 #/cc (EWNS-belichte tomaten) en drie andere werden in de controlekamer geplaatst (controletomaten). Geen van de tomatengroepen werd verder verwerkt. Aan EWNS blootgestelde tomaten en controles werden na 45 minuten verwijderd om het effect van EWNS te evalueren.
Elk experiment werd in drievoud uitgevoerd. De data-analyse werd uitgevoerd volgens het protocol beschreven in de aanvullende gegevens.
E. coli-, Enterobacter- en L. innocua-bacteriemonsters, blootgesteld aan EWNS (45 min, EWNS-aerosolconcentratie 40.000 #/cm3) en niet-blootgesteld, werden gepelleteerd om inactiveringsmechanismen te onderzoeken. Het neerslag werd 2 uur bij kamertemperatuur gefixeerd in een 0,1 M natriumcacodylaatoplossing (pH 7,4) met een fixeermiddel van 2,5% glutaraldehyde, 1,25% paraformaldehyde en 0,03% picrinezuur. Na het wassen werden de monsters 2 uur gefixeerd met 1% osmiumtetroxide (OsO4)/1,5% kaliumferrocyanide (KFeCN6), 3 keer gewassen met water en 1 uur geïncubeerd in 1% uranylacetaat, waarna ze tweemaal gewassen werden met water. Vervolgens werden de monsters 10 minuten gedehydrateerd met 50%, 70%, 90% en 100% alcohol. De monsters werden vervolgens 1 uur in propyleenoxide geplaatst en geïmpregneerd met een 1:1-mengsel van propyleenoxide en TAAP Epon (Marivac Canada Inc., St. Laurent, CA). De monsters werden ingebed in TAAB Epon en 48 uur gepolymeriseerd bij 60 °C. De uitgeharde korrelige hars werd gesneden en gevisualiseerd met behulp van TEM met behulp van een JEOL 1200EX (JEOL, Tokio, Japan), een conventionele transmissie-elektronenmicroscoop uitgerust met een AMT 2k CCD-camera (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, MA, VS).
Alle experimenten werden in drievoud uitgevoerd. Voor elk meetpunt werden bacteriële wasbeurten in drievoud uitgeplaat, wat resulteerde in een totaal van negen datapunten per punt. Het gemiddelde hiervan werd gebruikt als de bacteriële concentratie voor dat specifieke organisme. De standaarddeviatie werd gebruikt als meetfout. Alle punten tellen mee.
De logaritme van de afname van de concentratie bacteriën ten opzichte van t = 0 min werd berekend met behulp van de volgende formule:
waarbij C0 de concentratie van bacteriën in het controlemonster op tijdstip 0 is (d.w.z. nadat het oppervlak is gedroogd, maar voordat het in de kamer wordt geplaatst) en Cn de concentratie van bacteriën op het oppervlak na n minuten blootstelling.
Om rekening te houden met de natuurlijke afbraak van bacteriën tijdens de blootstellingsperiode van 45 minuten, werd ook de Log-reductie berekend ten opzichte van de controle na 45 minuten, als volgt:
Waarbij Cn de concentratie bacteriën in het controlemonster op tijdstip n is en Cn-Control de concentratie van de controlebacteriën op tijdstip n. De gegevens worden weergegeven als een logaritmische reductie ten opzichte van de controle (geen blootstelling aan EWNS).
Tijdens het onderzoek werden verschillende combinaties van spanning en afstand tussen de naald en de tegenelektrode geëvalueerd op basis van Taylor-kegelvorming, Taylor-kegelstabiliteit, EWNS-productiestabiliteit en reproduceerbaarheid. Verschillende combinaties worden weergegeven in aanvullende tabel S1. Twee gevallen werden geselecteerd voor een volledige studie die stabiele en reproduceerbare eigenschappen aantoonde (Taylor-kegel, EWNS-productie en stabiliteit in de tijd). Figuur 3 toont de resultaten voor de lading, grootte en het ROS-gehalte voor twee gevallen. De resultaten worden ook samengevat in tabel 1. Ter referentie bevatten figuur 3 en tabel 1 de eigenschappen van de eerder gesynthetiseerde, niet-geoptimaliseerde EWNS8, 9, 10, 11 (baseline-EWNS). Statistische significantieberekeningen met behulp van een tweezijdige t-toets worden opnieuw gepubliceerd in aanvullende tabel S2. Daarnaast zijn er aanvullende gegevens beschikbaar, waaronder onderzoeken naar het effect van de diameter (D) van het bemonsteringsgat van de tegenelektrode en de afstand tussen de aardelektrode en de punt van de naald (L) (aanvullende figuren S2 en S3).
(a–c) AFM-grootteverdeling. (d – f) Oppervlakteladingskarakteristiek. (g) Karakterisering van ROS en ESR.
Het is ook belangrijk om op te merken dat onder alle bovenstaande omstandigheden de gemeten ionisatiestromen in het bereik van 2-6 µA lagen en de spanningen in het bereik van -3,8 tot -6,5 kV, wat resulteerde in een stroomverbruik voor deze EWNS-module met één aansluiting van minder dan 50 mW. . generatiemodule. Hoewel EWNS onder hoge druk werd gesynthetiseerd, waren de ozonniveaus zeer laag en kwamen ze nooit boven de 60 ppb uit.
Aanvullende figuur S4 toont de gesimuleerde elektrische velden voor respectievelijk de scenario's [-6,5 kV, 4,0 cm] en [-3,8 kV, 0,5 cm]. De velden volgens de scenario's [-6,5 kV, 4,0 cm] en [-3,8 kV, 0,5 cm] worden berekend als respectievelijk 2 × 105 V/m en 4,7 × 105 V/m. Dit is te verwachten, aangezien de verhouding tussen spanning en afstand in het tweede geval veel hoger is.
Figuur 3a en b tonen de EWNS-diameter gemeten met de AFM8. De gemiddelde EWNS-diameters voor de scenario's [-6,5 kV, 4,0 cm] en [-3,8 kV, 0,5 cm] werden berekend als respectievelijk 27 nm en 19 nm. De geometrische standaarddeviaties van de verdelingen voor de gevallen [-6,5 kV, 4,0 cm] en [-3,8 kV, 0,5 cm] zijn respectievelijk 1,41 en 1,45, wat wijst op een smalle grootteverdeling. Zowel de gemiddelde grootte als de geometrische standaarddeviatie liggen zeer dicht bij de basislijn-EWNS, namelijk respectievelijk 25 nm en 1,41. Figuur 3c toont de grootteverdeling van de basislijn-EWNS gemeten met dezelfde methode en onder dezelfde omstandigheden.
Figuur 3d toont de resultaten van de ladingskarakterisering. De gegevens zijn gemiddelde metingen van 30 gelijktijdige concentratiemetingen (#/cm3) en stroomsterkte (I). De analyse laat zien dat de gemiddelde lading op de EWNS 22 ± 6 e- en 44 ± 6 e- bedraagt ​​voor respectievelijk [-6,5 kV, 4,0 cm] en [-3,8 kV, 0,5 cm]. Vergeleken met de Baseline-EWNS (10 ± 2 e-) is hun oppervlaktelading significant hoger, twee keer zo hoog als in het [-6,5 kV, 4,0 cm]-scenario en vier keer zo hoog als in het [-3,8 kV, 0,5 cm]-scenario. Figuur 3f toont de basisgegevens van de EWNS-betaling.
Uit de EWNS-concentratiekaarten (aanvullende figuren S5 en S6) blijkt dat de [-6,5 kV, 4,0 cm]-scène een significant hoger aantal deeltjes heeft dan de [-3,8 kV, 0,5 cm]-scène. Ook moet worden opgemerkt dat de EWNS-concentraties tot 4 uur lang werden gemonitord (aanvullende figuren S5 en S6), waarbij de stabiliteit van de EWNS-generatie in beide gevallen dezelfde deeltjesconcentraties liet zien.
Figuur 3g toont het EPR-spectrum na controle (achtergrond)subtractie voor geoptimaliseerde EWNS bij [-6,5 kV, 4,0 cm]. Het ROS-spectrum wordt ook vergeleken met de EWNS-basislijn in een eerder gepubliceerd artikel. Het berekende aantal EWNS-reacties met de spintrap is 7,5 × 104 EWNS/s, wat vergelijkbaar is met de eerder gepubliceerde Baseline-EWNS8. De EPR-spectra wezen duidelijk op de aanwezigheid van twee soorten ROS, waarbij O2- overheerste, terwijl OH• in een kleinere hoeveelheid aanwezig was. Bovendien toonde een directe vergelijking van de piekintensiteiten aan dat de geoptimaliseerde EWNS een significant hoger ROS-gehalte had vergeleken met de basislijn-EWNS.
Figuur 4 toont de depositie-efficiëntie van EWNS in EPES. De gegevens zijn ook samengevat in Tabel I en vergeleken met de originele EWNS-gegevens. Voor beide EUNS-gevallen was de depositie bijna 100%, zelfs bij een lage spanning van 3,0 kV. Doorgaans is 3,0 kV voldoende om 100% depositie te bereiken, ongeacht de verandering in de oppervlaktelading. Onder dezelfde omstandigheden was de depositie-efficiëntie van de Baseline-EWNS slechts 56% vanwege de lagere lading (gemiddeld 10 elektronen per EWNS).
Figuur 5 en tabel 2 vatten de mate van inactivering samen van micro-organismen die op het oppervlak van tomaten zijn geïnoculeerd na blootstelling aan ongeveer 40.000 #/cm3 EWNS gedurende 45 minuten onder het optimale scenario [-6,5 kV, 4,0 cm]. Geïnoculeerde E. coli en L. innocua lieten een significante reductie zien van 3,8 log na 45 minuten blootstelling. Onder dezelfde omstandigheden vertoonde S. enterica een lagere logreductie van 2,2 log, terwijl S. cerevisiae en M. parafortuitum een ​​reductie van 1,0 log lieten zien.
Elektronenmicroscopische opnamen (Figuur 6) tonen de fysieke veranderingen die EWNS veroorzaakt in cellen van E. coli, Salmonella enterica en L. innocua, die leiden tot inactivatie. De controlebacteriën vertoonden intacte celmembranen, terwijl de blootgestelde bacteriën beschadigde buitenmembranen hadden.
Elektronenmicroscopische beeldvorming van de controlebacteriën en de blootgestelde bacteriën toonde schade aan het membraan.
De gegevens over de fysisch-chemische eigenschappen van de geoptimaliseerde EWNS laten gezamenlijk zien dat de EWNS-eigenschappen (oppervlaktelading en ROS-gehalte) aanzienlijk verbeterd waren in vergelijking met de eerder gepubliceerde EWNS-basisgegevens8,9,10,11. Aan de andere kant bleef hun grootte in het nanometerbereik, wat zeer vergelijkbaar is met eerder gepubliceerde resultaten, waardoor ze gedurende een lange periode in de lucht kunnen blijven. De waargenomen polydispersiteit kan worden verklaard door veranderingen in de oppervlaktelading, die de omvang van het Rayleigh-effect, willekeur en mogelijke samensmelting van EWNS bepalen. Zoals echter gedetailleerd door Nielsen et al.22, vermindert een hoge oppervlaktelading de verdamping door de oppervlakte-energie/-spanning van de waterdruppel effectief te verhogen. Deze theorie werd experimenteel bevestigd voor microdruppels22 en EWNS in onze vorige publicatie8. Het verlies van overuren kan ook de grootte beïnvloeden en bijdragen aan de waargenomen grootteverdeling.
Bovendien bedraagt ​​de lading per structuur ongeveer 22-44 e-, afhankelijk van de omstandigheden, wat aanzienlijk hoger is dan bij de basis-EWNS, die een gemiddelde lading heeft van 10 ± 2 elektronen per structuur. Opgemerkt dient echter te worden dat dit de gemiddelde lading van EWNS is. Seto et al. hebben aangetoond dat de lading niet uniform is en een lognormale verdeling volgt21. Vergeleken met ons eerdere werk verdubbelt een verdubbeling van de oppervlaktelading de depositie-efficiëntie in het EPES-systeem tot bijna 100%11.