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Recentemente, foi desenvolvida uma plataforma antimicrobiana livre de químicos, baseada em nanotecnologia e utilizando nanoestruturas artificiais de água (EWNS). As EWNS possuem alta carga superficial e são ricas em espécies reativas de oxigênio (ROS), que podem interagir e inativar diversos microrganismos, incluindo patógenos transmitidos por alimentos. Neste trabalho, demonstra-se que suas propriedades durante a síntese podem ser ajustadas e otimizadas para aumentar ainda mais seu potencial antibacteriano. A plataforma laboratorial de EWNS foi projetada para ajustar as propriedades das EWNS por meio da alteração dos parâmetros de síntese. A caracterização das propriedades das EWNS (carga, tamanho e conteúdo de ROS) foi realizada utilizando métodos analíticos modernos. Além disso, microrganismos presentes em alimentos, como Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocua, Mycobacterium para fortitum e Saccharomyces cerevisiae, foram inoculados na superfície de tomates-cereja orgânicos para avaliar seu potencial de inativação microbiana. Os resultados apresentados demonstram que as propriedades das EWNS podem ser ajustadas durante a síntese, resultando em um aumento exponencial na eficiência de inativação. Em particular, a carga superficial aumentou quatro vezes e o teor de ROS (espécies reativas de oxigênio) também aumentou. A taxa de remoção microbiana foi dependente do microrganismo e variou de 1,0 a 3,8 log após 45 minutos de exposição a uma dose de aerossol de 40.000 #/cm³ de EWNS (nanopartículas de nitrogênio eletrônico).
A contaminação microbiana é a principal causa de doenças transmitidas por alimentos, resultantes da ingestão de patógenos ou suas toxinas. Somente nos Estados Unidos, essas doenças são responsáveis ​​por cerca de 76 milhões de casos, 325 mil hospitalizações e 5 mil mortes por ano¹. Além disso, o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA) estima que o aumento do consumo de produtos frescos seja responsável por 48% de todas as doenças transmitidas por alimentos relatadas nos Estados Unidos². O custo das doenças e mortes causadas por patógenos transmitidos por alimentos nos Estados Unidos é muito alto, estimado pelos Centros de Controle e Prevenção de Doenças (CDC) em mais de US$ 15,6 bilhões por ano³.
Atualmente, as intervenções antimicrobianas químicas4, por radiação5 e térmicas6 para garantir a segurança alimentar são implementadas principalmente em pontos críticos de controle (PCCs) limitados na cadeia de produção (geralmente após a colheita e/ou durante o envase), em vez de serem implementadas continuamente, de forma que os produtos frescos fiquem sujeitos à contaminação cruzada7. As intervenções antimicrobianas são necessárias para um melhor controle das doenças transmitidas por alimentos e da deterioração dos alimentos, e têm o potencial de serem aplicadas em toda a cadeia produtiva, do campo à mesa. Menor impacto e custo.
Uma plataforma antimicrobiana livre de químicos, baseada em nanotecnologia, foi recentemente desenvolvida para inativar bactérias em superfícies e no ar, utilizando nanoestruturas artificiais de água (EWNS). Para a síntese das EWNS, dois processos paralelos foram utilizados: eletroaspiração e ionização da água (Fig. 1a). Já foi demonstrado que as EWNS possuem um conjunto único de propriedades físicas e biológicas^8,9,10. As EWNS apresentam uma média de 10 elétrons por estrutura e um tamanho médio de 25 nm (Fig. 1b,c)^8,9,10. Além disso, a ressonância de spin eletrônico (RSE) mostrou que as EWNS contêm uma grande quantidade de espécies reativas de oxigênio (EROs), principalmente radicais hidroxila (OH•) e superóxido (O_2-) (Fig. 1c)⁸. As EWNS permanecem no ar por um longo período e podem colidir com microrganismos suspensos no ar e presentes em superfícies, liberando sua carga de EROs e causando a inativação microbiana (Fig. 1d). Esses estudos anteriores também mostraram que o EWNS pode interagir e inativar várias bactérias gram-negativas e gram-positivas de importância para a saúde pública, incluindo micobactérias, em superfícies e no ar8,9. A microscopia eletrônica de transmissão mostrou que a inativação foi causada pela ruptura da membrana celular. Além disso, estudos de inalação aguda mostraram que altas doses de EWNS não causam danos ou inflamação pulmonar8.
(a) A eletropulverização ocorre quando uma alta voltagem é aplicada entre um capilar contendo líquido e um contraeletrodo. (b) A aplicação de alta voltagem resulta em dois fenômenos diferentes: (i) eletropulverização de água e (ii) geração de espécies reativas de oxigênio (íons) aprisionadas nas EWNS. (c) A estrutura única das EWNS. (d) As EWNS são altamente móveis devido à sua natureza nanométrica e podem interagir com patógenos presentes no ar.
A capacidade da plataforma antimicrobiana EWNS de inativar microrganismos transmitidos por alimentos na superfície de alimentos frescos também foi demonstrada recentemente. Além disso, foi mostrado que a carga superficial da EWNS pode ser usada em combinação com um campo elétrico para direcionamento específico. Mais importante ainda, um resultado inicial promissor de redução de aproximadamente 1,4 log na atividade de tomates orgânicos contra diversos microrganismos alimentares, como *E. coli* e *Listeria*, foi observado em 90 minutos de exposição à EWNS em uma concentração de aproximadamente 50.000#/cm³. Ademais, testes preliminares de avaliação organoléptica não mostraram nenhum efeito organoléptico em comparação com o tomate controle. Embora esses resultados iniciais de inativação sejam promissores para a segurança alimentar mesmo em doses muito baixas de EWNS, como 50.000#/cm³, é evidente que um potencial de inativação maior seria mais benéfico para reduzir ainda mais o risco de infecção e deterioração.
Neste trabalho, concentraremos nossa pesquisa no desenvolvimento de uma plataforma de geração de EWNS (nanopartículas extracelulares de nanotubos de carbono) para ajustar os parâmetros de síntese e otimizar as propriedades físico-químicas das EWNS, visando aprimorar seu potencial antibacteriano. Em particular, a otimização tem se concentrado no aumento da carga superficial (para melhorar a entrega direcionada) e do conteúdo de ROS (espécies reativas de oxigênio) (para melhorar a eficiência de inativação). A caracterização das propriedades físico-químicas otimizadas (tamanho, carga e conteúdo de ROS) será realizada utilizando métodos analíticos modernos e microrganismos comuns presentes em alimentos, como *E. coli*, *S. enterica*, *L. innocua*, *S. cerevisiae* e *M. parafortuitum*.
O EVNS foi sintetizado por eletropulverização e ionização simultâneas de água de alta pureza (18 MΩ cm–1). O atomizador elétrico 12 é tipicamente usado para atomizar líquidos e partículas sintéticas de polímero e cerâmica 13 e fibras 14 de tamanho controlado.
Conforme detalhado em publicações anteriores 8, 9, 10, 11, em um experimento típico, uma alta voltagem é aplicada entre um capilar metálico e um contraeletrodo aterrado. Durante esse processo, dois fenômenos distintos ocorrem: 1) eletrodispersão e 2) ionização da água. Um forte campo elétrico entre os dois eletrodos provoca o acúmulo de cargas negativas na superfície da água condensada, resultando na formação de cones de Taylor. Como resultado, formam-se gotículas de água altamente carregadas, que continuam a se fragmentar em partículas menores, de acordo com a teoria de Rayleigh16. Simultaneamente, um forte campo elétrico provoca a divisão de algumas moléculas de água, liberando elétrons (ionização), gerando assim uma grande quantidade de espécies reativas de oxigênio (ROS)17. Os pacotes de ROS18 gerados simultaneamente foram encapsulados em EWNS (Fig. 1c).
A Figura 2a mostra o sistema de geração de EWNS desenvolvido e utilizado na síntese de EWNS neste estudo. Água purificada, armazenada em um frasco fechado, foi conduzida através de um tubo de Teflon (2 mm de diâmetro interno) até uma agulha de aço inoxidável 30G (capilar metálico). Como mostrado na Figura 2b, o fluxo de água é controlado pela pressão do ar dentro do frasco. A agulha está conectada a um console de Teflon que pode ser ajustado manualmente a uma determinada distância do contraeletrodo. O contraeletrodo é um disco de alumínio polido com um orifício no centro para amostragem. Abaixo do contraeletrodo encontra-se um funil de amostragem de alumínio, que está conectado ao restante da configuração experimental através de uma porta de amostragem (Figura 2b). Todos os componentes do amostrador são aterrados eletricamente para evitar o acúmulo de carga que poderia degradar a amostragem de partículas.
(a) Sistema de Geração de Nanoestruturas de Água Projetadas (EWNS). (b) Corte transversal do amostrador e da unidade de eletrospray mostrando os parâmetros mais importantes. (c) Configuração experimental para inativação de bactérias.
O sistema de geração de EWNS descrito acima permite a alteração de parâmetros operacionais chave para facilitar o ajuste fino das propriedades do EWNS. Ajuste a tensão aplicada (V), a distância entre a agulha e o contraeletrodo (L) e o fluxo de água (φ) através do capilar para refinar as características do EWNS. Os símbolos [V (kV), L (cm)] são usados ​​para denotar diferentes combinações. Ajuste o fluxo de água para obter um cone de Taylor estável com um determinado conjunto [V, L]. Para os propósitos deste estudo, a abertura do contraeletrodo (D) foi definida em 0,5 polegadas (1,29 cm).
Devido à geometria limitada e à assimetria, a intensidade do campo elétrico não pode ser calculada a partir de princípios fundamentais. Em vez disso, o software QuickField™ (Svendborg, Dinamarca)¹⁹ foi utilizado para calcular o campo elétrico. O campo elétrico não é uniforme, portanto, o valor do campo elétrico na ponta do capilar foi usado como valor de referência para várias configurações.
Durante o estudo, diversas combinações de voltagem e distância entre a agulha e o contraeletrodo foram avaliadas em termos de formação do cone de Taylor, estabilidade do cone de Taylor, estabilidade da produção de EWNS e reprodutibilidade. Várias combinações são mostradas na Tabela Suplementar S1.
A saída do sistema de geração de EWNS foi conectada diretamente a um Analisador de Mobilidade de Partículas por Varredura (SMPS, modelo 3936, TSI, Shoreview, Minnesota) para medir a concentração de partículas e foi utilizada com um eletrômetro de aerossol Faraday (TSI, modelo 3068B, Shoreview, EUA) para medir os fluxos de aerossol, conforme descrito em nossa publicação anterior⁹. Tanto o SMPS quanto o eletrômetro de aerossol amostraram a uma vazão de 0,5 L/min (vazão total da amostra de 1 L/min). As concentrações de partículas e os fluxos de aerossol foram medidos durante 120 s. A medição foi repetida 30 vezes. A carga total de aerossol foi calculada a partir das medições de corrente, e a carga média de EWNS foi estimada a partir do número total de partículas de EWNS amostradas. O custo médio de EWNS pode ser calculado usando a Equação (1):
onde IEl é a corrente medida, NSMPS é a concentração numérica medida com a SMPS e φEl é a taxa de fluxo para o eletrômetro.
Como a umidade relativa (UR) afeta a carga superficial, a temperatura e a UR foram mantidas constantes em 21°C e 45%, respectivamente, durante o experimento.
A microscopia de força atômica (AFM), utilizando um microscópio Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, CA) e uma sonda AC260T (Olympus, Tóquio, Japão), foi empregada para medir o tamanho e a vida útil das nanopartículas de parede eletrônica (EWNS). A taxa de varredura da AFM foi de 1 Hz e a área de varredura foi de 5 µm × 5 µm, com 256 linhas de varredura. Todas as imagens foram submetidas a um alinhamento de primeira ordem utilizando o software Asylum (máscara com alcance de 100 nm e limiar de 100 pm).
Remova o funil de amostragem e posicione a superfície de mica a uma distância de 2,0 cm do contraeletrodo por um tempo médio de 120 s para evitar a coalescência de partículas e a formação de gotículas irregulares na superfície da mica. A EWNS foi aplicada diretamente em superfícies de mica recém-cortadas (Ted Pella, Redding, CA). Imediatamente após a pulverização catódica, a superfície da mica foi visualizada por meio de AFM. O ângulo de contato da superfície da mica recém-cortada e não modificada é próximo de 0°, portanto, a EWNS se propaga sobre a superfície da mica em formato de cúpula20. O diâmetro (a) e a altura (h) das gotículas em difusão foram medidos diretamente a partir da topografia AFM e usados ​​para calcular o volume de difusão da EWNS em formato de cúpula, utilizando nosso método previamente validado8. Assumindo que a EVNS embarcada tenha o mesmo volume, o diâmetro equivalente pode ser calculado a partir da equação (2):
De acordo com o método previamente desenvolvido, um dispositivo de captura de radicais por ressonância de spin eletrônico (RSE) foi utilizado para detectar a presença de intermediários radicais de curta duração em EWNS. Os aerossóis foram passados ​​por uma solução contendo 235 mM de DEPMPO (5-(dietoxifosforil)-5-metil-1-pirrolina-N-óxido) (Oxis International Inc., Portland, Oregon). Todas as medições de RSE foram realizadas utilizando um espectrômetro Bruker EMX (Bruker Instruments Inc., Billerica, MA, EUA) e matrizes de células planas. O software Acquisit (Bruker Instruments Inc., Billerica, MA, EUA) foi utilizado para coletar e analisar os dados. A caracterização de ROS foi realizada apenas para um conjunto de condições operacionais [-6,5 kV, 4,0 cm]. As concentrações de EWNS foram medidas utilizando SMPS após considerar a perda de EWNS no impactor.
Os níveis de ozono foram monitorizados utilizando um monitor de ozono de feixe duplo 205™ (2B Technologies, Boulder, Co)8,9,10.
Para todas as propriedades do EWNS, o valor da medição é a média das medições e o erro de medição é o desvio padrão. Um teste t foi realizado para comparar o valor do atributo EWNS otimizado com o valor correspondente do EWNS base.
A Figura 2c mostra um Sistema de Passagem por Precipitação Eletrostática (EPES) previamente desenvolvido e caracterizado, que pode ser usado para direcionar EWNS11 a superfícies. O EPES utiliza uma carga EWNS em combinação com um forte campo elétrico para “apontar” diretamente para a superfície do alvo. Detalhes do sistema EPES são apresentados em uma publicação recente de Pyrgiotakis et al.11. Assim, o EPES consiste em uma câmara de PVC impressa em 3D com extremidades afiladas, contendo duas placas metálicas paralelas de aço inoxidável (aço inoxidável 304, polido espelhado) no meio, separadas por 15,24 cm. As placas foram conectadas a uma fonte externa de alta tensão (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), sendo a placa inferior sempre positiva e a placa superior sempre aterrada (flutuante). As paredes da câmara são revestidas com folha de alumínio, que é aterrada eletricamente para evitar a perda de partículas. A câmara possui uma porta frontal selada que permite que as superfícies de teste sejam colocadas em suportes de plástico, elevando-as da placa metálica inferior para evitar interferência de alta tensão.
A eficiência de deposição de EWNS em EPES foi calculada de acordo com um protocolo previamente desenvolvido, detalhado na Figura Suplementar S111.
Como câmara de controle, o segundo fluxo através da câmara cilíndrica é conectado em série com o sistema EPES usando um filtro HEPA intermediário para remover EWNS. Conforme mostrado na figura 2c, o aerossol de EWNS foi bombeado através de duas câmaras conectadas em série. O filtro entre a sala de controle e o EPES remove qualquer EWNS remanescente, resultando nos mesmos níveis de temperatura (T), umidade relativa (UR) e ozônio.
Microorganismos importantes transmitidos por alimentos foram encontrados contaminando produtos frescos, como Escherichia coli (ATCC nº 27325), um indicador fecal, Salmonella enterica (ATCC nº 53647), um patógeno transmitido por alimentos, Listeria innocua (ATCC nº 33090), uma alternativa à Listeria monocytogenes patogênica, Saccharomyces cerevisiae (ATCC nº 4098), como alternativa à levedura deteriorante, e Mycobacterium parafortuitus (ATCC nº 19686), uma bactéria viva mais resistente, foram adquiridos da ATCC (Manassas, Virgínia).
Compre aleatoriamente caixas de tomates-cereja orgânicos no mercado local e refrigere-os a 4°C até o uso (por até 3 dias). Selecione tomates para experimentar com um tamanho de cerca de 1,2 cm de diâmetro.
Os protocolos de incubação, inoculação, exposição e contagem de colônias foram detalhados em nossas publicações anteriores e explicados em detalhes nos Dados Suplementares 11. O desempenho do EWNS foi avaliado expondo tomates inoculados a 40.000 #/cm³ por 45 minutos. Resumidamente, no tempo t = 0 min, três tomates foram utilizados para avaliar os microrganismos sobreviventes. Três tomates foram colocados em EPES e expostos ao EWNS a 40.000 #/cm³ (tomates expostos ao EWNS) e outros três foram colocados na câmara de controle (tomates controle). Nenhum dos grupos de tomates foi submetido a processamento adicional. Os tomates expostos ao EWNS e os controles foram removidos após 45 minutos para avaliar o efeito do EWNS.
Cada experimento foi realizado em triplicata. A análise dos dados foi realizada de acordo com o protocolo descrito nos Dados Suplementares.
Amostras bacterianas de *E. coli*, *Enterobacter* e *L. innocua* expostas a EWNS (45 min, concentração de aerossol de EWNS de 40.000 #/cm³) e não expostas foram centrifugadas para avaliar os mecanismos de inativação. O precipitado foi fixado por 2 horas à temperatura ambiente em solução de cacodilato de sódio 0,1 M (pH 7,4) com um fixador de 2,5% de glutaraldeído, 1,25% de paraformaldeído e 0,03% de ácido pícrico. Após lavagem, foram fixadas com 1% de tetróxido de ósmio (OsO₄)/1,5% de ferrocianeto de potássio (KFeCN₆) por 2 h, lavadas 3 vezes com água e incubadas em acetato de uranila 1% por 1 h, sendo então lavadas duas vezes com água. A desidratação subsequente foi realizada por 10 minutos em cada uma das seguintes concentrações de álcool: 50%, 70%, 90% e 100%. As amostras foram então colocadas em óxido de propileno por 1 hora e impregnadas com uma mistura 1:1 de óxido de propileno e TAAP Epon (Marivac Canada Inc., St. Laurent, CA). As amostras foram embutidas em TAAB Epon e polimerizadas a 60 °C por 48 horas. A resina granular curada foi cortada e visualizada por MET utilizando um microscópio eletrônico de transmissão JEOL 1200EX (JEOL, Tóquio, Japão), um microscópio eletrônico de transmissão convencional equipado com uma câmera CCD AMT 2k (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, MA, EUA).
Todos os experimentos foram realizados em triplicata. Para cada ponto de tempo, as lavagens bacterianas foram plaqueadas em triplicata, resultando em um total de nove pontos de dados por ponto, cuja média foi usada como a concentração bacteriana para aquele organismo específico. O desvio padrão foi usado como erro de medição. Todos os pontos são contabilizados.
O logaritmo da diminuição na concentração de bactérias em comparação com t = 0 min foi calculado usando a seguinte fórmula:
onde C0 é a concentração de bactérias na amostra de controle no tempo 0 (ou seja, após a superfície secar, mas antes de ser colocada na câmara) e Cn é a concentração de bactérias na superfície após n minutos de exposição.
Para levar em consideração a degradação natural das bactérias durante o período de exposição de 45 minutos, a redução logarítmica também foi calculada em comparação com o controle aos 45 minutos, da seguinte forma:
Onde Cn é a concentração de bactérias na amostra de controle no tempo n e Cn-Controle é a concentração de bactérias de controle no tempo n. Os dados são apresentados como uma redução logarítmica em comparação com o controle (sem exposição ao EWNS).
Durante o estudo, diversas combinações de voltagem e distância entre a agulha e o contraeletrodo foram avaliadas em termos de formação do cone de Taylor, estabilidade do cone de Taylor, estabilidade da produção de EWNS e reprodutibilidade. Várias combinações são mostradas na Tabela Suplementar S1. Dois casos foram selecionados para um estudo completo, demonstrando propriedades estáveis ​​e reprodutíveis (cone de Taylor, produção de EWNS e estabilidade ao longo do tempo). A Figura 3 mostra os resultados da carga, tamanho e conteúdo de ROS para os dois casos. Os resultados também estão resumidos na Tabela 1. Para referência, a Figura 3 e a Tabela 1 incluem as propriedades dos EWNS8, 9, 10 e 11 sintetizados anteriormente e não otimizados (EWNS de referência). Os cálculos de significância estatística usando um teste t bicaudal são republicados na Tabela Suplementar S2. Além disso, dados adicionais incluem estudos sobre o efeito do diâmetro do orifício de amostragem do contraeletrodo (D) e da distância entre o eletrodo de aterramento e a ponta da agulha (L) (Figuras Suplementares S2 e S3).
(a–c) Distribuição de tamanho por AFM. (d – f) Característica da carga superficial. (g) Caracterização de ROS e ESR.
É importante notar também que, para todas as condições acima, as correntes de ionização medidas variaram de 2 a 6 µA, e as tensões, de -3,8 a -6,5 kV, resultando em um consumo de energia para este módulo de geração EWNS de terminal único inferior a 50 mW. Embora o EWNS tenha sido sintetizado sob alta pressão, os níveis de ozônio foram muito baixos, nunca ultrapassando 60 ppb.
A Figura Suplementar S4 mostra os campos elétricos simulados para os cenários [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm], respectivamente. Os campos, de acordo com os cenários [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm], são calculados como 2 × 10⁵ V/m e 4,7 × 10⁵ V/m, respectivamente. Isso é esperado, visto que a relação entre tensão e distância é muito maior no segundo caso.
As figuras 3a e 3b mostram o diâmetro das nanopartículas de parede de elétrons (EWNS) medido com o AFM8. Os diâmetros médios das EWNS para os cenários [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm] foram calculados em 27 nm e 19 nm, respectivamente. Os desvios padrão geométricos das distribuições para os casos [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm] são 1,41 e 1,45, respectivamente, indicando uma distribuição de tamanho estreita. Tanto o tamanho médio quanto o desvio padrão geométrico são muito próximos aos das EWNS de referência, sendo 25 nm e 1,41, respectivamente. A figura 3c mostra a distribuição de tamanho das EWNS de referência medida usando o mesmo método e sob as mesmas condições.
As figuras 3d e 3e mostram os resultados da caracterização da carga. Os dados representam a média de 30 medições simultâneas de concentração (#/cm³) e corrente (I). A análise mostra que a carga média no EWNS é de 22 ± 6 e⁻ e 44 ± 6 e⁻ para [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm], respectivamente. Comparada ao Baseline-EWNS (10 ± 2 e⁻), a carga superficial é significativamente maior, o dobro da do cenário [-6,5 kV, 4,0 cm] e quatro vezes maior que a do cenário [-3,8 kV, 0,5 cm]. A figura 3f mostra os dados básicos de pagamento do EWNS.
A partir dos mapas de concentração numérica de EWNS (Figuras Suplementares S5 e S6), observa-se que a cena [-6,5 kV, 4,0 cm] apresenta um número significativamente maior de partículas do que a cena [-3,8 kV, 0,5 cm]. Cabe ressaltar também que as concentrações numéricas de EWNS foram monitoradas por até 4 horas (Figuras Suplementares S5 e S6), período em que a estabilidade da geração de EWNS demonstrou níveis semelhantes de concentração numérica de partículas em ambos os casos.
A Figura 3g mostra o espectro de EPR após a subtração do controle (fundo) para EWNS otimizado em [-6,5 kV, 4,0 cm]. O espectro de ROS também é comparado ao espectro de referência de EWNS em um artigo publicado anteriormente. O número calculado de EWNS reagindo com a armadilha de spin é de 7,5 × 10⁴ EWNS/s, valor semelhante ao do espectro de referência EWNS8 publicado anteriormente. Os espectros de EPR indicaram claramente a presença de dois tipos de ROS, com predominância de O₂⁻ e presença de OH• em menor quantidade. Além disso, uma comparação direta das intensidades dos picos mostrou que o EWNS otimizado apresentou um conteúdo de ROS significativamente maior em comparação ao EWNS de referência.
A Figura 4 mostra a eficiência de deposição de EWNS em EPES. Os dados também estão resumidos na Tabela I e comparados com os dados originais de EWNS. Para ambos os casos de EUNS, a deposição foi próxima de 100%, mesmo com uma baixa tensão de 3,0 kV. Tipicamente, 3,0 kV são suficientes para atingir 100% de deposição, independentemente da variação da carga superficial. Sob as mesmas condições, a eficiência de deposição do Baseline-EWNS foi de apenas 56% devido à menor carga (média de 10 elétrons por EWNS).
A Figura 5 e a Tabela 2 resumem o grau de inativação de microrganismos inoculados na superfície de tomates após exposição a aproximadamente 40.000 #/cm³ de EWNS (esferas de nêutrons de parede simples) por 45 minutos sob o cenário ideal [-6,5 kV, 4,0 cm]. A inoculação de E. coli e L. innocua apresentou uma redução significativa de 3,8 log após 45 minutos de exposição. Sob as mesmas condições, S. enterica apresentou uma redução logarítmica menor, de 2,2 log, enquanto S. cerevisiae e M. parafortuitum apresentaram uma redução de 1,0 log.
Micrografias eletrônicas (Figura 6) que mostram as alterações físicas induzidas por EWNS em células de E. coli, Salmonella enterica e L. innocua, levando à inativação. As bactérias do grupo controle apresentaram membranas celulares intactas, enquanto as bactérias expostas apresentaram membranas externas danificadas.
A análise por microscopia eletrônica de bactérias do grupo controle e das bactérias expostas revelou danos na membrana.
Os dados sobre as propriedades físico-químicas das EWNS otimizadas mostram coletivamente que as propriedades das EWNS (carga superficial e conteúdo de ROS) foram significativamente melhoradas em comparação com os dados de referência de EWNS publicados anteriormente8,9,10,11. Por outro lado, seu tamanho permaneceu na faixa nanométrica, o que é muito semelhante aos resultados publicados anteriormente, permitindo que permaneçam no ar por um longo período de tempo. A polidispersidade observada pode ser explicada por mudanças na carga superficial, que determinam a magnitude do efeito Rayleigh, a aleatoriedade e a potencial fusão das EWNS. No entanto, como detalhado por Nielsen et al.22, uma alta carga superficial reduz a evaporação, aumentando efetivamente a energia/tensão superficial da gota de água. Essa teoria foi confirmada experimentalmente para microgotículas22 e EWNS em nossa publicação anterior8. A perda ao longo do tempo também pode afetar o tamanho e contribuir para a distribuição de tamanho observada.
Além disso, a carga por estrutura é de cerca de 22 a 44 elétrons, dependendo das circunstâncias, o que é significativamente maior em comparação com o EWNS básico, que possui uma carga média de 10 ± 2 elétrons por estrutura. No entanto, deve-se notar que esta é a carga média do EWNS. Seto et al. demonstraram que a carga não é uniforme e segue uma distribuição log-normal.²¹ Comparado ao nosso trabalho anterior, dobrar a carga superficial dobra a eficiência de deposição no sistema EPES para quase 100%.¹¹