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Recentemente, foi desenvolvida uma plataforma antimicrobiana livre de produtos químicos baseada em nanotecnologia utilizando nanoestruturas artificiais de água (EWNS). As EWNS possuem alta carga superficial e são ricas em espécies reativas de oxigênio (ROS) que podem interagir e inativar diversos microrganismos, incluindo patógenos de origem alimentar. Aqui, é demonstrado que suas propriedades durante a síntese podem ser ajustadas e otimizadas para aumentar ainda mais seu potencial antibacteriano. A plataforma laboratorial EWNS foi projetada para ajustar as propriedades das EWNS alterando os parâmetros de síntese. A caracterização das propriedades das EWNS (carga, tamanho e teor de ROS) foi realizada utilizando métodos analíticos modernos. Além disso, microrganismos alimentares como Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocua, Mycobacterium para fortitum e Saccharomyces cerevisiae foram inoculados na superfície de tomates-uva orgânicos para avaliar seu potencial de inativação microbiana. Os resultados apresentados aqui demonstram que as propriedades das EWNS podem ser ajustadas durante a síntese, resultando em um aumento exponencial na eficiência de inativação. Em particular, a carga superficial aumentou quatro vezes, e o teor de ROS aumentou. A taxa de remoção microbiana foi dependente da microbiota e variou de 1,0 a 3,8 log após 45 minutos de exposição a uma dose de aerossol de 40.000 #/cm³ de EWNS.
A contaminação microbiana é a principal causa de doenças transmitidas por alimentos, causadas pela ingestão de patógenos ou suas toxinas. Doenças transmitidas por alimentos são responsáveis ​​por cerca de 76 milhões de doenças, 325.000 hospitalizações e 5.000 mortes a cada ano, somente nos Estados Unidos¹. Além disso, o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA) estima que o aumento do consumo de produtos frescos seja responsável por 48% de todas as doenças transmitidas por alimentos relatadas nos Estados Unidos². O custo de doenças e mortes por patógenos transmitidos por alimentos nos Estados Unidos é muito alto, estimado pelos Centros de Controle e Prevenção de Doenças (CDC) em mais de US$ 15,6 bilhões por ano³.
Atualmente, as intervenções antimicrobianas químicas4, radiológicas5 e térmicas6 para garantir a segurança alimentar são implementadas principalmente em pontos críticos de controle (PCCs) limitados na cadeia de produção (geralmente após a colheita e/ou durante o envase), em vez de serem implementadas continuamente, de forma que os produtos frescos fiquem sujeitos à contaminação cruzada. 7 As intervenções antimicrobianas são necessárias para controlar melhor as doenças transmitidas por alimentos e a deterioração dos alimentos e têm o potencial de serem aplicadas em todo o processo, da fazenda à mesa. Menor impacto e menor custo.
Uma plataforma antimicrobiana livre de produtos químicos baseada em nanotecnologia foi recentemente desenvolvida para inativar bactérias em superfícies e no ar usando nanoestruturas artificiais de água (EWNS). Para a síntese de EVNS, dois processos paralelos foram usados: eletrospray e ionização de água (Fig. 1a). EWNS já demonstraram ter um conjunto único de propriedades físicas e biológicas8,9,10. EWNS tem uma média de 10 elétrons por estrutura e um tamanho nanométrico médio de 25 nm (Fig. 1b,c)8,9,10. Além disso, a ressonância de spin eletrônico (ESR) mostrou que EWNS contêm uma grande quantidade de espécies reativas de oxigênio (ROS), principalmente radicais hidroxila (OH•) e superóxido (O2-) (Fig. 1c)8. EWNS permaneceram no ar por um longo tempo e poderiam colidir com micróbios suspensos no ar e presentes em superfícies, liberando sua carga útil de ROS e causando inativação microbiana (Fig. 1d). Esses estudos anteriores também demonstraram que o EWNS pode interagir e inativar diversas bactérias gram-negativas e gram-positivas de importância para a saúde pública, incluindo micobactérias, em superfícies e no ar8,9. A microscopia eletrônica de transmissão mostrou que a inativação foi causada pela ruptura da membrana celular. Além disso, estudos de inalação aguda demonstraram que altas doses de EWNS não causam danos ou inflamação pulmonar8.
(a) A eletropulverização ocorre quando uma alta voltagem é aplicada entre um capilar contendo líquido e um contraeletrodo. (b) A aplicação de alta voltagem resulta em dois fenômenos diferentes: (i) eletropulverização de água e (ii) geração de espécies reativas de oxigênio (íons) presas no EWNS. (c) A estrutura única do EWNS. (d) Os EWNS são altamente móveis devido à sua natureza em nanoescala e podem interagir com patógenos transportados pelo ar.
A capacidade da plataforma antimicrobiana EWNS de inativar microrganismos de origem alimentar na superfície de alimentos frescos também foi demonstrada recentemente. Foi demonstrado também que a carga de superfície EWNS pode ser usada em combinação com um campo elétrico para entrega direcionada. Mais importante ainda, um resultado inicial promissor de aproximadamente 1,4 log de redução na atividade do tomate orgânico contra vários microrganismos alimentares, como E. coli e Listeria, foi observado dentro de 90 minutos de exposição à EWNS em uma concentração de aproximadamente 50.000#/cm311. Além disso, testes preliminares de avaliação organoléptica não mostraram efeito organoléptico em comparação com o tomate controle. Embora esses resultados iniciais de inativação prometam segurança alimentar mesmo em doses muito baixas de EWNS de 50.000#/cc, veja, é claro que um maior potencial de inativação seria mais benéfico para reduzir ainda mais o risco de infecção e deterioração.
Aqui, concentraremos nossa pesquisa no desenvolvimento de uma plataforma de geração de EWNS para refinar os parâmetros de síntese e otimizar as propriedades físico-químicas dos EWNS, a fim de aprimorar seu potencial antibacteriano. Em particular, a otimização se concentrou no aumento da carga superficial (para melhorar a entrega direcionada) e do teor de ROS (para melhorar a eficiência de inativação). A caracterização das propriedades físico-químicas otimizadas (tamanho, carga e teor de ROS) foi realizada utilizando métodos analíticos modernos e microrganismos alimentares comuns, como E. coli, S. enterica, L. innocua, S. cerevisiae e M. parafortuitum.
O EVNS foi sintetizado por eletropulverização e ionização simultâneas de água de alta pureza (18 MΩ cm–1). O atomizador elétrico 12 é normalmente usado para atomizar líquidos e partículas de polímeros sintéticos e cerâmicas 13 e fibras 14 de tamanho controlado.
Conforme detalhado em publicações anteriores 8, 9, 10, 11, em um experimento típico, uma alta tensão é aplicada entre um capilar metálico e um contraeletrodo aterrado. Durante esse processo, ocorrem dois fenômenos diferentes: 1) eletrospray e 2) ionização da água. Um forte campo elétrico entre os dois eletrodos faz com que cargas negativas se acumulem na superfície da água condensada, resultando na formação de cones de Taylor. Como resultado, gotículas de água altamente carregadas são formadas, as quais continuam a se fragmentar em partículas menores, de acordo com a teoria de Rayleigh16. Ao mesmo tempo, um forte campo elétrico faz com que algumas moléculas de água se dividam e retirem elétrons (ionização), gerando assim uma grande quantidade de espécies reativas de oxigênio (ROS)17. Pacotes de ROS18 gerados simultaneamente foram encapsulados em EWNS (Fig. 1c).
A figura 2a mostra o sistema de geração de EWNS desenvolvido e utilizado na síntese de EWNS neste estudo. Água purificada armazenada em um frasco fechado foi alimentada através de um tubo de Teflon (diâmetro interno de 2 mm) a uma agulha de aço inoxidável de 30G (capilar metálico). Conforme mostrado na Figura 2b, o fluxo de água é controlado pela pressão do ar dentro do frasco. A agulha é fixada a um console de Teflon que pode ser ajustado manualmente a uma certa distância do contraeletrodo. O contraeletrodo é um disco de alumínio polido com um furo no meio para amostragem. Abaixo do contraeletrodo há um funil de amostragem de alumínio, que é conectado ao restante da configuração experimental por meio de uma porta de amostragem (Fig. 2b). Todos os componentes do amostrador são aterrados eletricamente para evitar o acúmulo de carga que poderia degradar a amostragem de partículas.
(a) Sistema de geração de nanoestrutura de água projetada (EWNS). (b) Corte transversal do amostrador e da unidade de eletropulverização mostrando os parâmetros mais importantes. (c) Configuração experimental para inativação de bactérias.
O sistema de geração de EWNS descrito acima é capaz de alterar os principais parâmetros operacionais para facilitar o ajuste fino das propriedades de EWNS. Ajuste a tensão aplicada (V), a distância entre a agulha e o contraeletrodo (L) e o fluxo de água (φ) através do capilar para ajustar as características de EWNS. Os símbolos [V (kV), L (cm)] são usados ​​para denotar diferentes combinações. Ajuste o fluxo de água para obter um cone de Taylor estável de um determinado conjunto [V, L]. Para os fins deste estudo, a abertura do contraeletrodo (D) foi definida em 0,5 polegada (1,29 cm).
Devido à geometria limitada e à assimetria, a intensidade do campo elétrico não pode ser calculada a partir de princípios básicos. Em vez disso, o software QuickField™ (Svendborg, Dinamarca)19 foi utilizado para calcular o campo elétrico. O campo elétrico não é uniforme, portanto, o valor do campo elétrico na ponta do capilar foi usado como valor de referência para várias configurações.
Durante o estudo, diversas combinações de voltagem e distância entre a agulha e o contraeletrodo foram avaliadas em termos de formação do cone de Taylor, estabilidade do cone de Taylor, estabilidade da produção de EWNS e reprodutibilidade. As diversas combinações são apresentadas na Tabela Suplementar S1.
A saída do sistema de geração de EWNS foi conectada diretamente a um Scanning Mobility Particle Sizer (SMPS, modelo 3936, TSI, Shoreview, Minnesota) para medir a concentração do número de partículas e foi usada com um eletrômetro de aerossol Faraday (TSI, modelo 3068B, Shoreview, EUA). MN) para medir fluxos de aerossol, conforme descrito em nossa publicação anterior9. Tanto o SMPS quanto o eletrômetro de aerossol amostraram a uma vazão de 0,5 L/min (vazão total da amostra de 1 L/min). As concentrações de partículas e os fluxos de aerossol foram medidos por 120 s. Repita a medição 30 vezes. A carga total do aerossol é calculada a partir das medições atuais, e a carga média do EWNS é estimada a partir do número total de partículas de EWNS amostradas. O custo médio do EWNS pode ser calculado usando a Equação (1):
onde IEl é a corrente medida, NSMPS é a concentração numérica medida com o SMPS e φEl é a vazão para o eletrômetro.
Como a umidade relativa (UR) afeta a carga da superfície, a temperatura e a (UR) foram mantidas constantes em 21°C e 45%, respectivamente, durante o experimento.
Microscopia de força atômica (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, CA) e sonda AC260T (Olympus, Tóquio, Japão) foram utilizadas para medir o tamanho e a vida útil do EWNS. A taxa de varredura do AFM é de 1 Hz e a área de varredura é de 5 µm × 5 µm com 256 linhas de varredura. Todas as imagens foram submetidas ao alinhamento de primeira ordem usando o software Asylum (máscara com alcance de 100 nm e limiar de 100 pm).
Remova o funil de amostragem e coloque a superfície da mica a uma distância de 2,0 cm do contraeletrodo por um tempo médio de 120 s para evitar a coalescência de partículas e a formação de gotículas irregulares na superfície da mica. A EWNS foi aplicada diretamente em superfícies de mica recém-cortadas (Ted Pella, Redding, CA). Imediatamente após a pulverização catódica, a superfície da mica foi visualizada usando AFM. O ângulo de contato da superfície da mica recém-cortada não modificada é próximo de 0°, então a EWNS se propaga sobre a superfície da mica em um formato de cúpula20. O diâmetro (a) e a altura (h) das gotículas em difusão foram medidos diretamente da topografia de AFM e usados ​​para calcular o volume de difusão em cúpula da EWNS usando nosso método previamente validado8. Assumindo que a EVNS integrada tem o mesmo volume, o diâmetro equivalente pode ser calculado a partir da equação (2):
De acordo com nosso método desenvolvido anteriormente, uma armadilha de spin de ressonância de spin de elétrons (ESR) foi usada para detectar a presença de intermediários radicais de vida curta em EWNS. Os aerossóis foram passados ​​através de uma solução contendo 235 mM DEPMPO (5-(dietoxifosforil)-5-metil-1-pirrolina-N-óxido) (Oxis International Inc., Portland, Oregon). Todas as medições de EPR foram realizadas usando um espectrômetro Bruker EMX (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, EUA) e matrizes de células planas. O software Acquisit (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, EUA) foi usado para coletar e analisar os dados. A caracterização de ROS foi realizada apenas para um conjunto de condições operacionais [-6,5 kV, 4,0 cm]. As concentrações de EWNS foram medidas usando SMPS após levar em consideração a perda de EWNS no impactador.
Os níveis de ozônio foram monitorados usando um 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Co)8,9,10.
Para todas as propriedades EWNS, o valor da medição é a média das medições e o erro de medição é o desvio padrão. Um teste t foi realizado para comparar o valor do atributo EWNS otimizado com o valor correspondente do EWNS base.
A Figura 2c mostra um Sistema de Passagem de Precipitação Eletrostática (EPES) previamente desenvolvido e caracterizado que pode ser usado para direcionar EWNS11 para superfícies. O EPES usa uma carga de EWNS em combinação com um forte campo elétrico para "apontar" diretamente para a superfície do alvo. Detalhes do sistema EPES são apresentados em uma publicação recente de Pyrgiotakis et al.11. Assim, o EPES consiste em uma câmara de PVC impressa em 3D com extremidades cônicas contendo duas placas de metal paralelas de aço inoxidável (aço inoxidável 304, polido espelhado) no meio, a 15,24 cm de distância. As placas foram conectadas a uma fonte externa de alta tensão (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), a placa inferior sempre positiva e a placa superior sempre aterrada (flutuante). As paredes da câmara são cobertas com papel alumínio, que é aterrado eletricamente para evitar perda de partículas. A câmara possui uma porta de carregamento frontal selada que permite que as superfícies de teste sejam colocadas em suportes de plástico, levantando-as da placa de metal inferior para evitar interferência de alta tensão.
A eficiência de deposição de EWNS em EPES foi calculada de acordo com um protocolo desenvolvido anteriormente detalhado na Figura Suplementar S111.
Como câmara de controle, o segundo fluxo através da câmara cilíndrica é conectado em série com o sistema EPES, utilizando um filtro HEPA intermediário para remover EWNS. Como mostrado na figura 2c, o aerossol de EWNS foi bombeado através de duas câmaras conectadas em série. O filtro entre a sala de controle e o EPES remove qualquer EWNS restante, resultando na mesma temperatura (T), umidade relativa (UR) e níveis de ozônio.
Foi descoberto que importantes microrganismos transmitidos por alimentos contaminam produtos frescos, como Escherichia coli (ATCC #27325), um indicador fecal, Salmonella enterica (ATCC #53647), um patógeno transmitido por alimentos, Listeria innocua (ATCC #33090), uma alternativa à Listeria monocytogenes patogênica., Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098) como uma alternativa à levedura deteriorante e Mycobacterium parafortuitous (ATCC #19686) como uma bactéria viva mais resistente foram adquiridos da ATCC (Manassas, Virgínia).
Compre aleatoriamente caixas de tomates-uva orgânicos no mercado local e refrigere a 4 °C até o uso (até 3 dias). Selecione tomates para experimentar com um tamanho único, com cerca de 1,2 cm de diâmetro.
Os protocolos para incubação, inoculação, exposição e contagem de colônias foram detalhados em nossas publicações anteriores e explicados em detalhes nos Dados Suplementares 11. O desempenho do EWNS foi avaliado expondo tomates inoculados a 40.000 #/cm3 por 45 minutos. Resumidamente, no tempo t = 0 min, três tomates foram usados ​​para avaliar os microrganismos sobreviventes. Três tomates foram colocados em EPES e expostos ao EWNS a 40.000 #/cc (tomates expostos ao EWNS) e outros três foram colocados na câmara de controle (tomates controle). Nenhum dos grupos de tomate foi submetido a processamento adicional. Os tomates expostos ao EWNS e os controles foram removidos após 45 minutos para avaliar o efeito do EWNS.
Cada experimento foi realizado em triplicata. A análise dos dados foi realizada de acordo com o protocolo descrito em Dados Suplementares.
Amostras bacterianas de E. coli, Enterobacter e L. innocua expostas a EWNS (45 min, concentração de aerossol de EWNS 40.000 #/cm3) e não expostas foram peletizadas para avaliar os mecanismos de inativação. O precipitado foi fixado por 2 horas à temperatura ambiente em solução de cacodilato de sódio 0,1 M (pH 7,4) com um fixador de 2,5% de glutaraldeído, 1,25% de paraformaldeído e 0,03% de ácido pícrico. Após a lavagem, foram fixadas com 1% de tetróxido de ósmio (OsO4)/1,5% de ferrocianeto de potássio (KFeCN6) por 2 h, lavadas 3 vezes com água e incubadas em 1% de acetato de uranila por 1 h, depois lavadas duas vezes com água. Desidratação subsequente de 10 minutos cada de 50%, 70%, 90%, 100% de álcool. As amostras foram então colocadas em óxido de propileno por 1 hora e impregnadas com uma mistura 1:1 de óxido de propileno e TAAP Epon (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA). As amostras foram incluídas em TAAB Epon e polimerizadas a 60 °C por 48 horas. A resina granular curada foi cortada e visualizada por MET usando um JEOL 1200EX (JEOL, Tóquio, Japão), um microscópio eletrônico de transmissão convencional equipado com uma câmera CCD AMT 2k (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, MA, EUA).
Todos os experimentos foram realizados em triplicata. Para cada ponto de tempo, as lavagens bacterianas foram semeadas em triplicata, resultando em um total de nove pontos de dados por ponto, cuja média foi usada como a concentração bacteriana para aquele organismo específico. O desvio padrão foi usado como o erro de medição. Todos os pontos contam.
O logaritmo da diminuição da concentração de bactérias em relação a t = 0 min foi calculado pela seguinte fórmula:
onde C0 é a concentração de bactérias na amostra de controle no tempo 0 (ou seja, após a superfície ter secado, mas antes de ser colocada na câmara) e Cn é a concentração de bactérias na superfície após n minutos de exposição.
Para levar em conta a degradação natural das bactérias durante o período de exposição de 45 minutos, a redução de log também foi calculada em comparação ao controle em 45 minutos, da seguinte forma:
Onde Cn é a concentração de bactérias na amostra de controle no instante n e Cn-Controle é a concentração de bactérias de controle no instante n. Os dados são apresentados como uma redução logarítmica em comparação ao controle (sem exposição a EWNS).
Durante o estudo, diversas combinações de voltagem e distância entre a agulha e o contraeletrodo foram avaliadas em termos de formação do cone de Taylor, estabilidade do cone de Taylor, estabilidade da produção de EWNS e reprodutibilidade. As diversas combinações são apresentadas na Tabela Suplementar S1. Dois casos foram selecionados para um estudo completo, demonstrando propriedades estáveis ​​e reprodutíveis (cone de Taylor, produção de EWNS e estabilidade ao longo do tempo). A Figura 3 mostra os resultados sobre carga, tamanho e conteúdo de ROS para dois casos. Os resultados também estão resumidos na Tabela 1. Para referência, a Figura 3 e a Tabela 1 incluem as propriedades dos EWNS não otimizados previamente sintetizados8, 9, 10, 11 (EWNS de linha de base). Os cálculos de significância estatística utilizando um teste t bicaudal são republicados na Tabela Suplementar S2. Além disso, dados adicionais incluem estudos sobre o efeito do diâmetro do furo de amostragem do contraeletrodo (D) e da distância entre o eletrodo terra e a ponta da agulha (L) (Figuras Suplementares S2 e S3).
(a–c) Distribuição de tamanho de AFM. (d – f) Característica de carga de superfície. (g) Caracterização de ROS e ESR.
Também é importante observar que, para todas as condições acima, as correntes de ionização medidas estavam na faixa de 2 a 6 µA e as tensões na faixa de -3,8 a -6,5 kV, resultando em um consumo de energia para este módulo de geração de EWNS de terminal único inferior a 50 mW. Embora o EWNS tenha sido sintetizado sob alta pressão, os níveis de ozônio foram muito baixos, nunca ultrapassando 60 ppb.
A Figura Suplementar S4 mostra os campos elétricos simulados para os cenários [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm], respectivamente. Os campos, de acordo com os cenários [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm], são calculados como 2 × 105 V/m e 4,7 × 105 V/m, respectivamente. Isso é esperado, visto que a relação entre tensão e distância é muito maior no segundo caso.
Na fig. 3a,b mostra o diâmetro EWNS medido com o AFM8. Os diâmetros EWNS médios para os cenários [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm] foram calculados como 27 nm e 19 nm, respectivamente. Os desvios padrões geométricos das distribuições para os casos [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm] são 1,41 e 1,45, respectivamente, indicando uma distribuição de tamanho estreita. Tanto o tamanho médio quanto o desvio padrão geométrico são muito próximos do EWNS basal, sendo 25 nm e 1,41, respectivamente. Na fig. 3c mostra a distribuição de tamanho do EWNS basal medido usando o mesmo método sob as mesmas condições.
Na fig. 3d,e mostra os resultados da caracterização de carga. Os dados são medições médias de 30 medições simultâneas de concentração (#/cm³) e corrente (I). A análise mostra que a carga média no EWNS é de 22 ± 6 e- e 44 ± 6 e- para [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm], respectivamente. Comparado ao EWNS de linha de base (10 ± 2 e-), sua carga de superfície é significativamente maior, duas vezes maior que a do cenário [-6,5 kV, 4,0 cm] e quatro vezes maior que a do cenário [-3,8 kV, 0,5 cm]. 3f mostra dados básicos de pagamento do EWNS.
A partir dos mapas de concentração numérica de EWNS (Figuras Suplementares S5 e S6), pode-se observar que a cena [-6,5 kV, 4,0 cm] apresenta um número significativamente maior de partículas do que a cena [-3,8 kV, 0,5 cm]. Deve-se observar também que as concentrações numéricas de EWNS foram monitoradas por até 4 horas (Figuras Suplementares S5 e S6), onde a estabilidade da geração de EWNS apresentou os mesmos níveis de concentração numérica de partículas em ambos os casos.
A Figura 3g mostra o espectro EPR após a subtração do controle (fundo) para EWNS otimizados em [-6,5 kV, 4,0 cm]. O espectro de ROS também é comparado à linha de base de EWNS em um artigo publicado anteriormente. O número calculado de EWNS reagindo com a armadilha de spin é de 7,5 × 104 EWNS/s, o que é semelhante à Linha de Base-EWNS8 publicada anteriormente. Os espectros EPR indicaram claramente a presença de dois tipos de ROS, onde O2- predominou, enquanto OH• estava presente em menor quantidade. Além disso, uma comparação direta das intensidades de pico mostrou que a EWNS otimizada apresentou um conteúdo de ROS significativamente maior em comparação com a EWNS de linha de base.
A Fig. 4 mostra a eficiência de deposição de EWNS em EPES. Os dados também estão resumidos na Tabela I e comparados com os dados originais de EWNS. Para ambos os casos de EUNS, a deposição foi próxima de 100%, mesmo em baixa tensão de 3,0 kV. Tipicamente, 3,0 kV são suficientes para atingir 100% de deposição, independentemente da mudança na carga superficial. Sob as mesmas condições, a eficiência de deposição da EWNS de base foi de apenas 56% devido à menor carga (média de 10 elétrons por EWNS).
A Figura 5 e a Tabela 2 resumem o grau de inativação de microrganismos inoculados na superfície de tomates após exposição a aproximadamente 40.000 #/cm³ de EWNS por 45 minutos no cenário ótimo [-6,5 kV, 4,0 cm]. E. coli e L. innocua inoculadas apresentaram uma redução significativa de 3,8 log após 45 minutos de exposição. Nas mesmas condições, S. enterica apresentou uma redução menor de 2,2 log, enquanto S. cerevisiae e M. parafortuitum apresentaram uma redução de 1,0 log.
Micrografias eletrônicas (Figura 6) representando as alterações físicas induzidas por EWNS em células de E. coli, Salmonella enterica e L. innocua, levando à inativação. As bactérias controle apresentaram membranas celulares intactas, enquanto as bactérias expostas apresentaram membranas externas danificadas.
Imagens de microscopia eletrônica de bactérias controle e expostas revelaram danos à membrana.
Os dados sobre as propriedades físico-químicas do EWNS otimizado mostram coletivamente que as propriedades do EWNS (carga superficial e conteúdo de ROS) foram significativamente melhoradas em comparação com os dados de linha de base do EWNS publicados anteriormente8,9,10,11. Por outro lado, seu tamanho permaneceu na faixa nanométrica, o que é muito semelhante aos resultados publicados anteriormente, permitindo que permanecessem no ar por um longo período de tempo. A polidispersão observada pode ser explicada por mudanças na carga superficial, que determinam a magnitude do efeito Rayleigh, a aleatoriedade e a potencial fusão do EWNS. No entanto, conforme detalhado por Nielsen et al.22, a alta carga superficial reduz a evaporação ao aumentar efetivamente a energia/tensão superficial da gota d'água. Essa teoria foi confirmada experimentalmente para microgotas22 e EWNS em nossa publicação anterior8. A perda de tempo ao longo do tempo também pode afetar o tamanho e contribuir para a distribuição de tamanho observada.
Além disso, a carga por estrutura é de cerca de 22 a 44 e-, dependendo das circunstâncias, o que é significativamente maior em comparação com o EWNS básico, que possui uma carga média de 10 ± 2 elétrons por estrutura. No entanto, deve-se notar que esta é a carga média do EWNS. Seto et al. demonstraram que a carga não é uniforme e segue uma distribuição log-normal21. Em comparação com nosso trabalho anterior, dobrar a carga superficial duplica a eficiência de deposição no sistema EPES para quase 100%11.